專利名稱：：由胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方法和由該方法誘導(dǎo)的肝細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及由胚胎干細(xì)胞(以下也稱為ES細(xì)胞)向肝細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方法和由該方法誘導(dǎo)的肝細(xì)胞，以及生物人工肝臟。
背景技術(shù)：
：肝臟是人體中最大的實(shí)質(zhì)器官，其功能為從糖類、蛋白質(zhì)、脂肪的代謝開始，經(jīng)膽紅素代謝、藥物代謝、血液凝固因子的生成等分支，包括未知功能的肝臟功能高達(dá)數(shù)百，在生物中起著十分重要的作用。因此，即使只是一時(shí)，嚴(yán)重的肝臟疾病對于患者的生命來說也是極度危險(xiǎn)的。另一方面，肝臟具有旺盛的再生能力，即使由于暴發(fā)性肝功能衰竭受到肝傷害，如果可以一周內(nèi)代替肝功能，患者就可恢復(fù)。對于這樣嚴(yán)重的肝病，事實(shí)上肝臟移植是最有效果的，但是鑒于捐獻(xiàn)者嚴(yán)重不足，因此很多人無法享受到這種好處。目前，在日本，作為暫時(shí)代替肝功能的手段，通過組合持續(xù)過濾透析和血漿交換，可以獲得一定程度的成活率，但是這種成活率還不夠，需要建立更有效的治療方法，對治療用人工肝臟的開發(fā)的需求正日益增加。因此，希望獲得填充了細(xì)胞的生物人工肝臟以便利用活細(xì)胞的代謝能力和蛋白質(zhì)合成能力。生物人工肝臟可以說是通過將肝細(xì)胞整合于栽體中進(jìn)行固定，模擬反應(yīng)器化的生物體內(nèi)的肝臟的人工肝臟裝置?？梢詫⒒颊叩难簩?dǎo)入到該裝置中，利用肝細(xì)胞的代謝能力來除去血液中的毒素并提供來源于肝臟細(xì)胞的凝固因子等生理活性物質(zhì)。作為細(xì)胞來源，理想的是健康的人肝細(xì)胞，但是由于捐獻(xiàn)的肝臟的不足，因此極難獲得，在歐美，不適合移植的肝臟被活用于肝細(xì)胞分離，在臨床應(yīng)用于肝細(xì)胞移植和生物人工肝臟，但是在日本，規(guī)定不適合移植的肝臟要焚燒，因此不可能活用于生物人工肝臟。作為這個(gè)問題的對策，進(jìn)行了由人外周血干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞以及肝祖細(xì)胞等誘導(dǎo)成肝細(xì)胞的研究，但是由于這些細(xì)胞缺乏增殖能力，實(shí)。另一方面，在歐美和中國，在人中進(jìn)行使用豬肝細(xì)胞的生物人工肝臟治療，但豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒、E型肝炎等人畜共通感染病被認(rèn)為是問題，今后的進(jìn)展面臨著嚴(yán)峻的現(xiàn)狀。而且，現(xiàn)在還以最終分化的人細(xì)胞為目的，研究了通過基因重組建立永生化細(xì)胞林，但是在這些使用基因重組的方法中，為了導(dǎo)入外源基因，在應(yīng)用于人時(shí)，在導(dǎo)入基因的細(xì)胞的染色體的變化和相伴隨的細(xì)胞的腫瘤化等方面障礙很大(CraigD.Woodworthetal.，MolecularandCellularBiologyOct.4492-4501，1988)。而且，關(guān)于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的使用，自2002年9月報(bào)道了對法國的X染色體連鎖先天性重復(fù)性重癥免疫缺陷癥(X-LinkedSCID)患兒，使用逆轉(zhuǎn)路病毒載體的基因治療中產(chǎn)生Y5-T細(xì)胞性白血病的事故以來，一直采用慎重的態(tài)度(S.Hacein-Bey-Abinaetal.,Science,Vol.302(17),415-419,2003)。因此，當(dāng)開發(fā)可實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用的生物人工肝臟時(shí)，需要研究更接近于自然形態(tài)的細(xì)胞來源。另一方面，在ES細(xì)胞中，存在l)可以分化成構(gòu)成生物體的所有種類的細(xì)胞，2)由于存在半永久的增殖能力，因此可以以低成本大量培養(yǎng)，3)由于不進(jìn)行基因重組也可以使用采用細(xì)胞增殖因子的誘導(dǎo)法，因此可以獲得比基因發(fā)生改變的細(xì)胞更接近于自然體的細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)。作為由肝細(xì)胞分化誘導(dǎo)肝細(xì)胞的方法，使用肝細(xì)胞增殖因子(hepatocytegrowthfactor:HGF)，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、地塞米松(dexamethasone)、制瘤素M(oncostatin)(屬于白介素6家族)、n-丁酸，但是無法i秀導(dǎo)為功能完整的肝細(xì)胞(RambhatlaLetal.，CellTransplant.Vol12，l-ll，2003、SchwartzREetal.，J.Clin.Invest.109;1291-1302，2002和特表2003-530879號公報(bào))。而且，還報(bào)道了通過在引起肝病的小鼠的肝臟中移植ES細(xì)胞，促進(jìn)ES細(xì)胞向肝細(xì)胞的分化誘導(dǎo)的實(shí)例(YamamotoHetal.Hepatology200337:983,2003),但存在操作復(fù)雜，必須從受損小鼠肝臟中回收分化的肝細(xì)胞等問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供功能完整，可大量提供的安全的肝細(xì)胞及其用途，尤其是使用肝細(xì)胞的生物人工肝臟。鑒于前述問題進(jìn)行了積極的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過使用HGF的天然的變異體(naturalvariant)-缺失型肝細(xì)胞增殖因子(以下也稱為dHGF),可以將ES細(xì)胞有效地分化誘導(dǎo)為具有功能的肝細(xì)胞，從而完成本發(fā)明。也就是說，本發(fā)明提供了如下所述的由胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方法，由該方法獲得的肝細(xì)胞，使用該肝細(xì)胞的生物人工肝臟，使用該肝細(xì)胞的藥物檢查方法，使用該肝細(xì)胞的生理活性物質(zhì)的產(chǎn)生方法。由胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方法，其特征在于在缺失型肝細(xì)胞增殖因子的存在下培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞。一種由胚胎千細(xì)胞向肝細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方法，其包括形成胚胎干細(xì)胞的胚狀體的步驟，和在缺失型肝細(xì)胞增殖因子的存在下培養(yǎng)獲得的胚狀體的步驟。根據(jù)前述第(1)項(xiàng)或(2)項(xiàng)記載的方法，所述胚胎肝細(xì)胞來源于哺乳類。根據(jù)前述第(3)項(xiàng)記載的方法，所述哺乳類為人。根據(jù)前述第(3)項(xiàng)記載的方法，所述哺乳類為小鼠。根據(jù)前述第(2)項(xiàng)至第(5)項(xiàng)任一項(xiàng)中記載的方法，所述胚狀體是由懸浮培養(yǎng)形成的。根據(jù)前述第(l)項(xiàng)至第(5)項(xiàng)任一項(xiàng)中記載的方法，所述培養(yǎng)是通過三維培養(yǎng)進(jìn)行的。由前述第(l)項(xiàng)至第(7)項(xiàng)任一項(xiàng)中記栽的方法誘導(dǎo)的肝細(xì)胞。含有前述笫(8)項(xiàng)記載的肝細(xì)胞的生物人工肝臟。生物人工肝臟的制備方法，其包括形成胚胎干細(xì)胞的胚狀體的步驟，在生物人工肝臟反應(yīng)器中填充獲得的胚狀體的步驟，和在生物人工肝臟反應(yīng)器中，在缺失型肝細(xì)胞增殖因子的存在下培養(yǎng)前述胚狀體的步驟。使用前述第(8)項(xiàng)記栽的肝細(xì)胞檢查藥物的方法。使用前述第(8)項(xiàng)記載的肝細(xì)胞生產(chǎn)生理活性物質(zhì)的方法。圖1:為按照本發(fā)明的方法，在無紡布上由小鼠ES細(xì)胞分化誘導(dǎo)成小鼠肝細(xì)胞(實(shí)施例3)的相位差顯微鏡照片。被分化誘導(dǎo)的肝細(xì)胞1中觀察到肝細(xì)胞的特征-多個(gè)核2。圖2:(a)為附著于無紡布上的纖維4上的剛接種后的胚狀體3的掃描顯微鏡照片，(b)為附著于無紡布上的纖維4上的經(jīng)分化誘導(dǎo)的肝細(xì)胞1的掃描顯微鏡照片。圖3:是以本發(fā)明的生物人工肝臟反應(yīng)器的一個(gè)實(shí)施方式為例，表示制作過程的一個(gè)實(shí)施方式的圖。(a)為在設(shè)置了裱褙5的無紡布6上安置了中空纖維膜7的圖。這里，安置了裱褙5的無紡布6上設(shè)置有切口8。(b)是表示將(a)巻成巻軸狀的過程的圖。(c)是(b)的X-X線截面放大圖。(d)是表示在兩端設(shè)置放置漏液的部件9的筒狀容器10中整合了中空纖維膜7和無紡布6構(gòu)成的巻軸的生物人工肝臟反應(yīng)器11的概略圖。圖4:是表示肝特異性的基因和內(nèi)源性標(biāo)準(zhǔn)-GAPDH基因在用本發(fā)明的方法由小鼠ES細(xì)胞分化誘導(dǎo)成小鼠肝細(xì)胞中表達(dá)的圖片。線1-6分別表示大小標(biāo)記，未分化ES細(xì)胞，伺養(yǎng)細(xì)胞，被分化誘導(dǎo)的ES細(xì)胞(實(shí)施例2)，在無紡布上的分化誘導(dǎo)的ES細(xì)胞(實(shí)施例3)和小鼠肝細(xì)胞。圖5:表示由本發(fā)明的方法分化誘導(dǎo)的小鼠肝細(xì)胞的藥物代謝能力的圖。圖6:表示由本發(fā)明的方法分化誘導(dǎo)的小鼠肝細(xì)胞的尿素產(chǎn)生能力的圖。圖7:表示由本發(fā)明的方法分化誘導(dǎo)的小鼠肝細(xì)胞的白蛋白產(chǎn)生能力的圖。圖8:表示用本發(fā)明的方法由人ES細(xì)胞形成的胚狀體(實(shí)施例5)的相位差顯微鏡照片。圖9:表示用本發(fā)明的方法由人ES細(xì)胞形成的人肝細(xì)胞(實(shí)施例5)的相位差顯微鏡照片。圖10:(a)是附著在無紡布的纖維4上的剛接種后的胚狀體23的掃描顯微鏡照片(實(shí)施例6)。(b)是附著在無紡布的纖維4上的分化誘導(dǎo)的肝細(xì)胞21(實(shí)施例6)的掃描顯微鏡照片。圖11:是表示肝細(xì)胞特異性基因-白蛋白基因和內(nèi)源性對照-P肌動蛋白基因在用本發(fā)明的方法由人ES細(xì)胞分化誘導(dǎo)成人肝細(xì)胞中的表達(dá)的圖。線l-7分別表示大小標(biāo)記，未分化人ES細(xì)胞，形成胚狀體的人ES細(xì)胞，形成胚狀體后不使用無紡布分化誘導(dǎo)的人ES細(xì)胞(實(shí)施例5)，形成胚狀體后在無紡布上分化誘導(dǎo)的人ES細(xì)胞(實(shí)施例6)，人肝細(xì)胞以及大小標(biāo)記。圖12:是用本發(fā)明的方法由在無紡布上的人ES細(xì)胞分化誘導(dǎo)成肝細(xì)胞的透射電鏡照片(實(shí)施例6)。圖13:是表示用本發(fā)明的方法被分化誘導(dǎo)成小鼠肝細(xì)胞的藥物代謝能力的圖。圖14:是表示用本發(fā)明的方法被分化誘導(dǎo)成人肝細(xì)胞的尿素產(chǎn)生能力的圖。圖15:是表示用本發(fā)明的方法被分化誘導(dǎo)成人肝細(xì)胞的白蛋白產(chǎn)生能力的圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明涉及通過使用比HGF細(xì)胞損傷性更小的HGF的天然變異體-dHGF將ES細(xì)胞分化誘導(dǎo)成肝細(xì)胞的方法。本發(fā)明的由ES細(xì)胞分化誘導(dǎo)成肝細(xì)胞的方法包括(a)形成ES作為ES細(xì)胞，優(yōu)選為哺乳類來源的，作為哺乳類，可以列舉人，食蟹猴等靈長類，小鼠等。dHGF是通過天然的HGF的剪切缺失5個(gè)氨基酸所產(chǎn)生的剪切變異體(參照FEBSLetters434(1998)，165-170)。dHGF可以按照特公平7-68272號公報(bào)和其分案申請?zhí)亻_平7-188292號公報(bào)中記載的進(jìn)行制造。而且，在這些公報(bào)中，dHGF被記載為TCF-II。ES細(xì)胞可以由受精卵持續(xù)生長的初期階段-胚進(jìn)行制造。卵子和精子成為l體的受精卵，在逐漸成長為胎兒的途中，反復(fù)分裂，分裂成2個(gè)，4個(gè)，8個(gè)，…...，在第5、6天稱為胚泡。胚泡為直徑為0.lmm左右的球狀塊，包圍內(nèi)部細(xì)胞塊，還包括胚泡腔。內(nèi)側(cè)的細(xì)胞塊生長為內(nèi)胚層、中胚層、外胚層，形成身體的所有細(xì)胞的幾個(gè)部分中，營養(yǎng)外胚層形成那些胎盤，而且形成將胚與外界隔離的袋。分解該內(nèi)部細(xì)胞塊后，取出細(xì)胞，通過在可以增殖并且不分化的環(huán)境下培養(yǎng)這些細(xì)萬包，可以制備ES細(xì)胞。因此，如前所述，ES細(xì)胞可以由胚進(jìn)^亍制造。這種ES細(xì)胞由Evans等人(Evansetal.，1981，Nature292:154-6)，和Martin等人(MartinGR.etal.，1981，ProcNat1AcadSci78:7634-8)于1981年在小鼠中建立，可以從大日本住友制藥抹式會社(大阪，日本)等作為商品購得。而且，人ES細(xì)胞由1998年Thomson等人(Thomsonetal.，Science,1998，282:1145-7)建立，可以由WiCell研究才幾構(gòu)(WiCellResearchInstitute,website,http://www.wicell.org/，Madison，威斯康星州，美國)獲得。在日本，人ES細(xì)胞的研究被指定為國家生物資源計(jì)劃，由京都大學(xué)再生醫(yī)科學(xué)研究所附屬干細(xì)胞醫(yī)學(xué)研究中心建立的人ES細(xì)胞可以按照《再生醫(yī)科學(xué)研究所人ES細(xì)胞分配規(guī)定》(平成15年11月26日施行)，在獲得文部科學(xué)大臣的確認(rèn)(承認(rèn))等一定條件下獲得?，F(xiàn)在，可以獲得人ES細(xì)胞林"KhES-l"(平成15年8月建立)，"KhES-2"(平成15年10月建立)，"KhES-3"(平成15年10月建立)。前述人ES細(xì)胞林KhES-l、KhES-2、KhES-3是采用用于體外受精或顯微受精等生殖輔助醫(yī)療而制作的受精卵的剩余胚(不移植而廢棄的受精卵)所建立的細(xì)胞林。也就是說，培養(yǎng)受精卵直至胚泡的階段，從該胚泡分離內(nèi)部細(xì)胞塊，在祠養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)，增殖，選擇非分化細(xì)胞并傳代，并重復(fù)進(jìn)行，是通過可以傳代而建立的細(xì)胞林，建立方法自身，與小鼠和猴的情況本質(zhì)上沒有區(qū)別。人ES細(xì)胞，與小鼠ES細(xì)胞不同，在飼養(yǎng)細(xì)胞上制成扁平的大體上單層的菌落，形態(tài)與猴ES細(xì)胞非常近似。人ES細(xì)胞表達(dá)未分化ES細(xì)胞中的特異性基因，而且保持正常的染色體結(jié)構(gòu)(參照末森博文，臨床病理，52:3(2004)，254-258頁)。作為前述ES細(xì)胞所表達(dá)的未分化ES細(xì)胞中的特異性基因，確認(rèn)有堿性磷酸酯(ALP)、SSEA-3和4、TRA-1-60和81，通過RT-PCR確認(rèn)了Nanog0ct-3/4、Rex-1的表達(dá)。對于核型(Gband法)，KhES-1、KhES-2在正常的2倍體中帶有雌核型，KhES-3在正常的2倍體中帶有雄核型(參照京都大學(xué)再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所附屬千細(xì)胞醫(yī)學(xué)研究中心的主頁的"關(guān)于人ES細(xì)胞的分配-人ES細(xì)胞林KhES-l、-2、-3-，，)。在本發(fā)明中，根據(jù)需要，在不分化ES細(xì)胞的條件下傳代，維持，使之增殖(以下有時(shí)將該步驟稱為制備步驟)，根據(jù)需要使用其一部分分化誘導(dǎo)成肝細(xì)胞。在制備步驟中，作為進(jìn)行ES細(xì)胞培養(yǎng)的容器，從增殖能力方面出發(fā)，優(yōu)選使用由飼養(yǎng)細(xì)胞或支架涂層的容器。作為詞養(yǎng)細(xì)胞，可以列舉經(jīng)Y射線照射處理過的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞。此外，作為支架，可以列舉層粘素、纖連蛋白、骨膠原(骨膠原IV和骨膠原I等)、體內(nèi)素、具有自身組織化能力的肽水凝膠、聚(p-N-vinylbenzy1-D-lactonamide)(PVLA)(在側(cè)鏈具有乳糖的聚苯乙烯衍生物)等。作為市售品，可以例舉有Matrigel(由Matrigel、56%的層粘素、31%的骨膠原IV、8%的體內(nèi)素構(gòu)成，Becton，DickinsonandCompany制)、GrowthFactorReducedMatrigel(GFRMatrigel、61%的層粘素、30°/。的骨膠原IV、7%的體內(nèi)素構(gòu)成，Becton，Dickinson&Company制)、PuraMatrix(PuraMatrix、16個(gè)氨基酸殘基(Ac-(RADA)4-CONH2),長度為約5nm的寡肽-肽水凝膠，(抹)ThreeDayMatrixJapanCo,制)、聚(p-N-vinylbenzyl-D-lactonamide)(PVLA)(CelagixResltd.制)等。小鼠來源的ES細(xì)胞，優(yōu)選使用以飼養(yǎng)細(xì)胞涂層的培養(yǎng)容器。小鼠來源的ES細(xì)胞，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例-生物人工肝臟中使用時(shí)，由于存在混入異種生物來源的細(xì)胞的危險(xiǎn)，因此不使用用小鼠來源的飼養(yǎng)細(xì)胞涂層的培養(yǎng)容器，而優(yōu)選使用經(jīng)支架涂層的容器。而且，由于人ES細(xì)胞的培養(yǎng)狀態(tài)良好，因此更優(yōu)選使用前述Matrigel,GrowthFactorReducedMatrigel(GFRMatrigel)、PuraMatrix。在調(diào)制過程中，作為培養(yǎng)液、培養(yǎng)條件，可以采用常規(guī)的方法，例如，作為培養(yǎng)液，可以列舉(1)ES培養(yǎng)液(R-ES-IOI，購自大日本住友制藥株式會社)Dulbecco'sModifiedEagle(薩M)培養(yǎng)液(1:1容量比)的混合液中補(bǔ)充了15。/。胎兒牛血清(FBS)、1%非必須氨基酸、1%核苷酸、110jaM2-巰基乙醇(購自大日本住友制藥林式會社)、1%青霉素和鏈霉素、1%谷氨酸和500U/ml小鼠來源的白血病抑制因子(LIF)(購自大日本住友制藥林式會社)，(2)靈長類ES細(xì)胞用培養(yǎng)基((林)ReprocellInc.制等)，(3)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞用馴化培養(yǎng)基(R&DSystem制等)。培養(yǎng)溫度優(yōu)選為36~37°C，pH優(yōu)選在7.3~7.4范圍內(nèi)。在小鼠ES細(xì)胞的制備過程中，為了抑制分化一般使用白血病抑制因子(LIF)，但是在人ES細(xì)胞的制備過程中白血病抑制因子(LIF)對分化抑制沒有效果，優(yōu)選使用Matrigel等支架。而且，作為不使用伺養(yǎng)細(xì)胞而使用支架的培養(yǎng)方法，優(yōu)選Geron乂^司(MelonoPark，加州，美國)公開的方法(ProtocolsfortheMaintenanceofHumanEmbryonicStemCellsinFeederFreeConditions)。在本發(fā)明的方法中，在將ES細(xì)胞向肝細(xì)胞分化誘導(dǎo)的培養(yǎng)過程中使用的dHGF的濃度優(yōu)選比lng/ml高，并比1000ng/ml低，更優(yōu)選lOng/ml-500ng/ml，最優(yōu)選100ng/ml。dHGF的濃度在未達(dá)到前述范圍時(shí)，存在無法實(shí)現(xiàn)向肝細(xì)胞的分化的傾向，另一方面，在超出前述范圍時(shí)，存在發(fā)現(xiàn)輕度細(xì)胞損傷性的傾向。在本發(fā)明中，可以在ES細(xì)胞中直接添加dHGF進(jìn)行分化誘導(dǎo)，優(yōu)選首先由ES細(xì)胞形成胚狀體(Embryoidbody:EB),而后添加dHGF進(jìn)行分化誘導(dǎo)。作為形成胚狀體的方法，可以例舉通過將用培養(yǎng)液稀釋成約10萬個(gè)/ml的ES細(xì)胞以液滴狀(l滴約30Ml)接種于Petridish的孔蓋中，液滴以在孔蓋內(nèi)側(cè)懸掛但不落下的狀態(tài)培養(yǎng)兩天左右，形成胚狀體，然后用培養(yǎng)液洗脫胚狀體，在Petridish中懸浮培養(yǎng)，使之成熟的hanging-drop法；在10cm的Petridish中約10ml的培養(yǎng)液中使約500萬個(gè)ES細(xì)胞懸浮培養(yǎng)5天左右，形成胚狀體的懸浮培養(yǎng)的形成法等。從簡便性方面出發(fā)，更優(yōu)選用懸浮培養(yǎng)進(jìn)行的胚狀體形成法。在本發(fā)明中，優(yōu)選一般在胚狀體的形成過程中3~7天左右的培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)移到分化誘導(dǎo)步驟中。在胚狀體形成過程中，作為培養(yǎng)液、培養(yǎng)條件，可以采用常規(guī)的方法，例如，作為培養(yǎng)液，可以列舉(1)ES分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(DMEMF12)[DMEM(GIBCOBRL、InvitrogenCorporation制)和營養(yǎng)素混合物F-12(ham)(GIBC0BRL、InvitrogenCorporation制)以1:1容量比的比例混合，加入4.5mg/ml濃度的葡萄糖，20%FBS、2mML-谷氨酰胺、25mM匿ES(GIBCOB壯、InvitrogenCorporation制)、100mg/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素(Sigma-AldrichCORPORATION制)，不加入LIF]，(2)靈長類ES細(xì)胞用培養(yǎng)基((株)ReprocellInc.制等)，(3)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞用馴化培養(yǎng)基(R&Dsystem制等)。培養(yǎng)溫度優(yōu)選為3637。C,pH優(yōu)選在7.3~7.4范圍內(nèi)。本發(fā)明中，在進(jìn)行分化誘導(dǎo)的培養(yǎng)過程中，可以使用平面培養(yǎng)和三維培養(yǎng)的任一種，但是，近年來，逐漸了解，通過在支架(基礎(chǔ))上，三維培養(yǎng)細(xì)胞，可以制作接近于生物體內(nèi)環(huán)境的條件，細(xì)胞功能提高，從肝功能提高的方面出發(fā)，優(yōu)選三維培養(yǎng)。作為在三維培養(yǎng)中使用的支架，可以列舉層粘素、纖連蛋白、骨膠原IV、骨膠原I等骨膠原、體內(nèi)素、肽水凝膠、聚(p-N-vinylbenzyl-D-lacto誦ide)(PVU)等。作為市售品，可以例舉有前述Matrigel、GFRMatrigel、PuraMatrix等。而且，可以^f吏用后述的無紡布等。在分化誘導(dǎo)步驟中，作為培養(yǎng)液、培養(yǎng)條件，可以釆用常規(guī)的方法，例如，作為培養(yǎng)液，可以列舉(1)ES分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(DMEMF12)[DMEM(GIBCOBRL、InvitrogenCorporation制)和營養(yǎng)素混合物F-12(ham)(GIBC0BRL、InvitrogenCorporation制)以1:1容量比的比例混合，加入4.5mg/ml濃度的葡萄糖，20%FBS、2mML-谷氨酰胺、25mMHEPES(GIBC0BRL、InvitrogenCorporation制)、100mg/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素(Sigma-AldrichCORPORATION制)，不加入LIF]，(2)靈長類ES細(xì)胞用培養(yǎng)基((林)ReprocellInc.制等)，(3)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞用馴化培養(yǎng)基(R&Dsystem制等)。培養(yǎng)溫度優(yōu)選為36~37。C，pH優(yōu)選在7.3~7.4范圍內(nèi)。培養(yǎng)時(shí)間為14~21天左右。在本發(fā)明的分化誘導(dǎo)步驟中，除了dHGF之外還可以一起使用1種或2種以上的各種有機(jī)溶劑、細(xì)胞素、激素等。這些有機(jī)溶劑、細(xì)胞素、激素等，如果對細(xì)胞沒有不良影響，可以使用任意一種，但是優(yōu)選以往細(xì)胞的分化中使用的。具體的是，可以列舉二甲基亞砜(DMS0)、二甲基乙酰胺(DMA)、六亞甲基二乙酰胺、以及聚乙烯二乙酰胺等有機(jī)溶劑，activinA、bFGF、糖類皮質(zhì)激素、上皮增殖因子(EGF)、胰島素、TGF-oc、TGF-^、FGF、肝素、地塞米松，和HGF、IL-1、IL-6、IGF-I、IGF-II以及HBGF-1等細(xì)胞素或激素等。通過形態(tài)學(xué)的特征的觀察和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)可以確認(rèn)用本發(fā)明的方法由ES細(xì)胞分化誘導(dǎo)成的肝細(xì)胞。作為形態(tài)學(xué)的確認(rèn)方法，可以例舉有確認(rèn)用相位差型顯微鏡觀察到的具有多個(gè)核的細(xì)胞和用電子顯微鏡觀察到的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在豐富的顆粒，尤其是糖原顆粒這樣的肝細(xì)胞所特異的形態(tài)學(xué)特征。而且，還可以通過RT-PCR根據(jù)基因的表達(dá)評價(jià)誘導(dǎo)的肝細(xì)胞的基因表達(dá)。如果可以通過RT-PCR等確認(rèn)表達(dá)白蛋白基因，不表達(dá)未分化基因-ot-胎兒球蛋白，可以稱之為分化被誘導(dǎo)。而且，作為表示作為肝細(xì)胞的成熟度.的指標(biāo)，優(yōu)選確認(rèn)上皮細(xì)胞的標(biāo)記-CK18(細(xì)胞角蛋白18),G6P(葡萄糖6磷酸化酶)、TAT(酪氨酸氨基酸轉(zhuǎn)移酶)、HNF3b(肝細(xì)胞核因子3p)的基因表達(dá)。而且，是否可以實(shí)際作為肝細(xì)胞行使功能，在培養(yǎng)基中添加氨、利多卡因、安定等是否可以代謝是很主要的方面。而且，如果在培養(yǎng)基中產(chǎn)生白蛋白、尿素，可以認(rèn)為分化成功能充分的肝細(xì)胞。在本發(fā)明中，如果使ES細(xì)胞增殖到所需要的細(xì)胞數(shù)，通過使用dHGF進(jìn)行向肝細(xì)胞的分化誘導(dǎo)，不需要導(dǎo)入基因，可以大量供給安全的肝細(xì)胞。通過以其作為生物人工肝臟的細(xì)胞源，可以使大眾受益，生物人工肝臟的開發(fā)大有希望。因此，本發(fā)明的還有一個(gè)方式為含有由ES細(xì)胞分化誘導(dǎo)成的肝細(xì)胞的生物人工肝臟及其制備方法。可以認(rèn)為在制備本發(fā)明的生物人工肝臟時(shí)，填充于反應(yīng)器內(nèi)時(shí)的細(xì)胞的分化程度很重要。通過使ES細(xì)胞形成胚狀體，增強(qiáng)與無紡布等的支架的粘著性。此外，附著于無紡布等的支架上的細(xì)胞呈現(xiàn)三維的球形。近年來，了解了通過在支架上三維培養(yǎng)細(xì)胞可以制備接近于生物體內(nèi)環(huán)境的條件，細(xì)胞功能提高，在無紡布等支架上培養(yǎng)細(xì)胞，功能有效提高。因此，在胚狀體形成后，ES細(xì)胞填充于反應(yīng)器中，通過用dHGF進(jìn)行三維的分化誘導(dǎo)，與平面培養(yǎng)相比，肝細(xì)胞特異性的高等的功能-氨代謝能力等大幅增加。因此，優(yōu)選在促進(jìn)由ES細(xì)胞形成胚狀體后，將細(xì)胞填充于反應(yīng)器中，用本發(fā)明的誘導(dǎo)法進(jìn)行向肝細(xì)胞的分化。作為生物人工肝臟，可以列舉中空纖維型反應(yīng)器(裝置)和組合了分離'培養(yǎng)細(xì)胞的Hybrid型的人工肝臟等。生物人工肝臟存在安置于體外并與血管連接，安置于體內(nèi)并與血管連接，或者不與血管連接但安置于腹腔內(nèi)這三種形態(tài)。本發(fā)明的肝細(xì)胞可以在任意一種形態(tài)的生物人工肝臟中使用，但是ES細(xì)胞一旦分化誘導(dǎo)，就喪失增殖能力，殘留分化不充分的ES細(xì)胞時(shí)，如果將細(xì)胞移植于生物體內(nèi)，由于存在發(fā)生畸胎瘤的可能性，因此從回避伴隨細(xì)胞移入的危險(xiǎn)性的方面出發(fā)，優(yōu)選體外型。生物人工肝臟的開發(fā)中，反應(yīng)器的設(shè)計(jì).開發(fā)是十分重要的要素。作為生物反應(yīng)器，已知有以在CirceBiomedical公司(Lexington,馬賽諸塞州，美國)的支持下的Cedars-SainaiMedicalCenter(LosAngeles，加州，美國)的Demetriou等為中心的使用豬肝細(xì)胞的生物人工肝臟治療用HepatAssist(HuiT，RozgaJ，DemetriouAA.JHepatobiliaryPancreatSurg2001;8:1-15)和^f吏用豬肝臟的德、國的Gerlach等的MELS(ModularExtracorporealLiverSystem)等各種類型。這些反應(yīng)器當(dāng)然可以在本發(fā)明中使用，但是由于沒有肝細(xì)胞附著的支架，存在有細(xì)胞僅僅只以填充于中空纖維內(nèi)的空間或中空纖維外懸浮的狀態(tài)的傾向。肝細(xì)胞在懸浮的狀態(tài)的下，存在分化功能不充分表達(dá)的傾向，而且與周圍的細(xì)胞沖突，容易受壓力刺激。因此，在本發(fā)明中，優(yōu)選由可以給肝細(xì)胞提供支架的中空纖維和無紡布等支架構(gòu)成的反應(yīng)器。作為中空纖維膜，如果細(xì)胞附著在膜表面且不妨礙物質(zhì)交換，可以使用任意一種，具體優(yōu)選，用于以往醫(yī)療用途的市售物，例如，優(yōu)選聚砜膜，乙烯-乙酸乙烯無規(guī)共聚物皂化物膜(例如，商品名EVAL，KurarayMedical林式會社制等)等。市售的中空纖維膜的孔徑，根據(jù)其用途，存在透析膜(5nm)、血漿成分分離膜(2G30nm)、血漿分離膜(30~200nm)等。從物質(zhì)的透過性出發(fā)，優(yōu)選血漿分離膜(2030nm)。為了避免免疫排異，最優(yōu)選30認(rèn)100mn，以便流經(jīng)中空纖維內(nèi)的血液中的免疫載體細(xì)胞和免疫球蛋白不與填充于中空纖維外的無紡布等支架的細(xì)胞直接接觸。作為無紡布，優(yōu)選加工修飾成可以粘著細(xì)胞的無紡布。作為無紡布的纖維，可以例舉有聚四氟乙烯(PTFE)等。尤其是，從其加工的容易程度出發(fā)，優(yōu)選在聚四氟乙烯(PTFE)中施加了聚氨基酸氨基甲酸酯(PAU)加工的纖維。以本發(fā)明的生物人工肝臟反應(yīng)器的一個(gè)實(shí)施方式為例，直至添充的過程示于圖3。在設(shè)置了裱褙5的無紡布6上安置中空纖維膜7(圖3(a))。其中，在安置了裱褙5的無紡布6上設(shè)置了切口8。將(a)巻成巻軸狀(圖3(b))。其X-X線截面為(圖3(c))。其整合于在兩端設(shè)置放置漏液的部件9的筒狀容器10中。反應(yīng)器11中設(shè)置了細(xì)胞注入口12和可以進(jìn)行細(xì)胞的取樣的取出口13，切口8i殳置成與細(xì)胞注入口12連接。而且，生物人工肝臟治療，為了安全又科學(xué)地施行，優(yōu)選用將以下功能一體化的裝置實(shí)施l)人工肝臟反應(yīng)器的流入壓與流出壓在反應(yīng)器中的監(jiān)視，2)出現(xiàn)氣泡時(shí)的警告的操作，3)反應(yīng)器的暖化(37度)等。作為這樣的生物人工肝臟，在中空纖維無紡布型反應(yīng)器中填充新鮮分離豬肝臟細(xì)胞、可逆性永生人肝細(xì)胞，在猴肝衰模型中的動物模型獲得了良好的成績(小林直哉等，《生物反應(yīng)器人工肝臟》，肝膽胰，2003年，第46巻，p381-393)。而且，用本發(fā)明的方法由ES細(xì)胞分化誘導(dǎo)成的肝細(xì)胞，尤其是人肝細(xì)胞作為藥物的代謝試驗(yàn)用細(xì)胞是有用的。也就是說，作為新藥開發(fā)和安全性試驗(yàn)、毒性試驗(yàn)等中的試驗(yàn)用細(xì)胞是有用的。肝細(xì)胞為各種藥物代謝的中心，為了檢測藥物的毒性和安全性，需要給肝細(xì)胞施以藥物來調(diào)查代謝。然后，在物質(zhì)代謝中，由于人和實(shí)驗(yàn)動物中差異很大，因此最終的測試，即使用人肝細(xì)胞的試驗(yàn)是不可缺少的。在這一方面，可以大量提供品質(zhì)均一的人肝細(xì)胞的本發(fā)明是有用的。作為這種代謝試驗(yàn)中使用的裝置，可以使用與前述的生物人工肝臟結(jié)構(gòu)相同的裝置等。而且，在生理活性物質(zhì)的產(chǎn)生中可以使用用本發(fā)明的方法由ES細(xì)胞分化誘導(dǎo)成的肝細(xì)胞，尤其是人肝細(xì)胞。作為這種生理活性物質(zhì)，可以例舉有白蛋白、各種血液凝固因子等。作為這種生理活性物質(zhì)的制備裝置，可以使用與前述生物人工肝臟結(jié)構(gòu)相同的裝置等。以下，以使用小鼠和人來源的ES細(xì)胞的實(shí)施例為例說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受其限制。實(shí)施例制造例1ES細(xì)力包的制備使用導(dǎo)入了新霉素抗性基因的飼養(yǎng)細(xì)胞(小鼠來源的胚胎成纖維細(xì)胞，購自大日本住友制藥林式會社)，使用涂覆了濃度為0.1%的明膠水(目錄編號R-ES-006B，購自大日本住友制藥林式會社)的培養(yǎng)瓶T-75(Falcon公司制，Becton，DickinsonandCompany出售)培養(yǎng)129v小鼠來源的ES細(xì)胞(購自大日本住友制藥林式會社)。在培養(yǎng)液中使用在ES培養(yǎng)液(R-ES-101，購自大日本住友制藥林式會社)Dulbeccc/sModifiedEagle(DMEM)培養(yǎng)液的混合液(1:1容量比)中補(bǔ)充了15%胎兒牛血清(FBS)、1°/。非必須氨基酸、1%核苷酸、110juM2-巰基乙醇(購自大日本住友制藥林式會社)、1%青霉素和鏈霉素、1%谷氨酸和500U/ml小鼠來源的白血病抑制因子(LIF)(購自大日本住友制藥林式會社)的培養(yǎng)液。培養(yǎng)液每日更換，ES細(xì)胞每3天傳代。ES細(xì)胞在培養(yǎng)板上所占的比例達(dá)到80%~90%的狀態(tài)時(shí)，用兩個(gè)階段式處理，也就是首先添加0.25。/。濃度的胰蛋白酶-EDTA(GIBCOBRL、InvitrogenCorporation制)，經(jīng)過45秒后，除去胰蛋白酶-EDTA，同時(shí)除去飼養(yǎng)細(xì)胞(ES細(xì)胞在該階段還殘留于培養(yǎng)板中)，接著通過兩分鐘后添加ES培養(yǎng)液進(jìn)行剝離，回收殘留于培養(yǎng)板中的ES細(xì)胞。實(shí)施例1在涂覆了濃度為0.1%的明膠水(目錄編號R-ES-006B，購自大日本住友制藥林式會社)的培養(yǎng)瓶T-75(Falcon公司制，Becton，DickinsonandCompany出售)，添力口10ml的ES分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(DMEMF12)中添加濃度為100ng/ml的小鼠來源的dHGF(由第一制藥林式會社(東京)提供)和濃度為100ng/ml的bFGF，濃度為1%的DMSO(Sigma-AldrichCorp.制)，l(T7摩爾濃度的地塞米柏^((Sigma-AldrichCorp.制)，進(jìn)行由制造例1獲得的500萬個(gè)ES細(xì)胞向肝細(xì)胞的分化誘導(dǎo)培養(yǎng)。DMEMF12的組成是DMEM(GIBC0BRL、InvitrogenCorporation制)和營養(yǎng)素混合物F-12(ham)(GIBC0BRL、InvitrogenCorporation制)以1:1的比例混合，加入4.5mg/ml濃度的葡萄糖，20%FBS、2mML-谷氨酰胺、25mMHEPES(GIBCOBRL、InvitrogenCorporation制)、100mg/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素(Sig歸-AldrichCORPORATION制)，不加入LIF。培養(yǎng)液每3天更換一次。培養(yǎng)開始14天后進(jìn)行向肝細(xì)胞的分化誘導(dǎo)效果的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)具有有數(shù)個(gè)核小體的核這樣的所有肝細(xì)胞的形態(tài)學(xué)的特征，白蛋白的表達(dá)，確認(rèn)了向肝細(xì)胞的分化。實(shí)施例2在10cm滅菌皿(淺型90xi5mm,商品編號SH90-15，AsahiTechnoglass林式會社制)中使用10ml的ES培養(yǎng)液(R-ES-101)培養(yǎng)500萬個(gè)由制造例1獲得的小鼠ES細(xì)胞，使之懸浮培養(yǎng)5天，形成胚狀體。接著，除了使用獲得的胚狀體代替ES細(xì)胞之外，其與以與實(shí)施例1同樣方式誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞。實(shí)施例3將以與實(shí)施例2同樣方式形成的胚狀體，以3x1(T個(gè)細(xì)胞/cW的濃度接種于涂覆了lcmxlcm大小的具有細(xì)胞粘著性的聚氨基酸氨基甲酸酯(PAU)加工的PTFE(聚四氟乙烯)無紡布(KurarayMedical林式會社制)的12孔培養(yǎng)板(正式名:Multiwell12-孔Falcon,Falcon公司制，Becton，DickinsonandCompany出售)上，與實(shí)施例l一樣，使用ES分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基DMEMF12，添加濃度為100ng/ml的小鼠來源的dHGF(由第一制藥林式會社(東京)提供)和濃度為100ng/ml的bFGF,濃度為1%的而0(Sigma-AldrichCorp.制)，10—7摩爾濃度的地塞米松((Sigma-AldrichCorp.制)，培養(yǎng)14天，誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞。培養(yǎng)液每3天更換。用相位差顯微鏡(OlympusCK40，Olympus林式會社制)獲得的細(xì)胞的形態(tài)(圖1)。而且，用掃描電子顯微鏡觀察了接種后的胚狀體在無紡布纖維4上的附著情況(圖2(a))和14天后被分化誘導(dǎo)的肝細(xì)胞(圖2(b))。符號l表示被分化誘導(dǎo)的肝細(xì)胞，符號2表示核，符號3表示胚狀體，符號4表示無紡布的纖維。制造例2生物人工肝臟反應(yīng)器的制備按照以下步驟制造中空纖維和無紡布構(gòu)成的全血環(huán)流型系統(tǒng)的生物人工肝臟(BAL)(參照圖3)。根據(jù)中空纖維膜的種類，如表l所示，分別示為BAL-1BAL-<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>KurarayMedical林式會社制用人造纖維裱褙的無紡布(10x1Ocm)上有規(guī)則地設(shè)置500根1Ocm的中空纖維膜(參照圖3(a)),將其巻成巻軸狀(參照圖3(b))。截面的模式圖示于圖3(c)。這種無紡布和中空纖維膜構(gòu)成的巻軸整合到在兩端設(shè)置了防止液漏的部件的筒狀容器中(參照圖3(d))。而且，作為無紡布，使用具有細(xì)胞粘著性的聚氨基酸氨基曱酸酯(PAU)加工的PTFE無紡布(KurarayMedical林式會社制)。為了判定獲得的反應(yīng)器的生物體適應(yīng)性，將各個(gè)反應(yīng)器分別裝于正常豬的頸部動靜脈間使之運(yùn)作，結(jié)果可以對24小時(shí)循環(huán)動態(tài)沒有不良影響地安全地使之運(yùn)作。而且，沒有發(fā)現(xiàn)紅血球血小板等血球成分的減少。而且，為了安全且科學(xué)地施行BAL治療，開發(fā)了集以下功能為一體的裝置1)BAL反應(yīng)器的流入壓與流出壓在反應(yīng)器中的監(jiān)視，2)出現(xiàn)氣泡時(shí)的警告的操作，3)反應(yīng)器的暖化(37度)，通過豬實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證系統(tǒng)運(yùn)作良好。實(shí)施例4在由前述制造例2獲得的生物人工肝臟反應(yīng)器BAL-2中，在中空纖維外的空間中填充了實(shí)施例2中獲得的胚狀體，10mlES細(xì)胞分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基DMEMF12中添加了濃度為100ng/ml的小鼠來源的dHGF(由第一制藥林式會社(東京)提供)和濃度為100ng/ral的小鼠來源的bFGF,濃度為1%的DMSO(Sigma-AldrichCorp.制)，10—7摩爾濃度的地塞米松((Sigma-AldrichCorp.制)，進(jìn)行向肝細(xì)胞的分化誘導(dǎo)培養(yǎng)。每3天更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)14天后進(jìn)行分化誘導(dǎo)效果的研究。試驗(yàn)例1誘導(dǎo)的肝細(xì)胞中的基因表達(dá)通過RT-PCR法，研究與肝臟代謝相關(guān)的重要基因，即CK18(細(xì)胞角蛋白18)，G6P(葡萄糖6磷酸化酶)、TAT(酪氨酸氨基酸轉(zhuǎn)移酶)、白蛋白、AFP(a-fetoprotein)以及HNF3b(肝細(xì)胞核因子3p)基因在誘導(dǎo)的肝細(xì)胞(實(shí)施例2和3)中的表達(dá)。還研究了作為內(nèi)源性對照的GAPDH基因的表達(dá)。在RT-PCR法中，再用0.25%胰蛋白酶-EDTA(GIBCOBRL、InvitrogenCorporation制)處理細(xì)胞后進(jìn)行回收，用RNATrizol(InvitrogenCorporation制)按照制品的處理"i兌明書提取RNA。在22X:iO分鐘，再在42。C20分鐘，用RNA逆轉(zhuǎn)錄酶使1jug總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。將獲得的2yg的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，用20pmol/ml各種引物，用AmpliTagGold試齊'J盒(PerkinElmer/Cetus乂>司，NoRwalk，力口州，美國)，按照其規(guī)程用于PCR擴(kuò)增。對各基因的引物和PCR條件記載如下。小鼠OQ8基因(182bp，59。C,35個(gè)循環(huán))5，引物5，-CGATACAAGGCACAGATGGA(序列號1)3，引物5，—CTTCTCCATCCTCCAGCAAG(序列號2)小鼠G6P基因(206bp,57X:，35個(gè)循環(huán))5，引物5，-CAGGACTGGTTCATCCTT(序列號3)3，引物5，-GTTGCTGTAGTAGTCGGT(序列號4)小鼠TAT基因(210bp，55'C，35個(gè)循環(huán))5，引物5，-ACCTTCAATCCCATCCGA(序列號5)3，引物5，-TCCCGACTGGATAGGTAG(序列號6)小鼠白蛋白基因(174bp,59'C,35個(gè)循環(huán))5，引物5，-GCTAGGCACACAGTGCTTG(序列號7)3，引物5，-CAGGATTGCAGACAGATAGTC(序列號8)小鼠AFP基因(300bp，59。C，32個(gè)循環(huán))5，引物5，-CACTGCTGCMCTCTTCGTA(序列號9)3，引物5，-CTTTGGACCCTCTTCTGTGA(序列號10)小鼠HNF3b基因(500bp，60。C，35個(gè)循環(huán))5，引物5，-TATTGGCTGCAGCTAAGCGG(序列號11)3，引物5，-GCATCGGACTCAGGTGAGGT(序列號12)小鼠GAPDH基因(459bp，60C32個(gè)循環(huán))5，引物5，-CAGCCGAGCCACATC(序列號13)3，引物5，-TGAGGCTGTTGTCATACTTCT(序列號14)結(jié)果示于圖4。線1至6分別表示大小標(biāo)記、未分化ES細(xì)胞、祠養(yǎng)細(xì)胞、被分化誘導(dǎo)的ES細(xì)胞(實(shí)施例2)，在無紡布上的分化誘導(dǎo)的ES細(xì)胞(實(shí)施例3)和小鼠肝細(xì)胞。實(shí)施例2和3中誘導(dǎo)的肝細(xì)胞中，確認(rèn)了與肝臟細(xì)胞相關(guān)的重要基因，CK18(細(xì)胞角蛋白18)，G6P(葡萄糖6磷酸化酶)、TAT(酪氨酸氨基酸轉(zhuǎn)移酶)、白蛋白和HNF3b(肝細(xì)胞核因子3P)的基因表達(dá)，尤其是，用無紡布誘導(dǎo)的肝細(xì)胞(實(shí)施例3)中，觀察到CK18(細(xì)胞角蛋白18)、G6P(葡萄糖6磷酸化酶)、TAT(酪氨酸氨基酸轉(zhuǎn)移酶)、白蛋白基因的表達(dá)增強(qiáng)，分化細(xì)胞的標(biāo)記-AFP(甲胎蛋白)表達(dá)的消失。該結(jié)果表明，通過使用無紡布，可以更有效地誘導(dǎo)向肝細(xì)胞的分化誘導(dǎo)。試驗(yàn)例2肝功能的測定氨的代謝分化誘導(dǎo)開始14天后將實(shí)施例2~4中獲得的肝細(xì)胞的培養(yǎng)液換成新的培養(yǎng)液。在該培養(yǎng)液中，負(fù)栽1.4毫摩爾的四氯化氨，4小時(shí)后采集10pl培養(yǎng)液，測定氨濃度。(b)安定的代謝分化誘導(dǎo)開始14天后將實(shí)施例2~4中獲得的肝細(xì)胞的培養(yǎng)液換成新的培養(yǎng)液。在該培養(yǎng)液中，以終濃度ljug/ml負(fù)載安定，4小時(shí)后采集1000m1培養(yǎng)基，測定安定濃度。(C)利多卡因的代謝分化誘導(dǎo)開始14天后將實(shí)施例2~4中獲得的肝細(xì)胞的培養(yǎng)液換成新的培養(yǎng)液。在該培養(yǎng)液中，以終濃度lmg/ml負(fù)載利多卡因，4小時(shí)后采集lOOO)a1培養(yǎng)基，測定利多卡因濃度。前述(A)~(C)的代謝率示于圖5。代謝率用負(fù)載藥物時(shí)的該藥物的濃度減去4小時(shí)后的各藥物濃度的值與藥物負(fù)載時(shí)的藥物的濃度的比值表示。以各實(shí)施例為基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)了藥物代謝能力，但是通過在無紡布中的培養(yǎng)，進(jìn)而在反應(yīng)器中的三維培養(yǎng)，清楚可見藥物代謝能力增強(qiáng)。(D)尿素的產(chǎn)生與前述(A)相同，負(fù)載1.4毫摩爾的四氯化氨，4小時(shí)后采取培養(yǎng)液，測定尿素的產(chǎn)生量。在實(shí)施例2~4中，分別為相當(dāng)于100萬個(gè)細(xì)胞的21.4ug、22.2jag和24.7pg(圖6)。(E)白蛋白的產(chǎn)生分化誘導(dǎo)開始14天后將實(shí)施例2~4中獲得的肝細(xì)胞的培養(yǎng)液換成新的培養(yǎng)液。然后，在培養(yǎng)24小時(shí)后收集培養(yǎng)液，使用小鼠白蛋白ELISA試劑盒(商品編號E90-134,Funakoshi林式會社制)測定白蛋白的產(chǎn)生量。白蛋白的產(chǎn)生量，在實(shí)施例2~4中，分別為相當(dāng)于lml的500ng、850ng和920ng(圖7)。清楚可見通過在無紡布上的培養(yǎng)，進(jìn)行進(jìn)行三維培養(yǎng)，白蛋白產(chǎn)生能力增強(qiáng)。參考例填充了新鮮豬肝臟細(xì)胞的生物人工肝臟的功能評價(jià)按照設(shè)置動物實(shí)驗(yàn)處理指南，用檢疫后的食蟹猴(購自CleaJapan),研究制造例1中制備的生物人工肝臟反應(yīng)器的安全性和有效性。將約10億個(gè)豬肝臟細(xì)胞(生存率>90%)填充于制造例1中制備的生物人工肝臟反應(yīng)器BAL-1中。新鮮分離的豬肝細(xì)胞，通過采用disperse和膠原酶的4階段環(huán)流法分離外科切除的肝臟外測區(qū)域(丸山昌伸，小林直哉，都津川敏范等人，OrganBiology,Vol.9，No.3.295-301，2002)。通過在雄性食蟹猴(4kg，n-6)中靜脈注射0.5g/kg的D-半乳糖胺(購自Sigma公司)，誘導(dǎo)藥物性肝功能紊亂。在給藥D-半乳糖胺18小時(shí)后，在全身麻醉下在治療組的猴(n-2)的左內(nèi)頸動脈插入原子6Fr的導(dǎo)管(AtomMedicalCo.,Tokyo,Japan)，此時(shí)，與填充了豬肝臟細(xì)胞的生物人工肝臟反應(yīng)器連接。用PERISTAB10-MINIPUNP(ATT0，東京，日本)作為泵，以10ml/分的流量使之體外循環(huán)6小時(shí)。麻醉，使用DIPRIVAN作為靜脈麻醉(5ml/小時(shí))。作為抗血栓療法，在血流通過反應(yīng)器之前，從反應(yīng)器的中樞側(cè)注入1000個(gè)單位的肝素，以后的體外循環(huán)中通過持續(xù)注入肝素(500個(gè)單位肝素/小時(shí))，進(jìn)行全身的肝素化。作為陰性對照組(n-2)，使用不填充細(xì)胞的空反應(yīng)器進(jìn)行同樣的試驗(yàn)。結(jié)果是，在陰性對照組中，兩例猴都在D-半乳糖胺給藥后l周內(nèi)，由于肝衰而死亡。通過解剖確認(rèn)了肝臟的出血壞死，顯著的萎縮，積存了黃疽性胸腹水，在組織學(xué)上也確認(rèn)了肝細(xì)胞的大范圍的壞死。另一方面，填充了約10億個(gè)豬肝臟細(xì)胞的組均生存3周以上，解剖也沒有發(fā)現(xiàn)任何異常。制造例3人ES細(xì)胞的制備作為人來源的ES細(xì)胞，使用KhES-l(按照由京都大學(xué)再生醫(yī)科學(xué)研究所的"再生醫(yī)科學(xué)研究所人ES細(xì)胞分配規(guī)定"分配的)。本發(fā)明的培養(yǎng)按照Geron^>司7>開的培養(yǎng)方法(protocolsfortheMaintenanceofHumanEmbryonicStemCellsinFeederFreeConditions,Geron公司的網(wǎng)址(http://www.geron.com))進(jìn)行。具體如下所述培養(yǎng)。培養(yǎng)板，使用涂覆了Matrigel(Becton，DickinsonandCompany制)的6孑L板(Falcon乂>司制，Becton，DickinsonandCompany出售)，培養(yǎng)液使用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞用馴化培養(yǎng)基(目錄編號AR005,R&DSystem公司制)作為ES培養(yǎng)液。培養(yǎng)液每日更換，更換時(shí)在培養(yǎng)液中添加小鼠胚胎成纖維細(xì)胞增殖因子(bFGF)使其終濃度為100ng/ml。ES細(xì)胞每7天傳代一次。具體是，ES細(xì)胞在培養(yǎng)板上所占的比例達(dá)到80%~90%的狀態(tài)時(shí)，用兩個(gè)階段式處理，也就是首先添加膠原酶IV液(200U/ml)(GIBCOBRL/InvitrogenCorporation制，目錄編號17104-019)，37'C經(jīng)過10分鐘后，通過除去膠原酶IV液除去飼養(yǎng)細(xì)胞。ES細(xì)胞在該階段還殘留于板中。接著在前述6孔板上添加2ml的ES培養(yǎng)液，用2ml的移液管，通過刮取剝離殘留于培養(yǎng)板上的未分化狀態(tài)的ES細(xì)胞后，進(jìn)行5次移液，接種于6孔板上進(jìn)行傳代。實(shí)施例5將用2ml的ES培養(yǎng)液(與制造例3中使用的相同)稀釋制造例3中獲得的5xi()6個(gè)KhES-l細(xì)胞獲得的溶液接種于預(yù)先添加了1mlES培養(yǎng)液(與制造例3中使用的相同)的胚狀體形成用培養(yǎng)皿(COSTAR，CorningIncorporated制)的中央。用這種胚狀體形成用培養(yǎng)皿培養(yǎng)5天，形成胚狀體后，用含有100ng/ml的人來源dHGF(第一制藥株式會社提供)，100ng/ml的人來源的bFGF，1%的DMSO和10—7摩爾濃度的地塞米松((Sigma-AldrichCorp.制)的ES培養(yǎng)液(與制造例3中使用的相同)進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行14天向肝細(xì)胞的分化誘導(dǎo)。培養(yǎng)液每兩天更換1次，形成胚狀體的人ES細(xì)胞的相位差顯微鏡照片示于圖8，由人ES細(xì)胞分化誘導(dǎo)成的肝細(xì)胞的相位差顯微鏡照片示于圖9。分化誘導(dǎo)成的肝細(xì)胞21中觀察到了肝細(xì)胞的特征-多個(gè)核22。實(shí)施例6將制造例3中獲得的KhES-1細(xì)胞以3x1(T細(xì)胞個(gè)/cn^的終濃度接種于涂覆了lcmxlcm大小的具有細(xì)胞粘著性的聚氨基酸氨基甲酸酯(PAU)加工的PTFE(聚四氟乙烯)無紡布(KurarayMedical林式會社制)的加入了ES培養(yǎng)液(與制造例3中使用的相同)的12孔培養(yǎng)板(正式名Multiwell12-孔Falcon,Falcon公司制)上。在培養(yǎng)板上接種前述ES細(xì)胞后，培養(yǎng)5天形成胚狀體。在無紡布上形成的胚狀體的掃描電子顯微鏡照片示于圖10(a)。在圖10(a)中表示了附著于無紡布的纖維14的胚狀體23。接著，用含有100ng/ml的人來源dHGF,100ng/ml的人來源的bFGF，1%的DMSO和l(T摩爾濃度的地塞米松((Sigma-AldrichCorp.制)的ES培養(yǎng)液(與制造例3中使用的相同)，培養(yǎng)14天，進(jìn)行向肝細(xì)胞的分化誘導(dǎo)。培養(yǎng)液每兩天更換l次。在無紡布上的分化誘導(dǎo)的肝細(xì)胞的掃描電子顯微鏡照片示于圖10(b)。在圖10(b)中表示了附著于無紡布的纖維4的分化誘導(dǎo)的肝細(xì)胞21。試驗(yàn)例3誘導(dǎo)的肝細(xì)胞中的基因表達(dá)和形態(tài)學(xué)的變化實(shí)施例5和6中記栽的誘導(dǎo)了的肝細(xì)胞中，通過RT-PCR法研究與肝臟代謝相關(guān)的肝細(xì)胞特異的基因-白蛋白基因的表達(dá)。還研究了內(nèi)源性對照-P肌動蛋白基因的表達(dá)。在RT-PCR中，進(jìn)行與針對小鼠的情況的試驗(yàn)例1同樣的操作。也就是說，用Q.25。/。胰蛋白酶-EDTA處理后，回J)欠細(xì)月包，用RNATrizol(InvitrogenCorporation制)按照制品的處理說明書提取RNA。在22。C10分鐘，再在42。C20分鐘，用RNA逆轉(zhuǎn)錄酶使1|ig總RM進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。將獲得的2jag的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，用20pmol/ml各種引物，用AmpliTagGold試劑盒(PerkinElmer/Cetus/>司，Norwalk，力口州，美國)，按照其規(guī)程用于PCR擴(kuò)增。對各基因的引物和PCR條件記栽如下。人白蛋白基因(576bp，59'C，35個(gè)循環(huán))5，引物5，-AAACCTCTTGTGGAAGAGCC(序列號15)3，引物5，-CAAAGCAGGTCTCCTTATCG(序列號16)人P肌動蛋白基因(610bp，60°C,32個(gè)循環(huán))5，引物5，-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA(序列號17)3，引物5，-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGACGG(序列號18)結(jié)果示于圖11。線1~7分別表示大小標(biāo)記、未分化人ES細(xì)胞、形成胚狀體的人ES細(xì)胞，形成胚狀體后不使用無紡布的分化誘導(dǎo)的人ES細(xì)胞(實(shí)施例5)、形成胚狀體后在無紡布的分化誘導(dǎo)的人ES細(xì)胞(實(shí)施例6)、人肝細(xì)胞、和大小標(biāo)記。實(shí)施例5和6中誘導(dǎo)了的肝細(xì)胞中，確認(rèn)了與肝臟細(xì)胞相關(guān)的重要基因的白蛋白的表達(dá)，尤其是，用無紡布通過三維培養(yǎng)誘導(dǎo)的肝細(xì)胞(實(shí)施例6)中，可以確認(rèn)表達(dá)增強(qiáng)。該結(jié)果強(qiáng)有力地支持通過使用無紡布，可以更有效地誘導(dǎo)向肝細(xì)胞的分化誘導(dǎo)。而且，在通過使用無紡布，誘導(dǎo)的人ES細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)，通過透射電子顯微鏡還觀察到成熟的肝細(xì)胞的特征糖原顆粒(圖12)。在圖12中，符號24，25，26分別表示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和糖原顆粒。試驗(yàn)例4肝功能的測定氨的代謝分化誘導(dǎo)開始14天后將實(shí)施例5~6中獲得的肝細(xì)胞的培養(yǎng)液換成新的培養(yǎng)液。在該培養(yǎng)液中，負(fù)載1.4毫摩爾的四氯化氨，4小時(shí)后采集10pl培養(yǎng)液，測定氨濃度。實(shí)施例5~6中的氨的代謝率分別為7.1%、7.8%。(B)利多卡因的代謝分化誘導(dǎo)開始14天后將實(shí)施例5~6中獲得的肝細(xì)胞的培養(yǎng)液換成新的培養(yǎng)液。在該培養(yǎng)液中，以終濃度lmg/ml負(fù)栽利多卡因，4小時(shí)后采集1000(J1培養(yǎng)基，測定利多卡因濃度。實(shí)施例5~6中的利多卡因的代謝率分別為13.4%、23.2%。前述(A)、(B)的代謝率示于圖13。代謝率用負(fù)載藥物時(shí)的該藥物的濃度減去4小時(shí)后的各藥物濃度的值與藥物負(fù)載時(shí)的藥物的濃度的比值表示。以各實(shí)施例為基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)了藥物代謝能力，但是通過在無紡布上的三維培養(yǎng)培養(yǎng)，清楚可見藥物代謝能力增強(qiáng)。(C)尿素的產(chǎn)生與前述(A)相同，負(fù)載1.4毫摩爾的四氯化氨，4小時(shí)后采取培養(yǎng)液，測定尿素的產(chǎn)生量。在實(shí)施例5~6中，分別為相當(dāng)于100萬個(gè)細(xì)胞的5.4jjg、6.8jjg(圖14)。(D)白蛋白的產(chǎn)生分化誘導(dǎo)開始14天后將實(shí)施例5~6中獲得的肝細(xì)胞的培養(yǎng)液換成新的培養(yǎng)液。然后，在培養(yǎng)24小時(shí)后收集培養(yǎng)液，使用白蛋白ELISA試劑盒ALBUWELLII(ExocellInc，Philadelphia,Pennsylvania州，美國)測定白蛋白的產(chǎn)生量。白蛋白的產(chǎn)生量，在實(shí)施例5~6中，分別為相當(dāng)于lml的289ng、349ng(圖15)。清楚可見通過使用無紡布進(jìn)行三維培養(yǎng)所誘導(dǎo)的肝細(xì)胞的白蛋白產(chǎn)生能力增強(qiáng)。產(chǎn)業(yè)上利用的可能性通過本發(fā)明的分化誘導(dǎo)的方法，可以誘導(dǎo)代替正常人肝臟細(xì)胞的功能完整的且可以大量提供的安全的肝細(xì)胞。而且，本發(fā)明的生物人工肝臟為體外型時(shí)，可以避免伴隨細(xì)胞移入的危險(xiǎn)性，并實(shí)現(xiàn)安全性更高的治療。而且，在本發(fā)明中，提供了使用可以大量提供的人肝細(xì)胞的藥物的檢查方法和生理活性物質(zhì)的產(chǎn)生方法。序歹寸表free-text序列號l:用于檢測小鼠CK18基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用5，引物序列號2:用于檢測小鼠CK18基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用3，引物序列號3:用于檢測小鼠G6P基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用5，引物序列號4:用于檢測小鼠G6P基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用3，引物序列號5:用于檢測小鼠TAT基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用5，引物序列號6:用于檢測小鼠TAT基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用3，引物序列號7:用于檢測小鼠白蛋白基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用5，引物序列號8:用于檢測小鼠白蛋白基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用3，引物序列號9:用于檢測小鼠AFP基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用5，引物序列號10:用于檢測小鼠AFP基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用3'引物序列號ll:用于檢測小鼠HNF3b基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用5，引物序列號12:用于檢測小鼠HNF3b基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用3，引物序列號13:用于檢測小鼠GAPDH基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用5，引物序列號14:用于檢測小鼠GAPDH基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用3，引物序列號15用于檢測人白蛋白基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用5，引物序列號16用于檢測人白蛋白基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用3，引物序列號17用于檢測人P肌動蛋白的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用5，引物序列號18用于檢測人P肌動蛋白的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用3，引物權(quán)利要求1.由胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方法，其特征在于在缺失型肝細(xì)胞增殖因子的存在下培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞。2、由胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方法，其包括(a)形成胚胎干細(xì)胞的胚狀體的步驟，和(b)在缺失型肝細(xì)胞增殖因子的存在下培養(yǎng)獲得的胚狀體的步驟。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2記栽的方法，其中，胚胎肝細(xì)胞來源于哺乳類。4、根據(jù)權(quán)利要求3記載的方法，其中，哺乳類為人。5、根據(jù)權(quán)利要求3記載的方法，其中，哺乳類為小鼠。6、根據(jù)權(quán)利要求2~5中任一項(xiàng)記載的方法，其中，胚狀體是由懸浮培養(yǎng)形成的。7、根據(jù)權(quán)利要求1~5中任一項(xiàng)記載的方法，其中，培養(yǎng)是通過三維培養(yǎng)進(jìn)行的。8、由權(quán)利要求1~7中任一項(xiàng)記栽的方法誘導(dǎo)的肝細(xì)胞。9、含有權(quán)利要求8記載的肝細(xì)胞的生物人工肝臟。10、生物人工肝臟的制備方法，其包括(a)形成胚胎干細(xì)胞的胚狀體的步驟，(b)在生物人工肝臟反應(yīng)器中填充獲得的胚狀體的步驟，和(c)在生物人工肝臟反應(yīng)器中，在缺失型肝細(xì)胞增殖因子的存在下培養(yǎng)前述胚狀體的步驟。11、使用權(quán)利要求8記載的肝細(xì)胞檢查藥物的方法。12、使用權(quán)利要求8記載的肝細(xì)胞生產(chǎn)生理活性物質(zhì)的方法。全文摘要本發(fā)明提供由胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方法，其特征在于為了獲得功能完整的且可大量提供的安全的肝細(xì)胞，在dHGF的存在下培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞。而且，還提供由胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方法，其包括(a)形成胚胎干細(xì)胞的胚狀體的步驟，和(b)在缺失型肝細(xì)胞增殖因子的存在下培養(yǎng)所獲得的胚狀體的步驟。文檔編號C12N15/09GK101233227SQ20068000688公開日2008年7月30日申請日期2006年2月2日優(yōu)先權(quán)日2005年2月3日發(fā)明者小林直哉,田中紀(jì)章申請人:國立大學(xué)法人岡山大學(xué)