專利名稱：一種啟動子及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種啟動子，包括含有此啟動子的結構和載體，并涉及此啟動子的制備方法。
背景技術：
昆蟲病原絲狀真菌可通過侵染昆蟲使其致死，因此，已作為防治昆蟲的有效的生物農(nóng)藥。但野生昆蟲病原真菌毒力低，致死昆蟲時間長。通過基因工程的手段，超表達某些外源或內(nèi)源毒力基因，可以大大提高病原真菌毒力。但目前昆蟲病原真菌中常用的啟動基因表達的啟動子大都是來自其他動植物病原真菌，目前應用最廣泛的是構巢曲霉三磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動子(PgpdA)，是多種真菌中外源及內(nèi)源基因的組成性表達首選的啟動子，如人類病原真菌，植物病原真菌及昆蟲病原真菌。但是PgpdA的啟動效率表現(xiàn)不盡人意。而且，PgpdA長2. 21Λ，片段較大，不利于基因工程中載體構建。尋找真菌內(nèi)源的高效率的組成型啟動子，一方面可為昆蟲病原真菌基因工程研究提供工具，同時也為利用該啟動子構建具有高效殺蟲活性的昆蟲病原真菌奠定基礎。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種啟動效率高，易構建的啟動子，即PMagpd啟動子。本發(fā)明的另一目的在于提供含有上述啟動子的表達載體。本發(fā)明的再一目的在于提供含有上述啟動子的轉化載體。本發(fā)明的再一目的在于提供含有上述啟動子的宿主或宿主細胞。本發(fā)明的目的是通過如下措施實現(xiàn)的一種啟動子，為SEQ ID NO 1所示核苷酸序列或為對SEQ ID NO=I所示核苷酸序列進行一個或多個核苷酸的取代、缺失或添加所獲得的，具有與SEQ IDNO 1相同的作為啟動子能力的核苷酸序列。一種啟動子，為能在高度嚴格條件下與SEQ ID NO 1所示核苷酸序列雜交的核苷酸序列，或為能在高度嚴格條件下與對SEQ ID NO :1所示核苷酸序列進行一個或多個核酸的取代、缺失或添加所獲得的，具有與SEQ ID NO :1相同的作為啟動子能力的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。上述啟動子，包括表1所述的DNA序列，在所述啟動子的位置如表1所述。表1中所示DNA序列是PMagpd啟動子中的一些保守序列和反向或正向重復序列，這些序列一般來說是不可取代或缺失，它們的組合發(fā)揮著啟動效力。表權利要求
1.一種啟動子，其特征在于為SEQ ID NO :1所示核苷酸序列或為SEQ ID N0:1所示核苷酸序列進行一個或多個核苷酸的取代、缺失或添加所獲得的，具有與SEQ ID N0:1相同的作為啟動子能力的核苷酸序列。
2.一種啟動子，其特征在于為能在高度嚴格條件下與SEQ ID NO :1所示核苷酸序列雜交的核苷酸序列，或為能在高度嚴格條件下與對SEQ ID NO :1所示核苷酸序列進行一個或多個核酸的取代、缺失或添加所獲得的，具有與SEQ ID NO :1相同的作為啟動子能力的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
3.根據(jù)權利要求1或2所述啟動子，其特征在于所述啟動子來源于蝗綠僵菌的Magpd 基因上游序列。
4.含權利要求1、2或3所述啟動子的表達載體。
5.一種轉化載體，含有權利要求1、2或3所述的啟動子。
6.一種轉化過的宿主或宿主細胞，含有權利要求1或2所述的啟動子、或權利要求4所述的表達載體、或權利要求5所述的轉化載體。
7.如權利要求6所述的轉化過的宿主或宿主細胞，所述宿主或宿主細胞是真菌或真菌細胞。
8.如權利要求6所述的轉化過的宿主或宿主細胞，所述宿主或宿主細胞是昆蟲病原絲狀真菌。
9.如權利要求6所述的轉化過的宿主或宿主細胞，所述宿主或宿主細胞是蝗綠僵菌。
10.根據(jù)權利要求1-3任一項所述啟動子的制備方法，包括如下步驟(1)培養(yǎng)蝗綠僵菌(Metarzhiziumacridum)菌株 CQMal02。(2)從菌株中提取基因組DNA。(3)用序列如SEQID NO. 2和SEQ ID NO. 3的引物從基因組DNA中擴增所述啟動子序列。
11.根據(jù)權利要求10所述啟動子的制備方法，包括如下步驟(1)將蝗綠僵菌(Metarzhiziumacridum)菌株，在1/4SDAY液體培養(yǎng)基(葡萄糖IOg/ L，蛋白胨2. 5g/L，酵母浸膏5. Og/L, pH值調(diào)至6. 0)，28°C 250rpm振蕩培養(yǎng)3天(2)用真菌基因DNA提取試劑盒提取基因組DNA。(3)根據(jù)蝗綠僵菌基因組序列(Genbank登錄號ANDI00000000)，獲取了Magpd基因組序歹Ij (Genbank登錄號EFY84384. 1)，用引物MgpdF和MgpdR引物，其序列見SEQ ID NO. 2禾口 SEQ ID NO. 3所示，擴增Magpd基因上游的所述啟動子序列。
12.上述權利要求5所述的轉化載體或權利要求6-9任一項所述宿主或宿主細胞的構建方法，包括以下步驟(1)將PMagpd啟動子與目的基因可操作地連接；(2)構建含有PMagpd啟動子與目的基因的表達載體；(3)將所述表達載體轉化宿主，制得轉化載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種啟動效率高、序列較短啟動子，即PMagpd啟動子。由SEQIDNO:1所示核苷酸序列或?qū)EQIDNO:1所示核苷酸序列進行一個或多個核苷酸的取代、缺失或添加所獲得的，具有與SEQIDNO:1相同的作為啟動子能力的核苷酸序列組成。該啟動子啟動效率高，啟動基因范圍廣，可啟動任何基因的在真菌內(nèi)的組成型表達。且該啟動子片段小，利于構建。適于實驗室和工業(yè)應用。
文檔編號C12N15/80GK102373207SQ20111035155
公開日2012年3月14日 申請日期2011年11月9日 優(yōu)先權日2011年11月9日
發(fā)明者夏玉先, 曹月青, 焦?jié)?申請人:重慶大學