專利名稱：植物中外源基因的瞬時(shí)表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為一種植物中外源基因的表達(dá)方法，具體涉及一種根部吸收法。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，隨著利用植物來(lái)表達(dá)外源蛋白的發(fā)展，許多研究者開始了在植物中利用病毒 載體來(lái)進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)外源基因，其實(shí)用價(jià)值和開發(fā)前景己獲得普遍的肯定。利用植物生產(chǎn) 的一些藥用蛋白，疫苗，抗體等已經(jīng)用于臨床實(shí)踐階段，利用植物生產(chǎn)外源蛋白越來(lái)越顯 出其重要意義。目前，人們普遍使用葉片注射法來(lái)進(jìn)行外源基因的瞬時(shí)表達(dá)，其缺點(diǎn)是難 以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，從而影響了其在生產(chǎn)上的推廣應(yīng)用。
在過(guò)去的二十年中，大量研究表明植物能夠有效表達(dá)許多外源蛋白，包括人的血清蛋 白，生長(zhǎng)因子，抗體，疫苗等。利用植物生產(chǎn)外源蛋白主要有兩種方式，即穩(wěn)定表達(dá)和瞬 時(shí)表達(dá)。瞬時(shí)表達(dá)具有快速，安全，有效等優(yōu)點(diǎn)，因此，近些年來(lái)逐漸成為國(guó)內(nèi)外的研究 熱點(diǎn)。幾個(gè)植物病毒載體已經(jīng)被發(fā)展為能夠成功表達(dá)外源蛋白的載體，包括煙草花葉病毒， 馬鈴薯X病毒，煙草脆裂病毒(TMV， PVX和TRV)等。
現(xiàn)在普遍用于瞬時(shí)表達(dá)外源蛋白的方法有葉片注射法和真空吸收法，但這兩種方法都 有其局限性，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種植物中外源基因的瞬時(shí)表達(dá)方法 實(shí)驗(yàn)材料
植物材料包括煙草Nb和Nb-Hc-Pro基因型，Nb-Hc-Pro為表達(dá)轉(zhuǎn)錄后基因沉默抑制 子Hc-Pro的轉(zhuǎn)基因煙草植物。將Nb和Nb-Hc-Pro的種子播種于1/2MS培養(yǎng)基(網(wǎng)上 査得)，放于光照培養(yǎng)箱，培養(yǎng)一周左右。將小苗移栽于花盆中，在25±3°。的溫度條件 下，每天光照16h和黑暗8h的循環(huán)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，生長(zhǎng)28-35天左右，分別選取處于四 葉期，五葉期和六葉期的小苗作為侵染材料。 載體和菌種
原始載體p35S-30B-GFP (如圖1)由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所植物生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室 公開提供，EHA105-30B-GFP載體由本實(shí)驗(yàn)室以常規(guī)方法構(gòu)建。農(nóng)桿菌EHA105由本實(shí)驗(yàn) 室儲(chǔ)備(可以在市場(chǎng)購(gòu)買到)。綠色熒光蛋白(GFP)純化蛋白可以在市場(chǎng)購(gòu)買到。兔源綠 色熒光蛋白(GFP)抗體購(gòu)買于寶生物公司。
農(nóng)桿菌侵染液
將農(nóng)桿菌EHA服-30B-GFP放于5ml LB中(添加5ul的50ug/ml卡那霉素，5ul的 50ug/ml利福平，5ul的5ug/ml四環(huán)素)，28'C條件下過(guò)夜培養(yǎng)，，然后將lml過(guò)夜的培養(yǎng) 物按照1: 50的比例進(jìn)行擴(kuò)搖U80r/min)。 50mlLB中加入以上抗生素各50ul后，添加 Mes 10mol/L (PH5.6)和AS 20mol/L。 28。C條件下過(guò)夜，農(nóng)桿菌培養(yǎng)液在3000r/min， 4 ""C條件下離心收集菌體，然后重懸于重懸液MMA(10mmol/L Mgcl2，10mmol/L Mes，100umol/L AS。分別選擇重懸液MMA OD600為0.58，0.82，1.05,1.25,1.41，1.62的濃度進(jìn) 行侵染，在侵染前靜置3h。 實(shí)驗(yàn)方法
根部吸收法
取4-5ml的農(nóng)桿菌EHA朋-30B-GFP重懸液，盛放于5ml離心管中，然后分別將四葉 期，五葉期和六葉期的帶根小苗的根部直接放入重懸液中，最后將浸染材料在室溫28'C， 日光、燈光照射16h或黑暗8h中培養(yǎng)，并在紫外燈照射條件下進(jìn)行連續(xù)一周的觀察并拍照。 對(duì)表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的植株分別提取植物總RNA和總可溶性蛋白，進(jìn)行RT-PCR 水平和蛋白水平(Western-Blot)上的檢測(cè)。
本發(fā)明具有操作過(guò)程簡(jiǎn)單，容易規(guī)?；?，具有較高的表達(dá)水平等優(yōu)點(diǎn)。將有利于在植 物中進(jìn)行藥用蛋白的大規(guī)模的生產(chǎn)、推廣和應(yīng)用。


附圖1為p35S-30B-GFP載體附圖2為不同菌液濃度對(duì)表達(dá)效率影響的示意附圖3為不同苗齡的小苗對(duì)表達(dá)效率影響的示意附圖4為干旱處理對(duì)表達(dá)效率影響的示意圖
具體實(shí)施例方式
實(shí)例一
在非去根處理實(shí)驗(yàn)中，以Nb-HC-Pro植株五葉期的小苗作為宿主材料。將Nb-Hc-Pro
的種子播種于1/2MS培養(yǎng)基(網(wǎng)上査得)，放于光照培養(yǎng)箱，培養(yǎng)一周左右。將小苗移栽
于花盆中，在:25土3。C的溫度條件下，每天光照16h和黑暗8h的循環(huán)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，
取生長(zhǎng)30天左右的小苗做侵染。當(dāng)采用菌液重懸液(MMA) OD6G()=1.23時(shí)進(jìn)行侵染，綠
色熒光蛋白(GFP)表達(dá)的效率達(dá)到了 100%;當(dāng)侵染菌液濃度較低時(shí)(MMAOD6oo-0.58)，
其表達(dá)效率降低50% (如圖2)。表達(dá)效率由具有綠色熒光現(xiàn)象表型的植株占總株數(shù)的百分
比決定。 實(shí)例二
在非去根處理實(shí)驗(yàn)中，采用菌液重懸液(MMAOD6W)=1.2時(shí))進(jìn)行侵染。將Nb-Hc-Pro 的種子播種于1/2MS培養(yǎng)基(網(wǎng)上査得)，放于光照培養(yǎng)箱，培養(yǎng)一周左右。將小苗移栽 于花盆中，在25土3X:的溫度條件下，每天光照16h和黑暗8h的循環(huán)條件下進(jìn)行培養(yǎng)， 生長(zhǎng)28~35天左右的小苗作為侵染材料。以Nb-HC-Pro植株四葉期的小苗(移栽后生長(zhǎng) 28天)作為宿主材料，綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)的效率達(dá)到了卯％;以Nb-HC-Pro植 株五葉期的小苗(移栽后生長(zhǎng)30天)作為宿主材料，綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)的效率達(dá) 到了95%;以Nb-HC-Pro植株六葉期的小苗(移栽后生長(zhǎng)35天)作為宿主材料，綠色熒 光蛋白(GFP)表達(dá)的效率達(dá)到了20%。表達(dá)效率由具有綠色熒光現(xiàn)象表型的植株占總株 數(shù)的百分比決定(如圖3)。 實(shí)例三.-
在去根處理實(shí)驗(yàn)中，以Nb-HC-Pro植株五葉期的小苗(移栽后生長(zhǎng)30天)作為侵然 材料，當(dāng)菌液重懸液(MMA OD600=1.2時(shí))，侵染后3天可觀測(cè)到綠色熒光蛋白(GFP) 在幼葉中開始表達(dá)，侵染后7天可觀測(cè)到綠色熒光開始擴(kuò)散到老葉片，并發(fā)現(xiàn)在新生的根 中綠色熒光蛋白(GFP)也有表達(dá)現(xiàn)象。在非去根處理試驗(yàn)中，侵染后12小時(shí)即可觀察到 綠色熒光蛋白(GFP)在莖中大量表達(dá)，并開始在幼葉中表達(dá)，侵染后3天可觀測(cè)到綠色 熒光蛋白(GFP)在老葉中開始表達(dá)，侵染后5天整個(gè)植株呈現(xiàn)通透的綠色熒光。非去根 處理小苗比去根處理小苗的GFP表達(dá)的速度更快，我們推測(cè)植株的根部增強(qiáng)了其吸收菌液 的能力。RT-PCR結(jié)果為外源基因在植物組織中傳播提供了證據(jù)。 實(shí)例四
我們發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)效率還受溫度，濕度影響。將Nb-Hc-Pro的種
子播種于1/2MS培養(yǎng)基(網(wǎng)上查得)，放于光照培養(yǎng)箱'培養(yǎng)一周左右。將小苗移栽于花
盆中，在25土3'C的溫度條件下，每天光照16h和黑暗8h的循環(huán)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，將生 長(zhǎng)22天左右的小苗進(jìn)行干旱處理(不澆水)7天左右，再進(jìn)行侵染實(shí)驗(yàn)。在低濃度的菌液 條件下(MMAOD600=0.58)，可增加綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)效率60% (如圖4)。結(jié) 果暗示了用根部吸收體系進(jìn)行外源蛋白的表達(dá)，主要在于菌液迅速在植物體內(nèi)達(dá)到一定量 的積累過(guò)程。
權(quán)利要求
1、植物中外源基因的瞬時(shí)表達(dá)方法，其特征是取4-5ml的農(nóng)桿菌EHA105-30B-GFP重懸液，盛放于5ml離心管中，然后分別將四葉期，五葉期和六葉期的帶根小苗的根部直接放入重懸液中，然后將浸染材料在室溫28℃，日光、燈光照射16h或黑暗8h中培養(yǎng)，并在紫外燈照射條件下進(jìn)行連續(xù)一周的觀察并拍照，對(duì)表達(dá)綠色熒光蛋白GFP的植株分別提取植物總RNA和總可溶性蛋白，進(jìn)行RT-PCR水平和蛋白水平Western-Blot上的檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明為植物中外源基因的表達(dá)方法，具體涉及一種根部吸收法，本發(fā)明是通過(guò)病毒載體介導(dǎo)，農(nóng)桿菌吸收法將植物根部浸于農(nóng)桿菌重懸液中，通過(guò)根部自然吸收攜帶有目的基因的病毒載體的菌液來(lái)表達(dá)外源基因，本發(fā)明在一定程度上提高了外源蛋白的表達(dá)水平。其操作過(guò)程更為簡(jiǎn)單，快捷，可在更短時(shí)間內(nèi)獲得較高水平的外源蛋白的表達(dá)，其表達(dá)量可占植物總可溶性蛋白的6％以上。能夠?qū)崿F(xiàn)外源蛋白大規(guī)模的生產(chǎn)和推廣應(yīng)用，更易于一些急需藥用蛋白的快速規(guī)?；a(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/87GK101096682SQ20071005531
公開日2008年1月2日 申請(qǐng)日期2007年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月6日
發(fā)明者楊麗萍, 王興智 申請(qǐng)人:東北師范大學(xué)