專利名稱：棗樹(shù)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種棗樹(shù)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶基因。
背景技術(shù)：
Mills最初發(fā)現(xiàn)動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)具有抗氧化作用的GPX，其功能被認(rèn)為是防御紅血球氧化引起的溶血，并將其命名為谷胱甘肽過(guò)氧化物酶。過(guò)去一直認(rèn)為這是經(jīng)典的GPX，現(xiàn)在把具有這種功能的酶命名為GPX-1.后來(lái)，F(xiàn)lohe研究小組純化并分析了分布在細(xì)胞中并作用于各種有機(jī)過(guò)氧化物及H2O2的GPX，研究表明它是由4個(gè)蛋白質(zhì)亞基構(gòu)成的四聚體，每個(gè)亞基各含1個(gè)硒半胱氨酸，并且它是以離子化硒醇(selenol)的形式形成酶的氧化還原活性中心。大量的研究表明，哺乳動(dòng)物的GPXs有著較高的催化活性，可迅速清除體內(nèi)產(chǎn)生的多余的活性氧(R0S)，并且GPXs多數(shù)以谷胱甘肽GSH(glutathione)作為底物催化分解生物體內(nèi)產(chǎn)生的H202。目前，根據(jù)GPXs所包含的半胱氨酸殘基的不同，可簡(jiǎn)單將其分為含硒和不含硒兩大類(lèi)。植物中同樣也存在屬于GPX家族的酶類(lèi)，直到最近幾年，在植物中也開(kāi)展了 GPXs 的功能研究，最初的研究是從煙草的葉片里克隆了與動(dòng)物依賴硒的GPXs有著較高同源性的cDNA。后來(lái)從柑橘、擬南芥、和中國(guó)大白菜等多種植物中分離得到了類(lèi)似基因。研究發(fā)現(xiàn)，不同于動(dòng)物基因組GPXs核苷酸UGA終止密碼子處插入的硒代半胱氨酸殘基，植物基因組GPXs核苷酸序列攜帶的是一個(gè)半胱氨酸殘基。動(dòng)物中含硒代半胱氨酸殘基的GPXs有較強(qiáng)的催化活性，而植物中多數(shù)是半胱氨酸殘基，這就大大降低了 GPXs在植物中的催化作用。然而，也有人在研究柑橘的GPXs時(shí)，用硒代半胱氨酸殘基代替了半胱氨酸殘基，卻沒(méi)有出現(xiàn)類(lèi)似于哺乳動(dòng)物的GPXs的活性。植物中GPXs的結(jié)構(gòu)、對(duì)底物的特異性及在植物組織的分布上都不相同，它們對(duì)抵御外界脅迫起了很重要的作用，但我們對(duì)其功能及結(jié)構(gòu)特性的認(rèn)識(shí)仍很有限，還需要做大量的工作。因此，克隆和鑒定植物中GPXs，研究抗逆機(jī)制以及與逆境相關(guān)基因的分子結(jié)構(gòu)、 表達(dá)、功能及調(diào)控，可為充分利用這些優(yōu)良抗性基因提高植物的抗逆性提供一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和奠定理論基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種棗樹(shù)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶基因，可作為目的基因?qū)胫参铮岣咧参锟鼓嫘?，進(jìn)行植物品種改良。本發(fā)明是采用以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種棗樹(shù)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶基因，該基因的核苷酸序列是如SEQ ID NO: 1所示的序列。由所述的一種棗樹(shù)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶基因，該基因的核苷酸序列編碼的氨基酸序列是如SEQ ID NO:2所示的序列。由所述的一種棗樹(shù)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶基因，該基因的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
所述的棗樹(shù)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶基因在提高植物抗逆性中的應(yīng)用。本發(fā)明從山西省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心園藝作物生物技術(shù)研究室構(gòu)建壺瓶棗 iZiziphus jujuba Mill hupingzao)結(jié)果枝(即棗吊)cDNA文庫(kù)中篩選到棗樹(shù)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶基因的全序列，將其命名為ZjGPXiZiziphus Jujuba glutathione neroxidase)。 生物信息學(xué)分析表明^ζ/β吁基因cDNA序列全長(zhǎng)為510bp，編碼170個(gè)氨基酸，其中包含有 16個(gè)酸性氨基酸，19個(gè)堿性氨基酸，計(jì)算得知蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量為19. ^KD,理論等電點(diǎn)為5. 00，脂肪指數(shù)為76. 69。根據(jù)棗樹(shù)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶基因cDNA編碼的序列，設(shè)計(jì)帶有^I和5 I 酶切位點(diǎn)的特異性引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。其上游引物為 GYl的序列為5' —ACGAATTCTCATGACTAGCCAGC—3'，包含I限制性酶切位點(diǎn)(即有下劃線部分)，三個(gè)保護(hù)堿基ACG及此蛋白的起始密碼子ATG。下游引物為GY2的序列為5'— ATCCCGGGTTGAGATTCCCAAGA— 3',包含該Sim I限制性酶切位點(diǎn)(即下劃線部分)，兩個(gè)保護(hù)性堿基AT及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的終止密碼子TGA。經(jīng)限制性內(nèi)切酶^I和5 I修飾后連接于植物表達(dá)載體PES (K) -LNY上，然后再經(jīng)含卡納霉素的LB平板篩選轉(zhuǎn)化子、PCR 鑒定、酶切鑒定、測(cè)序證明植物表達(dá)載體PES (K)-LNY-ZjiKT構(gòu)建成功。通過(guò)凍融法將攜帶目的基因的植物表達(dá)載體PES (K) -\m-ZjGPX轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404的感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)含卡納霉素的LB平板篩選轉(zhuǎn)化子、PCR鑒定、酶切鑒定、測(cè)序證明工程菌PES (K)-LNY-ZjiKT 構(gòu)建成功。農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化擬南芥，經(jīng)含卡那霉素的V2MS培養(yǎng)基篩選獲得含有目的基因ZjGPX的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株Ttl代，經(jīng)PCR鑒定目的基因證實(shí)Zj^KT成功轉(zhuǎn)入擬南芥。將轉(zhuǎn)基因的T2代擬南芥種子和野生型(WT)擬南芥種子均播種在加不同濃度 NaCl的1/2MS培養(yǎng)基上，對(duì)轉(zhuǎn)吁基因植株及其T2代進(jìn)行耐鹽性評(píng)價(jià)，觀察其生長(zhǎng)狀況， 發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)^ζ/β吁基因擬南芥植株在鹽脅迫處理下長(zhǎng)勢(shì)和根系明顯好于野生型(WT)擬南芥植株。將長(zhǎng)出2片真葉的轉(zhuǎn)Zj^KT基因的T2代擬南芥植株和野生型(WT)擬南芥植株進(jìn)行耐鹽、耐旱脅迫處理，15天后觀察其生長(zhǎng)狀況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Zj^KT基因的擬南芥耐鹽性明顯提高， 轉(zhuǎn)Zj^KT基因的擬南芥耐旱性明顯提高。本發(fā)明為了進(jìn)一步研究Zj^KT基因在棗樹(shù)體內(nèi)的表達(dá)，分別對(duì)辣椒棗組培苗進(jìn)行干旱、NaCl脅迫處理，研究逆境因素對(duì)Zj^KT基因表達(dá)的影響。CTAB法提取所辣椒棗組培苗的總RNA，經(jīng)OD26tl值測(cè)定、甲醛變性膠電泳等方法檢測(cè)證明所提RNA濃度和純度都符合標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)量合格。反轉(zhuǎn)錄所提總RNA，定量PCR檢測(cè)結(jié)果分析證實(shí)Zj^KT可受干旱、NaCl脅迫等逆境因素誘導(dǎo)表達(dá)。此外，本發(fā)明為了進(jìn)一步研究棗樹(shù)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶基因Zj^KT及編碼蛋白 ZjGPX,本發(fā)明構(gòu)建了重組原核表達(dá)載體pGEX-4T-2-ZjGPX，實(shí)現(xiàn)其在大腸桿菌(五colO BL21 (DE3)中的原核表達(dá)，為該基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)、功能、調(diào)控等方面研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明首次從棗樹(shù)中分離出棗樹(shù)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶基因 ZjGPX，該基因作為目的基因?qū)胫参铮岣咧参锟鼓嫘?，?duì)于植物品種改良具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，對(duì)于具有優(yōu)良抗性的植物的抗逆機(jī)制的深入研究，有助于明確逆境相關(guān)基因的分子結(jié)構(gòu)、表達(dá)、功能及調(diào)控，為進(jìn)一步充分利用這些優(yōu)良抗性基因來(lái)提高植物的抗逆性提供一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和奠定理論基礎(chǔ)，同時(shí)有助于了解GPXs在植物活性氧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用，促進(jìn)人們對(duì)活性氧作為信號(hào)分子的了解。


圖1為Zj^KT與已知基因氨基酸同源性對(duì)比樹(shù)狀圖。圖2為棗樹(shù)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖。圖3為PCR目的基因產(chǎn)物圖譜。圖4為pGEX-4T-2及目的基因ZjGPX酶切圖譜。圖5為重組質(zhì)粒的酶切鑒定圖。圖 6 為工程菌 ρ6ΕΧ-4Τ-2-Ζ7·β°/"Β 的 PCR 鑒定圖。圖 7 為誘導(dǎo)產(chǎn)物的 SDS-PAGE 分析。圖8為IPTG對(duì)蛋白表達(dá)量的影響與融合蛋白的純化。圖9為PCR目的基因產(chǎn)物圖譜。圖10為PEZR⑷-LNY及目的基因的酶切圖譜。圖11為重組質(zhì)粒的酶切鑒定圖譜。圖12為篩選出的轉(zhuǎn)Zj^KT基因擬南芥Ttl代幼苗。圖13為篩選出的轉(zhuǎn)Zj^KT基因擬南芥Ttl代植株。圖14為轉(zhuǎn)Zj^KT基因擬南芥T1不同株系擬南芥基因檢測(cè)。圖15為轉(zhuǎn)ZjK吁基因擬南芥和WT擬南芥種子在不同濃度的NaCl培養(yǎng)基上的萌發(fā)情況。圖16為轉(zhuǎn)ZjK吁基因擬南芥和WT擬南芥植株在不同濃度的NaCl培養(yǎng)基上根系的生長(zhǎng)情況。圖17為轉(zhuǎn)Zj^KT基因擬南芥和WT擬南芥植株鹽脅迫后生長(zhǎng)情況的對(duì)比圖。圖18為轉(zhuǎn)Zj^KT基因擬南芥和WT擬南芥植株干旱脅迫后生長(zhǎng)情況的對(duì)比圖。圖19為RNA甲醛變性膠電泳圖譜。圖20為辣椒棗組培苗經(jīng)不同濃度的NaCl脅迫后的Zj^KT相對(duì)表達(dá)量的對(duì)比表。圖21為辣椒棗組培苗經(jīng)PEG-6000脅迫(模擬干旱處理)后的Zj^KT相對(duì)表達(dá)量的對(duì)比表。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 棗樹(shù)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶基因ZjGPX的生物信息學(xué)分析
本發(fā)明從山西省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心園藝作物生物技術(shù)研究室構(gòu)建壺瓶棗 (Mziphus jujuba Mill hupingzao)結(jié)果枝(即棗吊、落性枝)cDNA文庫(kù)中篩選到棗樹(shù)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶基因ZjGPX的全序列。將所測(cè)定Zj^KT基因序列通過(guò)Blastx搜索NCBI的核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行序列相似性分析；用DNAMar進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)并做此蛋白的進(jìn)化樹(shù)；用ProtParam計(jì)算蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量和理論等電點(diǎn)；連接至http://WWW. expasy. org/prosite進(jìn)行保守序列分析；將此蛋白的氨基酸序列提交Swiss-Model預(yù)測(cè)其三級(jí)結(jié)構(gòu)。生物信息學(xué)分析表明棗樹(shù)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶基因cDNA序列為全長(zhǎng)510bp的開(kāi)放讀碼框(0RF)，通過(guò)在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Blastx搜索進(jìn)行序列相似性分析表明，該蛋白與已知的其它植物谷胱甘肽過(guò)氧化物酶具有極高的同源性，與蓖麻的同源性為95%，楊樹(shù)的同源性為93%，擬南芥的同源性為93% ；對(duì)Zj^KT蛋白的氨基酸序列與其它屬的物種的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶用DNAMar構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，如圖1所示，棗樹(shù)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶基因的氨基酸序列和蓖麻的GPX親緣關(guān)系最近，7個(gè)物種的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶被聚為5個(gè)類(lèi)群，擬南芥和楊樹(shù)聚為一類(lèi)；玉米和高粱聚為一類(lèi)；棗、葡萄、蓖麻單獨(dú)聚為一類(lèi)；聚類(lèi)分析還表明棗谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和6物種GPX的氨基酸同源性均達(dá)到73. 8%以上；ZjK吁基因cDNA序列全長(zhǎng)為510bp，用ProtParam分析該序列得，它編碼170個(gè)氨基酸，其中包含有16個(gè)酸性氨基酸，19個(gè)堿性氨基酸，計(jì)算得知蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量為19. ^KD,理論等電點(diǎn)為5. 00， 脂肪指數(shù)為76. 69 ；連接至http://WWW. expasy. org/prosite進(jìn)行保守序列分析，結(jié)果表明該基因編碼的蛋白具有一個(gè)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性位點(diǎn)，其氨基酸序列為第31個(gè)氨基酸到第46個(gè)氨基酸“GKvLLIvNVaSkCGmT”，還有一個(gè)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶保守肽段，其氨基酸序列為“LAFPCNQF”，即第68個(gè)氨基酸到第75個(gè)氨基酸；在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索到 ^ζ/β吁同源模型 2p5rA，用 Swiss Model 程序(http//au. expasy. org/tools/)進(jìn)行同源建模(homology modeling)，推測(cè)ZjK吁基因編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)如圖2所示，棗樹(shù)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶與白楊樹(shù)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶有極高的相似性，推測(cè)其可能與白楊樹(shù)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶有著相似的功能。上述生物信息學(xué)分析方法均為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)手段。實(shí)施例2 =Zj^KT基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建 1.材料、試劑及儀器
1.1載體和菌株
大腸桿菌(Escherichia coli)DH5a菌株；克隆載體pSPORTl-ZjGPX、原核表達(dá)載體 PGEX-4T-2均由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心園藝作物研究室保存。1. 2酶與試劑盒
DNA回收試劑盒QIAquick 購(gòu)自QIAGEN公司；限制性內(nèi)切酶及油辦I ,Sma I ,Sal I、 T4DNA 連接酶、DNA Marker (15000bp、2000 bp ladder)等均購(gòu)自大連 TaKaRa (寶生物)工程有限公司。1.3試劑及儀器設(shè)備
抗生素氨芐青霉素購(gòu)自上海生工生物工程服務(wù)有限公司。質(zhì)粒提取、瓊脂糖凝膠電泳中所用的其他試劑均購(gòu)自天津天大化工。主要的儀器設(shè)備有電子天平(Sarorius BS200s_WEl)、超凈工作臺(tái)(上海迅博醫(yī)療設(shè)備廠Vs-840-2)、隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠Ρ -DHS)、高壓滅菌鍋 (Τ0ΜΥ SS-325)、高速冷凍離心機(jī)(Thero HP-62)、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Beck man J-25)、 PCR擴(kuò)增儀(Eppendorf AG)、UVP凝膠成像分析儀(美國(guó)BioSpectrum 600)、真空干燥箱 (ΗΕΤ0 VR-I )、水浴恒溫振蕩器(國(guó)華企業(yè)SHZ-82A)、電熱恒溫水浴鍋(天津市華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、恒溫金屬浴(杭州博日科技有限公司)、恒溫磁力攪拌器(江蘇金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠79W-1)、DYY-6B型電泳儀(北京市六一儀器廠)、JY-DF系列電泳槽(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)、Saritorius PH計(jì)、分光光度計(jì)(印pendorf BioPhotometer)。2.實(shí)驗(yàn)方法
2.1大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞的制作用CaCl2法制備大腸桿菌(五C07i)DH5a感受態(tài)細(xì)胞，具體方法見(jiàn)精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南，與細(xì)菌接觸的液體及容器都需經(jīng)過(guò)滅菌處理。2.2 PCR引物的設(shè)計(jì)與合成
根據(jù)棗樹(shù)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶基因cDNA編碼的序列，設(shè)計(jì)帶有ife // I和5 I酶切位點(diǎn)的特異性引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。棗樹(shù)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶基因的上游引物Gl序列為5’—— TATGGATCCATGACTAGCCAGCCCA——3’，包含BamH I限制性酶切位點(diǎn)(即有下劃線部分)，三個(gè)保護(hù)堿基TAT，及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶Zj^KT基因的起始密碼子ATG。下游引物G2的序列為5’——ATCCCGGGTCATGAGATTCCCAAGA——3’，包含fe I限制性酶切位點(diǎn)(即有下劃線部分)，兩個(gè)保護(hù)堿基AT，及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶Zj^KT基因的終止密碼子TCA。2. 3載體pGEX-4T-2的制備及目的基因ZjGPX的擴(kuò)增 2. 3. 1堿裂解法快速提取質(zhì)粒pGEX-4T-2和pSPORTl-Zj^KT
堿裂解法快速提取質(zhì)粒PGEX-4T-2和pSPORTl-Zj^KT，具體步驟見(jiàn)精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南。2. 3.2目的基因序列的擴(kuò)增
以克隆載體PSP0RT1 (攜帶目的片段)為模板，用設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。先利用梯度PCR技術(shù)設(shè)置不同的溫度，找出最佳退火溫度為61°C。PCR 反應(yīng)體系=IOXPCR buffer 5μ1 (含 Mg2+離子)，dNTP μ ，上下游引物各 μ (20pmol/L)，rTaq聚合酶0. 3μ1，模板DNA Ιμ1(2. 3μβ/μ1 )，滅菌超純水加至總體積為50μ1。 擴(kuò)增條件為95°C預(yù)變性5 min，94°C變性1 min，61°C退火1 min，72°C延伸2 min，共40個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5 min。2. 4目的基因ZjGPX和載體pGEX_4T_2的BatnH I和Sma I酶切
利用BamH I和Sma I分別酶切目的基因ZjGPX的PCR產(chǎn)物和載體pGEX_4T_2。目的基因ZjGPX的PCR產(chǎn)物的酶切反應(yīng)體系如下
注PCR產(chǎn)物的體積依據(jù)其濃度而定，最少酶切1 目的基因片段。最后加超純水至總體積為50μ1。 載體pGEX-4T-2的酶切反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種棗樹(shù)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶基因，其特征是該基因的核苷酸序列是如SEQ ID NO: 1所示的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種棗樹(shù)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶基因，其特征是該基因的核苷酸序列編碼的氨基酸序列是如SEQ ID N0:2所示的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種棗樹(shù)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶基因，其特征是該基因的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)具有如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種棗樹(shù)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶基因，其特征在于，該基因在提高植物抗逆性中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種棗樹(shù)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶基因，該基因的核苷酸序列以及氨基酸序列是如序列表中所示SEQIDNO:1和SEQIDNO:2，本發(fā)明構(gòu)建植物表達(dá)載體，獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，對(duì)其進(jìn)行耐鹽性和耐旱性評(píng)價(jià)，證明該基因作為目的基因?qū)胫参铮岣咧参锟鼓嫘裕瑢?duì)于植物品種改良具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，對(duì)于具有優(yōu)良抗性的植物的抗逆機(jī)制的深入研究，有助于明確逆境相關(guān)基因的分子結(jié)構(gòu)、表達(dá)、功能及調(diào)控，為進(jìn)一步充分利用這些優(yōu)良抗性基因來(lái)提高植物的抗逆性提供一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和奠定理論基礎(chǔ)，同時(shí)有助于了解GPXs在植物活性氧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用，促進(jìn)人們對(duì)活性氧作為信號(hào)分子的了解。
文檔編號(hào)C12N9/08GK102533809SQ20121004213
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月23日
發(fā)明者孟玉平, 張春芬, 張曉娟, 曹尚銀, 曹秋芬, 薛華柏 申請(qǐng)人:山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心, 山西維民生科技有限公司