專利名稱：擬南芥谷胱甘肽過氧化物酶基因had1在植物抗干旱方面應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種擬南芥谷胱甘肽過氧化物酶/WZ)7基因在植物抗干旱方 面的應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
當前，我國人口迅速增長，糧食生產(chǎn)面臨越來越嚴峻的挑戰(zhàn)。干旱逆境 傷害嚴重影響到了農(nóng)作物的生長發(fā)育，是限制農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量提高的主要 因素，據(jù)統(tǒng)計，世界干旱和半干旱地區(qū)面積占世界總面積的1/3，而我國則占 1/2，其中沒有灌溉條件的旱地約占65%。目前，我國大約有10億畝為中低 產(chǎn)田，其中大部分是干旱與鹽堿所致，提高作物的抗旱能力和建立高抗旱性 的新品系，是當前提高糧食產(chǎn)量迫切需要解決的問題。雖然國際上通過多種 生物學手段來提高作物的抗旱性，但至今還沒有取得突破性的研究進展，隨 著分子生物學和基因工程研究的深入，國際上很多實驗室也企圖尋找抵抗干 旱的關(guān)鍵基因，擬通過基因工程技術(shù)改良作物的抗旱性，但這方面的研究進 展也仍然很緩慢。因此，認識植物對干旱的反應(yīng)機制，提高植物的抗旱性， 是農(nóng)業(yè)增產(chǎn)的重要基礎(chǔ)。
現(xiàn)有研究表明，當遇到干旱脅迫時，植物體內(nèi)會伴隨著大量的活性氧 (Reactive Oxygen Species，ROS)產(chǎn)生。谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathine Peroxidase, GPX)是抵御氧化脅迫的-一種重要防御酶，其在動物和酵母中用 于清除活性氧的功能已被證實，但它在植物中的應(yīng)用還曾被報道，例如它如
何應(yīng)答外界脅迫，如何感受和清除非生物脅迫產(chǎn)生的ROS還需要進一步去探 索。因此，克隆和鑒定植物中GPX功能，并研究其與干旱的關(guān)系，具有重要 的理論意義和實際應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種擬南芥谷胱甘肽過氧化物酶基因/L4D7在提 高植物耐干旱性能上的應(yīng)用。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案在于采用了一種擬南芥谷胱甘肽 過氧化物酶/^D7基因在植物抗干旱方面的應(yīng)用。
具體應(yīng)用為將//^D7基因用于構(gòu)建植物表達載體并通過植物轉(zhuǎn)基因方法 獲得具有抗干旱性能的轉(zhuǎn)基因植物。
本發(fā)明的技術(shù)方案還在于采用了一種生產(chǎn)抗干旱轉(zhuǎn)基因植物的方法，將 基因連接在pBIB超表達融合載體轉(zhuǎn)化擬南芥，構(gòu)建了正義表達載體并 通過農(nóng)桿菌介導法或基因槍法的開花轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，通過含有潮霉素抗 性的MS平板上篩選，得到了轉(zhuǎn)基因擬南芥。
所述的宿主植物也可以為煙草。
所述的/i4D7基因，其在Genbank中的編號為AT2g43350，該基因的 cDNA長625bp，編碼206個氨基酸的蛋白。
本發(fā)明通過遠紅外成像技術(shù)從抗氧化基因突變體中篩選和鑒定了 /MD7，其在Genbank中的編號為AT2g43350,該基因的cDNA長625bp，.編
碼206個氨基酸的蛋白。通過蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)其含有半胱氨酸殘基，也是 植物細胞保持ROS平衡的--個清除酶，但它與動物細胞不同的是該酶為一種 非硒依賴的過氧化物酶，這種結(jié)構(gòu)的不同導致了酶活性的改變。本發(fā)明通過
將//JD/基因連接在pBIB超表達融合載體轉(zhuǎn)化擬南芥，試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽性 轉(zhuǎn)基因植物/^"7的表達量明顯提高，該/"D/基因可用于提高農(nóng)作物對干 旱的耐受程度，大大降低了農(nóng)作物生長過程中水灌溉的成本，可提高農(nóng)作物 的產(chǎn)量，具有重要的經(jīng)濟價值和廣泛的應(yīng)用前景。本發(fā)明還可以用于其它宿 主植物的轉(zhuǎn)化，如轉(zhuǎn)化煙草等。
試驗發(fā)現(xiàn)，生長20d (天)的&W突變體和野生型擬南芥幼苗，經(jīng)干旱 處理15d (天)后，/z"W植株出現(xiàn)萎焉，而野生型生長正常。


圖1為干旱脅迫下WT、超表達轉(zhuǎn)基因(overHADl)和hadl突變體擬南 芥離體葉片失水率的測定結(jié)果； '
圖2為ABA和&02對/zW7氣孔開閉的影響。
具體實施例方式
實施例1
HAD1基因蛋白活性的鑒定
采用體外表達HAD1蛋白的方法考察其是否具有過氧化物酶的活性，以 BL21為載體構(gòu)建表達HAD1融合蛋白的表達載體，并在大腸桿菌中表達，通 過Glutathione resin純化后進行了谷胱甘肽過氧化物酶活性分析，己知谷E甘 肽過氧化物酶的氧化和還原兩種狀態(tài)轉(zhuǎn)換所需要NADPH的消耗，在340nm 波長的激發(fā)下，測定NADPH的吸光值，可以計算其消耗量，即NADPH消耗 的越多，HAD1的酶活性越高。結(jié)果表明，原核表達的HADl、Trx、TR、NADPH 和&02共同存在的情況下，OD34Dnm隨著時間的變化而不斷的下降。當記錄 16 min時，其OD值下降了大約0.4，而以GSH作為電子供體只有小幅度的
下降。另夕卜，通過Western blotting技術(shù)檢測了 HAD1氧化態(tài)和還原態(tài)的轉(zhuǎn)變, 結(jié)果表明氧化態(tài)比還原態(tài)泳動速度要快，并且在Trx和TR的作用下能使氧化 態(tài)的HAD1得到還原。該結(jié)果表明了原核表達的HAD1具有過氧化物酶的活 性，且Trx很可能是HAD1氧化還原狀態(tài)轉(zhuǎn)換的主要電子供體。 實施例2
/i4D7基因的體內(nèi)表達
利用PCR擴增技術(shù)得到的//JD/基因的啟動子與GUS融合(pCMBIA1381 載體)的轉(zhuǎn)基因陽性植株，以檢測/WD/在擬南芥不同組織中的表達，纟且織 化學染色表明，5d (天)大小的幼苗整個植株都有強烈的表達，分別對葉、 花、根、莖、莢等不同組織進行GUS活性測定，結(jié)果表明，葉和根中的表達 量最強，而在果、莢、莖和花中的表達相對較弱；RT-PCR分析/WD/的mRNA 在不同組織的轉(zhuǎn)錄，同樣證實了根和葉中的表達量較高；另夕卜，/^D7基因在 植物保衛(wèi)細胞中表達量明顯高于其它同功酶基因。
實施例3
/i4D7基因過量表達及突變體的分子表型鑒定 ' 為了證明HAD1蛋白的功能，從SALK實驗室得到了其T-DNA插入突 變體(SALK—071176)，其插入位點位于第一個外顯子中；用SALK實驗室 提供設(shè)計的LP和RP雙引物對SALK—071176進行鑒定，以野生型擬南芥基 因組DNA作為模板，PCR擴增結(jié)果表明，900 bp處有一條明顯的條帶，而 SALK—071176卻沒有出現(xiàn)。為了進一步鑒定純合體，又用T-DNA左邊界上 設(shè)計的引物LBal和LBbl，分別和基因組上的RP進行PCR反應(yīng)，用 SALK_071176植物基因組DNA作為模板在約500 bp和700 bp處擴增出兩條
明顯的條帶，其大小相差約200 bp。另外，RT-PCR分析表明，潛在突變體 /"D7的mRNA的轉(zhuǎn)錄被終止，而用轉(zhuǎn)基因技術(shù)互補該基因，卻能恢復(fù)iWD/ 的表達。通過突變體和野生型擬南芥的回交試驗表明，F(xiàn)2代對甘露醇敏感性 的表型的分離比約為3:1，因此篩選的突變體應(yīng)為單基因純合突變體(/2^/7)。
將//JD/基因連接在pBIB超表達融合載體轉(zhuǎn)化擬南芥，構(gòu)建了正義表 達載體并通過農(nóng)桿菌介導的開花轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，通過含有潮霉素抗性的 MS平板上篩選，得到了 20株轉(zhuǎn)基因擬南芥，并對其中的5株進行Northom 分析，其/WD/表達水平大大提高。將過量表達的/WD/植株、野生型(WT) 和/z^Z/突變體植物種在土壤中，觀察其表型，三者之間沒有差異。
實施例4
基因?qū)Ω珊档捻憫?yīng)
干旱脅迫下，水分將過度蒸發(fā)，從而降低葉片表面溫度。為了證實HAD1 參與干旱脅迫的耐性，通過遠紅外成像技術(shù)測定了移栽營養(yǎng)土中15d (天) 幼苗葉片表面溫度變化。結(jié)果表明，干旱5d (天)后的突變體葉片表面溫度 明顯低于野生型，其平均溫度將比野生型低大約rC，而超表達/WD7轉(zhuǎn)基 因植株葉溫升高，阻止了水分的過度蒸發(fā)。通過測定離體葉片的失水率的表 明了/^W失水率明顯高于野生型擬南芥，當干旱處理2h后，/^W的失水率 將比野生型快約10%，而超表達植株失水明顯變慢，如圖1所示。
將過量表達的HAD1植株、野生型(WT)和/z"W突變體植物種在土壤 中，試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生長15天的幼苗，然后經(jīng)干旱處理7天后，A"W植株 出現(xiàn)萎焉，而野生型生長正常；8天后野生型開始萎蔫，80%超表達植株還表 現(xiàn)一定的活性；9天后進行復(fù)水試驗，只有超表達植株能恢復(fù)生長。另外，
在含有5mmol/L H202的MS培養(yǎng)基上，H202不但影響了 突變體的根伸 長，而且也影響了真葉的正常發(fā)育。這些結(jié)果表明HAD1具有抵抗干旱和氧 化脅迫的重要功能，同時過量表達/^D/基因提高了植物耐水份虧缺能力。
實施例5 '
/"D/基因參與了 ABA和&02誘導的氣孔關(guān)閉
氣孔是控制水分進出細胞的重要器官，其開閉程度直接影響植物的抗旱 能力，諸多研究表明干旱條件下植物激素脫落酸(ABA)大量增加。為了 驗證HAD1參與干旱脅迫的信號轉(zhuǎn)導，表皮生物學實驗表明，//JD7功能缺 失阻止了 ABA誘導的氣孔關(guān)閉，但不能抑制ABA誘導保衛(wèi)細胞&02的產(chǎn) 生(見圖2)。酵母雙雜交和GST Pull-Down實驗顯示，HAD1能與ABA的 負調(diào)控因子ABI2強烈的相互作用，與ABI1的作用相對較弱。 '
以上結(jié)果表明HAD1不僅具有保持14202平衡的功能，而且能直接參與 控制氣孔的開閉，調(diào)節(jié)因干旱而導致的水分過度蒸發(fā)。
本發(fā)明中的///4D7基因(High amount of water loss under drought stress, HAD1)突變體(SALK—071176)是從擬南芥資源中心(ABRC， Ohio State University)獲得，其基因編號為AT2g43350，該基因的cDNA長625bp，編 碼206個氨基酸的蛋白。
最后所應(yīng)說明的是以上實施例僅用以說明而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案， 盡管參照上述實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當
理解依然可以對本發(fā)明進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和
范圍的任何修改或局部替換，如宿主植物的改變等，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的 權(quán)利要求范圍當中。
權(quán)利要求
1、一種擬南芥谷胱甘肽過氧化物酶HAD1基因在植物抗干旱方面的應(yīng)用。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的/WD/基因在植物抗干旱方面的應(yīng)用，其特征在 于具體應(yīng)用為將/^D/基因用于構(gòu)建植物表達載體并通過植物轉(zhuǎn)基因方法獲得具有抗干旱性能的轉(zhuǎn)基因植物。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的/^4D/基因在植物抗干旱方面的應(yīng)用，其特征在 于將/^4D7基因連接在pBIB超表達融合載體轉(zhuǎn)化擬南芥，構(gòu)建了正義表達 載體并通過農(nóng)桿菌介導法或基因槍法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，通過含有潮霉素抗性 的MS平板上篩選，得到了轉(zhuǎn)基因擬南芥。
4、 根據(jù)權(quán)利要求一3中任一條所述的/^D/基因在植物抗干旱方面的應(yīng) 用，其特征在于所述的/WD7基因，其在Genbank中的編號為AT2g43350， 該基因的cDNA長625bp，編碼206個氨基酸的蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種擬南芥谷胱甘肽過氧化物酶基因HAD1(High amount of water loss under drought stress，HAD1)在抗干旱方面的應(yīng)用。其中HAD1基因突變體(SALK_071176)是從擬南芥資源中心(ABRC，Ohio State University)獲得，其基因編號為AT2g43350，該基因的cDNA長625bp，編碼206個氨基酸的蛋白。本發(fā)明涉及到的HAD1基因可用于提高農(nóng)作物對干旱的耐受程度，大大降低了農(nóng)作物生長過程中水灌溉的成本，提高植物水分利用效率，并可增加農(nóng)作物的產(chǎn)量，具有重要的經(jīng)濟價值和廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N9/08GK101381733SQ200710055090
公開日2009年3月11日 申請日期2007年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月3日
發(fā)明者杰 代, 宋純鵬, 坤 李, 苗雨晨, 郭敬功 申請人:河南大學