專利名稱：具有降低的過敏原性和保留的T－細(xì)胞反應(yīng)性的Phl p 5a衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及早熟禾亞科(Pooideae)第5組過敏原變體的制備和用途，其特征在于和已知的野生型過敏原相比，具有降低的IgE反應(yīng)性以及基本保留的與T-淋巴細(xì)胞的反應(yīng)性。這些低過敏原性的過敏原變體可用于草類花粉過敏患者的特定免疫療法(弱敏性)或用于草類花粉過敏的預(yù)防免疫療法。
背景技術(shù)：
I型變態(tài)反應(yīng)具有世界范圍的重要性。在工業(yè)化國家，最高達(dá)20％的人群遭受諸如過敏性鼻炎、結(jié)膜炎或支氣管哮喘的困擾。這些變態(tài)反應(yīng)由空氣中存在的過敏原(空氣過敏原)引起，這些過敏原由例如植物花粉、螨、貓或狗等各種來源釋放。而最高達(dá)40％的I型變態(tài)反應(yīng)又表現(xiàn)為特異性的與草類花粉過敏原的IgE反應(yīng)性(Friedhoff等.，1986，J.Allergy Clin.Immunol.78，1190-2002)。
觸發(fā)I型變態(tài)反應(yīng)的物質(zhì)是蛋白、糖蛋白或多肽。經(jīng)粘膜吸收后，這些過敏原與致敏人群的結(jié)合在肥大細(xì)胞表面的IgE分子反應(yīng)。如果2個(gè)IgE分子經(jīng)過1個(gè)過敏原彼此連接，就導(dǎo)致效應(yīng)細(xì)胞的介導(dǎo)分子(例如組胺、前列腺素)和細(xì)胞因子的釋放，然后引起相應(yīng)的臨床癥狀。
根據(jù)具有抗一些單個(gè)的過敏原分子與變態(tài)反應(yīng)患者的IgE抗體反應(yīng)的相對(duì)頻率，可以看出主要過敏原和次要過敏原的差別。
在梯牧草(Phleum pratense)的病例中，迄今為止，Phlp1(Petersen等.，1993，J.Allergy Clin.Immunol.92789-796)，Phl p 5(Matthiesen and Lwenstein，1991，Clin.Exp.Allergy21，297-307；Petersen等.，Int.Arch.AllergyImmunol.98105-109)，Phl p6(Petersen等.，1995，Int.Arch.Allergy Immunol.108，49-54)，Phl p2/3(Dolecek等.，1993，F(xiàn)EBS 335(3)，299-304)，Phl p4(Haavik等.，1985，Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.78260-268；Valenta等.，1992，Int.Arch.Allergy Immunol.97287-294，F(xiàn)ischer等.，1996，J.Allergy Clin.Immunol.98189-198)和Phl p13(Suck等.，2000，Clin.Exp.Allergy30324-332；Suck等.，2000，Clin.Exp.Allergy301395-1402)迄今被確定為主要過敏原。
在梯牧草(Phleum pratense)中占優(yōu)勢(shì)的主要過敏原為Phl p1和Phl p 5，Phl p 5以5a和5b兩種形式存在，其分子量不同并且由各自的基因編碼。推斷的Phl p 5a和Phl p 5b的氨基酸序列已經(jīng)通過重組DNA技術(shù)的方法得以確定。Phl p 5a為約32kD的蛋白質(zhì)并且與85-90％的草類花粉過敏患者的IgE抗體反應(yīng)。Phl p 5a以一系列同源變體形式存在，其相互間因點(diǎn)突變而不同而可能對(duì)應(yīng)于不同的等位形式。相關(guān)草類，如黑麥草(Lolium perenne)、草地早熟禾(Poapratensis)及其他的花粉包含與Phl p 5a同源的過敏原且一起已知為第5組過敏原。這些草類第5組過敏原的高級(jí)結(jié)構(gòu)同源性相應(yīng)地引起與草類花粉過敏患者的IgE抗體高的分子交叉反應(yīng)性。
對(duì)變態(tài)反應(yīng)有效治療的經(jīng)典方法是特異性的免疫治療和脫敏治療(Fiebig，1995，Allergo J.4(6)，336-339，Bousquet等.，1998，J.Allergy Clin.Immunol.102(4)，558-562)。在這些方法中，把天然過敏原提取物以逐步增加劑量的方式給病人皮下注射。不過，該方法必須承受變態(tài)反應(yīng)甚至過敏性休克的風(fēng)險(xiǎn)。為了把這些風(fēng)險(xiǎn)降低到最小程度，現(xiàn)在采用類變應(yīng)原形式的新穎制備物。與未處理過的提取物相比，這些化學(xué)修飾的過敏原提取物明顯地降低IgE反應(yīng)性，但具有一致的T細(xì)胞反應(yīng)性(Fiebig，1995，Allergo J.4(7)，377-382)。
使用通過重組方法產(chǎn)生的過敏原，有可能更實(shí)質(zhì)性地優(yōu)化治療方法。通過重組方法產(chǎn)生高純度的過敏原的確定的混合劑，如果需要與各個(gè)病人相匹配，可以代替來源于天然過敏原的提取物，因?yàn)槌烁鞣N過敏原外，后者還含有相對(duì)大量的免疫原性但不伴有過敏原性的蛋白。用表達(dá)產(chǎn)物獲得安全脫敏療法的真實(shí)前景，可通過特異突變重組過敏原來實(shí)現(xiàn)，在這些過敏原中，IgE表位被特異地缺失，而不損壞治療所須的T細(xì)胞表位(Schramm等.，1999，J.Immunol.162，2406-2414)。
通過治療方法影響過敏患者中擾亂的Th細(xì)胞平衡的另一個(gè)可能是，用編碼相關(guān)過敏原(免疫治療性DNA疫苗)的可表達(dá)的DNA進(jìn)行治療。給嚙齒類注射編碼過敏原的DNA，已經(jīng)得到了對(duì)過敏原特異的免疫應(yīng)答的初步實(shí)驗(yàn)證據(jù)(Hsu等.，1996，Nature Medicine 2(5)，540-544)。
本發(fā)明的目的在于提供蛋白質(zhì)和DNA水平的具有降低的IgE活性而同時(shí)T-細(xì)胞反應(yīng)性基本保留的早熟禾亞科(Pooideae)第5組過敏原的新變體，并且因此適于特異性的免疫療法和免疫治療的DNA接種。
附1早熟禾亞科(Pooideae)種類Phl p 5a同源cDNA序列相關(guān)區(qū)域的對(duì)比黑麥草(Lol p)、草地早熟禾(Poa p)、普通小麥(Tri a)和大麥(Hor v)編號(hào)DNA插入的核苷酸位點(diǎn)Phl p 5a、Poa p 5和Lol p 5序列來自國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)，Bethesda，USA“Gen-Bank”數(shù)據(jù)庫的cDNA序列Hor v和Tri a序列來自基因組研究所(TIGR)，Rockville，USA EST數(shù)據(jù)庫的EST序列黑色邊框與Phl p 5a(基于GenBank AJ555152)一致的序列帶點(diǎn)的邊框?qū)?yīng)于氨基酸94-113(基于GenBank AJ555152)的缺失帶長劃的邊框?qū)?yīng)于氨基酸175-198(基于GenBank AJ555152)的缺失圖2早熟禾亞科(Pooideae)種類Phl p 5a同源氨基酸序列的對(duì)比(相關(guān)的序列區(qū)域，由DNA序列推斷)黑麥草(Lol p)、草地早熟禾(Poa p)、普通小麥(Tri a)和大麥(Hor v)編號(hào)DNA插入的核苷酸位點(diǎn)Phl p 5a、Poa p 5和Lol p 5序列來自國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)，Bethesda，USA“Gen-Bank”數(shù)據(jù)庫的cDNA序列Hor v和Tri a序列來自基因組研究所(TIGR)，Rockville，USA EST數(shù)據(jù)庫的EST序列黑色邊框與Phl p 5a(基于GenBank AJ555152)一致的序列帶點(diǎn)的邊框?qū)?yīng)氨基酸94-113(基于GenBank AJ555152)的缺失帶長劃的邊框?qū)?yīng)氨基酸175-198(基于GenBank AJ555152)的缺失圖3組氨酸融合蛋白形式的純化的缺失突變體的SDS-PAGE
1)標(biāo)記2)rPhl p 5a wt(His)3)Phl p 5a DM-Δ94-113(His)4)Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198(His)5)Phl p 5a DM-Δ175-198(His)6)標(biāo)記圖4純化的非融合蛋白Phl p 5a DM-D94-113、175-198和rPhlp 5a wt(頂端)的SDS-PAGE和用αPhl p 5抗體進(jìn)行的鑒定試驗(yàn)(底端)αPhl p 5 mAb α-1D11結(jié)合區(qū)175-198(只有rPhl p 5a wt是陽性的)αPhl p 5a mAb α-3B2結(jié)合兩個(gè)Phl p 5a分子的連接點(diǎn)表位(兩個(gè)蛋白質(zhì)均是陽性的)(mAb單克隆抗體)圖5缺失突變體Phl 5a DM-Δ94-113、175-198和重組野生型Phl p 5a(純化的非融合蛋白)的分析SEC柱Superdex75 HR10/30(Amersham Bioscience，Uppsala，Sweden)洗脫液PBS箭頭排除體積圖6缺失突變體Phl 5a DM-Δ94-113、175-198和重組野生型Phl p 5a(純化的非融合蛋白)的非-變性等電聚焦1)IEF標(biāo)記2)rPhl p 5a wt3)Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198p1 rPhl p 5a wt＝8.7pl rPhl p 5a DM-Δ94-113、175-198＝6.4圖7用于檢查Phl p 5a缺失突變體(非-變性的)的IgE結(jié)合能力的剝離試驗(yàn)P臨床確定的草類花粉過敏癥患者的血清圖8通過使用兩個(gè)代表性的單份血清(a和b)和血清庫(c)的EAST抑制試驗(yàn)來確定Phl p 5a缺失突變體的降低的IgE反應(yīng)性-●-nPh p 5a/b
-○-rPhl p 5a wt-△-rPhl p 5a wt(His)-◇-Phl p 5a DM-Δ94-113(His)-◆-Phl p 5a DM-Δ175-198(His)-■-Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198-□-Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198(His)P臨床確定的草類花粉過敏癥患者的血清圖9通過使用六個(gè)不同草類花粉過敏癥患者(P)的嗜堿細(xì)胞的嗜堿細(xì)胞活性試驗(yàn)來確定Phl p 5a缺失突變體Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198的弱敏性發(fā)明詳述cDNA序列的誘變和克隆本發(fā)明特別優(yōu)選的弱敏性Phl p 5a變體的起始點(diǎn)為通過特異性引物經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)從梯牧草(Phleum pratense)總cDNA中分離的野生型Phl p 5a異構(gòu)體的cDNA(NCBI(國家生物技術(shù)信息中心，Bethesda，USA)GenBank編號(hào)AJ555152)(SEQ ID NO 1)。SEQ ID NO 2的氨基酸序列已經(jīng)從cDNA序列推斷出來。Phl p 5a，由284個(gè)氨基酸組成，在大腸桿菌中以可溶性蛋白形式在胞內(nèi)可溶性地表達(dá)且隨后被純化。Phl p 5a(rPhl p 5a wt)的重組野生型形式與單克隆抗-Phl p 5抗體以及能與天然純化的Phl p 5a(nPhl p 5a)反應(yīng)的草類花粉過敏癥患者的IgE抗體反應(yīng)。
由所述的rPhl p 5a wt的cDNA起始，通過限制性酶切/連接方法和PCR以及連接入表達(dá)載體pProExHTa(Invitrogen，Carlsbad，USA)來制備一系列不同的缺失變體(缺失突變體)。分布于cDNA分子整個(gè)序列的6至72bp長度的片段被缺失，導(dǎo)致在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白的多肽鏈中對(duì)應(yīng)缺失體的誘導(dǎo)出現(xiàn)。
通過免疫印跡研究了Phl p 5a缺失變體與草類花粉過敏癥患者的代表性血清庫中IgE抗體的結(jié)合能力。
在該方法中，令人驚奇的是，發(fā)現(xiàn)Phl p 5a的兩個(gè)缺失變體(Phlp 5a DM-Δ94-113、氨基酸94-113缺失和Phl p 5a DM-Δ175-198、rPhl p 5a wt的氨基酸175-198缺失)，其具有降低的與IgE抗體的(代表性血清庫)結(jié)合。這兩個(gè)Phl p 5a缺失體作為包含兩個(gè)有效缺失(Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198)的雙缺失變體構(gòu)建的起始點(diǎn)。
以下描述通過遺傳工程方法構(gòu)建Phl p 5a DM-Δ94-113、Phl p 5aDM-Δ175-198和Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198和其生化和免疫學(xué)表征。
對(duì)于缺失變體Phl p 5a DM-Δ94-113(SEQ ID NO 3、cDNA序列(795bp)和SEQ ID NO4，氨基酸序列(264aa))，首先從rPhl p 5awt起始制備兩個(gè)片段。片段“F1-93”，編碼rPhl p 5a wt的氨基酸1-93，是通過利用引物1和引物5的PCR進(jìn)行制備的，而片段“F114-284”是利用引物4和引物6進(jìn)行制備的(引物序列參見表1)。在使用引物1和4的另外的PCR中片段“F1-93”和“F114-284”被用作底物，其導(dǎo)致對(duì)編碼缺失變體Phl p 5a DM-Δ94-113的完整cDNA的擴(kuò)增。通過PCR連接片段“F1-93”和“F114-284”的基礎(chǔ)為兩個(gè)片段的共同序列區(qū)域。該序列區(qū)域通過PCR擴(kuò)增片段“F114-284”而形成，該P(yáng)CR使用在其5’區(qū)域包含編碼氨基酸88-93的額外的DNA序列的特異性有義的寡核苷酸(表1)。
通過兩個(gè)單獨(dú)制備的cDNA片段的限制性酶切和隨后的連接而產(chǎn)生編碼缺失變體Phl p 5a DM-Δ175-198(SEQ ID NO 5、cDNA序列(783bp)和SEQ ID NO6、氨基酸序列(260aa))。5’端片段“F1-174”是通過PCR使用引物1和2制備的而3’端片段“F199-284”是使用引物3和4制備的。將cDNA片段用限制性酶Spel消化，隨后連接(參見表1)。使用引物1和4通過PCR將連接產(chǎn)物擴(kuò)增。
缺失變體Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198的cDNA(SEQ ID NO7，cDNA序列(723bp)和SEQ ID NO8，氨基酸序列(240aa))類似地是從兩個(gè)cDNA片段制備的。利用引物1和5以及以rPhl p 5awt-cDNA為基質(zhì)產(chǎn)生5’端片段，而利用引物4和6以及以Phl p 5a DM-Δ175-198-cDNA為基質(zhì)產(chǎn)生3’端片段。通過對(duì)應(yīng)于rPhl p 5a wt蛋白的氨基酸88-93的共同序列區(qū)域，利用引物1和4經(jīng)第三次PCR連接片段，并且擴(kuò)增片段。
將編碼修飾的過敏原的cDNA經(jīng)EheI和HindIII限制性酶切位點(diǎn)連接入表達(dá)載體pProExHTa(Invitrogen，Carlsbad，USA)并且隨后進(jìn)行全長測(cè)序。
早熟禾亞科(Pooideae)，例如草地早熟禾和黑麥草第5組過敏原的免疫交叉反應(yīng)基于非常相似的氨基酸序列。可以認(rèn)為相應(yīng)的基因來自共同的祖基因。早熟禾亞科(Pooideae)第5組過敏原中的同源序列區(qū)存在于Phl p 5a wt蛋白序列(參考GenBank AJ555152)的缺失體Δ94-113和Δ175-198序列并且存在于其側(cè)翼序列區(qū)。所述序列區(qū)的高同源性可在DNA水平和氨基酸水平得到證實(shí)(

圖1和圖2)。
表1用于制備缺失變體的PCR引物列表
SpeI限制性酶切位點(diǎn)由下劃線表示。
重組Phl p 5a分子的表達(dá)和純化將重組蛋白以組氨酸融合蛋白形式在大腸桿菌(JM109)中表達(dá)，該融合蛋白含有整合的蛋白酶切割位點(diǎn)(表達(dá)載體pProExHTa；Invitrogen，Carlsbad，USA)，用于任選地除去組氨酸融合組分(His)。將rPhl p 5a wt和缺失突變體首先通過將N-端組氨酸殘基特異性地結(jié)合至Ni2+螯合物基質(zhì)(固定化的金屬離子親和色譜，IMAC)并且隨后通過制備性的凝膠過濾(體積排阻色譜)而純化。
通過SDS-PAGE和分析SEC監(jiān)控洗脫的蛋白的純度。結(jié)果顯示rPhlp 5a wt(His)、Phl p 5a DM-Δ94-113(His)；Phl p 5a DM-Δ175-198(His)和Phl p 5a DM-Δ94-113，175-198(His)可以以高純度和單體形式制備(圖3)。蛋白的身份是通過Phl p 5a-特異性單克隆抗體被證實(shí)的。
IgE反應(yīng)性是通過IgE結(jié)合技術(shù)(免疫印跡、剝離試驗(yàn)、EAST抑制試驗(yàn)和嗜堿細(xì)胞活性試驗(yàn))的檢驗(yàn)和T-細(xì)胞反應(yīng)性的研究以及使用不帶有組氨酸融合組分的檢驗(yàn)物質(zhì)而進(jìn)行的。
為了達(dá)到這個(gè)目的，首先以融合蛋白的形式以類似于對(duì)照蛋白rPhl p 5a wt的方式制得缺失變體。然而，組氨酸融合組分隨后被酶切除去(TEV蛋白酶，Invitrogen，Carlsbad，USA)，僅留下甘氨酸作為靶蛋白N端蛋白酶切割序列的殘基。將切除的組氨酸組分和用于切割的蛋白酶通過IMAC徹底分離。經(jīng)制備性的SEC后，通過SDS-PAGE和分析性的SEC檢驗(yàn)洗脫蛋白的純度和組成，如圖4和5分別顯示的rPhl p 5a wt和突變體Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198。以純化和單體形式制得所有蛋白。通過對(duì)非-融合蛋白的非-變性等電聚焦(IEF)的研究顯示表面電荷的高度均一性(參見圖6，圖解Phl p 5aDM-Δ94-113、175-198)。
通過單克隆抗-Phl p 5a的抗體(Allergopharma，Reinbek，Germany)α-1D11或α-3B2(參見圖4，圖解Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198)以及N-端測(cè)序證實(shí)重組蛋白的身份。
Phl p 5a缺失變體的降低的IgE結(jié)合的測(cè)定用于測(cè)定變態(tài)反應(yīng)分子的IgE反應(yīng)性的一個(gè)簡單的試驗(yàn)方法為通過剝離試驗(yàn)研究來自過敏癥患者血清的特異性IgE與膜-結(jié)合試驗(yàn)蛋白的結(jié)合。
為此，將試驗(yàn)物質(zhì)在非-變性條件下以相同的濃度和量依次結(jié)合在硝酸纖維素膜條帶上?？梢詫⒁幌盗兴瞿l帶與過敏癥患者的多種血清同時(shí)孵育。經(jīng)過洗滌步驟后，將特異性結(jié)合的IgE抗體通過由抗-hlgE/堿性磷酸酶偶聯(lián)物促進(jìn)的生色反應(yīng)而在膜上呈現(xiàn)出來。
通過使用43個(gè)草類花粉過敏癥患者的血清在剝離試驗(yàn)中比較研究重組蛋白rPhl p 5a wt(His)、Phl p 5a DM-Δ94-113(His)；Phl p 5a DM-Δ175-198(His)和Phl p 5a DM-Δ94-113，175-198(His)的IgE反應(yīng)性(圖7)。
所有43個(gè)過敏癥患者的血清包含Phl p 5a-特異性IgE抗體，其與天然Phl p 5a(nPhl p 5a，此處未顯示)和重組等同物rPhl p 5awt(His)強(qiáng)烈地反應(yīng)。
令人驚奇的是，清楚地顯示所有43個(gè)患者血清的Phl p 5a-特異性IgE抗體均不與缺失變體Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198(His)結(jié)合或僅以大大降低的程度相結(jié)合。該降低的IgE結(jié)合歸因于缺失Δ94-113和缺失Δ175-198。缺失變體Phl p 5a DM-Δ175-198(His)在該試驗(yàn)的43個(gè)過敏癥患者血清的35個(gè)中顯示清晰可見的降低的IgE結(jié)合能力。在一些試驗(yàn)中，氨基酸175-198缺失的影響如此之大以致IgE的結(jié)合基本上完全被阻止(Ex.P3、P20、P28)。
缺失Δ94-113對(duì)IgE結(jié)合反應(yīng)性的影響相對(duì)較少被提及，但同樣是清晰可見的。與參照rPhl p 5a wt(His)相比，缺失變體Phl p 5aDM-Δ94-113(His)與43個(gè)過敏癥患者血清中的19個(gè)IgE結(jié)合明顯地更微弱(Ex.P31、P37、P42)。然而，相比Δ175-198引起的降低，在許多個(gè)體試驗(yàn)中所述IgE結(jié)合的降低相對(duì)不那么明顯。
因此很顯然，這兩個(gè)缺失對(duì)缺失變體Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198(His)的總IgE結(jié)合反應(yīng)性的降低有貢獻(xiàn)。
與剝離試驗(yàn)相反，EAST抑制試驗(yàn)(酶過敏原吸附試驗(yàn))可研究溶液中過敏原/IgE的相互作用，使得能干擾固定于膜上試驗(yàn)物質(zhì)表位的屏蔽被基本上排除。EAST抑制試驗(yàn)如下進(jìn)行。給微量滴定板包被過敏原，過敏原在此處為天然-ral Phl p 5(nPhl p 5a/b、Phl p 5a和Phl p 5b的混合物)。通過洗滌除去未結(jié)合的過敏原分子后，將平板用牛血清白蛋白封阻以防止隨后的非特異性結(jié)合。將過敏癥患者的IgE抗體，作為個(gè)體血清的代表性庫(血清庫)或單個(gè)血清，以合適的稀釋度與過敏原包被的微量滴定板一起孵育。通過偶聯(lián)至二級(jí)抗體(抗-hlgE/堿性磷酸酶偶聯(lián)物)的酶將底物轉(zhuǎn)化成生色的終產(chǎn)物而對(duì)過敏原結(jié)合的IgE抗體量進(jìn)行光度定量。
IgE抗體的結(jié)合受濃度依賴的可溶性過敏原或所要檢測(cè)物質(zhì)(重組修飾的過敏原)的物質(zhì)特異性的抑制。免疫化學(xué)相同的物質(zhì)呈現(xiàn)一致的抑制曲線。
在研究中所用的參照分子為nPhl p 5、rPhl p 5a wt以及組氨酸融合蛋白rPhl p 5a wt(His)。除了其他分子，通過與這些參照對(duì)比對(duì)組氨酸融合蛋白Phl p 5a DM-Δ94-113(His)、Phl p 5a DM-Δ175-198(His)和Phl p 5a DM-Δ94-113，175-198(His)以及非-融合蛋白Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198的IgE結(jié)合進(jìn)行了研究。
圖8a-c代表性地顯示試驗(yàn)物質(zhì)與草類花粉過敏癥患者的兩個(gè)單個(gè)血清和血清庫的特異性的抑制曲線。nPhl p 5a/b在所有試驗(yàn)中顯示最大的抑制作用(濃度10μg/ml時(shí)約為80-95％的抑制作用)。rPhlp 5a的抑制作用明顯較低，為最大值的70-80％。該作用由nPhl p 5a/b的組合物引起，其除了異構(gòu)體Phl p 5a外，還包含異構(gòu)體Phl p 5b。Phl p 5b的特異性IgE抗體不被rPhl p 5a wt抑制。
組氨酸融合組分對(duì)IgE結(jié)合沒有影響。這在所有試驗(yàn)中通過rPhl p5a wt(His)和rPhl p 5a wt的相同的抑制曲線清楚可見。這證實(shí)了組氨酸融合蛋白試驗(yàn)的效力。
通常，兩組患者血清在定性的IgE結(jié)合方面不同。
第一組由單獨(dú)的血清P15表示(圖8a)。這些過敏癥患者的血清包含IgE抗體，其與Phl p 5a的結(jié)合因缺失Δ94-113和Δ175-198而降低。此處缺失突變體Phl p 5a DM-Δ94-113(His)僅顯示約最大抑制作用的50％，而缺失突變體Phl p 5a DM-Δ175-198(His)僅顯示抑制作用的20-30％。
雙缺失突變體Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198(His)在所用的最高濃度時(shí)僅能抑制0-10％IgE抗體的結(jié)合。非-融合蛋白Phl p 5aDM-Δ94-113、175-198的使用證實(shí)了該結(jié)果(最大IgE抑制的0-10％)。
第二組過敏癥患者的血清，由單個(gè)血清P44表示(圖8b)，與第一組的不同在于，血清中的IgE抗體與Phl p 5a DM-Δ94-113(His)的反應(yīng)和參照rPhl p 5a wt(His)(70-80％最大抑制)的同樣良好，然而沒有或沒有可檢測(cè)量的與Phl p 5a DM-Δ175-198(His)反應(yīng)的IgE抗體(最大抑制的0-10％)。
雙缺失突變體Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198同樣顯示對(duì)該組過敏癥患者的血清的很大程度降低的抑制作用(0-10％)，對(duì)于融合蛋白和無融合組分的蛋白來說均如此。
這些過敏癥患者的血清顯然包含主要針對(duì)該分子C-端部分的表位的IgE抗體。
20個(gè)過敏癥患者的血清庫的IgE抗體的IgE結(jié)合反應(yīng)性的測(cè)定數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了缺失Δ94-113和Δ175-198對(duì)Phl p 5a的IgE結(jié)合降低的重要性(圖8c)。兩個(gè)單缺失突變體Phl p 5a DM-Δ94-113(His)和Phl p 5a DM-Δ175-198(His)顯示較低的最大抑制作用，與rPhlp 5a wt(約70％)相比，分別為40-50％和約30％。雙缺失突變體Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198僅與血清庫的IgE抗體非常微弱地結(jié)合(最大抑制的10-15％)，其與剝離試驗(yàn)中43個(gè)過敏癥患者的檢驗(yàn)相一致，表明該P(yáng)hl p 5a變體在許多，即使不全是草類花粉過敏癥的患者中顯示了很大程度上降低的IgE結(jié)合反應(yīng)性。
通過嗜堿細(xì)胞活性試驗(yàn)測(cè)定缺失突變體的弱敏性通過嗜堿細(xì)胞活性試驗(yàn)，研究了缺失突變體的降低的IgE結(jié)合能力對(duì)效應(yīng)細(xì)胞的膜-結(jié)合IgE通路中功能效應(yīng)的影響及其活性。因此在靈敏的體外試驗(yàn)中測(cè)定了變態(tài)反應(yīng)中功能的降低。
對(duì)于嗜堿細(xì)胞活化試驗(yàn)，將來自過敏癥患者肝素化的全血與各種濃度的試驗(yàn)物質(zhì)一起孵育。致敏物質(zhì)能結(jié)合特異性的IgE抗體，該抗體與嗜堿性粒細(xì)胞的高-親和性IgE受體相聯(lián)系。
由過敏原分子啟動(dòng)的IgE/受體復(fù)合物的交聯(lián)產(chǎn)生信號(hào)傳導(dǎo)，其引起效應(yīng)細(xì)胞的脫粒以及體內(nèi)變態(tài)反應(yīng)的起始。
在體外，過敏原-誘導(dǎo)的嗜堿免疫細(xì)胞的活化可通過與IgE受體交聯(lián)的信號(hào)傳導(dǎo)偶聯(lián)的表面蛋白(CD203c)表達(dá)的定量化而測(cè)定(Kahlert等.，Clinical Immunology and Allergy in Medicine Proceedingof the EAACI 2002(2003)Naples，Italy 739-744)。通過熒光標(biāo)記的單克隆抗體結(jié)合至表面蛋白以及隨后通過熒光-激活的流式細(xì)胞術(shù)的分析而高靈敏度地測(cè)定細(xì)胞上表面蛋白的表達(dá)量以及細(xì)胞庫中活化細(xì)胞的百分比。
此處所用的參照物質(zhì)為純化的天然Phl p 5a(nPhl p 5a)和與試驗(yàn)物質(zhì)相似的rPhl p 5a wt。來自六個(gè)個(gè)體的雙缺失突變體Phl p 5aDM-Δ94-113、175-198對(duì)嗜堿細(xì)胞的試驗(yàn)結(jié)果在圖9中以曲線顯示。來自全部10個(gè)確定為過敏癥患者的嗜堿細(xì)胞的試驗(yàn)結(jié)果在表2中顯示。
參照分子的A50值(A50活化的嗜堿細(xì)胞數(shù)達(dá)到最大值的50％時(shí)的過敏原的濃度)各自在～1.3-15pM(對(duì)于rPhl p 5a wt)以及～0.3-10pM(對(duì)于nPhl p 5a)的范圍內(nèi)變化(表2)。相反，缺失變體Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198的A50值為～18-8400pM。測(cè)定的所用三種物質(zhì)的A50值被用于確定每個(gè)試驗(yàn)個(gè)體中相對(duì)于未改變的參照分子nPhl p 5a和rPhl p 5a wt、缺失變體Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198的變態(tài)反應(yīng)效力(表2)。
缺失變體Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198的相對(duì)變態(tài)反應(yīng)效力(Pr，相對(duì)潛力)與參照分子rPhl p 5a wt相比降低了～12-5000倍，或與參照nPhl p 5a相比降低了～16-32000倍(表2)。
表2通過嗜堿細(xì)胞活性試驗(yàn)測(cè)定缺失突變體Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198的弱敏性
a活化的嗜堿細(xì)胞數(shù)達(dá)到最大值的50％時(shí)的過敏原的濃度b相對(duì)潛力c臨床確定的草類花粉過敏癥患者d從A50 rPhl p 5a wt/A50 Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198計(jì)算得到e從A50 nPhl p 5a/A50 Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198計(jì)算得到f粗體的最小和最大值T-細(xì)胞反應(yīng)性讓輔助性淋巴細(xì)胞與通過在抗原-呈遞細(xì)胞(APC)中進(jìn)行酶降解而形成的過敏原的多肽片段(約12-25個(gè)氨基酸)反應(yīng)并且在APC表面包含了II型MHC分子的合適的多肽后將其呈遞至T-細(xì)胞。該輔助性的T淋巴細(xì)胞過敏原-特異性的活化對(duì)于隨后的反應(yīng)(增值、無反應(yīng)性、凋亡)以及功能性區(qū)分(TH1和TH2)是必需的。在脫敏作用中用過敏原或過敏原變體處理的過敏原-特異性T淋巴細(xì)胞的影響被認(rèn)為是治療效力的關(guān)鍵。
為了研究T-細(xì)胞的反應(yīng)性，通過常規(guī)方法用nPhl p 5或rPhl p 5分子刺激而建立禾本科花粉過敏癥患者的寡克隆T-細(xì)胞系(TCL)。
在增值試驗(yàn)中，用參照過敏原nPhl p 5a和rPhl p 5a wt和雙缺失突變體Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198刺激各種T-細(xì)胞系。通過摻入[3H]胸腺嘧啶脫氧核苷按照常規(guī)方法測(cè)定增值率。
表3通過采用Phl p 5-特異性T-細(xì)胞系(TCL)的增值試驗(yàn)測(cè)定缺失突變體Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198的T-細(xì)胞反應(yīng)性
a從[3H]測(cè)定值計(jì)算得到。過敏原刺激的細(xì)胞培養(yǎng)物的cpm測(cè)定值/未刺激的細(xì)胞培養(yǎng)物的cpm測(cè)定值b供體臨床確定的草類花粉過敏癥患者來自六個(gè)過敏癥患者的十個(gè)TCL的結(jié)果顯示這些TCL受Phl p 5aDM-Δ94-113、175-198刺激而增值的強(qiáng)度與未改變的天然或重組野生型過敏原的相當(dāng)(表3)。
本發(fā)明因此涉及早熟禾亞科(Pooideae)的第5組過敏原變體，其特征在于和已知的野生型過敏原相比，具有降低的IgE反應(yīng)性以及保留的T-淋巴細(xì)胞反應(yīng)性。這些第5組過敏原優(yōu)選Phl p 5a、Poa p 5和Lol p 5，尤其優(yōu)選Phl p 5a。
已經(jīng)證實(shí)對(duì)應(yīng)于在第5組過敏原中缺失或除去的Phl p 5a氨基酸序列區(qū)94-113和175-198的氨基酸序列區(qū)特別有利于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明尤其涉及所述的過敏原變體。首次提及的或其次提及的區(qū)域可以分別缺失，但所述區(qū)域也可同時(shí)缺失，后者的實(shí)施方式是特別優(yōu)選的。
由于和早熟禾亞科(Pooideae)第5組過敏原具有高度的序列同源性，這些區(qū)域可在Phl p 5a序列與來自其他第5組過敏原的序列的序列對(duì)比中明確地得到鑒定。上述過敏原變體優(yōu)選始于Phl p 5a或?qū)?yīng)于序列SEQ ID NO 4、6或8。
本發(fā)明的過敏原變體可在基因工程方法幫助下從克隆的DNA開始制備。然而原則上，對(duì)天然過敏原提取物的化學(xué)修飾也是可行的(Fiebig，1995，Allergo J.4(7)，377-382)。
當(dāng)然，在其他位點(diǎn)上進(jìn)行另外的修飾-例如，為了提高弱敏性-通過本發(fā)明申請(qǐng)所述的對(duì)第5組過敏原的改變也是可行的。這些修飾可以是例如氨基酸的插入、缺失和交換、將蛋白質(zhì)切割為片段以及將蛋白或其片段與其他蛋白或多肽融合。
在制備此處詳細(xì)所述的過敏原變體時(shí)，可通過基因工程方法引入His標(biāo)簽以改善對(duì)過表達(dá)的蛋白的純化。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及編碼上述過敏原變體的DNA分子，尤其是根據(jù)SEQ ID NO 3、5或7的序列，涉及包含該DNA分子的重組表達(dá)載體以及使用所述DNA分子或所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主體。合適的宿主體可以是原核或真核的、單細(xì)胞體或多細(xì)胞體，如細(xì)菌或酵母。本發(fā)明優(yōu)選的宿主體為大腸桿菌。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過培養(yǎng)所述宿主體和從培養(yǎng)物分離相應(yīng)過敏原變體而制備本發(fā)明過敏原變體的方法。
本發(fā)明還涉及作為藥物的上述過敏原變體、DNA分子和表達(dá)載體。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于早熟禾亞科(Pooideae)第5組過敏原參與觸發(fā)的過敏癥治療，或用于早熟禾亞科(Pooideae)第5組過敏原參與觸發(fā)的過敏癥患者的免疫治療接種和/或所述過敏癥的預(yù)防的藥物組合物，其包括這些過敏原變體或相應(yīng)的DNA分子或相應(yīng)的表達(dá)載體中的至少一種以及任選另外的活性組分和/或佐劑。
如果這些藥物組合物為第二種類型(包括至少一種DNA分子或表達(dá)載體)，則該組合物優(yōu)選進(jìn)一步包括氫氧化鋁、具有免疫刺激作用的包含CpG的寡核苷酸或上述兩種的組合作為佐劑。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，藥物組合物可用作人或獸類藥物的治療制劑。合適的賦形劑為有機(jī)或無機(jī)物質(zhì)，其適于腸胃外給藥并且不與本發(fā)明的第5組過敏原變體反應(yīng)。適于腸胃外給藥尤其指溶液，優(yōu)選油性或水溶液，進(jìn)一步為懸液、乳劑或植入物。本發(fā)明的過敏原變體可以是經(jīng)冷凍干燥的以及用于例如注射制劑制備的所得到的冷凍干燥物。所述組合物可以是無菌的和/或包括佐劑，如潤滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑和/或濕劑、乳化劑、用于調(diào)節(jié)滲透壓的鹽類、緩沖物質(zhì)和/或多種另外的活性組分。
最后，本發(fā)明涉及至少一種本發(fā)明的過敏原變體或本發(fā)明的DNA分子或本發(fā)明的表達(dá)載體在制備藥物中的用途，其用于早熟禾亞科(Pooideae)第5組過敏原參與觸發(fā)的過敏癥治療或早熟禾亞科(Pooideae)第5組過敏原參與觸發(fā)的過敏癥患者的免疫治療接種和/或所述過敏癥的預(yù)防。
序列表<110>Merck Patent GmbH<120>具有降低的過敏原性和保留的T-細(xì)胞反應(yīng)性的Phl p 5a衍生物<130>P 03/109<140>DE 10325508.7<141>2003-06-04<160>14<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>855<212>DNA<213>梯牧草<400>1gccgatctag gctacggccc ggccacccca gctgccccgg ccgccggcta cacccccgcc 60gccccggccg gagcggagcc agcaggtaag gcgacgaccg aggagcagaa gctgatcgag120aagatcaacg ccggcttcaa ggcggccttg gccgctgccg ccggcgtccc gccagcggac180aagtacagga cgttcgtcgc aaccttcggc gcggcctcca acaaggcctt cgcggagggc240ctctcgggcg agcccaaggg cgccgccgaa tccagctcca aggccgcgct cacctccaag300ctcgacgccg cctacaagct cgcctacaag acagccgagg gcgcgacgcc tgaggccaag360tacgacgcct acgtcgccac cctaagcgag gcgctccgca tcatcgccgg caccctcgag420gtccacgccg tcaagcccgc ggccgaggag gtcaaggtta tccctgccgg cgagctgcag480gtcatcgaga aggtcgacgc cgccttcaag gtcgctgcca ccgccgccaa cgccgcgccc540
gccaacgaca agttcaccgt cttcgaggcc gccttcaaca acgccatcaa ggcgagcacg600ggcggcgcct acgagagcta caagttcatc cccgccctgg aggccgccgt caagcaggcc660tacgccgcca ccgtcgccac cgcgccggag gtcaagtaca ccgtctttga gaccgcgctg720aaaaaggcca tcaccgccat gtccgaggcc cagaaggctg ccaagcccgc tgccgctgcc780accgccaccg caacctccgc cgttggcgcg gccaccggcg ccgccaccgc cgctactggt840ggctacaaag tctga 855<210>2<211>284<212>PRT<213>梯牧草<400>2Ala Asp Leu Gly Tyr Gly Pro Ala Thr Pro Ala Ala Pro Ala Ala Gly1 5 10 15Tyr Thr pro Ala Ala Pro Ala Gly Ala Glu Pro Ala Gly Lys Ala Thr20 25 30Thr Glu Glu Gln Lys Leu Ile Glu Lys Ile Asn Ala Gly Phe Lys Ala35 40 45Ala Leu Ala Ala Ala Ala Gly Val Pro Pro Ala Asp Lys Tyr Arg Thr50 55 60Phe Val Ala Thr Phe Gly Ala Ala Ser Asn Lys Ala Phe Ala Glu Gly65 70 75 80Leu Ser Gly Glu Pro Lys Gly Ala Ala Glu Ser Ser Ser Lys Ala Ala85 90 95Leu Thr Ser Lys Leu Asp Ala Ala Tyr Lys Leu Ala Tyr Lys Thr Ala100 105 110Glu Gly Ala Thr Pro Glu Ala Lys Tyr Asp Ala Tyr Val Ala Thr Leu115 120 125Ser Glu Ala Leu Arg Ile Ile Ala Gly Thr Leu Glu Val His Ala Val130 135 140Lys Pro Ala Ala Glu Glu Val Lys Val Ile pro Ala Gly Glu Leu Gln
145 150 155 160Val Ile Glu Lys Val Asp Ala Ala Phe Lys Val Ala Ala Thr Ala Ala165 170 175Asn Ala Ala Pro Ala Asn Asp Lys Phe Thr Val Phe Glu Ala Ala Phe180 185 190Asn Asn Ala Ile Lys Ala Ser Thr Gly Gly Ala Tyr Glu Ser Tyr Lys195 200 205Phe Ile Pro Ala Leu Glu Ala Ala Val Lys Gln Ala Tyr Ala Ala Thr210 215 220Val Ala Thr Ala Pro Glu Val Lys Tyr Thr Val phe Glu Thr Ala Leu225 230 235 240Lys Lys Ala Ile Thr Ala Met Ser Glu Ala Gln Lys Ala Ala Lys Pro245 250 255Ala Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Thr Ser Ala Val Gly Ala Ala Thr260 265 270Gly Ala Ala Thr Ala Ala Thr Gly Gly Tyr Lys Val275 280<210>3<211>795<212>DNA<213>梯牧草<400>3gccgatctag gctacggccc ggccacccca gctgccccgg ccgccggcta cacccccgcc 60gccccggccg gagcggagcc agcaggtaag gcgacgaccg aggagcagaa gctgatcgag120aagatcaacg ccggcttcaa ggcggccttg gccgctgccg ccggcgtccc gccagcggac180aagtacagga cgttcgtcgc aaccttcggc gcggcctcca acaaggcctt cgcggagggc240ctctcgggcg agcccaaggg cgccgccgaa tccagctccg gcgcgacgcc tgaggccaag300tacgacgcct acgtcgccac cctaagcgag gcgctccgca tcatcgccgg caccctcgag360gtccacgccg tcaagcccgc ggccgaggag gtcaaggtta tccctgccgg cgagctgcag420gtcatcgaga aggtcgacgc cgccttcaag gtcgctgcca ccgccgccaa cgccgcgccc480
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1.早熟禾亞科(Pooideae)的第5組過敏原變體，其特征在于和已知的野生型過敏原相比，具有降低的IgE反應(yīng)性以及基本保留的與T-淋巴細(xì)胞的反應(yīng)性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的過敏原變體，選自Ph1 p 5a、Poa p 5和Lo1 p 5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的一項(xiàng)或多項(xiàng)的過敏原變體，由Ph1 p 5a衍生而得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中的一項(xiàng)或多項(xiàng)的過敏原變體，其特征在于和已知野生型過敏原相比，對(duì)應(yīng)于Ph1 p 5a的氨基酸序列區(qū)94-113和175-198的至少一個(gè)區(qū)域或其組合缺失了。
5.過敏原Ph1 p 5a的變體，其特征在于選自氨基酸序列區(qū)94-113和175-198的至少一個(gè)區(qū)域或其組合缺失了。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的過敏原Ph1 p 5a的變體，它具有選自SEQ IDNO 4、6和8的氨基酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中的一項(xiàng)或多項(xiàng)的過敏原變體，其特征在于它們是通過重組基因工程方法獲得。
8.編碼根據(jù)權(quán)利要求1-7中的一項(xiàng)或多項(xiàng)的過敏原變體的DNA分子。
9.對(duì)應(yīng)于選自SEQ ID NO 3、5和7的一個(gè)序列DNA序列的DNA分子。
10.包含根據(jù)權(quán)利要求8或9的DNA分子的重組表達(dá)載體，它與表達(dá)控制序列功能性地結(jié)合。
11.使用權(quán)利要求8或9的DNA分子或權(quán)利要求10的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主體。
12.通過培養(yǎng)權(quán)利要求11的宿主體以及從培養(yǎng)物分離相應(yīng)的過敏原變體而制備根據(jù)權(quán)利要求1-7的過敏原變體的方法。
13.用作藥物的權(quán)利要求1-7中的一項(xiàng)或多項(xiàng)的過敏原變體。
14.用于治療早熟禾亞科(Pooideae)第5組過敏原參與觸發(fā)的過敏癥的藥物組合物，包括對(duì)應(yīng)于權(quán)利要求1-7中的一項(xiàng)或多項(xiàng)的至少一種過敏原變體以及任選的另外的活性組分和/或佐劑。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-7中的一項(xiàng)或多項(xiàng)的至少一種過敏原變體在制備用于治療早熟禾亞科(Pooideae)第5組過敏原參與觸發(fā)的過敏癥的藥物中的應(yīng)用。
16.用作藥物的權(quán)利要求8或9的DNA分子。
17.用作藥物的權(quán)利要求10的重組表達(dá)載體。
18.用于早熟禾亞科(Pooideae)第5組過敏原參與觸發(fā)的過敏癥患者的免疫治療的DNA接種和/或所述過敏癥的預(yù)防的藥物組合物，它包括權(quán)利要求16的至少一種DNA分子或權(quán)利要求17的至少一種表達(dá)載體以及任選另外的活性組分和/或佐劑。
19.權(quán)利要求18的藥物組合物，它包括氫氧化鋁、具有免疫刺激作用的包含CpG的寡核苷酸或上述兩種組合的作為佐劑。
20.權(quán)利要求16的至少一種DNA分子或權(quán)利要求17的至少一種表達(dá)載體在制備早熟禾亞科(Pooideae)第5組過敏原參與觸發(fā)的過敏癥患者的免疫治療的DNA接種和/或所述過敏癥的預(yù)防的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及早熟禾亞科(Pooideae)第5組過敏原變體的制備和用途，其特征在于和已知的野生型過敏原相比，具有降低的IgE反應(yīng)性以及基本保留的與T－淋巴細(xì)胞的反應(yīng)性。這些低過敏原性的過敏原變體可用于草類花粉過敏患者的特定免疫療法(弱敏性)或用于草類花粉過敏的預(yù)防免疫療法。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1798763SQ200480015311
公開日2006年7月5日 申請(qǐng)日期2004年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月4日
發(fā)明者M·瓦爾德, O·克羅姆維爾, A·南迪, H·卡萊爾特, B·韋伯, H·費(fèi)比希 申請(qǐng)人:默克專利股份公司