專利名稱：胚胎干細(xì)胞分化成t細(xì)胞的培養(yǎng)方法及分化培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于干細(xì)胞與免疫學(xué)領(lǐng)域，涉及干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，尤其是涉及胚胎干細(xì)胞分化成T細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
T淋巴細(xì)胞是特異性免疫應(yīng)答主要的效應(yīng)細(xì)胞之一，在感染性疾病，尤其是病毒和胞內(nèi)寄生蟲，以及腫瘤免疫中發(fā)揮重要的作用。T淋巴細(xì)胞的異常不僅可使宿主易患感染性疾病和腫瘤，還可導(dǎo)致自身免疫性疾病和過敏性疾病。臨床上常見的移植排斥和許多老年性疾病也與T淋巴細(xì)胞密切相關(guān)。
到目前為止，T淋巴細(xì)胞的發(fā)育過程和作用機(jī)制還不十分清楚。這主要是由于T淋巴細(xì)胞的發(fā)育必須依賴胸腺微環(huán)境，因此，很難在體外誘導(dǎo)出T淋巴細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體外誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞必須依賴胚胎胸腺器官培養(yǎng)或重聚胸腺器官培養(yǎng)提供立體支持和特殊的信號(hào)。
最近有文獻(xiàn)報(bào)道(Nat Immunol.2004 Apr；5(4)410-7)，通過轉(zhuǎn)染了Notchligand(Delta-1)的OP-9細(xì)胞也能在體外誘導(dǎo)出T淋巴細(xì)胞，這一發(fā)現(xiàn)為研究T淋巴細(xì)胞的發(fā)育過程提供了模型，也為獲得可用于臨床治療的T淋巴細(xì)胞提供了來源。但已報(bào)道的誘導(dǎo)體系都存在以下兩方面的缺陷(1)必須依賴外源性的細(xì)胞提供T淋巴細(xì)胞分化所需的立體支持和分化信號(hào)，這些細(xì)胞有的來源極少，有的與T細(xì)胞的某些前體細(xì)胞極其相似，還有的轉(zhuǎn)入了外源基因易導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生變異，從而限制了T細(xì)胞的應(yīng)用。(2)轉(zhuǎn)入外源基因時(shí)使用的載體等本身就有致癌致畸的危險(xiǎn)，因此，很難進(jìn)入實(shí)際的臨床應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一個(gè)胚胎干細(xì)胞分化成T細(xì)胞的培養(yǎng)方法，能克服現(xiàn)有誘導(dǎo)體系的上述缺陷。
本發(fā)明利用胚胎干細(xì)胞自身具有多向分化潛能的特性，通過不同細(xì)胞因子的組合，誘導(dǎo)其向T細(xì)胞方向分化。來源于胚胎干細(xì)胞的胚胎體在細(xì)胞因子的作用下，通過自身的空間結(jié)構(gòu)和細(xì)胞膜表面分子提供T細(xì)胞分化所需的立體支持和特殊的信號(hào)，獲得可用于臨床治療的安全的T淋巴細(xì)胞。
本發(fā)明所述的胚胎干細(xì)胞分化成T細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括以下步驟A.制備胚胎體用胰酶將胚胎干細(xì)胞消化成單個(gè)細(xì)胞接種于含15％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)5～7天，誘導(dǎo)胚胎體形成；B.將胚胎體轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)液中，所述的分化培養(yǎng)液是在含15％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中加入50～200ng/ml干細(xì)胞因子，5～20ng/ml白介素-3，5～20ng/ml白介素-7，5～20μg/ml胸腺肽；C.胰酶消化胚胎體成單個(gè)細(xì)胞，標(biāo)記T細(xì)胞特異性表面分子相應(yīng)抗體，流式細(xì)胞儀檢測T細(xì)胞數(shù)量，得到所需的T細(xì)胞。
所述的高糖DMEM培養(yǎng)液選自HYCLONE公司的Cat.No.SH30003.01的產(chǎn)品，或者GIBCO公司的同類產(chǎn)品。
效果評價(jià)分化培養(yǎng)一周后開始出現(xiàn)CD3分子表達(dá)，兩周后出現(xiàn)CD4/CD8單陽細(xì)胞，三周半至四周時(shí)CD3+細(xì)胞≥25％，CD3+CD4+細(xì)胞≥6％，CD3+CD8+細(xì)胞≥2％隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，陽性細(xì)胞百分率可能進(jìn)一步增加。
本發(fā)明還提供了一種胚胎干細(xì)胞分化成T細(xì)胞的分化培養(yǎng)基。
所述的胚胎干細(xì)胞分化成T細(xì)胞的分化培養(yǎng)基，包括凍存的細(xì)胞因子組合，含有以下成分干細(xì)胞因子50～200ng/ml白介素-3 5～20ng/ml白介素-7 5～20ng/ml胸腺肽5～20μg/ml；使用時(shí)，將其解凍后加入含15％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于摒棄了以往體外誘導(dǎo)T細(xì)胞需要依賴外源性細(xì)胞的做法，避免了轉(zhuǎn)入了外源基因易導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生變異的缺陷，利用胚胎干細(xì)胞來源的胚胎體和安全的細(xì)胞因子提供T細(xì)胞分化所需條件，直接從胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)出T淋巴細(xì)胞，為研究T細(xì)胞分化提供一個(gè)簡單有效的體外模型，為臨床應(yīng)用T細(xì)胞提供了一個(gè)安全有效的來源。


圖1為在本發(fā)明所述的T細(xì)胞誘導(dǎo)體系中誘導(dǎo)一個(gè)月后的流式細(xì)胞檢測圖；(a)圖中顯示總T細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)量的38.9％，其中CD3+CD8+細(xì)胞為29.3％；(b)圖中顯示總T細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)量的41.1％，其中CD3+CD4+細(xì)胞為33.4％；(c)圖中顯示CD4+CD8+細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)量的27.7％，CD4+細(xì)胞為6.5％，CD8+細(xì)胞為5.5％。
具體實(shí)施例方式
材料胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ES cells)，為國際通用細(xì)胞系E14.1和本發(fā)明人所在實(shí)驗(yàn)室自建的來源于B6/129的細(xì)胞系SC1001和SC1002。
儀器主要包括CO2孵箱、離心機(jī)、流式細(xì)胞儀等。
本發(fā)明所述的胚胎干細(xì)胞分化成T細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括以下步驟A.制備胚胎體用胰酶將胚胎干細(xì)胞消化成單個(gè)細(xì)胞接種于含15％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)5～7天，誘導(dǎo)胚胎體形成。
所述的高糖DMEM培養(yǎng)基選用HYCLONE公司的CAT NO.SH30003.01產(chǎn)品，或者GIBCO公司的同類產(chǎn)品。
B.將胚胎體轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)液中，所述的分化培養(yǎng)液是在含15％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中加入50～200ng/ml干細(xì)胞因子，5～20ng/ml白介素-3，5～20ng/ml白介素-7，5～20μg/ml胸腺肽；C.胰酶消化胚胎體成單個(gè)細(xì)胞，標(biāo)記T細(xì)胞特異性表面分子相應(yīng)抗體，流式細(xì)胞儀檢測T細(xì)胞數(shù)量，得到所需的T細(xì)胞。
在步驟B中，所述的分化培養(yǎng)液中加入的成分包括但不限于以下組合組合一50ng/ml干細(xì)胞因子，5ng/ml白介素-3，5ng/ml白介素-7，5μg/ml胸腺肽；
組合二100ng/ml干細(xì)胞因子，10ng/ml白介素-3，10ng/ml白介素-7，10μg/ml胸腺肽；組合三200ng/ml干細(xì)胞因子，20ng/ml白介素-3，20ng/ml白介素-7，20μg/ml胸腺肽。
效果評價(jià)分化培養(yǎng)一周后開始出現(xiàn)CD3分子表達(dá)，兩周后出現(xiàn)CD4/CD8單陽細(xì)胞，三周半至四周時(shí)CD3+細(xì)胞≥25％，CD3+CD4+細(xì)胞≥6％，CD3+CD8+細(xì)胞≥2％隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，陽性細(xì)胞百分率可能進(jìn)一步增加。
如圖1所示，在本發(fā)明所述的T細(xì)胞誘導(dǎo)體系中誘導(dǎo)一個(gè)月后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，約40％的細(xì)胞是CD3+T淋巴細(xì)胞，其中CD4+CD8+細(xì)胞占27％，CD4+細(xì)胞占6％，CD8+細(xì)胞占5.5％本發(fā)明還提供了一種胚胎干細(xì)胞分化成T細(xì)胞的分化培養(yǎng)基。
所述的胚胎干細(xì)胞分化成T細(xì)胞的分化培養(yǎng)基，包括凍存的細(xì)胞因子組合，含有以下成分干細(xì)胞因子50～200ng/ml白介素-3 5～20ng/ml白介素-7 5～20ng/ml胸腺肽5～20μg/ml；使用時(shí)，將其解凍后加入含15％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中。
該分化培養(yǎng)基的成分包括但不限于以下組合組合一50ng/ml干細(xì)胞因子，5ng/ml白介素-3，5ng/ml白介素-7，5μg/ml胸腺肽；組合二100ng/ml干細(xì)胞因子，10ng/ml白介素-3，10ng/ml白介素-7，10μg/ml胸腺肽；組合三200ng/ml干細(xì)胞因子，20ng/ml白介素-3，20ng/ml白介素-7，20μg/ml胸腺肽。
權(quán)利要求
1.胚胎干細(xì)胞分化成T細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟A.制備胚胎體用胰酶將胚胎干細(xì)胞消化成單個(gè)細(xì)胞接種于含15％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)5～7天，誘導(dǎo)胚胎體形成；B.將胚胎體轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)液中，所述的分化培養(yǎng)液是在含15％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中加入50～200ng/ml干細(xì)胞因子，5～20ng/ml白介素-3，5～20ng/ml白介素-7，5～20μg/ml胸腺肽；C.胰酶消化胚胎體成單個(gè)細(xì)胞，標(biāo)記T細(xì)胞特異性表面分子相應(yīng)抗體，流式細(xì)胞儀檢測T細(xì)胞數(shù)量，得到所需的T細(xì)胞。
2.一種胚胎干細(xì)胞分化成T細(xì)胞的分化培養(yǎng)基，其特征在于包括凍存的細(xì)胞因子組合，含有以下成分干細(xì)胞因子 50～200ng/ml白介素-35～20ng/ml白介素-75～20ng/ml胸腺肽 5～20μg/ml；使用時(shí)，將其解凍后加入含15％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中。
全文摘要
本發(fā)明屬于干細(xì)胞與免疫學(xué)領(lǐng)域，涉及胚胎干細(xì)胞分化成T細(xì)胞的培養(yǎng)方法。本發(fā)明所述的方法包括以下步驟制備胚胎體將胚胎體轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)液中；胰酶消化胚胎體成單個(gè)細(xì)胞，標(biāo)記T細(xì)胞特異性表面分子相應(yīng)抗體，流式細(xì)胞儀檢測T細(xì)胞數(shù)量，得到所需的T細(xì)胞。本發(fā)明還提供了胚胎干細(xì)胞分化成T細(xì)胞的分化培養(yǎng)基。本發(fā)明摒棄了以往體外誘導(dǎo)T細(xì)胞需要依賴外源性細(xì)胞的做法，避免了轉(zhuǎn)入了外源基因易導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生變異的缺陷，利用胚胎干細(xì)胞來源的胚胎體和安全的細(xì)胞因子提供T細(xì)胞分化所需條件，直接從胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)出T淋巴細(xì)胞，為研究T細(xì)胞分化提供一個(gè)簡單有效的體外模型，為臨床應(yīng)用T細(xì)胞提供了一個(gè)安全有效的來源。
文檔編號(hào)C12N5/08GK1804028SQ200510032739
公開日2006年7月19日 申請日期2005年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月13日
發(fā)明者項(xiàng)鵬, 李樹濃, 彭延文 申請人:中山大學(xué)