專利名稱：一步法制備基因重組人源銅、鋅超氧化歧化酶工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物工程中酶化學(xué)，更具體地說，它是應(yīng)用一步法制備 基因重組人源銅、鋅超氧化歧化酶工藝。
背景技術(shù)：
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase)簡稱S0D，是一種含金屬離子 的新型酶制劑，廣泛分布于各種生物體內(nèi)，幾乎從動物到植物，都有它的存 在。被國際公認(rèn)為是清除氧化自由基(也稱游離基)的特效的酶，人體在正 常的新陳代謝或各種激情況下，會產(chǎn)生大量有氧元素的自由基，稱為超氧自 由基。超氧自由基在人體的過度聚集能加速細(xì)胞的衰老和降低機(jī)體的免疫功 能，甚至誘發(fā)腫瘤。S 0D則能促使超氧自由基分解，因為作為有害物質(zhì)的 超氧陰離子在S0D的作用下和氫離子反應(yīng)，生成另一種物質(zhì)——過氧化氫； 過氧化氫又在過氧化氫酶的作用下和氫離子反應(yīng)，最終生成了--種對人體無 害的物質(zhì)——水，從而消除其對人體的損害，它在一定程度上有防止腫瘤 發(fā)生、抗衰老、提高機(jī)體免疫力的作用，因而被用于某些急性炎癥、自身免 疫性疾病、營養(yǎng)缺乏、腫瘤等的輔助治療。1969年Mcord和Fridvich從牛血發(fā)現(xiàn)并提取出超氧化物歧化酶以來， SOD的生產(chǎn)取得了重在進(jìn)展。目前，生產(chǎn)SOD大體上有二種方法，第-'方法 是傳統(tǒng)方法，從動物血中提取SOD，由于血制品SOD存在外源感染的危險性 和非人源制品SOD用于人體有抗原性，在醫(yī)療中很難發(fā)揮作用，而且成本高，原料來源有限，歐洲從1999年就禁止長期用于人體上；第二種方法是植物中提取S0D，雖然可以消除病毒、外源性污染等弊端，但由于植物中SOD含 量低，很難實現(xiàn)工業(yè)批量生產(chǎn)。上述提取SOD生產(chǎn)流程，都是釆用傳統(tǒng)工藝 中的抽提、離子交換、分子篩等分離、純化工序，提取過程復(fù)雜，收率低。 目前，尚未發(fā)現(xiàn)把當(dāng)代生物科學(xué)技術(shù)應(yīng)用到SOD產(chǎn)業(yè)中，采用一 步法制備基因重組人源銅、鋅超氧化歧化酶工藝，基因重組生產(chǎn)SOD是當(dāng)含 世界最前沿技術(shù)，基因重組生產(chǎn)SOD具有無外源性污染、無免疫排斥、無蛋 白種屬差異、無病毒殘存，且純度高、活性高，最適于人體，是S0D產(chǎn)業(yè)從 技術(shù)到質(zhì)量上的一次革命。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有提取S0D技術(shù)中的不足，提供一種具有無外源 性污染、無免疫排斥、無蛋白種屬差異、無病毒殘存，且純度高、活性高的 一步法制備基因重組人源銅、鋅超氧化歧化酶工藝，更好地發(fā)揮SOD對急病 其預(yù)防、治療的作用。本發(fā)明提出的一步法制備基因重組人源銅、鋅超氧化歧化酶工藝，其主 要技術(shù)在于一、溫控分泌型人源S0D菌種，應(yīng)用基因重組技術(shù)將PRPL啟動子和STII 信號肽及人S0D基因克隆至PBR322中，構(gòu)建了分泌型表達(dá)質(zhì)粒 PBV/STII/S0D。此質(zhì)粒帶有溫控型啟動子PRPL，帶有STII信號肽，使所表 達(dá)的外源蛋白以可溶形式分泌到細(xì)胞周基質(zhì)中，給外源蛋白的進(jìn)一步純化帶 來方便。將構(gòu)建的分泌型表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌W3110，獲得重組人源 銅鋅超氧化物歧化酶菌種。超氧化物歧化酶溫控分泌型菌種構(gòu)建，見附圖。 二、工程發(fā)酵培養(yǎng)1、 菌種篩選工藝劃線培養(yǎng)一試管培養(yǎng)一挑單菌落一小試表達(dá)一擴(kuò)增培養(yǎng)一生產(chǎn)用菌2、 種子液的制備a. 取凍存菌種1支，用接種環(huán)取小量菌種在LB平皿上劃線，(LB培養(yǎng)液 的制備蛋白胨56g，酵母粉28g， NaCe56g,溶液5.6L) 30。C培養(yǎng)20—24 小時。b. 挑取單菌落接種于LB培養(yǎng)基試管中，30°C, 150—180轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng) 10—15小時，待0D值達(dá)18—20，接種于發(fā)酵罐中。3、 發(fā)酵罐培養(yǎng)a、 采用改良的M9培養(yǎng)基，(M9培養(yǎng)基的的制備80L發(fā)酵罐中蛋白胨 ■g,酵母粉SOOg'NaHPOJSOg'KI^POJlOg'NaCelOOg'MiCeYOg'MgSoaS. 4g， CaLeO. 5g， CuSoJ0g， ZnSo在5g，葡萄糖600g。)。b. 發(fā)酵罐空消條件12rC， 30分鐘。4、 接種，將單獨(dú)滅菌的罐培養(yǎng)基分份注入罐內(nèi)，在滅菌條件下，保護(hù) 子液接入發(fā)酵罐中。 '5、 培養(yǎng)a. 誘導(dǎo)培養(yǎng)前，每小時檢測一次0D值，并做鏡檢觀察菌形。b. 通過轉(zhuǎn)數(shù)和通氣量來控制溶氧值。c. 當(dāng)罐內(nèi)菌液0D600值為3.0時進(jìn)行升溫?zé)嵴T導(dǎo)，誘導(dǎo)溫度42。C。d. 誘導(dǎo)后繼續(xù)培養(yǎng)二個半小時，出罐。三、 離心收集菌體在GQ-105離心機(jī)上進(jìn)行。四、 復(fù)合破碎菌體破碎是純化工藝中重要的一環(huán)。本發(fā)明工藝采用復(fù)合破碎法凍融與均質(zhì)法(或超聲波破碎法)相結(jié)合，凍融從室溫降至-15°C—-2CTC，溫度下降梯度為lcrc/小時之后等溫冷凍，破碎之前融化。采用均質(zhì)法兩級破碎--級800bar， 二級200bar，酶液1: 3稀釋，破碎率達(dá)95%以上。五、 復(fù)合收取上清液復(fù)合破碎雖然破碎率達(dá)95%以上，但離心收集上清液困難。本發(fā)明工藝 將破碎液升溫，升溫梯度為2(TC/小時，升溫至5(TC，等溫數(shù)十分鐘，再將 酶液離心上清，效果極為良好，原酶液雜質(zhì)及各種雜質(zhì)蛋白為8.4mg/ml，上 清液降到2.3-3.5mg/ml，活力回收率達(dá)130%,為精純工藝奠定了簡化的重 要基礎(chǔ)。六、 過濾 ， 本發(fā)明工藝過濾采用網(wǎng)眼為0.5lim， 0.2um，雙濾心過濾。七、 超濾本發(fā)明工藝采用雙超濾網(wǎng)IOKD、 IOOKD超濾，超濾后活性達(dá)6-10萬U/ ml，損失率<10%。八、 凍干根據(jù)需要的活性要求，進(jìn)行稀配，除鹽、除菌凍干。 檢測根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T5009. 171-2003《超氧化物歧化酶活性的測定》 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比其積極有益效果是(1)工藝簡化、產(chǎn)量高，單位成本低，可實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)；(2)無外源性污染、無免疫排斥、無蛋白 種屬差異、無病毒殘存，且純度高、活性高；(3)用途廣泛，它在一定程度 上有防止腫瘤發(fā)生、抗衰老、提高機(jī)體免疫力的作用，因而被用于某些急性 炎癥、自身免疫性疾病、營養(yǎng)缺乏、腫瘤等的輔助治療，也可應(yīng)用到化妝品 食品、保健品等領(lǐng)域；(4)在防輻射等方面也已進(jìn)入臨床試驗階段。'


圖l，是本發(fā)明一步法制備基因重組人源銅、鋅超氧化歧化酶 工藝，超氧化物歧化酶溫控分泌型菌種構(gòu)建。
具體實施方式
下面結(jié)合實例，對本發(fā)明作的工藝作進(jìn)一步詳細(xì)描述。實施例本工藝在100L發(fā)酵罐實施應(yīng)用。1、 種子液的制備1) 取凍存工程菌(PBV/STII/S0D) —支，用接種環(huán)取小量菌種在LB平 皿上畫線，在30。C條件下培養(yǎng)24小時。2) 挑取單菌落接種取LB培養(yǎng)基試管中(LB培養(yǎng)液蛋白胨56g，酵母 粉28g， NaCe56g，定溶5. 6L)滅菌后，加入微量的氨芐，放入恒溫?fù)u床培養(yǎng)30 。C， 170轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)10—24小時，0D,為0.4—0. 6時接入發(fā)酵罐。2、 發(fā)酵罐培養(yǎng)1)發(fā)酵液采用改良的Mg培養(yǎng)基(M4咅養(yǎng)基的制備80L發(fā)酵罐中蛋白胨 800g,酵母粉500g， NaHPOJ20g， KH2PCU10g， NaCel00g， NH,Ce70g， MgSoJ3. 4g， CaLeO. 5g， CuSo,,10g， ZnSoA 5g，葡萄糖600g。)2) 發(fā)酵罐滅菌之后，將配制好的發(fā)酵液倒入罐中，升溫至i2rc，保溫30min，冷水降溫至所需溫度。3) 滅菌接入擴(kuò)增菌種，加入適量氨芐，3(TC培養(yǎng)。當(dāng)0D值為0.5-0.8 時進(jìn)行補(bǔ)料(葡萄糖)，當(dāng)OD值為2.0—3.0時補(bǔ)Cu"， Zn"，進(jìn)行升溫至42 °C，保溫2小時后下罐。3、 離心收集菌體，在16000轉(zhuǎn)/分立式離心機(jī)上離心收集菌體。4、 收集目的蛋白粗酶液。經(jīng)復(fù)合破碎(凍融與均質(zhì)法破碎)，菌體破碎率達(dá)95%以上，再經(jīng)梯度升 溫，離心提取粗酶液，活力回收率達(dá)130%。5、 目的蛋白純化目的蛋白粗酶液經(jīng)雙網(wǎng)過濾、雙網(wǎng)超濾，目的蛋白必要時可增加梯度升 溫處理，活性達(dá)6-10萬u/ml，比活》10000U/mg(prot)。6、 凍干根據(jù)需要，稀配除鹽、滅菌、凍干。本發(fā)明的工藝，100L發(fā)酵罐SOD活性達(dá)(6000萬-l億)U，凍干粉活 性3500U/mg ，每罐蛋白量達(dá)10g ，活性收率達(dá)50-70% ，比活〉 10000u/mg(pix)t)，目的蛋白人源銅、鋅超氧化歧化酶其分子量為32KD。生 產(chǎn)成本降低30%，每生產(chǎn)一次可節(jié)約時間30-40小時。
權(quán)利要求
1.一 步法制備基因重組人源銅、鋅超氧化歧化酶工藝其特征在于(一)溫控分泌型人源SOD菌種將PRPL啟動子和STII信號肽及人源SOD基因克隆至PBR322中，構(gòu)建了分泌型表達(dá)質(zhì)粒PBV/STII/SOD，此質(zhì)粒帶有溫控型啟動子PRPL，帶有STII信號肽，使所表達(dá)的外源蛋白以可溶形式分泌到細(xì)胞周基質(zhì)中，將構(gòu)建的分泌型表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌W3110，獲得重組人源銅鋅超氧化物歧化酶菌種；(二)工程發(fā)酵培養(yǎng)(1)菌種篩選工藝劃線培養(yǎng)→試管培養(yǎng)→挑單菌落→小試表達(dá)→擴(kuò)增培養(yǎng)→生產(chǎn)用菌(2)種子液的制備a.取凍存菌種PBV/STII/SOD1支，用接種環(huán)取小量菌種在LB平皿上劃線，在30℃培養(yǎng)24小時，b.挑取單菌落接種于LB培養(yǎng)基試管中，30℃，搖床170轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)30小時，(3)、發(fā)酵罐培養(yǎng)a.采用改良的M9培養(yǎng)基，b.發(fā)酵罐空消在條件121℃，30分鐘，(4)、接種，將單獨(dú)滅菌的罐培養(yǎng)基分份注入罐內(nèi)，在滅菌條件下，保護(hù)種子液接入發(fā)酵罐中，(5)、培養(yǎng)a.誘導(dǎo)培養(yǎng)前，每小時檢測一次OD值，并做鏡檢觀察菌形，b.通過轉(zhuǎn)數(shù)和通氣量來控制溶氧值，c.當(dāng)罐內(nèi)菌液OD600值為3.0時進(jìn)行升溫?zé)嵴T導(dǎo)，誘導(dǎo)溫度控制在42℃，d.誘導(dǎo)后繼續(xù)培養(yǎng)二個半小時，出罐，(三)、離心收集菌體，在GQ-105離心機(jī)上進(jìn)行，(四)、采用復(fù)合破碎法凍融與均質(zhì)法或超聲波破碎法相結(jié)合，凍融從室溫降至-15℃，溫度下降梯度為10℃/小時之后等溫冷凍，破碎之前融化，采用均質(zhì)法兩級破碎一級800bar，二級200bar，酶液1∶3稀釋，破碎率達(dá)95％以上(五)、復(fù)合收取上清液復(fù)合破碎菌體破碎率達(dá)95％以上，升溫梯度為20℃/小時，升溫至50℃，溫后，再將酶液離心上清，原酶液雜質(zhì)及各種雜質(zhì)蛋白為8.4mg/ml，上清液降到2.3-3.5mg/ml，活力回收率達(dá)130％，(六)、過濾，過濾采用網(wǎng)眼為0.5μm，0.2μm，雙濾心過濾，(七)、超濾采用雙超濾網(wǎng)10KD、100KD超濾，超濾后活性達(dá)6-10萬U/ml，損失率＜10％，(八)、凍干根據(jù)需要的活性要求，進(jìn)行稀配，除鹽、滅菌、凍干。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一步法制備基因重組人源銅、鋅超氧化歧 化酶工藝，其特征在于IOOL發(fā)酵罐SOD活性達(dá)6000萬一1億U，凍干 粉活性3500U/mg，每罐蛋白量達(dá)10g，活性收率達(dá)50-70%,比活〉 廳00u/mg。
3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一步法制備基因重組人源銅、鋅超氧化歧 化酶工藝其特征在于目的蛋白人源銅、鋅超氧化歧化酶其分子量為 32KDo
4、 一步法制備基因重組人源銅、鋅超氧化歧化酶工藝其特征在于 LB培養(yǎng)液的制備蛋白胨56g，酵母粉28g， NaCe56g，溶液5.6L。
5、 一步法制備基因重組人源銅、鋅超氧化歧化酶工藝其特征在于改 良M9培養(yǎng)基的制備為80L發(fā)酵罐中蛋白胨800g，酵母粉500g，NaHPO4320g， KH2PO4110g， NaCel00g， NH4Ce7Og， MgSo413.4g， CaLe0.5g， CuSo410g， ZnSo40.5g,葡萄糖600g。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生物工程中酶化學(xué)，更具體地說，它是應(yīng)用一步法制備基因重組人源銅、鋅超氧化歧化酶工藝，其主要技術(shù)在于是人源SOD工程菌發(fā)酵擴(kuò)增，離心收集菌體，復(fù)合破碎，梯度升溫，離心收集上清液、過濾、超濾、凍干，本發(fā)明省去生物工程傳統(tǒng)制取工藝中的抽提、離子交換、分子篩柱層析等分離、純化工序。生產(chǎn)流程大大縮短，每生產(chǎn)一次可節(jié)約時間30小時，生產(chǎn)成本降低30％，人源SOD產(chǎn)品比活≥10000u/mg(prot)?；蛑亟M人源SOD可廣泛應(yīng)用在藥品、保健品、化妝品、酒品、牙膏等SOD產(chǎn)品中。
文檔編號C12N9/08GK101245342SQ200710055369
公開日2008年8月20日 申請日期2007年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月15日
發(fā)明者于振賢, 關(guān)曉峰, 冀清發(fā), 彪 孫, 非 孫, 朗寶輝, 李廷生, 遲春萍, 博 韋 申請人:四平華科生物技術(shù)有限責(zé)任公司