專利名稱：來自 C a n d i d a A l bi c a n s的甘油－3－磷酸磷酸酶和甘油－3－磷酸脫氫酶 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有甘油-3-磷酸(glycerol-3-phosphate)脫氫酶活性的多肽，具有甘油-3-磷酸磷酸酶的活性的多肽，編碼所述多肽的多核苷酸，包含所述多核苷酸的載體和宿主細(xì)胞，以及使用所述宿主細(xì)胞生產(chǎn)甘油的方法。
背景技術(shù)：
[2]將甘油用作各種工業(yè)產(chǎn)品諸如化妝品、液體肥皂、食品、藥、和潤滑劑的中間體，并將其用作發(fā)酵工業(yè)的材料。例如，通過甘油的發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇。
可以通過發(fā)酵、化學(xué)合成，或脂解生產(chǎn)甘油。至于通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)甘油，已知作為甘油生產(chǎn)微生物的酵母諸如釀酒酵母(S.cerevisiae)、C.magnoliae、P.farinose、和C.glycerinogenes，細(xì)菌諸如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，和藻類諸如D.tertiolecta。
已知可以將通過操作已知甘油生物合成途徑開發(fā)的重組微生物用作生產(chǎn)甘油的微生物。通常，在ATP存在的情況下，將碳底物諸如葡萄糖通過已糖激酶轉(zhuǎn)變成葡萄糖-6-磷酸。通過葡萄糖-磷酸異構(gòu)酶將葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)變成果糖-6-磷酸，然后通過6-果糖磷酸激酶將其轉(zhuǎn)變成果糖-1，6-二磷酸。通過醛縮酶將果糖-1，6-二磷酸轉(zhuǎn)變成磷酸二羥丙酮(DHAP)。最終，通過NADH-依賴型甘油-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)將DHAP轉(zhuǎn)變成甘油-3-磷酸(G3P)，然后通過甘油-3-磷酸磷酸酶將其去磷酸化為甘油(Agarwal(1990)，Adv.Biochem.Engrg.41114)。
此外，已經(jīng)建議了從DHAP生產(chǎn)甘油的備選途徑(Wang et al.，1994 J.Bact.1767091-7095)。按照甘油生產(chǎn)的備選途徑，通過特異性或非特異性磷酸酶將DHAP去磷酸化為二羥丙酮，然后通過二羥丙酮還原酶將其還原為甘油。在原核生物和Schizosaccharomyces pombe中發(fā)現(xiàn)二羥丙酮還原酶。已經(jīng)建議了從DHAP中生產(chǎn)甘油的另一備選途徑(Redkar，ExperimentalMycology，19241，1995)。按照該生產(chǎn)甘油的備選途徑，通過丙糖-3-磷酸異構(gòu)酶將DHAP異構(gòu)化為甘油醛-3-磷酸，所述丙糖-3-磷酸異構(gòu)酶是常見糖酵解酶。將甘油醛-3-磷酸去磷酸化為甘油醛，然后通過醇脫氫酶或NADPH-依賴型甘油脫氫酶將其還原。
在參與已知甘油生物合成途徑的基因中，已知來自釀酒酵母的DARl和GPD1是編碼將DHAP轉(zhuǎn)變成G3P的G3PDH的基因。已知來自釀酒酵母的GPP2是編碼將G3P轉(zhuǎn)變成甘油的甘油-3-磷酸磷酸酶的基因。
此外，已知使用重組宿主細(xì)胞生產(chǎn)甘油的方法，所述重組宿主細(xì)胞通過將涉及甘油合成的外源基因引入依賴于天然甘油合成途徑的宿主細(xì)胞中而獲得。例如，美國專利號6,358,716公開了從重組微生物中生產(chǎn)甘油的方法，其包括(i)用表達(dá)盒轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞，所述表達(dá)盒包括(a)編碼NADH依賴型甘油-3-磷酸脫氫酶或NADPH-依賴型甘油-3-磷酸脫氫酶的基因；和(b)編碼甘油-3-磷酸磷酸酶(EC 3.1.3.21)的基因；(ii)在存在至少一個(gè)碳源的情況下，培養(yǎng)(i)的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，由此生產(chǎn)甘油，所述碳源選自由單糖、寡糖、多糖和單碳底物組成的組中；和(iii)回收(ii)中生產(chǎn)的甘油。
附圖簡述[8]

圖1舉例說明了甘油-3-磷酸脫氫酶活性測量的結(jié)果。
圖2舉例說明了甘油-3-磷酸磷酸酶活性測量的結(jié)果。
圖3舉例說明了包含多核苷酸的載體的構(gòu)建方案，其中將編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的多核苷酸和編碼甘油-3-磷酸磷酸酶的多核苷酸可操作地與合適的調(diào)節(jié)序列進(jìn)行連接。
最佳方式[11]本發(fā)明將在下文中通過實(shí)施例更具體地進(jìn)行描述。然而，隨后的實(shí)施例僅為舉例說明而提供因此本發(fā)明不受限于它們，或被它們所限制。
實(shí)施例1新基因的選擇[13]在該實(shí)施例中，使用由美國的國家生物技術(shù)信息中心(NationalCenter of Biotechnology Information)(NCBI)(www.ncbi.nlm.nih.gov)提供的BLAST程序進(jìn)行GPD1(NCBI X76859，SGDGPD1/YDL022W)和GPP2(SGDHOR2/YER062C)的同源性檢索從而選擇具有顯著同源性但未知功能的基因，所述GPD1是催化將磷酸二羥丙酮(DHAP)轉(zhuǎn)變成甘油3-磷酸的來自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的甘油-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)的基因，所述GPP2是催化將G3P轉(zhuǎn)變成甘油的來自釀酒酵母的甘油3-磷酸磷酸酶的基因。選定的基因是來自Candida albicans.的GPD2(SEQ ID NO3，CA0824)和RHR2(SEQ ID NO4，CA5788)。
實(shí)施例2Candida albicans的GPD2和RHR2基因的亞克隆[15]Candida albicans(KCTC7270)來自韓國生物科學(xué)和生物技術(shù)研究中心的韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(Korean Collection for Type Cultures，KCTC)并且從該菌株中提取了它的基因組DNA。使用基因組DNA作為模板和一對具有SEQ ID NOS5和6的核苷酸序列的寡核苷酸作為引物通過PCR擴(kuò)增GPD2。另外，使用基因組DNA作為模板和一對具有SEQ ID NOS7和8的核苷酸序列的寡核苷酸作為引物通過PCR擴(kuò)增RHR2。
使用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen，U.S.A.)將GPD2和RHR2的各自擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pCR 2.1載體中從而分別構(gòu)建pCR2.1-TOPO-GPD2和pCR2.1-TOPO-RHR2。
實(shí)施例3將GPD2基因克隆到表達(dá)載體中[18]1.GPD2基因的擴(kuò)增[19]使用在實(shí)施例2中構(gòu)建的pCR2.1-TOPO-GPD2作為模板和一對具有SEQ ID NOS9和10的核苷酸序列的寡核苷酸作為引物通過PCR擴(kuò)增GPD2基因。所述具有SEQ ID NOS9和10的核苷酸序列的引物包含NheI和XhoI的限制酶切位點(diǎn)。
使用通過將Accur Power PCR Premix(Bioneer，Korea)和10ng的模板以及100pmol的每個(gè)引物(SEQ ID NOS9和10)混和在一起制備的20μlPCR溶液進(jìn)行PCR。PCR條件如下于94℃變性30秒，于53℃雜交30秒，并于72℃聚合1分鐘30秒，30個(gè)循環(huán)。
通過瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增了1,129bp的DNA片段。分離和純化后，使用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen，U.S.A.)將所述DNA片段克隆到pCR2.1載體上。
2.將GPD2基因克隆到pSE380表達(dá)載體中[23]用NheI和XhoI將上述部分1的包含擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的pCR2.1載體進(jìn)行消化從而生產(chǎn)GPD2基因，然后進(jìn)行分離和純化。同時(shí)，用NheI和XhoI對pSE380表達(dá)載體(Invitrogen，U.S.A.)進(jìn)行消化，然后用CIP(牛小腸磷酸酶)進(jìn)行處理。
將1μl T4DNA連接酶和1μl連接酶緩沖液加入以前制備的100ngGPD2基因和10ng的pSE380載體限制片段中，并將蒸餾水加入其中以達(dá)到10μl的總體積并于16℃溫育6小時(shí)。反應(yīng)終止后，用得到的載體產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)DH5α細(xì)胞，然后從轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5α細(xì)胞中分離和純化包含GPD2基因的pSE380載體。
實(shí)施例4測量GPD2蛋白的酶活性[26]將在實(shí)施例3中獲得的轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5α細(xì)胞接種到包含氨芐青霉素和IPTG各3μl的3ml的LB培養(yǎng)基中并于37℃培養(yǎng)16小時(shí)。將200μl的R-緩沖液(0.1M Tris-maleate，1ml DTT，pH6.5)和溶菌酶(1mg/ml)加入培養(yǎng)物中并進(jìn)行懸浮。然后，將混懸液混合以25μl的氯仿并置于冰上約5分鐘以獲得無細(xì)胞提取物。
接下來，將1ml的蛋白質(zhì)測定溶液(Bio-Rad)的5×稀釋物加入無細(xì)胞提取物的10×稀釋物中并溫育5分鐘以測量595nm的OD值。通過將測量的OD值應(yīng)用到BSA(牛血清白蛋白)標(biāo)準(zhǔn)曲線上來計(jì)算無細(xì)胞提取物的總蛋白濃度。
無細(xì)胞提取物的酶促活性測量如下首先，將100μl的無細(xì)胞提取物，1μl的0.2M NADH，和1μl的0.2M磷酸二羥丙酮(DHAP)加入100μl的200mM Tris/HCl(pH7.5)和5μl的1M DTT中，然后將蒸餾水加入其中以得到1ml的總體積。將反應(yīng)溶液于30℃溫育4分鐘，并于340nm測量OD值。
結(jié)果，至于用pSE380載體轉(zhuǎn)化的對照大腸桿菌細(xì)胞，起始的OD340值是0.270并且溫育4分鐘后的OD340值是0.274。另一方面，至于包含GPD2的無細(xì)胞提取物，起始的OD340值是0.287并且溫育4分鐘后的OD340值是0.311。該結(jié)果顯示對照和測試樣品之間的OD值的顯著不同。因此，可見，測試樣品具有酶促活性(見表1和圖1)。
表1
實(shí)施例5將RHR2基因克隆到表達(dá)載體中[32]1.RHR2基因的擴(kuò)增[33]使用在實(shí)施例2中構(gòu)建的pCR2.1-TOPO-RHR2作為模板和一對具有SEQ ID NOS11和12的核苷酸序列的寡核苷酸作為引物通過PCR擴(kuò)增RHR2基因。所述具有SEQ ID NOS11和12的核苷酸序列的引物包含NheI和XhoI的限制酶切位點(diǎn)。
使用通過將Accur Power PCR Premix(Bioneer，Korea)和10ng的模板以及100pmol的每個(gè)引物(SEQ ID NOS11和12)混和在一起制備的20μlPCR溶液進(jìn)行PCR。PCR條件如下于94℃變性30秒，于50℃雜交30秒，并于72℃聚合1分鐘30秒，30個(gè)循環(huán)。
通過瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增了778bp的DNA片段。分離和純化后，使用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen，U.S.A.)將所述DNA片段克隆到pCR2.1載體中。
2.將RHR2基因克隆到pSE380表達(dá)載體上[37]用NheI和XhoI降上述部分1的包含擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的pCR2.1載體進(jìn)行消化從而生產(chǎn)RHR2基因，然后進(jìn)行分離和純化。同時(shí)，用NheI和XhoI對pSE380表達(dá)載體(Invitrogen，U.S.A.)進(jìn)行消化，然后用CIP進(jìn)行處理。
將1μl T4DNA連接酶和1μl連接酶緩沖液加入以前制備的100ng的RHR2基因和10ng的pSE380載體限制片段中，并將蒸餾水加入其中以達(dá)到10μl的總體積并于16℃溫育6小時(shí)。反應(yīng)終止后，用得到的載體產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)DH5α細(xì)胞，然后從轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5α細(xì)胞中分離和純化包含RHR2基因的pSE380載體。
實(shí)施例6測量RHR2蛋白的酶活性[40]將在實(shí)施例5中獲得的轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5α細(xì)胞接種到3ml的包含氨芐青霉素和IPTG各3μl的LB培養(yǎng)基中并于37℃培養(yǎng)16小時(shí)。將200μl的R-緩沖液(0.1M Tris-maleate，1ml DTT，pH6.5)和溶菌酶(1mg/ml)加入培養(yǎng)物中并進(jìn)行懸浮。然后，將混懸液混合以25μl的氯仿并置于冰上約5分鐘以獲得無細(xì)胞提取物。
接下來，將1ml的蛋白質(zhì)測定溶液(Bio-Rad)的5×稀釋物加入無細(xì)胞提取物的10×稀釋物中并溫育5分鐘以測量595nm的OD值。通過將測量的OD值應(yīng)用到BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線上來計(jì)算無細(xì)胞提取物的總蛋白質(zhì)濃度。
無細(xì)胞提取物的酶促活性測量如下首先，將100μl的1MTricine/HCl(pH7.0)，2.5μl的2M MgCl2，和10μl的1M DL-甘油-3-磷酸加入100μl的無細(xì)胞提取物中，然后將蒸餾水加入其中以得到1ml的總體積。將反應(yīng)溶液于37℃溫育4分鐘，并按照Ames方法分析無機(jī)磷酸鹽的濃度。
結(jié)果，至于用pSE380載體轉(zhuǎn)化的對照大腸桿菌細(xì)胞，起始的OD820值是0.420并且溫育4分鐘后的OD820值是0.412。另一方面，至于包含RHR2的無細(xì)胞提取物，起始的OD820值是1.628并且溫育4分鐘后的OD820值是1.691。該結(jié)果顯示對照和測試樣品之間的OD值的顯著不同。因此，可見，測試樣品具有酶促活性(見表2和圖2)。
表2
實(shí)施例7制備包含可操作地連接的GPD2和RHR2基因的多核苷酸和包含該多核苷酸的載體和微生物[46]在該實(shí)施例中，制備了包含多核苷酸的載體和包含所述載體的重組微生物，所述多核苷酸包括GPD2和RHR2基因，，其中GPD2和RHR2基因的每個(gè)與trc啟動(dòng)子和終止子可操作地連接。圖3舉例說明了多核苷酸和包含該多核苷酸的載體的制備方案。
1.包含GPD2的pSE380載體片段的制備[48]用NdeI對在實(shí)施例3中構(gòu)建的包含GPD2基因的pSE380載體進(jìn)行消化并用CIP進(jìn)行處理。通過瓊脂糖凝膠電泳分離和純化包含GPD2的pSE380載體片段。
2.制備包含RBS(核糖體結(jié)合位點(diǎn))和RHR2的多核苷酸使用通過將Accur Power HL-PCR Premix(Bioneer，Korea)與作為模板的在實(shí)施例5中構(gòu)建的包含RHR2基因的pSE380載體與100pmole的每種引物(SEQ ID NOS13和14)混和在一起制備的20μl PCR溶液進(jìn)行PCR，所述引物包含NdeI限制性酶切位點(diǎn)。PCR條件如下于94℃變性30秒，于50℃雜交30秒，并于72℃聚合1分鐘30秒，30個(gè)循環(huán)。
通過瓊脂糖凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，然后使用TOPOTA克隆試劑盒(Invitrogen，U.S.A.)將其克隆到pCR2.1載體中。
接下來，用NdeI限制酶消化pCR2.1載體以生產(chǎn)包括trc啟動(dòng)子，RHR2基因，和終止子的多核苷酸，然后通過瓊脂糖凝膠電泳(見圖3)對其進(jìn)行分離和純化。
3.構(gòu)建包含多核苷酸的載體，所述多核苷酸包含可操作連接的GPD2和RHR2，并對大腸桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化[54]將1μl T4 DNA連接酶和1μl連接酶緩沖液加入在部分1和2中制備的DNA片段中并將蒸餾水加入其中以得到10μl的總體積。將反應(yīng)溶液于16℃溫育6小時(shí)。用得到的載體產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α細(xì)胞。然后，從轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5α細(xì)胞中抽提載體并用限制酶進(jìn)行處理以證實(shí)重組事件的發(fā)生。從轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5α細(xì)胞中獲得的載體包含GPD2和RHR2基因，并被稱為pCJR-017，在所述GPD2和RHR2基因中，每個(gè)都包括trc啟動(dòng)子和終止子。將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5α細(xì)胞稱為大腸桿菌DH5α(pCJP-017)并于2003年5月9日保藏在韓國微生物保藏中心(Korean CultureCenter of Microorganisms)(KCCM)(登記號KCCM-10494)。
實(shí)施例8從大腸桿菌DH5α(pCJP-017)中生產(chǎn)甘油[56]該實(shí)施例證實(shí)了實(shí)施例7的大腸桿菌DH5α(pCJP-017)可以在葡萄糖培養(yǎng)基中生產(chǎn)甘油。
首先，將大腸桿菌DH5α(pCJP-017)接種在3ml的包含3μl氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中并于37℃培養(yǎng)16小時(shí)。將1ml的培養(yǎng)物加入50ml的生產(chǎn)甘油的培養(yǎng)基中并于37℃在200rpm下離心48小時(shí)。
生產(chǎn)甘油的培養(yǎng)基(pH6.7)是在1L蒸餾水中8g KH2PO4、2g Na2HP4、0.75g(NH4)2SO4、8g的(NH4)2HPO4，6.6g的檸檬酸、2.05g的MgSO4、40mgCaCl2、40mg FeSO4和微量元素貯備液的無菌培養(yǎng)基。所述微量貯備液是在1L蒸餾水中2g MnSO4.H2O、0.8g CoCl2.6H2O、0.4g ZnSO4.7H2O、0.4gNa2MoO4.2H2O、0.2g CuCl2.2H2O、0.1g H3BO3和10ml的HCl(37％)的無菌溶液。除了20g/L的葡萄糖，將維生素B1、抗生素和IPTG添加到生產(chǎn)甘油的培養(yǎng)基中。
使用HPLC組件類型(Waters 510泵，Waters 717自動(dòng)取樣器，Waters400 RI 檢測器，SP 4290積分儀)分析甘油和葡萄糖。
結(jié)果，盡管在用pSE380載體轉(zhuǎn)化的對照大腸桿菌細(xì)胞中沒有觀察到甘油的生產(chǎn)，在測試細(xì)胞中觀察到了4.328g/l的甘油。
發(fā)明方式[61]本發(fā)明提供具有甘油-3-磷酸脫氫酶活性的多肽，具有甘油-3-磷酸磷酸酶活性的多肽，和編碼這些多肽的基因。
本發(fā)明還提供一種多核苷酸和包含該多核苷酸的載體，所述多核苷酸包括與合適調(diào)節(jié)序列可操作地連接的并編碼具有甘油-3-磷酸脫氫酶活性的多肽的多核苷酸和與合適調(diào)節(jié)序列可操作地連接的并編碼具有甘油-3-磷酸磷酸酶活性的多肽的多核苷酸。
本發(fā)明還提供包含載體的宿主細(xì)胞以及通過培養(yǎng)宿主細(xì)胞生產(chǎn)甘油的方法。
按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了具有甘油-3-磷酸脫氫酶活性的并與SEQ ID NO1的氨基酸序列具有80％或更多同源性的多肽。優(yōu)選地，所述多肽具有甘油-3-磷酸脫氫酶活性并與SEQ ID NO1的氨基酸序列具有90％或更多的同源性。更優(yōu)選地，所述多肽具有SEQ ID NO1的氨基酸序列。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了編碼SEQ ID NO1的氨基酸序列的多核苷酸。優(yōu)選地，所述多核苷酸具有SEQ ID NO3的核苷酸序列。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了具有甘油-3-磷酸磷酸酶活性的并與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有80％或更多同源性的多肽。優(yōu)選地，所述多肽具有甘油-3-磷酸磷酸酶活性并與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有90％或更多的同源性。更優(yōu)選地，所述多肽具有SEQ ID NO2的氨基酸序列。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了編碼SEQ ID NO2的氨基酸序列的多核苷酸。優(yōu)選地，所述多核苷酸具有SEQ ID NO4的核苷酸序列。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種多核苷酸，所述多核苷酸包括編碼SEQ ID NO1的氨基酸序列的第一個(gè)多核苷酸和編碼SEQ ID NO2的氨基酸序列的第二個(gè)多核苷酸，所述第一個(gè)多核苷酸和所述第二個(gè)多核苷酸與合適調(diào)節(jié)序列可操作連接。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種載體，所述載體包含一種多核苷酸，所述多核苷酸包括第一個(gè)多核苷酸和第二個(gè)多核苷酸，所述第一個(gè)多核苷酸和第二個(gè)多核苷酸與合適調(diào)節(jié)序列可操作連接。優(yōu)選地，所述載體是pCJP-017。
用于本文時(shí)，術(shù)語‘載體’表示可攜帶細(xì)胞代謝非必需基因的染色體外的元件，通常是雙鏈環(huán)狀DNA。染色體外元件可以是自主復(fù)制的序列，基因組插入序列，噬菌體或核苷酸序列，線狀或環(huán)狀，單-或雙鏈DNA或RNA。載體通常包含合適的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)序列，選擇標(biāo)記，或自主復(fù)制或染色體插入的活性序列(competent sequence)。合適的載體包括調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始的基因的5′-區(qū)域和控制轉(zhuǎn)錄終止的DNA片段的3′-區(qū)域。術(shù)語‘合適的調(diào)節(jié)序列’指調(diào)節(jié)上述多核苷酸轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列。調(diào)節(jié)序列的實(shí)例包括核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、啟動(dòng)子和終止子。用于本文時(shí)，所述啟動(dòng)子不特別受限，如果其是驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄起始的序列。例如，所述啟動(dòng)子可以是CYC1，HIS3，GAL1，GAL10，ADH1，PGK，PHO5，GAPDH，ADC1，TRP1，URA3，LEU2，ENO，TPI(對于在Saccharomyces中的表達(dá)是有效的)，lac，trp，λPL，λPR，T7，tac，或trc(對于在大腸桿菌中的表達(dá)是有效的)。終止子區(qū)域可以是來自優(yōu)選的宿主細(xì)胞的各種基因并可以任選地被省略。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了包含一種多核苷酸的宿主細(xì)胞，所述多核苷酸包括編碼SEQ ID NO1的氨基酸序列的第一個(gè)多核苷酸和編碼SEQ ID NO2的氨基酸序列的第二個(gè)多核苷酸，所述第一個(gè)多核苷酸和第二個(gè)多核苷酸與合適的調(diào)節(jié)序列可操作地連接。宿主細(xì)胞可以是埃希氏菌屬(Escherichia)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、腸桿菌屬(Ehterobacter)、梭菌屬(Clostridium)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、氣桿菌屬(Aerobacter)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、曲霉屬(Aspergillus)、酵母菌(Saccharomyces)、裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces)或Zygosaccharomyces的細(xì)胞。優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞可以是埃希氏菌屬細(xì)菌的細(xì)胞，并且更優(yōu)選地是大腸桿菌的細(xì)胞。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種生產(chǎn)甘油的方法，所述方法包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含一種多核苷酸的宿主細(xì)胞，所述多核苷酸包括編碼SEQ ID NO1的氨基酸序列的第一個(gè)多核苷酸和編碼SEQ ID NO2的氨基酸序列的第二個(gè)多核苷酸，所述第一個(gè)多核苷酸和第二個(gè)多核苷酸與合適的調(diào)節(jié)序列可操作地連接；并從培養(yǎng)物中回收甘油。
培養(yǎng)基中包括可以在宿主細(xì)胞中被代謝的‘碳底物’或‘碳源’。所述碳底物或碳源可以選自由單糖、寡糖、多糖、單碳底物及其混合物組成的組中。
工業(yè)應(yīng)用性[74]可以將本發(fā)明的多肽和編碼多肽的多核苷酸有效用在重組甘油生物合成途徑中。
可以將包括GPD2和RHR2的多核苷酸，所述GPD2和RHR2與合適調(diào)節(jié)序列可操作地連接，包含本發(fā)明的多核苷酸的載體和宿主細(xì)胞用在有效生產(chǎn)甘油的方法中。按照本方法，可以高產(chǎn)量生產(chǎn)甘油。

涉及保藏的微生物或其它生物材料的指示(PCT細(xì)則13bis)

Form PCT/RO/134(1998年7月)
序列表<110>CJ株式會(huì)社<120>來自Candida Albicans的甘油-3-磷酸磷酸酶和甘油-3-磷酸脫氫酶，編碼它們的基因，包含該基因的載體和宿主細(xì)胞，和使用該宿主細(xì)胞生產(chǎn)甘油的方法<130>CJ000530<160>14<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>371<212>PRT<213>Candida albicans<400>1Met Thr Thr Ser Pro Tyr Pro Ile Glu Thr Pro Phe Lys Val Cys Ile1 5 10 15Val Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Ala Val Ala Lys Leu Val Ala Glu20 25 30Asn Cys Ala Glu Lys Pro Asn Ile Phe Gln Arg Asp Val Lys Met Trp35 40 45Val Phe Glu Glu Glu Ile Glu Gly Arg Lys Leu Thr Glu Ile Ile Asn50 55 60Thr Glu His Glu Asn Val Lys Tyr Leu Pro Glu Ile Lys Leu Pro Thr65 70 75 80Asn Leu Val Ala Asn Pro Asp Ile Val Asp Thr Val Gln Asp Ala Asp85 90 95Leu Ile Val Phe Asn Ile Pro His Gln Phe Leu Gly Arg Ile Val Lys100 105 110Gln Ile Glu Gly Lys Val Lys Pro Thr Ala Arg Ala Ile Ser Cys Leu115 120 125Lys Gly Leu Asp Val Ser Pro Glu Gly Cys Lys Leu Leu Ser Thr Ser130 135 140Ile Thr Asp Thr Leu Lys Ile Tyr Cys Gly Val Leu Ser Gly Ala Asn145 150 155 160Ile Ala Asn Glu Val Ala Lys Gly Asn Trp Ser Glu Thr Ser Ile Ala165 170 175Tyr Thr Val Pro Glu Asp Phe Arg Gly Ala Gly Lys Asp Ile Asp Pro180 185 190Phe Ile Leu Lys Glu Ala Phe His Arg Pro Tyr Phe His Val Arg Val195 200 205Ile Glu Asp Val Val Gly Ala Ser Ile Ala Gly Ala Leu Lys Asn Val210 215 220Ile Ala Cys Ser Val Gly Phe Val Glu Gly Ala Gly Trp Gly Asp Asn225 230 235 240Ala Lys Ala Ala Ile Met Arg Ile Gly Ile Lys Glu Thr Ile Arg Phe245 250 255Ala Ser Tyr Trp Glu Leu Phe Lys Ile Lys Ala Leu Ser Pro Pro Asn260 265 270Pro Lys Thr Phe Thr Glu Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr275 280 285Thr Cys Ser Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Arg Tyr Met Ile Lys290 295 300
Asn Asn Val Asp Ala Phe Glu Ala Glu Lys Ile Val Leu Lys Gly Gln305 310 315 320Ser Ser Gln Gly Ile Leu Thr Ala Lys Glu Val His Glu Leu Leu Thr325 330 335Asn Phe Asn Leu Gln Asp Glu Phe Pro Leu Leu Glu Ala Thr Tyr Lys340 345 350Val Ile Tyr Glu Asn Gly Ser Val Asp Asp Phe Pro Gln Leu Leu Glu355 360 365Gly Asp Gln370<210>2<211>254<212>PRT<213>Candida albicans<400>2Met Thr Lys Thr Gln Gln Pro Ala Val Phe Tyr Val His Ala Ala Leu1 5 10 15Phe Asp Cys Asp Gly Thr Leu Val Asn Ser Thr Gly Ala Ile Ser Glu20 25 30Phe Trp Arg Asp Phe Gly Lys Thr Arg Pro His Val Asp Pro Glu Glu35 40 45Ile Ile Arg Thr Ser His Gly Cys Arg Thr Phe Asp Val Ile Ala Lys50 55 60Trp Ser Pro Glu Asp Ala Ile Glu Glu Gln Val Thr Ala Trp Glu Gly65 70 75 80Ala Ile Pro Asp Thr Phe Gly His His Ala Lys Pro Ile Pro Gly Ser85 90 95Val Glu Leu Val Lys Ser Phe Asp Lys Leu Ser Lys Glu Ala Thr Glu100 105 110Asn Gly Lys Gln Arg Trp Ala Val Val Thr Ser Gly Thr Leu Pro Leu115 120 125Ala Thr Lys Trp Leu Lys Leu Leu Ser Ile Glu Arg Pro Asp Cys Phe130 135 140Ile Thr Ala Glu Lys Val Thr Lys Gly Lys Pro His Pro Gln Gly Tyr145 150 155 160Gln Ala Ala Arg Asp Thr Leu Gly Tyr His Asp Ala His Tyr Lys Val165 170 175Val Val Phe Glu Asp Ala Pro Ala Gly Ile Thr Ala Gly Lys Gly Ala180 185 190Gly Ala Met Val Val Gly Ile Cys Ser Thr Tyr Asp Pro Glu Lys Val195 200 205Arg Lys Ser Gly Ala Asn Ile Val Val Lys Asp Leu Ser Ser Phe Arg210 215 220Ile Asp Ser Tyr Ash Lys Glu Thr Asp Glu Phe Lys Val Val Val Asp225 230 235 240Asp Tyr Phe Tyr Ala Asp Glu Gln Phe Leu Gln Glu Ser Ala245 250<210>3<211>1116<212>DNA
<213>Candida albicans<400>3atgactactt ccccatatcc aattgaaact ccatttaaag tttgtattgt cggttccggt 60aactggggta ctgcagttgc aaaattagtt gctgaaaact gtgctgaaaa accaaatatt 120ttccaaagag acgttaaaat gtgggttttc gaagaagaaa ttgaaggtag aaaattgaca 180gaaataatta acaccgaaca tgaaaatgtt aaatacttgc cagaaattaa attgccaact 240aacttggttg ccaacccaga cattgttgac actgttcaag atgccgactt gattgttttc 300aatattccac atcaattctt gggtagaatt gtcaaacaaa tcgaaggtaa agtgaaacca 360actgctagag ccatttcatg tttgaaaggt ttggatgtga gtccagaagg ttgcaaattg 420ttgtcaacct ctatcactga tactttgaag atttactgtg gtgtcttatc tggtgctaat 480attgccaacg aagttgccaa aggtaactgg tcagaaactt ccattgccta cactgttcca 540gaagatttca gaggtgccgg taaagatatt gatccattta ttttgaaaga agctttccac 600agaccatact tccatgtcag agttattgaa gatgttgttg gtgcctctat tgctggtgcc 660ttaaagaatg tcattgcctg ttctgttggt ttcgttgaag gtgctggctg gggtgacaat 720gctaaagctg ctattatgag aatcggtatc aaagaaacca tccgttttgc ttcttactgg 780gaattgttca agatcaaggc tttgtctcca ccaaacccaa aaactttcac cgaagaaagt 840gctggtgttg ctgatttgat cactacttgc tcaggtggta gaaatgttaa agtcgccaga 900tacatgatta aaaacaatgt cgatgcattt gaagctgaaa aaattgtttt gaaaggacaa 960agttctcaag gtatcttgac tgccaaagaa gttcacgaat tgttaacaaa tttcaacctt1020caagacgaat tcccattact cgaagccacc tataaagtta tctacgagaa tggtagtgtt1080gacgatttcc cacaattatt agaaggtgat caataa 1116<210>4<211>765<212>DNA<213>Candida albicans<400>4atgacaaaga ctcaacaacc agctgttttt tacgttcacg ccgctttatt tgactgtgat 60ggtactttgg ttaactccac tggtgctatt tctgaattct ggagagattt cggaaaaact120agacctcatg ttgatccaga agaaattatc agaacttccc atggttgccg tacatttgat180gtcattgcca aatggtcacc ag4agatgca attgaagaac aagtcactgc atgggaaggt240gctattcctg acacttttgg ccaccacgcc aagccaattc caggttccgt tgaattggta300aaatcattcg ataaactttc taaagaagct actgaaaatg gtaaacaaag atgggctgtt360gtcacttctg gtactttgcc attagccacc aaatggttga aattattgtc tattgaaagg420ccagactgtt ttataaccgc tgaaaaagtg actaaaggta aaccacatcc acaaggttac480caagctgcta gagatacttt gggataccat gacgcccact acaaagttgt tgtgtttgaa540gacgctccag ctggtataac cgcaggtaaa ggtgctggcg ccatggttgt cggtatttgc600tcaacttacg atcctgaaaa agttagaaaa tcaggtgcta acattgttgt caaagattta660tccagcttta gaatcgactc atacaacaag gaaactgacg aattcaaggt tgttgttgat720gattatttct acgctgatga gcaattttta caagaatctg cttaa765
<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于從Candida albicans擴(kuò)增GPD2的正向引物<400>5cccatcttgt tccacaattt tact 24<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于從Candida albicans擴(kuò)增GPD2的反向引物<400>6tgtacaaaac agtgatatca ctgc 24<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于從Candida albicans擴(kuò)增RHR2的正向引物<400>7ccaatgattt ccacattcgt aaaa 24<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于從Candida albicans擴(kuò)增RHR2的反向引物<400>8tagcggacca ttttacacac aatt 24<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于從pCR2.1-GPD2載體擴(kuò)增GPD2的正向引物<400>9gctagcaatg actacttccc cata 24<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于從pCR2.1-GPD2載體擴(kuò)增GPD2的反向引物<400>10
ctcgagaccc atttattgat cacc 24<210>11<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于從pCR2.1-RHR2擴(kuò)增RHR2的正向引物<400>11gctagcaatg acaaagactc aaca 24<210>12<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于從pCR2.1-RHR2擴(kuò)增RHR2的反向引物<400>12ctcgagttaa gcagattctt gtaa 24<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>包含NdeI位點(diǎn)的正向引物<400>13catatgttgc gccgacatca taac 24<210>14<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>包含NdeI位點(diǎn)的反向引物<400>14catatgtgtc tcatgagcgg atac 2權(quán)利要求
1.一種多肽，其具有甘油-3-磷酸脫氫酶活性并與如SEQ ID NO1表示的氨基酸序列具有80％或更多的同源性。
2.一種編碼如SEQ ID NO1表示的氨基酸序列的多核苷酸。
3.一種多肽，其具有甘油-3-磷酸磷酸酶活性并與如SEQ ID NO2表示的氨基酸序列具有80％或更多的同源性。
4.一種編碼如SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多核苷酸。
5.一種包含一種多核苷酸的載體，所述多核苷酸包含編碼如SEQ ID NO1表示的氨基酸序列的第一個(gè)多核苷酸和編碼如SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的第二個(gè)多核苷酸，所述第一個(gè)多核苷酸和第二個(gè)多核苷酸與合適的調(diào)節(jié)序列可操作地連接。
6.權(quán)利要求5的載體，其是pCJP-017。
7.一種包含一種多核苷酸的宿主細(xì)胞，所述多核苷酸包含編碼如SEQ IDNO1表示的氨基酸序列的第一個(gè)多核苷酸和編碼如SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的第二個(gè)多核苷酸，所述第一個(gè)多核苷酸和第二個(gè)多核苷酸與合適的調(diào)節(jié)序列可操作地連接。
8.權(quán)利要求7的宿主細(xì)胞，其是大腸桿菌。
9.權(quán)利要求8的宿主細(xì)胞，其是大腸桿菌DH5α(pCJP-017)(登記號KCCM-10494)。
10.一種生產(chǎn)甘油的方法，所述方法包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求7的宿主細(xì)胞；和從培養(yǎng)物中回收甘油。
全文摘要
本發(fā)明提供一種具有甘油－3－磷酸脫氫酶活性并與如SEQ ID NO1表示的氨基酸序列具有80％或更多同源性的多肽和一種具有甘油－3－磷酸磷酸酶活性并與如SEQ ID NO2表示的氨基酸序列具有80％或更多同源性的多肽。本發(fā)明還提供一種生產(chǎn)甘油的方法，所述方法包括培養(yǎng)用包含多核苷酸的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述多核苷酸包括編碼如SEQ ID NO1表示的氨基酸序列的第一個(gè)多核苷酸和編碼如SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的第二個(gè)多核苷酸，所述第一個(gè)多核苷酸和第二個(gè)多核苷酸與合適的調(diào)節(jié)序列可操作地連接；從培養(yǎng)物中回收甘油。
文檔編號C12N9/02GK1798835SQ200480015572
公開日2006年7月5日 申請日期2004年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月3日
發(fā)明者樸英薰, 趙光命, 嚴(yán)惠媛 申請人:Cj株式會(huì)社