專(zhuān)利名稱(chēng)：改善植物的農(nóng)藝和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物細(xì)胞、種子、組織和全植株的轉(zhuǎn)化領(lǐng)域。更具體地講，本發(fā)明涉及將編碼類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑所特有的一種或多種酶的重組核苷酸序列插入植物材料，以便改善其農(nóng)藝和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。
背景技術(shù)：
前維生素A(β-胡蘿卜素)缺陷是一種非常嚴(yán)重的健康問(wèn)題，它會(huì)在以諸如大米之類(lèi)的谷物作為幾乎唯一的主要食物的世界人群中導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床癥狀。僅在東南亞，估計(jì)每年就有500萬(wàn)兒童發(fā)生眼睛疾病——干眼病，其中有2.5萬(wàn)人最終會(huì)失明(Sommer，1988；Grant，1991)。另外，盡管維生素A缺陷不是直接的死亡決定因素，但它與增加了的易患潛在的致命性疾病相關(guān)，如腹瀉、呼吸道疾病和兒童疾病，如麻疹(Grant，1991)。根據(jù)UNICEF的統(tǒng)計(jì)數(shù)字，改善前維生素營(yíng)養(yǎng)，每年能夠預(yù)防1-4歲兒童中1-200萬(wàn)人的死亡，并能預(yù)防0.25-0.5百萬(wàn)兒童在以后時(shí)間死亡(Humphrey等，1992)。因此，非常需要提高主要食物中的類(lèi)胡蘿卜素含量。另外，已知類(lèi)胡蘿卜素有助于預(yù)防幾種類(lèi)型的癌癥，并且證實(shí)了視網(wǎng)膜中的葉黃素和玉米黃素在預(yù)防黃斑變性方面的作用(例如，參見(jiàn)Brown等，1998；Schalch，1992)。
另外，類(lèi)胡蘿卜素作為人類(lèi)食品和動(dòng)物飼料以及在制藥行業(yè)中作為著色劑具有廣泛用途。另外，類(lèi)胡蘿卜素在“功能食品”中作為營(yíng)養(yǎng)化合物的價(jià)值也在增加。這是因?yàn)槟承╊?lèi)胡蘿卜素，例如，β-胡蘿卜素在哺乳動(dòng)物體內(nèi)具有前維生素-A特征。
類(lèi)胡蘿卜素是由8個(gè)異戊二烯單位縮合而產(chǎn)生的40個(gè)碳原子(C40)的類(lèi)異戊二烯，所述異戊二烯單位是由生物合成前體——異戊二烯二磷酸酯產(chǎn)生的(參見(jiàn)


圖1)。在命名時(shí)，類(lèi)胡蘿卜素分成兩種類(lèi)型，即包括烴的胡蘿卜素，和被稱(chēng)作葉黃素的加氧衍生物。它們?cè)谥参镏械闹饕饔檬?，防止?duì)質(zhì)體的光合裝置造成光氧化損傷。另外，它們?cè)诠夂献饔弥袇⑴c集光，并且是光合反應(yīng)中心的組成成分。類(lèi)胡蘿卜素是植物激素脫落酸的直接前體。
業(yè)已研究了
圖1所示的類(lèi)胡蘿卜素生物合成，并且業(yè)已在細(xì)菌、真菌、和植物中闡明了其途徑(例如，參見(jiàn)Britton，1998)。在植物中，類(lèi)胡蘿卜素是在質(zhì)體中形成的。
類(lèi)胡蘿卜素生物合成的早期中間體是香葉基香葉基二磷酸酯(GGPP)，它是通過(guò)香葉基香葉基二磷酸酯合成酶的作用由異戊烯二磷酸酯(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸酯(DMAPP)形成的(參見(jiàn)
圖1)。隨后的酶促步驟代表第一個(gè)類(lèi)胡蘿卜素專(zhuān)一性反應(yīng)，是由八氫番茄紅素合成酶催化的。該反應(yīng)包括一個(gè)兩步反應(yīng)，導(dǎo)致兩個(gè)GGPP分子的頭對(duì)頭的縮合，以便形成第一種尚未著色的胡蘿卜素產(chǎn)物八氫番茄紅素(Dogbo等，1988；Chamovitz等，1991；Linden等，1991；Pecker等，1992)。八氫番茄紅素合成酶以兩種形式存在可溶的無(wú)活性形式和膜結(jié)合的/活性形式，并且它需要連位的羥基官能團(tuán)以便在含有質(zhì)體半乳糖脂的膜表面具有活性(Schledz等，1996)。
盡管在細(xì)菌和植物中八氫番茄紅素的形成相似，但八氫番茄紅素的代謝明顯不同。在植物中，有兩種基因產(chǎn)物按順序起作用，以便產(chǎn)生著色的胡蘿卜素番茄紅素(Beyer等，1989)。這兩種酶是八氫番茄紅素脫飽和酶(PDS，例如，參見(jiàn)Hgueney等，1992)和ζ-胡蘿卜素脫飽和酶(ZDS，參見(jiàn)Albrecht等，1996)。每引入兩個(gè)雙鍵都能分別通過(guò)六氫番茄紅素產(chǎn)生ζ-胡蘿卜素和通過(guò)鏈孢紅素產(chǎn)生番茄紅素。據(jù)信PDS通過(guò)質(zhì)體醌(Mayer等，1990；Schulz等，1993；Norris等，1995)與一種膜結(jié)合氧化還原鏈機(jī)械連接(Nievelstein等，1995)，而ZDS以不同的方式機(jī)械地起作用(Albrecht等，1996)。在植物中，所述整個(gè)途徑似乎與順式結(jié)構(gòu)的中間體相關(guān)(Bartley等，1996)。相反，在諸如歐文氏菌屬的許多細(xì)菌中，產(chǎn)生所有4個(gè)雙鍵的整個(gè)脫飽和序列是由一種基因產(chǎn)物(CrtI)完成的，將八氫番茄紅素直接轉(zhuǎn)化成番茄紅素(例如，參見(jiàn)Miawa等，1990；Armstrong等，1990；Hundle等，1994)。已知這種類(lèi)型的細(xì)菌脫飽和酶不容易受漂白型除草劑的影響，這些除草劑能有效抑制植物類(lèi)型的八氫番茄紅素脫飽和酶。
在植物中，有兩種基因產(chǎn)物催化番茄紅素的環(huán)化，即α(ε)-和β-番茄紅素環(huán)化酶，分別形成α(ε)-和β-紫羅酮端基(例如，參見(jiàn)Cunningham等，1993；Scolnik和Bartley，1995，Cunningham等，1996)。在植物中，正常情況下生成具有兩個(gè)β-紫羅酮端基的β-胡蘿卜素和具有一個(gè)α(ε)和一個(gè)β-紫羅酮端基的α-胡蘿卜素。
植物葉黃素的形成首先是由兩種基因產(chǎn)物介導(dǎo)的，α-和β-羥化酶(Masamoto等，1998)，它們分別作用于α-和β-胡蘿卜素的胡蘿卜素主鏈的C3和C3’位置。產(chǎn)生的葉黃素被稱(chēng)為黃體素和玉米黃質(zhì)。
進(jìn)一步的加氧反應(yīng)是由玉米黃質(zhì)環(huán)氧酶催化的，這種酶能催化環(huán)氧官能團(tuán)導(dǎo)入玉米黃質(zhì)主鏈的C5、C6、和C5’、C6’(Marin等，1996)。這會(huì)導(dǎo)致花藥黃質(zhì)和紫黃質(zhì)的形成。在不同基因產(chǎn)物紫黃質(zhì)脫環(huán)氧酶的作用下可以逆轉(zhuǎn)該反應(yīng)(Bugos和Yamamoto，1996)。
導(dǎo)致新黃質(zhì)形成的基因產(chǎn)物尚有待鑒定。
業(yè)已從包括細(xì)菌到植物的生物中克隆了編碼類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因的基因和cDNA。細(xì)菌和藍(lán)細(xì)菌基因包括草生歐文氏菌(申請(qǐng)?zhí)朩O91/13078，Armstrong等，1990)，噬夏孢歐文氏菌(Misawa等，1990)，R.capsulatus(Armstrong等，1989)，嗜熱棲熱菌(Hoshino等，1993)，藍(lán)細(xì)菌屬聚球藍(lán)細(xì)菌(Genbank保藏號(hào)X63873)，黃桿菌菌株R1534(Pasamontes等，1997)。業(yè)已從各種來(lái)源克隆了編碼高等植物類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑的酶的基因和cDNA，所述來(lái)源包括擬南芥、白芥、辣椒、黃水仙、番茄等，正如可以從公共數(shù)據(jù)庫(kù)中推導(dǎo)的。
目前對(duì)所述克隆基因在高等植物轉(zhuǎn)化及所產(chǎn)生的效果的了解還比較少。來(lái)自番茄的八氫番茄紅素合成酶的表達(dá)，可以影響果實(shí)中類(lèi)胡蘿卜素的含量(Bird等，1991；Bramley等，1992；Fay和Grierson，1993)。業(yè)已報(bào)導(dǎo)了八氫番茄紅素合成酶在轉(zhuǎn)化的番茄植物中的組成型表達(dá)會(huì)導(dǎo)致矮化，這是因?yàn)楦淖兞顺嗝顾厣锖铣赏緩街写x產(chǎn)物GGPP的方向(Fray等，1995)。當(dāng)來(lái)自黃水仙的八氫番茄紅素合成酶在水稻胚乳中進(jìn)行組成型表達(dá)時(shí)沒(méi)有出現(xiàn)上述問(wèn)題(Burhardt等，1997)。已知作為細(xì)菌脫飽和酶的噬夏孢歐文氏菌CrtI能在植物中起作用，并能產(chǎn)生對(duì)漂白性除草劑的抗性(Misawa等，1993)。
在過(guò)去幾年里，為了改變或增強(qiáng)諸如營(yíng)養(yǎng)組織或種子的各種植物組織中或細(xì)菌中類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑，業(yè)已進(jìn)行了許多嘗試。例如，參見(jiàn)WO96/13149，WO98/06862，WO98/24300，WO96/28014，和US5618988。以上所有嘗試都局限于對(duì)細(xì)胞中現(xiàn)有類(lèi)胡蘿卜素生物合成反應(yīng)的操作。致力于改變富含油種子的類(lèi)胡蘿卜素生物合成的其他用途是不同的，因?yàn)樗鼈兲峁┝四苋菁{由于轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生的增產(chǎn)刺激所形成的過(guò)多的類(lèi)胡蘿卜素的庫(kù)。
很顯然，需要一種轉(zhuǎn)化植物材料的方法，以便得到能夠表達(dá)產(chǎn)生感興趣的胡蘿卜素和葉黃素所必需的類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑的所有酶。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、種子、組織或全植株以便產(chǎn)生能夠表達(dá)類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑的所有酶的轉(zhuǎn)化體的裝置和方法，這些酶是目標(biāo)宿主植物積累感興趣的胡蘿卜素和/或葉黃素所必需的。本發(fā)明還提供了為了適用于實(shí)施本發(fā)明方法而設(shè)計(jì)的DNA，以及包括所述分子的質(zhì)粒和載體系統(tǒng)。另外，本發(fā)明提供了具有改善了的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)并含有所述DNA分子的和/或用本發(fā)明方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、種子、組織和全植株。
因此，本發(fā)明提供了類(lèi)胡蘿卜素生物合成的從頭導(dǎo)入和表達(dá)，它對(duì)于諸如水稻胚乳和許多其他谷類(lèi)種子的、已知基本上不含類(lèi)胡蘿卜素的植物材料來(lái)說(shuō)是特別重要的，以及對(duì)現(xiàn)有的類(lèi)胡蘿卜素生物合成進(jìn)行修飾，以便上調(diào)或下調(diào)某些感興趣的中間體或產(chǎn)物的積累。
附圖簡(jiǎn)述
圖1表示植物類(lèi)胡蘿卜素生物合成的總體途徑。酶的名稱(chēng)用黑體表示。還示出了由細(xì)菌CrtI型胡蘿卜素脫飽和酶催化的反應(yīng)。
圖2表示中間體香葉基香葉基二磷酸酯(GGPP)不僅參與類(lèi)胡蘿卜素的生物合成，而且是通過(guò)異戊二烯化反應(yīng)(例如，生育酚、醌、葉綠素)或通過(guò)不利用非異戊烯受體分子(例如，赤霉素、芳香劑和香味物質(zhì))的不同反應(yīng)通向不同化合物的途徑中起著建筑組件的作用。
圖3表示對(duì)來(lái)自未轉(zhuǎn)化過(guò)的(圖3A)和轉(zhuǎn)化過(guò)的(圖3B，用質(zhì)粒A；圖3C，用質(zhì)粒A+B)水稻植物的拋光的水稻種子(胚乳)的HPLC分析。在表示轉(zhuǎn)化種子的圖樣中證實(shí)了類(lèi)胡蘿卜素、環(huán)狀胡蘿卜素和葉黃素的出現(xiàn)。
圖4表示用于“質(zhì)粒A”和“質(zhì)粒B”中的表達(dá)框。LB，左臂；RB，右臂；psy，八氫番茄素合成酶，cDNA來(lái)自黃水仙；crtI來(lái)自噬夏孢歐文氏菌的胡蘿卜素脫飽和酶基因；cyc番茄紅素環(huán)化酶，cDNA來(lái)自黃水仙；aph IV，潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶；Gtl，水稻谷蛋白1啟動(dòng)子；35S，CaMV35S啟動(dòng)子；nos，胭脂氨酸合成酶終止子；NptII，卡那霉素抗性基因。
圖5A，用未處理過(guò)的(泳道1)和CPTA-處理過(guò)的(泳道2)黃水仙花RNA進(jìn)行的Northern印跡。對(duì)固定的RNA進(jìn)行反復(fù)劃線，以便讓標(biāo)記過(guò)的探針雜交；B，八氫番茄紅素脫飽和酶；C，ζ-胡蘿卜素脫飽和酶；E，番茄紅素環(huán)化酶。B，用未處理過(guò)的(泳道1)和處理過(guò)的(泳道2)黃水仙花的蛋白提取物進(jìn)行的Western印跡。用抗A，八氫番茄紅素合成酶；B，八氫番茄紅素脫氫酶；C，ζ-胡蘿卜素脫飽和酶；D，番茄紅素環(huán)化酶的抗體檢測(cè)所述印跡。
本說(shuō)明書(shū)所用縮略語(yǔ)本文所提到的相關(guān)類(lèi)胡蘿卜素的系統(tǒng)名稱(chēng)為八氫番茄紅素7，8，11，12，7’，8’，11’，12’-八氫-φ，φ-胡蘿卜素六氫番茄紅素7，8，11，12，7’，8’-六氫-φ，φ-胡蘿卜素ζ-胡蘿卜素7，8，7’，8’-四氫-φ，φ-胡蘿卜素鏈孢紅素7，8-二氫-φ，φ-胡蘿卜素番茄紅素-φ，φ-胡蘿卜素β-胡蘿卜素β，β-胡蘿卜素α-胡蘿卜素β，ε-胡蘿卜素玉米黃質(zhì)β，β-胡蘿卜素-3，3’-二醇葉黃素β，ε-胡蘿卜素-3，3’-二醇花藥黃質(zhì)5，6-環(huán)氧-5，6-二氫-β，β-胡蘿卜素-3，3’-二醇紫黃質(zhì)5，6，5’，6’，雙環(huán)氧-5，6，5’，6’，四氫-β，β-胡蘿卜素-3，3’-二醇新黃質(zhì)5’，6’-環(huán)氧-6，7-二脫氫-5，6，5’，6’-四氫-β，β-胡蘿卜素-3，5，3’-三醇酶PSY八氫番茄紅素合成酶PDS八氫番茄紅素脫飽和酶CrtI細(xì)菌胡蘿卜素脫飽和酶ZDSζ-胡蘿卜素脫飽和酶
CYC番茄紅素β-環(huán)化酶非胡蘿卜素中間體IPP異戊烯二磷酸酯DMAPP二甲基烯丙基-二磷酸酯GGPP香葉基香葉基二磷酸酯在本文中，術(shù)語(yǔ)“植物”一般包括真核藻類(lèi)，有胚植物，包括苔蘚植物、蕨類(lèi)植物、和種子植物，如裸子植物和被子植物，后者包括Magnoliopsida，Rosopsida(真-“雙子葉植物”)、Liliopsida(單子葉植物)。代表性的和優(yōu)選的例子包括谷類(lèi)種子，例如水稻、小麥、大麥、燕麥、莧、亞麻、黑小麥、黑麥、玉米和其他禾本科植物；油用種子，如油用蕓薹種子、棉籽、大豆、紅花、向日葵、椰子果、和棕櫚等；其他食用種子或具有可食用部分的種子，包括南瓜、西葫蘆、芝麻、罌粟、葡萄、綠豆、花生、豌豆、菜豆、蘿卜、苜蓿、可可、咖啡、大麻、樹(shù)木堅(jiān)果，如胡桃、杏、大胡桃、鷹嘴豆等。另外，還有馬鈴薯、胡蘿卜、甘薯、番茄、辣椒、木薯、柳樹(shù)、橡樹(shù)、榆樹(shù)、楓樹(shù)、蘋(píng)果、香蕉；觀賞花卉，如百合、蘭花、蘆葦、薔薇、毛茛、矮牽牛、草夾竹桃、紫羅蘭、和向日葵等。一般，本發(fā)明可應(yīng)用于觀賞類(lèi)植物以及為了獲得食物、纖維、木材、鞣料、燃料、色素、樹(shù)膠、樹(shù)脂、膠乳產(chǎn)品、脂肪、油、藥物、和飲料等而栽培的植物。被選擇用于轉(zhuǎn)化的目標(biāo)植物優(yōu)選是為了獲得食物而栽培的，例如，谷物、根、豆、堅(jiān)果、蔬菜、塊莖、果實(shí)、和調(diào)料等。
發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明，提供了轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、種子、組織或全植株以便產(chǎn)生能夠表達(dá)類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑的所有酶的轉(zhuǎn)化體的裝置和方法，所述酶是目標(biāo)宿主植物積累感興趣的胡蘿卜素和/或葉黃素所必需的。按照本發(fā)明的另一方面，所述方法還可用于修飾現(xiàn)有的類(lèi)胡蘿卜素生物合成，以便上調(diào)或下調(diào)某些感興趣的中間體或產(chǎn)物的積累。另外，提供了特殊的DNA分子，該分子包括具有能夠指導(dǎo)類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑所特有的一種或多種酶產(chǎn)生的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)框的核苷酸序列，所述酶選自下列一組-源于植物、真菌、或細(xì)菌的八氫番茄紅素合成酶，
-源于植物、真菌、或細(xì)菌的八氫番茄紅素脫飽和酶，-源于植物或藍(lán)細(xì)菌的ζ-胡蘿卜素脫飽和酶，和-源于植物、真菌、或細(xì)菌的番茄紅素環(huán)化酶。
根據(jù)一種優(yōu)選實(shí)施方案，上述表達(dá)框包括一個(gè)或多個(gè)編碼植物、真菌或細(xì)菌八氫番茄紅素合成酶，植物、真菌或細(xì)菌八氫番茄紅素脫飽和酶，植物ζ-胡蘿卜素脫飽和酶，或植物、真菌、或細(xì)菌的番茄紅素環(huán)化酶的基因或cDNA，所述基因各自可操作地與合適的組成型、誘導(dǎo)型、或組織專(zhuān)一型啟動(dòng)子連接，使其能在植物細(xì)胞、種子、組織或全植株中表達(dá)。特別優(yōu)選的基因或cDNA編碼植物八氫番茄紅素合成酶，細(xì)菌八氫番茄紅素脫飽和酶或植物番茄紅素環(huán)化酶。業(yè)已分離了大量的、數(shù)量仍在增加的編碼八氫番茄紅素合成酶(植物和細(xì)菌)、CrtI-型胡蘿卜素脫飽和酶(細(xì)菌)和番茄紅素環(huán)化酶(植物和細(xì)菌)的基因，并可以從數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得該基因。這些基因來(lái)自各種來(lái)源，并且都可用于本發(fā)明的方法中。
優(yōu)選的是，所述DNA分子還包括至少一個(gè)可操作地連接于合適的組成型、誘導(dǎo)型或組織專(zhuān)一型啟動(dòng)子上的選擇標(biāo)記基因或cDNA，最優(yōu)選的是受組成型啟動(dòng)子控制的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶選擇標(biāo)記。盡管本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇能在植物材料中起作用的現(xiàn)有啟動(dòng)子中的任一種，但在設(shè)計(jì)本發(fā)明的合適表達(dá)框時(shí)，優(yōu)選將編碼八氫番茄紅素脫飽和酶、ζ-胡蘿卜素脫飽和酶、或番茄紅素環(huán)化酶的相應(yīng)的核苷酸序列可操作地連接于組織專(zhuān)一型或組成型啟動(dòng)子上，而編碼八氫番茄紅素合成酶的核苷酸序列優(yōu)選是在組織專(zhuān)一型啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，以便避免赤霉素形成的干擾。
可以理解的是，作為本發(fā)明DNA分子的功能元件的核苷酸序列可以包括上述一種或多種基因或cDNA任意組合。在本發(fā)明的一種特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核苷酸序列包括八氫番茄紅素合成酶和細(xì)菌或真菌八氫番茄紅素脫飽和酶的功能性表達(dá)框，可以在整合到合適的質(zhì)?；蜉d體系統(tǒng)(質(zhì)粒A)上之后導(dǎo)入目標(biāo)植物材料，可以單獨(dú)導(dǎo)入或者與包括編碼番茄紅素環(huán)化酶的核苷酸序列的第二種質(zhì)粒(質(zhì)粒B)一起導(dǎo)入。
本發(fā)明還提供了包括上述DNA分子或核酸序列的一種或多種的質(zhì)粒或載體系統(tǒng)，所述質(zhì)粒或載體系統(tǒng)源于根癌農(nóng)桿菌。
本發(fā)明還提供了轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、種子、組織和全植株，它具有改善了的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，并含有上述DNA分子、質(zhì)?；蜉d體中的一種或多種，和/或它是用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的。
本發(fā)明基于以下事實(shí)早期中間體香葉基香葉基二磷酸酯(GGPP)不僅用于胡蘿卜素生成，而且是用于若干不同生物合成途徑的分支點(diǎn)(圖2)。因此，可以得出這樣的結(jié)論這種前體存在于含有或不含類(lèi)胡蘿卜素的所有植物組織的質(zhì)體中，如水稻胚乳中。因此，GGPP的來(lái)源可用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，即部分或整個(gè)導(dǎo)入類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑，和/或增強(qiáng)或加速現(xiàn)有的類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑。
在本說(shuō)明書(shū)中術(shù)語(yǔ)“不含類(lèi)胡蘿卜素”在用于區(qū)分某些目標(biāo)植物細(xì)胞或組織時(shí)，是指已知未按照本發(fā)明轉(zhuǎn)化的相應(yīng)的植物材料正常情況下是基本上不含類(lèi)胡蘿卜素的，例如，對(duì)于儲(chǔ)存器官來(lái)說(shuō)就是這樣，例如，水稻胚乳等。不含類(lèi)胡蘿卜素并不表示排除了能積累幾乎不可檢測(cè)的量的類(lèi)胡蘿卜素的細(xì)胞或組織。優(yōu)選的是，所述術(shù)語(yǔ)限定的是類(lèi)胡蘿卜素含量為0.001％w/w或更低的植物材料。
在選擇產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素途徑酶的合適來(lái)源時(shí)，可以理解的是，與相應(yīng)植物序列同源的源于藍(lán)細(xì)菌的編碼序列也可用于本發(fā)明。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，將高等植物八氫番茄紅素合成酶可操作地連接于能進(jìn)行組織專(zhuān)一性表達(dá)的啟動(dòng)子上。該結(jié)構(gòu)與細(xì)菌(Crt-E-型)八氫番茄紅素脫飽和酶統(tǒng)一在相同質(zhì)粒(質(zhì)粒A)上，后者與編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA序列融合，并可操作地連接于能進(jìn)行組成型表達(dá)的啟動(dòng)子上。用存在于合適載體上的該結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化植物能指導(dǎo)番茄紅素在特定組織中的形成，例如，通過(guò)控制八氫番茄紅素合成酶的啟動(dòng)子可以在不含類(lèi)胡蘿卜素的谷類(lèi)種子中產(chǎn)生番茄紅素。令人驚奇的是，僅是所述轉(zhuǎn)化除了能產(chǎn)生番茄紅素之外，還能啟動(dòng)類(lèi)胡蘿卜素合成向下游葉黃素發(fā)展，如葉黃素、玉米黃質(zhì)、花藥黃質(zhì)、紫黃質(zhì)，和新黃質(zhì)，即使是在諸如水稻胚乳的不含類(lèi)胡蘿卜素的組織中也是這樣。另外，還觀察到了α-胡蘿卜素的形成。因此，形成了類(lèi)似于存在于綠色葉子中的類(lèi)胡蘿卜素補(bǔ)體。這種出人意料的現(xiàn)象(本文又稱(chēng)為“超越”機(jī)制)可能是由于相應(yīng)的晚期基因(番茄紅素環(huán)化酶、β-胡蘿卜素羥化酶、環(huán)氧化酶)的組成型表達(dá)，所述晚期基因是由轉(zhuǎn)化介導(dǎo)的底物供應(yīng)激活的，或者是通過(guò)轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因的表達(dá)而激活的。在所述“超越”機(jī)制不起作用的情況下，與編碼番茄紅素環(huán)化酶的基因或cDNA共轉(zhuǎn)化(質(zhì)粒B)可以克服這一問(wèn)題，并且至少能形成α-或β-胡蘿卜素(前維生素A)。在所述“超越”機(jī)制能起作用的情況下，這種共轉(zhuǎn)化能夠增強(qiáng)由八氫番茄紅素合成酶和CrtI型胡蘿卜素脫飽和酶所產(chǎn)生的效果。因此，本發(fā)明包括通過(guò)用質(zhì)粒A或A+B轉(zhuǎn)化以遺傳學(xué)以外的方式導(dǎo)入類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑。
質(zhì)粒A還能提高含有類(lèi)胡蘿卜素的組織的類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)量。所述轉(zhuǎn)化可以增強(qiáng)人類(lèi)食品和動(dòng)物飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。將crtI型細(xì)菌八氫番茄紅素脫飽和酶用于轉(zhuǎn)化的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，所述酶也能在葉片葉綠素中表達(dá)，因此，產(chǎn)生對(duì)針對(duì)植物八氫番茄紅素脫飽和酶的漂白性除草劑的抗性。因此，本發(fā)明還包括將漂白性除草劑抗性一起應(yīng)用于至少攜帶質(zhì)粒A的轉(zhuǎn)基因植物中。
可以使用可能具有編碼植物番茄紅素環(huán)化酶的第二種質(zhì)粒B；或者該質(zhì)粒具有與轉(zhuǎn)運(yùn)序列連接的細(xì)菌番茄紅素環(huán)化酶。將其可操作地連接于一種啟動(dòng)子上，優(yōu)選能產(chǎn)生與質(zhì)粒A上的八氫番茄紅素合成酶相同的組織專(zhuān)一性表達(dá)。質(zhì)粒A和B的共轉(zhuǎn)化，能導(dǎo)致全面形成補(bǔ)充目標(biāo)組織，如根、果實(shí)、塊莖、和種子，以便實(shí)現(xiàn)從香葉基香葉基二磷酸酯產(chǎn)生β-胡蘿卜素的類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑。對(duì)于現(xiàn)有途徑或該途徑的誘導(dǎo)的晚期反應(yīng)來(lái)說(shuō)，這種共轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)上文)能夠提高類(lèi)胡蘿卜素含量并增強(qiáng)β-胡蘿卜素-衍生的葉黃素的形成。
所使用的所有基因都可操作地裝配有編碼能夠輸入質(zhì)體的轉(zhuǎn)運(yùn)序列的DNA序列。這一目的是通過(guò)重組DNA技術(shù)實(shí)現(xiàn)的，或者所述轉(zhuǎn)運(yùn)序列存在于使用中的植物cDNA上。然后，所述轉(zhuǎn)化作用能夠利用存在于質(zhì)體中的前體香葉基香葉基二磷酸酯庫(kù)形成類(lèi)胡蘿卜素。這種中心化合物既不是類(lèi)胡蘿卜素，也不是專(zhuān)門(mén)僅用于類(lèi)胡蘿卜素生物合成的前體(參見(jiàn)圖2)。
所述植物應(yīng)當(dāng)表達(dá)導(dǎo)入的基因，并且優(yōu)選進(jìn)行純合表達(dá)。一般，所述基因應(yīng)當(dāng)可操作地連接于能在特別植物的目標(biāo)宿主細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子上。所述表達(dá)的水平應(yīng)當(dāng)能夠獲得所述基因的所需特征。例如，選擇標(biāo)記基因的表達(dá)應(yīng)當(dāng)提供按照本發(fā)明方法所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體的合適選擇。類(lèi)似的，類(lèi)胡蘿卜素和葉黃素生物合成途徑上的編碼增強(qiáng)的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)應(yīng)當(dāng)?shù)玫脚c不按照本發(fā)明的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化的同一物種相比具有較高含量的一種或多種所述途徑的中間體或產(chǎn)物的植物。另一方面，通常需要限制所述感興趣的基因的過(guò)度表達(dá)，以便避免對(duì)該植物的正常生理學(xué)造成明顯的負(fù)面影響，即避免達(dá)到使其栽培變得困難的程度。
編碼感興趣的酶的基因可用于表達(dá)框中，以便在轉(zhuǎn)化的植物組織中表達(dá)。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，即在感興趣的目標(biāo)植物中導(dǎo)入或補(bǔ)充類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑，用至少一個(gè)包括一個(gè)連接于感興趣的基因上的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的表達(dá)框轉(zhuǎn)化所述植物。
所述轉(zhuǎn)錄起始可以是宿主所固有的或類(lèi)似于該宿主或?qū)υ撍拗鱽?lái)說(shuō)是外源的或異源的。外源是指所述轉(zhuǎn)錄起始區(qū)不存在于導(dǎo)入了該轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的野生型宿主中。
特別感興趣的是與儲(chǔ)存蛋白相關(guān)的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，如谷蛋白、patatin、napin、ciferin、β-conglycinin、或菜豆蛋白等。
所述轉(zhuǎn)錄框沿轉(zhuǎn)錄的5’-3’方向包括一個(gè)轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)，一個(gè)感興趣的DNA序列，以及一個(gè)能在植物中起作用的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)。所述終止區(qū)可以是所述轉(zhuǎn)錄起始區(qū)所固有的，可以是所述感興趣的DNA序列所固有的，或者可源于其他來(lái)源。常見(jiàn)的終止區(qū)來(lái)自根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒，如章魚(yú)氨酸合成酶和胭脂氨酸合成酶終止區(qū)(同樣參見(jiàn)Guerineau等，1991；Proudfoot，1991；Sanfacon等，1991；Mogen等，1990；Munroe等，1990；Ballas等，1989；Joshi等，1987)。
在多數(shù)情況下，本發(fā)明感興趣的基因是針對(duì)質(zhì)體，如葉綠體表達(dá)的。這樣，如果感興趣的基因不是直接插入質(zhì)體中的話，所述表達(dá)框應(yīng)當(dāng)額外包括一個(gè)編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列，以便引導(dǎo)感興趣的基因進(jìn)入質(zhì)體。所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知(例如，參見(jiàn)Von Heijne等，1991；Clark等，1989；Della-Cioppa，1987；Romer等，1993；和Shah等，1986)。可用于本發(fā)明的所有類(lèi)胡蘿卜素途徑基因都可使用天然或異源轉(zhuǎn)運(yùn)肽。
所述結(jié)構(gòu)還可以包括任何其他必需調(diào)節(jié)子，如植物翻譯共有序列(Joshi，1987)，和內(nèi)含子(Luehrsen和Walbot，1991)等，它們可操作地連接于感興趣的核苷酸序列上。需要導(dǎo)入的基因上的內(nèi)含子序列能夠通過(guò)穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄物，并使其能夠有效轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核外面，并增強(qiáng)其表達(dá)。已知的所述內(nèi)含子序列包括植物遍在蛋白基因的內(nèi)含子(Cornejo，1993)。另外，業(yè)已觀察到相同的結(jié)構(gòu)插入所述基因組的不同位點(diǎn)上，可以改變?cè)谥参镏械谋磉_(dá)水平，據(jù)信，這一結(jié)果至少部分是由于所述基因在染色體上的位置，即單個(gè)的分離體會(huì)具有不同的表達(dá)水平(例如，參見(jiàn)Hoever等，1994)。例如，可用于構(gòu)建表達(dá)框的其他調(diào)控DNA序列包括能夠在植物組織中以誘導(dǎo)或抑制方式調(diào)控相關(guān)DNA序列轉(zhuǎn)錄的序列。
例如，已知有些植物基因是通過(guò)各種內(nèi)部和外部因素誘導(dǎo)的，如植物激素、熱激、化合物、病原體、缺氧、光照、脅迫等。
能夠調(diào)控的另一類(lèi)DNA序列包括通過(guò)化學(xué)方法啟動(dòng)的序列，例如，所述序列存在于煙草的PR(病理相關(guān))蛋白基因上的并可以通過(guò)化學(xué)調(diào)節(jié)子方式誘導(dǎo)的序列，如披露于EP-A0332104中的序列。
在植物中表達(dá)外源基因的另一個(gè)需要考慮的因素是轉(zhuǎn)基因基因組的穩(wěn)定性水平，即外源基因從該群體中分離的傾向。如果一種選擇標(biāo)記連接于感興趣的基因或表達(dá)框上，則可以進(jìn)行選擇，以便保持轉(zhuǎn)基因植株。
在所述表達(dá)框結(jié)構(gòu)中包括5’前導(dǎo)序列是有利的。所述前導(dǎo)序列能夠起到增強(qiáng)翻譯的作用。翻譯前導(dǎo)序列為本領(lǐng)域所公知，并且包括小R病毒前導(dǎo)序列，例如，EMCV前導(dǎo)序列(腦心肌炎病毒5’非編碼區(qū)；Elroy-Stein等，1989)；馬鈴薯Y病毒組前導(dǎo)序列，例如，TEV前導(dǎo)序列(煙草蝕刻病毒；Allisson等，1986)；和人類(lèi)免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BiP，Macejak和Sarnow，1991)；來(lái)自苜蓿花葉病毒的外被蛋白mRNA的未翻譯的前導(dǎo)序列(AMV RNA4；Joblig和Gehrke，1987)；煙草花葉病毒前導(dǎo)序列(TMV；Gallie等，1989)；和玉米退綠條斑病毒前導(dǎo)序列(MCMV；Lommel等，1991；還可參見(jiàn)Della-Cioppa，1987)。
根據(jù)感興趣的DNA序列是否要表達(dá)，可能需要合成具有植物優(yōu)選密碼子或具有葉綠體優(yōu)選密碼子的序列。植物優(yōu)選密碼子，可以在感興趣的特定植物物種中以最大量表達(dá)的蛋白的出現(xiàn)頻率最高的密碼子中確定(參見(jiàn)EP-A0359472；EP-A0386962；WO91/16432；Perlak等，1991；和Murray等，1989)。這樣，可以優(yōu)化所述核苷酸序列在任何植物中的表達(dá)。業(yè)已認(rèn)識(shí)到，可以對(duì)所述基因序列的全部或任何部分進(jìn)行優(yōu)化或合成。就是說(shuō)，也可以使用合成的或部分優(yōu)化的序列。有關(guān)葉綠體優(yōu)選基因的構(gòu)建可以參見(jiàn)USPN5545817。
在制備所述轉(zhuǎn)錄框時(shí)，可以對(duì)各種DNA片段進(jìn)行操作，以便提供正確方向的DNA序列，并且適應(yīng)于正確的讀框。為此，可以用接頭連接所述DNA片段或者進(jìn)行其他操作，以便提供常見(jiàn)的限制位點(diǎn)，除去多余的DNA，或除去限制位點(diǎn)等。為此，可以進(jìn)行體外誘變、引物修復(fù)、限制、退火、切除、或連接等，其中，可以進(jìn)行插入、缺失、或取代，例如，轉(zhuǎn)換和顛換。
用標(biāo)準(zhǔn)方法將具有感興趣的基因的表達(dá)框置入表達(dá)載體中。合適表達(dá)載體的選擇取決于將該表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法。一種典型的表達(dá)載體包括編碼細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的原核DNA元件，和在細(xì)菌宿主中生長(zhǎng)并選擇表達(dá)載體的抗生素抗性基因；一個(gè)用于插入外源DNA序列的克隆位點(diǎn)，在本發(fā)明中，所述外源DNA序列編碼類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑的一種或多種特定的酶；控制所述外源基因轉(zhuǎn)錄起始的真核DNA元件，如啟動(dòng)子；和控制轉(zhuǎn)錄物加工的DNA元件，如轉(zhuǎn)錄終止/聚腺苷酸化序列。它還可以包括最終將該載體整合到染色體上所需的序列。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體還包括一個(gè)編碼諸如潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的選擇標(biāo)記的基因(van den Elzen等，1985)，它與一個(gè)啟動(dòng)子呈功能性連接。能產(chǎn)生抗生素抗性、并因此適合作為選擇標(biāo)記的其他基因的例子，包括編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶卡那霉素抗性的基因(Velten等，1984)；源于Tn5的卡那霉素抗性(NPTII)基因(Bevan等，1983)；由Thompson等(1987)所披露的PAT基因；以及氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因。適用于本發(fā)明的植物表達(dá)載體和選擇標(biāo)記基因的一般性描述可以參見(jiàn)Gruber等(1993)的著述。如上文所述，還可以從包括細(xì)菌crtI的表達(dá)框中省略其他選擇標(biāo)記，業(yè)已證實(shí)該基因產(chǎn)物能產(chǎn)生對(duì)漂白性除草劑的抗性。在這種特定實(shí)施方案中，crtI優(yōu)選是受組成型或組織專(zhuān)一型啟動(dòng)子的控制。在一種高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，crtI是由綠色光合活性組織或細(xì)胞中所特有并且在其中起作用的啟動(dòng)子控制。
用于分別控制感興趣的基因和標(biāo)記基因表達(dá)的啟動(dòng)子元件可以是任何植物相容的啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子可以是植物基因啟動(dòng)子，如核酮糖-1，5-二磷酸酯羧化酶小亞基(RUBISCO)的啟動(dòng)子，或來(lái)自根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒的啟動(dòng)子，如胭脂氨酸和章魚(yú)氨酸合成酶啟動(dòng)子或病毒啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CaMV)19S和35S啟動(dòng)子或玄參花葉病毒35S啟動(dòng)子。例如，適用于本發(fā)明的已知植物啟動(dòng)子的綜述可以參見(jiàn)國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朩O91/19806。
“組織專(zhuān)一性”啟動(dòng)子能夠使要表達(dá)類(lèi)胡蘿卜素或葉黃素生物合成途徑產(chǎn)物的組織中的所述一種或多種基因產(chǎn)物的積累量特別高；某些表達(dá)可能出現(xiàn)在植物的其他部分。已知組織專(zhuān)一性啟動(dòng)子的例子包括谷蛋白1啟動(dòng)子(Kim等，1993；Okita等，1989；Zheng等，1993)，塊莖定向的I型patatin啟動(dòng)子(Bevan等，1986)；與馬鈴薯塊莖ADPGPP基因相關(guān)的啟動(dòng)子(Muller等，1990)；大豆β-conglycinin的啟動(dòng)子，又被稱(chēng)作7S蛋白，它能啟動(dòng)種子定向的轉(zhuǎn)錄(Bray，1987)；和來(lái)自玉米胚乳的玉米醇溶蛋白基因的種子定向啟動(dòng)子(Pedersen等，1982)?？捎糜诒景l(fā)明的另一種類(lèi)型的啟動(dòng)子是植物遍在蛋白啟動(dòng)子。植物遍在蛋白啟動(dòng)子為本領(lǐng)域所熟知，正如由Kay等(1987)和EP-A0342926所證實(shí)的。同樣適用于本發(fā)明的有肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、組蛋白啟動(dòng)子和微管蛋白啟動(dòng)子。優(yōu)選的化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的例子，如煙草PR-1a啟動(dòng)子詳細(xì)披露于EP-A0332104中。另一類(lèi)優(yōu)選的啟動(dòng)子是創(chuàng)傷誘導(dǎo)型的。這種類(lèi)型的優(yōu)選啟動(dòng)子包括披露于以下文獻(xiàn)中的啟動(dòng)子Stanford等(1989)，Xu等(1993)，Lozemann等，(1989)，Rohrmeier&Lehle(1993)，F(xiàn)irek等(1993)，和Warner等(1993)。
本發(fā)明所涉及的植物細(xì)胞、種子、組織和全植株可以通過(guò)若干種方法中的任一種獲得。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，方法的選擇取決于用于轉(zhuǎn)化的植物的類(lèi)型，即單子葉或雙子葉植物。所述方法通常包括直接基因轉(zhuǎn)移、化學(xué)誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、電穿孔、顯微注射(Crossway等，1986；Neuhaus等，1987)，農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，ballistic粒子加速，例如，使用Agracetus公司出售的裝置(Madison，Wisconsin)和杜邦公司(Wilmington，Delaware)出售的裝置(例如，參見(jiàn)Sanford等，US4945050；和McCabe等，1988)。
用于獲得本發(fā)明轉(zhuǎn)化的植物或其部分的一種方法是直接基因轉(zhuǎn)移，其中，在合適的條件下培養(yǎng)或以其他方式生長(zhǎng)植物細(xì)胞，所述培養(yǎng)是在有包括需要導(dǎo)入所述植物或其部分中的核苷酸序列的DNA寡核苷酸的條件下進(jìn)行的。供體DNA來(lái)源通常是包括所需基因的質(zhì)?；蚱渌线m載體。為方便起見(jiàn)，這里專(zhuān)指質(zhì)粒，但要理解的是，也包括所需基因的其他合適啟動(dòng)子。
能夠攝入所述質(zhì)粒的任何合適的植物組織都可以通過(guò)直接基因轉(zhuǎn)移處理。例如，所述植物組織包括發(fā)育早期，特別是在減數(shù)分裂之前，特別是減數(shù)分裂之前的1-2周的生殖結(jié)構(gòu)，一般，將減數(shù)分裂之前的生殖器官浸泡在質(zhì)粒溶液中，例如，通過(guò)將質(zhì)粒溶液直接注射到植物的生殖器官中或靠近生殖器官的地方。然后讓所述植物自花授粉，或者與用同樣方法處理過(guò)的另一個(gè)植株異花授粉。在每一個(gè)花結(jié)構(gòu)中，所述質(zhì)粒溶液通過(guò)在大約0.1-10毫升體積中含有大約10-50微克DNA，但可以根據(jù)特定花結(jié)構(gòu)的大小高于或低于這一用量。所述溶劑通常是無(wú)菌水、鹽水、或緩沖過(guò)的鹽水、或常規(guī)植物培養(yǎng)基，如果需要，所述質(zhì)粒溶液可以含有能化學(xué)誘導(dǎo)或增強(qiáng)質(zhì)粒攝取的試劑，如PEG、或Ca2+等。
所述生殖器官在接觸所述質(zhì)粒之后，讓所述花結(jié)構(gòu)生長(zhǎng)到成熟，并收獲種子。根據(jù)質(zhì)粒標(biāo)記，可以通過(guò)在標(biāo)記敏感性或優(yōu)選在標(biāo)記抗性培養(yǎng)基中發(fā)芽或生長(zhǎng)植株選擇具有所述標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化植物。例如，從用具有卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒處理過(guò)的植株上獲得的種子仍然保持綠色，而沒(méi)有該標(biāo)記基因的植株會(huì)白化。還可以通過(guò)常規(guī)Southern、Northern和Western印跡技術(shù)證實(shí)所需mRNA基因轉(zhuǎn)錄和肽表達(dá)的存在。
在適用于完成本發(fā)明的另一種方法中，對(duì)植物原生質(zhì)體進(jìn)行處理，以便誘導(dǎo)所述質(zhì)粒的攝入。原生質(zhì)體制備為本領(lǐng)域所熟知，并且通常包括用纖維素酶或其他酶消化植物細(xì)胞足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以便除去細(xì)胞壁。通常通過(guò)篩分和洗滌將原生質(zhì)體與消化混合物分離。然后將原生質(zhì)體懸浮在合適培養(yǎng)基中，如培養(yǎng)基F，CC培養(yǎng)基等，通常為104-107細(xì)胞/毫升。然后向該懸浮液添加上述質(zhì)粒溶液和諸如聚乙二醇、Ca2+、或仙臺(tái)病毒之類(lèi)的誘導(dǎo)物。另外，所述質(zhì)?？梢阅z囊化于脂質(zhì)體中。然后將所述質(zhì)粒溶液和原生質(zhì)體培養(yǎng)一段合適的時(shí)間，通常是在大約25℃下培養(yǎng)大約1小時(shí)。在某些場(chǎng)合下，可能需要熱激所述混合物，通過(guò)加熱到大約45℃，保持2-5分鐘，并迅速冷卻到所述培養(yǎng)溫度而實(shí)現(xiàn)。然后對(duì)處理過(guò)的原生質(zhì)體進(jìn)行克隆，并選擇所需基因的表達(dá)，例如，通過(guò)表達(dá)所述標(biāo)記基因和常規(guī)吸印技術(shù)。然后按常規(guī)方法由所述克隆再生全植株。
電穿孔技術(shù)是類(lèi)似的，所不同的是，通常在電穿孔室中，在沒(méi)有或有聚乙二醇或Ca2+的條件下對(duì)裸露的質(zhì)粒和原生質(zhì)體的混合物施加電流。典型的電穿孔包括用40-10000DC伏特的電壓進(jìn)行1-10次脈沖，脈沖時(shí)間為1-2000微秒，脈沖的時(shí)間間隔通常為0.2秒。還可以采用相似程度的交流電脈沖。更具體地講，讓一個(gè)充電的電容器通過(guò)含有所述質(zhì)粒原生質(zhì)體懸浮液的電穿孔室放電。該處理會(huì)導(dǎo)致生物膜可滲透性的可逆的增加，并因此能夠插入本發(fā)明的DNA。電穿孔的植物原生質(zhì)體可以再生其細(xì)胞壁，分裂并形成愈傷組織(例如，參見(jiàn)Riggs等，1986)。
適用于轉(zhuǎn)化目標(biāo)細(xì)胞的另一種方法包括使用農(nóng)桿菌。在該方法中，用包括具有所需基因或基因框的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞，并將所述質(zhì)粒插入靶細(xì)胞的基因組中。然后按上述方法篩選并克隆能表達(dá)所需基因的細(xì)胞。例如，通過(guò)質(zhì)粒，如Ri質(zhì)粒和農(nóng)桿菌，如發(fā)根或根癌農(nóng)桿菌將感興趣的基因?qū)肽繕?biāo)組織，如塊莖、根、谷?；蚨怪械囊环N方法，是利用適用于克隆到大腸桿菌中的小的重組質(zhì)粒，在該質(zhì)粒中業(yè)已剪接了T-DNA片段，在所述T-DNA內(nèi)的一個(gè)位點(diǎn)上將該重組質(zhì)粒切開(kāi)，將一段“乘客”DNA剪接到該切口上。所述乘客DNA包括要整合到所述植物DNA中的本發(fā)明的基因和一個(gè)選擇標(biāo)記，如編碼對(duì)抗生素抗性的基因。然后將該質(zhì)粒再次克隆到較大的質(zhì)粒上，然后導(dǎo)入具有未修飾過(guò)的Ri質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株中。在所述細(xì)菌生長(zhǎng)期間，有時(shí)會(huì)發(fā)生罕見(jiàn)的雙重組，會(huì)產(chǎn)生T-DNA獲得了插入片段-即所述乘客DNA的細(xì)菌。然后根據(jù)其能在含有所述抗生素的培養(yǎng)基存活鑒定并選擇所述細(xì)菌。將所述細(xì)菌用于將其T-DNA(用乘客DNA修飾過(guò))插入植物基因組。該方法采用發(fā)根農(nóng)桿菌或根癌農(nóng)桿菌，產(chǎn)生了能再生成健康的，有活力的植株的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞(例如，參見(jiàn)Hinchee等，1988)。
另一種合適的方法是用所述轉(zhuǎn)化的DNA包衣的微粒轟擊所述細(xì)胞(Wang等，1988)，或通過(guò)壓力沖擊沿待轉(zhuǎn)化細(xì)胞方向?qū)蠨NA的溶液進(jìn)行加速，在所述壓力沖擊的作用下將該溶液分散成很細(xì)的煙霧(WP-A0434616)。
微粒轟擊被作為包括植物細(xì)胞在內(nèi)的細(xì)胞的有效轉(zhuǎn)化技術(shù)。在Sanford等(1987)的著述中，報(bào)導(dǎo)了微粒轟擊能將核酸有效輸送到洋蔥的植物細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中。Chrisstou等(1988)報(bào)導(dǎo)了通過(guò)微粒轟擊用卡那霉素抗性基因穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化大豆愈傷組織。同一位作者還報(bào)導(dǎo)了能穿透至少大約0.1-5％的細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)化的愈傷組織在可觀察水平的NPTII酶活性和高達(dá)400毫克/升卡那霉素中具有抗性。McCabe等(1988)報(bào)導(dǎo)了用微粒轟擊穩(wěn)定轉(zhuǎn)化大豆。McCabe等還報(bào)導(dǎo)了從R0嵌合植株中回收轉(zhuǎn)化的R1植株(還可以參見(jiàn)Weissinger等，1988；Datta等，1990(水稻)；Klein等，1988a(玉米)；Klein等，1988b(玉米)；Fromm等，1990；和Gordon-Kamm等，1990(玉米))。
另外，可以直接轉(zhuǎn)化植物質(zhì)體。業(yè)已報(bào)導(dǎo)了在高等植物中對(duì)葉綠體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，例如，參見(jiàn)Svab等，1990；Svab和Maliga，1993；Staub和Maliga，1993。該方法依賴于含有選擇標(biāo)記的DNA的粒子槍輸送，并通過(guò)同源重組讓該DNA定向到質(zhì)體基因組中。在所述方法中，質(zhì)體基因表達(dá)可以用質(zhì)體基因啟動(dòng)子完成，或者通過(guò)反式激活沉默的質(zhì)體所具有的轉(zhuǎn)基因而實(shí)現(xiàn)，所述轉(zhuǎn)基因是用于由選擇性的啟動(dòng)子序列進(jìn)行表達(dá)的，如由T7 RNA聚合酶識(shí)別。所述沉默的質(zhì)體基因是通過(guò)以下方式激活的由細(xì)胞核表達(dá)結(jié)構(gòu)表達(dá)特定的RNA聚合酶，并利用轉(zhuǎn)運(yùn)肽將該聚合酶定向到所述質(zhì)體中。組織專(zhuān)一性表達(dá)可以用以下方法獲得利用由合適的植物組織專(zhuān)一性啟動(dòng)子表達(dá)的細(xì)胞核編碼的、并且是質(zhì)體定向的特定RNA聚合酶。所述系統(tǒng)業(yè)已披露于McBride等的著述中(1994)。
上文通過(guò)舉例的方式所列舉的可行的轉(zhuǎn)化方法并不完全，并且并非要以任何方式限定本發(fā)明的主題。
因此，本發(fā)明還包括選自原生質(zhì)體、細(xì)胞、愈傷組織、組織、器官、種子、胚胎、胚珠、合子等的轉(zhuǎn)基因植物材料，特別是全植株，所述轉(zhuǎn)基因植物材料通過(guò)本發(fā)明的方法轉(zhuǎn)化過(guò)，并且包括可表達(dá)形式的本發(fā)明的重組DNA。并且，本發(fā)明還包括用于生產(chǎn)所述轉(zhuǎn)基因植物材料的方法。
用本領(lǐng)域眾所周知的方法將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體再生成植株(例如，參見(jiàn)McCormick等，1986)。然后可以讓所述植株生長(zhǎng)，并用相同的轉(zhuǎn)化株系或不同的株系授粉，然后評(píng)估其后代中所需特性的存在和/或所需特性表達(dá)的程度，并鑒定所得到的具有所需表型特征的雜種。例如，第一次評(píng)估可以包括轉(zhuǎn)化植株的細(xì)菌/真菌抗性水平?？梢陨L(zhǎng)兩代或兩代以上，以便證實(shí)目標(biāo)表型特征得到穩(wěn)定地保持和遺傳，然后收獲種子，以確保業(yè)已獲得所需的表型或其他特性。
本發(fā)明的范圍還包括轉(zhuǎn)基因植物，特別是用本發(fā)明方法轉(zhuǎn)化過(guò)的轉(zhuǎn)基因可育植物及其由于轉(zhuǎn)化母本而仍然具有新的或所需特性的無(wú)性和/或有性后代。
術(shù)語(yǔ)‘后代’被理解為包括轉(zhuǎn)基因植株的“無(wú)性”和“有性”繁殖后代。該定義還意味著包括可以通過(guò)諸如細(xì)胞融合或突變體篩選的已知方法獲得的所有突變體和變體，所述突變體仍然具有原始轉(zhuǎn)化植株所具有的特有特征，還包括所述轉(zhuǎn)化植物材料的所有雜交和融合產(chǎn)物。
本發(fā)明的目的還包括植株部分，如事先用本發(fā)明方法轉(zhuǎn)化過(guò)的轉(zhuǎn)基因植物或其后代的花、莖、果實(shí)、葉、根，因此它至少包括部分轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
下面的實(shí)施例是說(shuō)明性的，而不是要限定本發(fā)明。
生物學(xué)材料的保藏?cái)y帶有本發(fā)明表達(dá)框的大腸桿菌菌株業(yè)已按照布達(dá)佩斯條約規(guī)定交由德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ)保藏，Braunschweig，德國(guó)，保藏號(hào)如下菌株 保藏號(hào)PRiceCYCTOP10(質(zhì)粒B的框) DSM12714Pbaa142TOP10(質(zhì)粒A的框) DSM12713實(shí)施例將前維生素A(β胡蘿卜素)和葉黃素生物合成導(dǎo)入不含類(lèi)胡蘿卜素的水稻胚乳。
八氫番茄紅素形成(Burkhardt等，1997)以前用放射性標(biāo)記過(guò)的異戊烯二磷酸酯進(jìn)行的生物化學(xué)研究業(yè)已證實(shí)，水稻胚乳具有酶促活性的GGPP合成酶，因此，提供了類(lèi)胡蘿卜素生物合成的重要前體。因此，通過(guò)微粒轟擊方法，用來(lái)自黃水仙的、受組成型控制并受胚乳專(zhuān)一性啟動(dòng)子控制的編碼八氫番茄紅素合成酶cDNA，轉(zhuǎn)化日本水稻模型品種Taipei309(黃水仙；保藏號(hào)X78814，Schledz和Beyer，1996)。在轉(zhuǎn)基因水稻植物中，證實(shí)了黃水仙酶通過(guò)無(wú)色胡蘿卜素八氫番茄紅素在水稻胚乳中的體內(nèi)積累而被激活。因此，首次證實(shí)了原則上可以在非光合的、缺乏類(lèi)胡蘿卜素的組織中通過(guò)工程方法實(shí)現(xiàn)類(lèi)胡蘿卜素生物合成的第一個(gè)類(lèi)胡蘿卜素專(zhuān)一的酶促步驟。
將通向番茄紅素、β胡蘿卜素(前維生素A)和葉黃素類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑導(dǎo)入水稻胚乳。質(zhì)粒構(gòu)建有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)參見(jiàn)Sambrook等，1989(有關(guān)結(jié)構(gòu)的示意性說(shuō)明參見(jiàn)圖4)。有關(guān)類(lèi)胡蘿卜素生物合成酶的結(jié)構(gòu)基因?yàn)镻sy源于黃水仙的八氫番茄紅素合成酶(保藏號(hào)X78814)。
CrtI源于噬夏孢歐文氏菌的與豌豆Rubisco的轉(zhuǎn)運(yùn)序列融合的胡蘿卜素脫飽和酶(Misawa等，1993)。
Cyc源于黃水仙的番茄紅素環(huán)化酶(保藏號(hào)X98796)。
構(gòu)建pB19hpc(在本文中被稱(chēng)為“質(zhì)粒A”)Misawa等(1993)業(yè)已構(gòu)建了具有源于噬夏孢歐文氏菌的完整的八氫番茄紅素脫飽和酶(crtI)基因和位于CaMC35S-啟動(dòng)子下游和nos3’聚腺苷化信號(hào)上游的豌豆Rubisco小亞基(tp)的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列的DNA片段，并將其連接到HindIII/EcoRI消化過(guò)的pUC19上，以便獲得質(zhì)粒pUCET4。以HindIII/EcoRI片段形式將crtI表達(dá)框從pUCET4上切除，并連接到HindIII/EcoRI消化過(guò)的pBluescriptKS上，得到質(zhì)粒pBaal1。用SacII消化具有psy表達(dá)框的質(zhì)粒pGt1PsyH(Burckhardt等，1997)，它包括受水稻谷蛋白1啟動(dòng)子(Gte；Kim等，1993；Okita等，1989；Zheng等，1993)控制的源于黃水仙的八氫番茄紅素合成酶cDNA(保藏號(hào)X78814)和nos3’聚腺苷化信號(hào)。并用T4-DNA聚合酶補(bǔ)平末端。為了獲得psi表達(dá)框，用KpnI進(jìn)行再次消化。然后將SacII(補(bǔ)平的)/KpnI片段連接到用pBaal1消化過(guò)的XhoI(補(bǔ)平的)/KpnI上，以便獲得具有crtI和psy表達(dá)框的質(zhì)粒pBaal2。
取代pUC18上的多接頭位點(diǎn)，以便按以下順序包括以下限制位點(diǎn)HindIII、I-SceI、KpnI、NotI、SmaI、IsceI、EcoRI。用KpnI和NotI消化所得到的質(zhì)粒pUC18M。用KpnI和NotI將具有crtI和psy表達(dá)框的DNA片段從pBaal2上切除，并連接到上述消化過(guò)的pUC8M上。所得到的質(zhì)粒pBaal3含有雙表達(dá)框，其旁側(cè)為大范圍核酸酶限制位點(diǎn)(I-SceI)。
以KpnI片段形式將含有在CaMV35S啟動(dòng)子和CaMV35S聚腺苷酸化控制之下的aph IV的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶aph IV表達(dá)框從pRice上切除(參見(jiàn)質(zhì)粒B的結(jié)構(gòu))，并連接到KpnI消化過(guò)的pBaal3上。所得到的pBaal42和pBaal41沿相同的方向包括潮霉素抗性框，類(lèi)似于psy表達(dá)框(pBaal42)，或者呈相反方向(pBaal41)。
用EcoRI和HandIII消化載體pBin19(Bevan，1984)，并用標(biāo)準(zhǔn)方法導(dǎo)入含有以下順序的下列限制位點(diǎn)的合成寡核苷酸序列HandIII、I-SaeI、KpnI、NotI、SmaI、IsceI、EcoRI，由此產(chǎn)生pBin19M。
通過(guò)大范圍核酸酶位點(diǎn)I-sceI將crtI、psy和aph IV的表達(dá)框從pBaal42上切除，并連接到用I-sceI消化過(guò)的pBin19M上。然后將所得到的質(zhì)粒pB19hpc用于轉(zhuǎn)化。構(gòu)建pZCycH(在本文中被稱(chēng)為“質(zhì)粒B”)用EcoRI/BglII切除pKS1上的谷蛋白1啟動(dòng)子Gt1(Okita等，1989)。并連接到用BamHI/MunI消化過(guò)的pV34(Futtere和Potrykus，未發(fā)表)上，位于兩個(gè)I-SceI大范圍核酸酶位點(diǎn)之間，以便獲得質(zhì)粒pV34Gt1。在用SalI和SacI從pCIB900(Wunn等，1996)上切除之后，所述潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因aph IV表達(dá)框含有CaMV 35S聚腺苷酸化信號(hào)，其后是CaMV35S啟動(dòng)子控制下的aph IV，以及另一個(gè)CaMV35S聚腺苷酸化信號(hào)。將XhoI接頭連接到所獲得的片段的SalI位點(diǎn)上，然后將該框連接到pV34Gt1上，以便獲得所述質(zhì)粒(pRice)。用Ecl136II和BamHI將源于黃水仙的番茄紅素環(huán)化酶cyc(保藏號(hào)X99796)從質(zhì)粒pGEM4CYC上切除(Bonk等，1997)。在用Klenow片段處理之后，將cyc連接到Ec136II消化過(guò)的pRice上，以便獲得pRiceCYC。
用EcoRI和HindIII消化載體pPZP100(Hajdukiewicz等，1994)，并用標(biāo)準(zhǔn)方法導(dǎo)入一個(gè)含有以下順序的限制位點(diǎn)的合成寡核苷酸序列HindIII、I-SceI、KpnI、NotI、SmaI、IsceI、EcoRI，以便形成pPZP100M。
用IsceI大范圍核酸酶將cyc aph IV雙框從pRiceCYC上切除，并連接到IsceI消化過(guò)的pPZP100M上，以便獲得轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pZCycH。愈傷組織誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)化愈傷組織誘導(dǎo)從溫室生長(zhǎng)的植株上采集日本水稻栽培種TP309的乳熟期的未成熟的種子，在70％乙醇(v/v)中表面消毒1分鐘，在搖床上，在6％次氯酸鈣中培養(yǎng)1小時(shí)，然后用無(wú)菌蒸餾水漂洗3-5次。然后在超凈工作臺(tái)上，在雙目顯微鏡下從消毒組織上分離未成熟的胚胎，并在NB培養(yǎng)基(N6鹽和B5維生素，補(bǔ)充了30克/升麥芽糖，500毫克/升脯氨酸，300毫克/升酪蛋白水解產(chǎn)物，500毫克/升谷氨酰胺，和2毫克/升2，4-D，pH5.8)上培養(yǎng)。4-5天除去胚芽鞘，并在新的NB培養(yǎng)基上對(duì)膨大的盾片進(jìn)行繼代培養(yǎng)3-5天，直到接種農(nóng)桿菌。
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化按公開(kāi)方法(Uze等，1997)將1周齡預(yù)先培養(yǎng)的未成熟胚胎浸泡在根癌農(nóng)桿菌LBA4404細(xì)胞懸浮液中。為了共轉(zhuǎn)化兩種獨(dú)立的載體——pZPsC和pZCycH，將LBA4404/pZPsC(OD600＝2.0)與等體積的LBA4404/pZCycH(OD600＝1.0)混合，在用丙酮丁香酮誘導(dǎo)之后用于接種。在補(bǔ)充了200mM丙酮丁香酮的NB培養(yǎng)基上共培養(yǎng)接種過(guò)的預(yù)培養(yǎng)的胚胎3天，在回收培養(yǎng)基(含有250毫克/升頭孢氨噻的NB)上繼代培養(yǎng)1周，然后轉(zhuǎn)移到含有30毫克/升潮霉素和250毫克/升頭孢氨噻的NB選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)4-6周。在補(bǔ)充了0.5毫克/升NAA和3毫克/升BAP的NB培養(yǎng)基上，用4周時(shí)間由回收的抗性愈傷組織再生植株，長(zhǎng)根并轉(zhuǎn)移到溫室中。Southern印跡為了證實(shí)所述轉(zhuǎn)基因的存在，按照標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等，1989)，用源于八氫番茄紅素合成酶、CrtI和環(huán)化酶的同源標(biāo)記的探針實(shí)施Southern印跡。類(lèi)胡蘿卜素色素分析將來(lái)自R0植株的種子(1克)去皮，并在搖床上用金剛砂紙?zhí)幚?小時(shí)，以便除去種子包衣。目測(cè)檢查轉(zhuǎn)化的品系，發(fā)現(xiàn)了由于類(lèi)胡蘿卜素的存在而出現(xiàn)的明顯可檢測(cè)的黃色。另外，在某些場(chǎng)合下的分離形式是可檢測(cè)的，非常接近預(yù)期的3(黃色)∶1(白色)的比例。
用微量粉碎機(jī)(Bruan，Melsungen)將來(lái)自單個(gè)品系的種子各50粒)一起磨成細(xì)粉。用丙酮對(duì)所述細(xì)粉進(jìn)行反復(fù)萃取，以便徹底脫色。在氮?dú)饬飨伦尯喜⒌奶崛∥锔稍?。將殘余物溶解在氯仿中，并用裝有光學(xué)二極管排列的檢測(cè)器的Waters HPLC系統(tǒng)和C30反相柱(YMCEurope GmbH)進(jìn)行定量HPLC分析。用溶劑系統(tǒng)AMeOH∶叔丁基甲基乙醚(1∶1，v/v)，BMeOH∶叔丁基甲基乙醚∶H2O(6∶1.2∶1.2，v/v/v)進(jìn)行分離，在25分鐘內(nèi)使用100％B-43％B的梯度，然后再用75分鐘時(shí)間達(dá)到0％B。將該最終條件再維持10分鐘，然后再重新平衡。在圖3A中給出了用未轉(zhuǎn)化對(duì)照所獲得的結(jié)果的例子，在圖3B中給出了用僅具有質(zhì)粒A的品系所獲得的結(jié)果，而在圖3C中給出了用具有質(zhì)粒A和B的品系獲得的結(jié)果。很明顯，在轉(zhuǎn)化體中積累了類(lèi)胡蘿卜素。所述對(duì)照有時(shí)表現(xiàn)出微量的類(lèi)胡蘿卜素，它可能在最大程度上是由于種子包衣所造成的，種子包衣難于徹底清除。在轉(zhuǎn)化種子中所檢測(cè)到的類(lèi)胡蘿卜素，β胡蘿卜素(前維生素A)是主要產(chǎn)物(高達(dá)60％)。另外，成葉黃素途徑是有效的，導(dǎo)致葉黃素和玉米黃質(zhì)的形成，以及某些數(shù)量的環(huán)氧化類(lèi)胡蘿卜素的形成。所得到的結(jié)論是，所述途徑的后一部分要么是由轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)的，要么是由源于該轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物誘導(dǎo)的。另外，所述成葉黃素途徑在水稻胚乳中是以組成型形式表達(dá)的，導(dǎo)致葉黃素玉米黃質(zhì)和葉黃素加上代表環(huán)氧化葉黃素的某些其他微量成分的形成。
原則上講，僅用質(zhì)粒A轉(zhuǎn)化過(guò)的品系表現(xiàn)出相同的類(lèi)胡蘿卜素特征，不過(guò)，類(lèi)胡蘿卜素的含量一般較低，因此，上述結(jié)論可以延伸到水稻胚乳中的番茄紅素環(huán)化酶上。
特別是葉黃素和玉米黃質(zhì)的存在，被視為具有出人意料的額外價(jià)值，因?yàn)樗哂姓嫘Ч?，例如，在視覺(jué)方面的效果(參見(jiàn)Brown等，1998；Schalch，1992)。
很顯然，根據(jù)以上說(shuō)明，可以對(duì)本發(fā)明作出多種改進(jìn)和改變。因此，應(yīng)當(dāng)理解的是，在所附權(quán)利要求書(shū)的范圍之內(nèi)，可以除上述具體說(shuō)明以外的方式實(shí)施本發(fā)明。普遍存在于植物材料中的前體香葉基香葉基二磷酸酯為了證實(shí)GGPP在除水稻以外的其他組織中的存在，以類(lèi)似于上述水稻胚乳的方法用從小麥的兩種實(shí)驗(yàn)室品種，大麥的兩種品種和Cavendish香蕉果實(shí)進(jìn)行培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。將未成熟的小麥和大麥谷粒去皮，取出胚乳，并除去胚胎。培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)是在存在0.5μCi[1-14C]異戊烯二磷酸酯的條件下在100mM Tris/HCl緩沖液pH7.4，10mM氯化鎂、1mM氯化錳、3mM ATP中，在25℃下進(jìn)行6小時(shí)。在每一個(gè)實(shí)驗(yàn)中添加堿性磷酸酶，以便所形成的異戊烯二磷酸酯進(jìn)行脫磷酸化。在3-6小時(shí)之后，通過(guò)用氯仿/甲醇(2/1，v/v)萃取，分離包括相應(yīng)的異戊二烯醇的脂溶性材料。然后按上述方法進(jìn)行HPLC分析。
在來(lái)自檢驗(yàn)過(guò)的小麥品種的胚乳中(兩個(gè)品種基本上都不含類(lèi)胡蘿卜素)，用真實(shí)的脫磷酸化GGPP(用來(lái)自白芥的重組GGPP合成酶產(chǎn)生的)觀察到了非常顯著的信號(hào)，證明它是香葉基香葉醇。因此，通過(guò)將前維生素A生物合成轉(zhuǎn)化到小麥中進(jìn)行安裝，與在水稻上一樣可行。在大麥中也觀察到了相應(yīng)醇形式的較少的，但是可檢測(cè)數(shù)量的GGPP。這是由于表達(dá)所產(chǎn)生的，即大麥胚乳表現(xiàn)出稍小背景的類(lèi)胡蘿卜素形成。類(lèi)似地，Cavendish香蕉產(chǎn)生了類(lèi)胡蘿卜素，因此，特別是在成熟狀態(tài)下觀察到形成GGPP活性的存在并不意外。
CPTA誘導(dǎo)類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因很早以前就已知的番茄紅素環(huán)化酶抑制劑CPTA(2-(4-氯苯基硫代)氯化三乙胺)及相關(guān)化合物(例如，參見(jiàn)El-Sayed Osman等，1984；Fosket和Radin1982)模擬物與用質(zhì)粒A進(jìn)行轉(zhuǎn)化的番茄紅素積累相關(guān)。為了證實(shí)類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因的上調(diào)，我們按照Scheutz和Baldwin(1957)披露的方法合成了CPTA，將該化合物的濃度為1mM水溶液施加到黃水仙花上。這種沒(méi)有光合作用活性的組織象預(yù)期的那樣產(chǎn)生了積累番茄紅素的反應(yīng)。不過(guò)，用CPTA(一種抑制劑)的主要作用無(wú)法解釋的是，類(lèi)胡蘿卜素的含量幾乎翻番。因此，進(jìn)行了Northern和Western印跡分析，以便證實(shí)對(duì)編碼類(lèi)胡蘿卜素生物合成酶的轉(zhuǎn)錄物的豐裕量或酶豐裕量的誘導(dǎo)。
圖5A提供了Northern印跡的結(jié)果。從未處理過(guò)的(泳道1)和CPTA處理過(guò)的花中分離總RNA。反復(fù)劃擦固定的RNA，以便隨后能與八氫番茄紅素合成酶(B)、八氫番茄紅素脫飽和酶(C)、ζ-胡蘿卜素脫飽和酶和番茄紅素環(huán)化酶的探針雜交。很顯然，除了ζ-胡蘿卜素脫飽和酶之外，包括番茄紅素環(huán)化酶在內(nèi)的所有特定胡蘿卜素發(fā)生RNA的含量都增加了。
為了進(jìn)行Western印跡分析(參見(jiàn)圖5B)，從未處理過(guò)的和用CPTA處理過(guò)的花中分離總蛋白，并在SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳(每個(gè)泳道30微克蛋白)之后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。讓所述印跡與抗八氫番茄紅素合成酶(A)、八氫番茄紅素脫飽和酶(B)、ζ-胡蘿卜素脫飽和酶(C)和番茄紅素環(huán)化酶的抗體一起培養(yǎng)。顯然，在蛋白水平上，在CPTA處理中出現(xiàn)了酶豐度的增加。
通過(guò)上面所提供的水稻的數(shù)據(jù)我們可以得出結(jié)論，類(lèi)胡蘿卜素(或其衍生產(chǎn)物)能夠以遺傳學(xué)方式，以反饋機(jī)制形式誘導(dǎo)類(lèi)胡蘿卜素的形成。
因此，本發(fā)明提供了通過(guò)遺傳工程將類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑導(dǎo)入不含類(lèi)胡蘿卜素的組織中，或提高現(xiàn)有類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑產(chǎn)量的方法。該方法可用于改善營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、改善種子、果實(shí)、塊莖、花或葉子的藥理學(xué)價(jià)值和外觀。
本發(fā)明主要用于改善營(yíng)養(yǎng)要求，其中，并非特別與產(chǎn)生大量類(lèi)胡蘿卜素相關(guān)。例如，磨過(guò)的稻米包括胚乳，它不含有可檢測(cè)的有色類(lèi)胡蘿卜素。存在于種子包衣中的類(lèi)胡蘿卜素在加工期間被除去了。該工藝是長(zhǎng)期儲(chǔ)存稻米谷物所必需的。
本發(fā)明是從頭工程產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑的第一個(gè)例子，并可應(yīng)用于在農(nóng)藝上有重要價(jià)值的不含類(lèi)胡蘿卜素的農(nóng)作物的其他組織上。例如，不含有色的或無(wú)色的類(lèi)胡蘿卜素的其他谷類(lèi)種子，根組織。它并不排除該方法在增加或改變現(xiàn)有類(lèi)胡蘿卜素方面的潛在用途。
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1.一種分離的DNA分子，包括具有一個(gè)或多個(gè)表達(dá)框的核苷酸序列，所述表達(dá)框能夠指導(dǎo)選自下列一組的類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑所特有的一種或多種酶產(chǎn)生-源于植物、真菌、或細(xì)菌的八氫番茄紅素合成酶，-源于植物、真菌、或細(xì)菌的八氫番茄紅素脫飽和酶，-源于植物的ζ-胡蘿卜素脫飽和酶，和-源于植物、真菌、或細(xì)菌的番茄紅素環(huán)化酶，其前提是，排除了僅能指導(dǎo)八氫番茄紅素合成酶產(chǎn)生的表達(dá)框。
2.如權(quán)利要求1的DNA分子，其中，所述表達(dá)框包括一個(gè)或多個(gè)編碼植物、真菌或細(xì)菌八氫番茄紅素合成酶，植物、真菌或細(xì)菌八氫番茄紅素脫飽和酶，植物ζ-胡蘿卜素脫飽和酶，或植物、真菌、或細(xì)菌的番茄紅素環(huán)化酶的基因或cDNA，所述基因各自可操作地與合適的組成型、誘導(dǎo)型、或組織專(zhuān)一型啟動(dòng)子連接，使其能在植物細(xì)胞、種子、組織或全植株中表達(dá)，其前提是，排除了僅包括編碼八氫番茄紅素合成酶的基因或cDNA的表達(dá)框。
3.如權(quán)利要求1或2的DNA分子，還包括至少一個(gè)可操作地連接于能使其在植物細(xì)胞、種子、組織或全植株中表達(dá)的組成型、誘導(dǎo)型或組織專(zhuān)一型啟動(dòng)子上的選擇標(biāo)記基因或cDNA。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的DNA分子，其中，所述編碼八氫番茄紅素合成酶的核苷酸序列源于植物，優(yōu)選在組織專(zhuān)一型啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的DNA分子，其中，所述編碼八氫番茄紅素脫氫酶的核苷酸序列源于細(xì)菌并且與合適的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼序列融合，這兩個(gè)序列優(yōu)選在組織專(zhuān)一型或組成型啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的DNA分子，其中，所述編碼源于植物的番茄紅素環(huán)化酶的核苷酸序列優(yōu)選是在組織專(zhuān)一型或組成型啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。
7.如權(quán)利要求2-6中任一項(xiàng)的DNA分子，其中，所述選擇標(biāo)記基因或cDNA是受組成型啟動(dòng)子控制的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的DNA分子，其中，所述核苷酸序列包括編碼八氫番茄紅素合成酶和細(xì)菌或真菌八氫番茄紅素脫飽和酶的功能性表達(dá)框。
9.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的DNA分子，其中，所述核苷酸序列包括編碼番茄紅素環(huán)化酶的功能性表達(dá)框。
10.如權(quán)利要求5或8的DNA分子，其中，所述質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列源于豌豆Rubisco小亞基(tp)。
11.一種包括一個(gè)或多個(gè)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的DNA分子的質(zhì)?；蜉d體系統(tǒng)。
12.如權(quán)利要求11的質(zhì)?；蜉d體系統(tǒng)，它源于根癌農(nóng)桿菌。
13.含有權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述DNA分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、種子、組織或全植株。
14.如權(quán)利要求13的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、種子、組織或全植株，選自下列一組真核藻類(lèi)，有胚植物，包括苔蘚植物、蕨類(lèi)植物、和種子植物，如裸子植物和被子植物，后者包括Magnoliopsida，Rosopsida、Liliopsida(單子葉植物)。
15.如權(quán)利要求14的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、種子、組織或全植株，選自下列一組谷類(lèi)種子，優(yōu)選水稻、小麥、大麥、燕麥、莧、亞麻、黑小麥、黑麥、和玉米；油用種子，優(yōu)選蕓薹種子、棉籽、大豆、紅花、向日葵、椰子果、和棕櫚；其他食用種子或具有可食用部分的種子，選自南瓜、西葫蘆、芝麻、罌粟、葡萄、綠豆、花生、豌豆、菜豆、蘿卜、苜蓿、可可、咖啡、大麻；樹(shù)木堅(jiān)果，優(yōu)選胡桃、杏、大胡桃、鷹嘴豆；馬鈴薯、胡蘿卜、甘薯、番茄、辣椒、木薯、柳樹(shù)、橡樹(shù)、榆樹(shù)、楓樹(shù)、蘋(píng)果、香蕉；以及觀賞花卉，優(yōu)選百合、蘭花、蘆葦、薔薇、毛茛、矮牽牛、草夾竹桃、紫羅蘭、和向日葵。
16.一種轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、種子、組織或全植株以便產(chǎn)生能夠表達(dá)產(chǎn)生感興趣的胡蘿卜素或葉黃素所必需的類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑的所有酶的轉(zhuǎn)化體的方法，包括用一種或多種如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述DNA分子或用權(quán)利要求1或11所述的質(zhì)?；蜉d體系統(tǒng)轉(zhuǎn)化所述植物細(xì)胞、種子、組織或全植株。
17.如權(quán)利要求16的方法，其中，被選擇用于轉(zhuǎn)化的宿主植物細(xì)胞、種子或組織正常情況下是不含類(lèi)胡蘿卜素的。
18.如權(quán)利要求16的方法，其中，被選擇用于轉(zhuǎn)化的所述宿主植物細(xì)胞、種子或組織正常情況下含有希望增加或改變量的類(lèi)胡蘿卜素。
19.由權(quán)利要求16-18中任一項(xiàng)所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體再生的轉(zhuǎn)化全植株或其部分，選自下列一組真核藻類(lèi)，有胚植物，包括苔蘚植物、蕨類(lèi)植物、和種子植物，如裸子植物和被子植物，后者包括Magnoliopsida，Rosopsida、Liliopsida(單子葉植物)。
20.如權(quán)利要求19的轉(zhuǎn)化過(guò)的全植株或其部分，選自下列一組谷類(lèi)種子，優(yōu)選水稻、小麥、大麥、燕麥、莧、亞麻、黑小麥、黑麥、和玉米；油用種子，優(yōu)選蕓薹種子、棉籽、大豆、紅花、向日葵、椰子果、和棕櫚；其他食用種子或具有可食用部分的種子，選自南瓜、西葫蘆、芝麻、罌粟、葡萄、綠豆、花生、豌豆、菜豆、蘿卜、苜蓿、可可、咖啡、大麻；樹(shù)木堅(jiān)果，優(yōu)選胡桃、杏、大胡桃、鷹嘴豆；馬鈴薯、胡蘿卜、甘薯、番茄、辣椒、木薯、柳樹(shù)、橡樹(shù)、榆樹(shù)、楓樹(shù)、蘋(píng)果、香蕉；以及觀賞花卉，優(yōu)選百合、蘭花、蘆葦、薔薇、毛茛、矮牽牛、草夾竹桃、紫羅蘭、和向日葵。
全文摘要
本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、種子、組織或全植株以便產(chǎn)生能夠表達(dá)類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑的所有酶的轉(zhuǎn)化體的裝置和方法,這些酶是目標(biāo)宿主植物積累感興趣的胡蘿卜素和/或葉黃素所必需的。本發(fā)明還提供了為了適用于實(shí)施本發(fā)明方法而設(shè)計(jì)的DNA分子,以及包括所述分子的質(zhì)粒和載體系統(tǒng)。另外,本發(fā)明提供了具有改善了的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)、并含有所述DNA分子的和/或用本發(fā)明方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、種子、組織和全植株。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1347454SQ00804609
公開(kāi)日2002年5月1日 申請(qǐng)日期2000年3月3日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月5日
發(fā)明者P·貝耶, I·波特賴庫(kù)斯 申請(qǐng)人:格林諾瓦森植物生物技術(shù)股份有限公司