專利名稱：一種殼聚糖微球固定化脂肪酶制備工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物化工技術領域，涉及殼聚糖微球固定化脂肪酶的制備工藝。(二) 背景技術殼聚糖是一種N-脫乙?；咸烟蔷酆衔?，來源豐富，價格便宜，是甲殼素最重 要的衍生物。殼聚糖具有無毒性、良好凝膠性、生物兼容性、蛋白質親和性和金屬 離子螯合特性，是良好的固定化酶載體。以殼聚糖為載體的固定化酶種類有很多， 如胃蛋白酶、葡萄糖氧化酶、L-天門冬酰胺酶、p-甘露聚糖酶等。以天然殼聚糖為載體固定化酶主要缺陷是因在偏酸條件下發(fā)生溶解，使固定化酶難以回收，其中 大部分為粉末狀，載體流速差，表面積小，限制其應用。因此目前的國內外研究主 要集中在制備殼聚糖微球作為固定化酶載體，該載體具有吸附性能強，耐酸耐堿性 能好等特性，從而克服了上述缺陷，是酶固定化的良好載體。脂肪酶作為生物催化劑催化反應條件溫和，產物顏色淺，副產物少且具有專一 性，利于生產高質量的單甘酯、脂肪酸、甘油和其他種類的油脂產物，在工業(yè)上應 用廣泛。尤其是近年來在油脂生產中的應用，對生產綠色環(huán)保燃料，建設環(huán)境友好 型社會，解決我國日益嚴重的能源問題，有著重要的現(xiàn)實意義和經濟效益。但脂肪 酶的價格較高，用游離脂肪酶進行反應時，脂肪酶只能使用一次而不能回收，因此 造成產物成本較高且導致后續(xù)分離步驟困難，影響了脂肪酶在工業(yè)上的具體應用。 通過對脂肪酶進行固定化，固定化酶在保持高效、專一及溫和的酶催化反應特性的 同時，還呈現(xiàn)貯存穩(wěn)定性高、分離回收容易、可多次重復使用、操作連續(xù)及可控、 工藝簡便等一系列優(yōu)點，大大提高了生產效益。以殼聚糖微球為載體固定化脂肪酶的研究近年來備受關注。Tien-ChiehHung等 人利用磁性殼聚糖微球固定化脂肪酶，酶活力達13.8U/g; Shao-HuaChiou通過兩種 殼聚糖微球來制備固定化脂肪酶，酶活回收率分別為75%和85%;吳茜茜等人研究 了殼聚糖吸附和戊二醛交聯(lián)對脂肪酶固定化條件，對德氏根霉脂肪酶進行固定，并 將該固定化酶用于酯的合成；陳盛等人以蟹殼為原料提取殼聚糖，用戊二醛作交聯(lián)
劑，將堿性脂肪酶固定于殼聚糖上；彭立鳳等人研究了殼聚糖涂層在纖維素濾紙上 成膜后再固定化豬胰脂肪酶的最佳條件。我國目前大多采用單一方法固定，如吸附法或交聯(lián)法單一固定化脂肪酶，由于 載體形狀的不規(guī)則性，固定化酶活力回收率普遍較低(36%-50%)及固定化酶對底物 的親和力低等不足之處限制了固定化脂肪酶的應用。針對此，我們以殼聚糖微球為 固定化載體，先后利用殼聚糖分子上的羥基和氨基，采用戊二醛和碳二亞胺兩次復 合固定脂肪酶，提高固定化酶活力。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提供一種殼聚糖微球固定化脂肪酶制備工藝。 為達到本發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案如下一種殼聚糖微球固定化脂肪酶的制備工藝，其特征在于所述的工藝按如下步驟進行(l)用戊二醛為交聯(lián)劑制備固定化脂肪酶A:將假絲酵母脂肪酶溶于磷酸鹽緩沖液 a中以殼聚糖微球為載體、采用戊二醛交聯(lián)，制備得戊二醛交聯(lián)固定化的脂肪酶 A;(2)用乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽活化固定化的脂肪酶A制備固定 化脂肪酶B:在用pH值為6. 5 7. 5磷酸鹽緩沖液b配制的0. 70 0. 80mg/mL假絲酵 母脂肪酶溶液中，加入固定化的脂肪酶A，所述的固定化的脂肪酶A的終濃度為 0.005 0.0055g/ml，攪拌均勻后，再加入乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽 酸鹽溶液，攪拌3 8小時，使其充分固定，用去離子水沖洗，過濾，濾餅干燥得 殼聚糖微球固定化脂肪酶B。本發(fā)明所述步驟(l)為用pH值為6. 5 7. 5磷酸鹽緩沖液a配制的0. 75mg/mL 的假絲酵母脂肪酶溶液中，加入殼聚糖微球，所述的殼聚糖微球的終濃度為0.005 0.0055g/ml，攪拌均勻后，再加入戊二醛溶液，使戊二醛的終濃度為2.0% 2.5%(g/ml)，續(xù)攪拌5 7時后，使其充分固定，用去離子水沖洗，過濾，濾餅干燥， 即得所述殼聚糖微球固定化脂肪酶A。本發(fā)明步驟(l)中所述的殼聚糖微球有80%以上的微球的粒徑在50 200nm。 本發(fā)明步驟(l)中所述的殼聚糖微球按如下方法制備稱取殼聚糖溶于體積分數 為2%的乙酸溶液，制得質量分數為2. 5%的殼聚糖酸性溶膠，在攪拌下，將所述的殼 聚糖酸性溶膠緩慢加入到液體石蠟和司盤-80的混合液中，所述的液體石蠟的加入量 為80mL/g殼聚糖，所述的的司盤-80的加入量為5mL/g殼聚糖，攪拌使溶膠液滴均勻 分散，然后加入體積分數為25%二醛溶液，所述的戊二醛溶液的加入量為10mL/g殼 聚糖，攪拌均勻，調pH至9 10，于7(TC水浴保溫2 4小時，靜置冷卻后，棄去油 層，再依次用石油醚、丙酮、無水乙醇浸洗，過濾后，慮餅ot:真空干燥，得到殼聚 糖微球。本發(fā)明所述的磷酸鹽緩沖液a或磷酸鹽緩沖液b各自獨立為Na2HP04-KH2P04、 Na2HP04-NaH2PO^ K2HP04-KH2P04。本發(fā)明步驟(l)中所述加入的戊二醛溶液的濃度為25M(g/ml)。 本發(fā)明步驟(2)中所述加入的乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽溶液的濃度 為0.2%(g/ml)。本發(fā)明所述的制備工藝具體按如下步驟進行a) 用pH值為7的Na2HP0廠KH2P04緩沖液配制的0. 75mg/mL的假絲酵母脂肪酶 (C朋力Va7 "gasa)溶液中，加入殼聚糖微球，所述的殼聚糖微球的終濃度為 0.005 0.0055g/ml，攪拌均勻后，再加入25%(g/ml)的戊二醛溶液，使戊二 醛的終濃度為2.2W(g/ml),繼續(xù)攪拌5 7時，使其充分固定，用去離子水 沖洗，過濾，濾餅干燥，即得所述殼聚糖微球固定化脂肪酶A;b) 用乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽活化固定化的脂肪酶A制備固定 化脂肪酶B:在用pH值為7的Na2HP04-KH2P04緩沖液配制的0. 70 0. 80mg/mL 的假絲酵母脂肪酶(Om^/a^goya)溶液中，加入固定化的脂肪酶A，所述的 固定化的脂肪酶A的終濃度為0.005 0.0055g/ml，攪拌均勻后，再加入乙 基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽溶液，振蕩6h，使其充分固定，用去 離子水沖洗，過濾，濾餅干燥得殼聚糖微球固定化脂肪酶B。本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在1)利用殼聚糖微球羥基和氨基先后兩次固定化脂 肪酶，提高了酶蛋白的結合率和活力回收率(62.5%)，固定化酶活力達835U/g載 體，比活力達34.9U/mg蛋白。2)利用本發(fā)明方法制得的殼聚糖微球固定化酶制 備油酸乙酯，反應8h后，油酸乙酯轉化率達到68.4%。殼聚糖微球固定化酶循環(huán)使 用次數達6次，降低了游離酶的反應成本。
具體實施方式
以下以具體實施例來說明本發(fā)明的技術方案，但本發(fā)明的保護范圍不限于 此。實施例中脂肪酶為假絲酵母脂肪酶C朋力由n^oM. 1個酶活力單位定義為在 37°C， pH7.2時，在l分鐘內水解橄欖油中l(wèi)微摩爾脂肪酸的量。我們使用的是美 國sigma公司商品酶type VII粗酶。實施例l.殼聚糖微球的制備稱取lg殼聚糖溶于體積分數為2。/。的乙酸溶液，制得質量分數為2.5%的殼聚糖酸 性溶膠。在攪拌下，將上述溶膠緩慢加入至iJ80mL液體石蠟和5mLSpan-80的混合液 中，攪拌20min，使溶膠液滴均勻分散，然后加入10mL體積分數為25y。戊二醛溶液， 攪拌10min后，用lmol/L的NaOH溶液將其pH調至9，于7(TC水浴保溫3h，靜置冷卻 后，棄去上層油層，再依次用石油醚、丙酮、無水乙醇浸洗，50'C真空干燥，得到 殼聚糖微球。實施例2.戊二醛為交聯(lián)劑制備固定化脂肪酶稱取0.50g殼聚糖微球，加入pH-7的Na2HP04-KH2P04緩沖液配制的0.75mg/mL 的假絲酵母脂肪酶(Ow^^i wg(wfl)溶液100mL，使殼聚糖微球終濃度0.005g/ml，室 溫下攪拌lh。接著加入25y。濃度的戊二醛溶液ll.lmL,使戊二醛終濃度為2.5%￡/1111， 繼續(xù)攪拌6h，充分交聯(lián)，用去離子水反復沖洗3遍，過濾，干燥即得固定化脂肪酶。 該固定化酶活力達473U/g載體，比活力達22.1U/mg蛋白，活力回收率達38.1%。實施例3.用乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽活化再次制備固定化脂肪酶稱取0.50g步驟2中的戊二醛固定的殼聚糖微球脂肪酶浸于100mL體積0.75 mg/tnL的脂肪酶液(pH-7)中，使戊二醛固定的殼聚糖微球脂肪酶濃度為0.005 g/ml， 攪拌lh。然后加入25mL乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽溶液(0.2%)，使乙 基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽濃度為0.04。/。g/ml，繼續(xù)振蕩6h，使其充分固 定，用去離子水反復沖洗3遍，過濾，干燥即得殼聚糖微球固定化脂肪酶，固定化酶 活力達813U/g載體，比活力達35.3U/mg蛋白，活力回收率達60.2%。實施例4.固定化酶應用于油酸乙酯的合成 稱取3g油酸加入至Ul0m該U度試管中，加入水3mL和乙醇3mL，之后向反應體系 中加入殼聚糖微球固定化酶0.4g，反應溫度47'C，反應8h后，油酸乙酯轉化率達到 68.4%。殼聚糖微球固定化酶循環(huán)使用次數達6次，油酸乙酯轉化率從68.4%降至32%。實施例5.殼聚糖微球的制備稱取^殼聚糖溶于體積分數為2%的乙酸溶液，制得質量分數為2.5%的殼聚糖酸 性溶膠。在攪拌下，將上述溶膠緩慢加入到80mL液體石蠟和5mLSpan-80的混合液 中，攪拌20min，使溶膠液滴均勻分散，然后加入10mL體積分數為25。/。戊二醛溶液， 攪拌10min后，用lmol/L的NaOH溶液將其pH調至10，于70"C水浴保溫3h，靜置冷卻 后，棄去上層油層，再依次用石油醚、丙酮、無水乙醇浸^fe， 5(TC真空干燥，得到 殼聚糖微球。實施例6.戊二醛為交聯(lián)劑制備固定化脂肪酶稱取0.525g殼聚糖微球，加入pt^6.5的Na2HP04-NaH2P04緩沖液配制的 0.75mg/mL的假絲酵母脂肪酶(Om^fo及wgosa)溶液100mL，使殼聚糖微球終濃度 0.00525g/ml，室溫下攪拌lh。接著加入25。/。濃度的戊二醛溶液8.7mL，使戊二醛終 濃度為2.0。/。g/ml，繼續(xù)攪拌5h，充分交聯(lián)，用去離子水反復沖洗3遍，過濾，干燥 即得固定化脂肪酶。該固定化酶活力達468U/g載體，比活力達20.2U/mg蛋白，活力 回收率達36.4%。實施例7.用乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽活化再次制備固定化脂肪酶 稱取0.525g步驟2中的戊二醛固定的殼聚糖微球脂肪酶浸于100mL體積0.70 mg/mL的脂肪酶液(pH-6.5)中，使戊二醛固定的殼聚糖微球脂肪酶濃度為0.005 25g/ml，攪拌lh。然后加入25mL乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽溶液(0.2。/0)， 使乙基[3-口甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽濃度為0,04n/。g/ml，繼續(xù)振蕩5h，使其充 分固定，用去離子水反復沖洗3遍，過濾，干燥即得殼聚糖微球固定化脂肪酶，固定 化酶活力達814U/g載體，比活力達31.8U/mg蛋白，活力回收率達61.2%。實施例8.固定化酶應用于油酸乙酯的合成稱取3g油酸加入到10m該lj度試管中，加入水3mL和乙醇3mL，之后向反應體系
中加入殼聚糖微球固定化酶(^40g,反應溫度47。C,反應8h后，油酸乙酯轉化率達到 67.1%。殼聚糖微球固定化酶循環(huán)使用次數達6次，油酸乙酯轉化率從67.1%降至 32.6%。實施例9.殼聚糖微球的制備稱取lg殼聚糖溶于體積分數為2。/。的乙酸溶液，制得質量分數為2.5。/。的殼聚糖酸 性溶膠。在攪拌下，將上述溶膠緩慢加入到80mL液體石蠟和5mLSpan-80的混合液 中，攪拌20min，使溶膠液滴均勻分散，然后加入10mL體積分數為25。/。戊二醛溶液， 攪拌10min后，用lmol/L的NaOH溶液將其pH調至9.5，于7(TC水浴保溫3h，靜置冷 卻后，棄去上層油層，再依次用石油醚、丙酮、無水乙醇浸洗，5(TC真空干燥，得 到殼聚糖微球。實施例IO.戊二醛為交聯(lián)劑制備固定化脂肪酶稱取0.55g殼聚糖微球，加入pI^7.5的K2HP04-KH2P04緩沖液配制的0.75mg/mL的假 絲酵母脂肪酶(Cam/Wa 7 "gOM)溶液100mL，使殼聚糖微球終濃度0.0055g/ml室溫下 攪拌lh。接著加入25o/。濃度的戊二醛溶液9.5mL，使戊二醛終濃度為2.17% g/ml，繼 續(xù)攪拌7h，充分交聯(lián)，用去離子水反復沖洗3遍，過濾，干燥即得固定化脂肪酶。該 固定化酶活力達482U/g載體，比活力達21.3U/mg蛋白，活力回收率達37.9%。實施例11.用乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽活化再次制備固定化脂肪酶稱取0.55g步驟2中的戊二醛固定的殼聚糖微球脂肪酶浸于100mL體積0.80 mg/mL的脂肪酶液(pP^7.5)中，使戊二醛固定的殼聚糖微球脂肪酶濃度為0.005 5g/ml，攪拌lh。然后加入25mL乙基[3-(:Z甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽溶液(0.20/0), 使乙基[3-口甲胺萄丙基]碳二亞胺鹽酸鹽濃度為0.0f/。(g/ml)，繼續(xù)振蕩7h，使其充 分固定，用去離子水反復沖洗3遍，過濾，干燥即得殼聚糖微球固定化脂肪酶，固定 化酶活力達835U/g載體，比活力達34.9U/mg蛋白，活力回收率達62.5%。實施例12.固定化酶應用于油酸乙酯的合成稱取3g油酸加入到10m該ij度試管中，加入水3mL和乙醇3mL，之后向反應體系 中加入殼聚糖微球固定化酶0.40g，反應溫度47。C，反應8h后，油酸乙酯轉化率達到66.8%。殼聚糖微球固定化酶循環(huán)使用次數達6次，油酸乙酯轉化率從66.8%降至 34.2%。
權利要求
1.一種殼聚糖微球固定化脂肪酶的制備工藝，其特征在于所述的工藝按如下步驟進行(1)用戊二醛為交聯(lián)劑制備固定化脂肪酶A將假絲酵母脂肪酶溶于磷酸鹽緩沖液a中，以殼聚糖微球為固定化載體，采用戊二醛交聯(lián)，制備得戊二醛交聯(lián)固定化的脂肪酶A；(2)用乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽活化固定化的脂肪酶A制備固定化脂肪酶B在用pH值為6.5～7.5磷酸鹽緩沖液b配制的0.70～0.80mg/mL假絲酵母脂肪酶溶液中，加入固定化的脂肪酶A，所述的固定化的脂肪酶A的終濃度為0.005～0.0055g/ml，攪拌均勻后，再加入乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽溶液，攪拌3～8小時，使其充分固定，用去離子水沖洗，過濾，濾餅干燥得殼聚糖微球固定化脂肪酶B。
2. 如權利要求1所述的殼聚糖微球固定化脂肪酶的制備工藝，其特征在于所述 步驟(l)為用pH值為6. 5 7. 5磷酸鹽緩沖液a配制的0. 75mg/mL的假絲 酵母脂肪酶溶液中，加入殼聚糖微球，所述的殼聚糖微球的終濃度為0. 005 0.0055g/ml，攪拌均勻后，再加入戊二醛溶液，使戊二醛的終濃度為2. 0% 2.5%(g/ml)，繼續(xù)攪拌5 7時后，使其充分固定，用去離子水沖洗，過濾， 濾餅干燥，即得所述殼聚糖微球固定化脂肪酶A。
3. 如權利要求1或2所述的殼聚糖微球固定化脂肪酶的制備工藝，其特征在于 所述步驟(l)中所述的殼聚糖微球有80%以上的微球的粒徑在50 200nm。
4. 如權利要求1或2所述的殼聚糖微球固定化脂肪酶的制備工藝，其特征在于 所述步驟(l)中所述的殼聚糖微球按如下方法制備稱取殼聚糖溶于體積分 數為2%的乙酸溶液，制得質量分數為2. 5%的殼聚糖酸性溶膠，在攪拌下， 將所述的殼聚糖酸性溶膠緩慢加入到液體石蠟和司盤-80的混合液中，所述 的液體石蠟的加入量為80mL/g殼聚糖，所述的的司盤-80的加入量為5mL/g 殼聚糖，攪拌使溶膠液滴均勻分散，然后加入體積分數為25%戊二醛溶液， 所述的戊二醛溶液的加入量為10mL/g殼聚糖，攪拌均勻，調pH至9 10， 于70'C水浴保溫2 4小時，靜置冷卻后，棄去油層，再依次用石油醚、丙 酮、無水乙醇浸洗，過濾后，慮餅0。C真空干燥，得到殼聚糖微球。
5. 如權利要求1或2所述殼聚糖微球固定化脂肪酶的制備工藝，其特征在于所 述的磷酸鹽緩沖液a或磷酸鹽緩沖液b各自獨立為Na2HP04-KH2P04、 Na2HP04-NaH2P04或K2HP04-KH2P04。
6. 如權利要求2所述殼聚糖微球固定化脂肪酶的制備工藝，其特征在于所述步 驟(1)中加入的戊二醛溶液的濃度為25% (g/ml)。
7. 如權利要求2所述殼聚糖微球固定化脂肪酶的制備工藝，其特征在于所述步 驟(2)中加入的乙基[3- (二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽溶液的濃度為0. 2%(g/ml)。
8. 如權利要求2所述殼聚糖微球固定化脂肪酶的制備工藝，其特征在于所述的 制備工藝按如下步驟進行a) 用pH值為7的Na2HP0rKH2P04緩沖液配制的0. 75mg/raL的假絲酵母脂肪 酶溶液中，加入殼聚糖微球，所述的殼聚糖微球的終濃度為0.005 0.0055g/ml，攪拌均勻后，再加入25% (g/ml)的戊二醛溶液，使戊二醛 的終濃度為2.2%( g/ml)，繼續(xù)攪拌5 7時，使其充分固定，用去離子 水沖洗，過濾，濾餅干燥，即得所述殼聚糖微球固定化脂肪酶A;b) 用乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽活化固定化的脂肪酶A制備固定化脂肪酶B:在用pH值為7的Na2HP04-1(貼04緩沖液配制的0. 70 0.80mg/mL的假絲酵母脂肪酶溶液中，加入固定化的脂肪酶A，所述的固 定化的脂肪酶A的終濃度為0.005~0.0055g/ral,攪拌均勻后，再加入乙 基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽溶液，振蕩6h，使其充分固定， 用去離子水沖洗，過濾，濾餅干燥得殼聚糖微球固定化脂肪酶B。
全文摘要
一種殼聚糖微球固定化脂肪酶的制備工藝(1)將假絲酵母脂肪酶溶于磷酸鹽緩沖液a中，以殼聚糖微球為固定化載體，采用戊二醛交聯(lián)，制備得戊二醛交聯(lián)固定化的脂肪酶A；(2)在用pH值為6.5～7.5磷酸鹽緩沖液b配制的0.70～0.80mg/mL假絲酵母脂肪酶溶液中，加入固定化的脂肪酶A(終濃度為0.005～0.0055g/ml)，攪拌均勻后，再加入乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽溶液，攪拌，使其充分固定，處理后得殼聚糖微球固定化脂肪酶B。利用本發(fā)明方法制備殼聚糖微球固定化酶，提高了酶蛋白的結合率和活力回收率高，固定化酶活力、比活力強，可循環(huán)使用次數達6次。
文檔編號C12N9/18GK101113433SQ200710069820
公開日2008年1月30日 申請日期2007年6月29日 優(yōu)先權日2007年6月29日
發(fā)明者孫培龍, 孟祥河, 平 邵 申請人:浙江工業(yè)大學