專利名稱：通過發(fā)酵生產(chǎn)硫胺的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)硫胺化合物的方法，其中使用了含有突變的微生物，所述突變使得該微生物得以過量產(chǎn)生硫胺并將其釋放到培養(yǎng)基中。本發(fā)明還提供了生物學(xué)上純的微生物，以及經(jīng)過分離的含有突變的多核苷酸。此外，本發(fā)明還提供了在臨床樣品中探測(cè)病原微生物的方法、用于鑒定抗生素的試驗(yàn)以及通過上述試驗(yàn)鑒定出來的抗生素。
硫胺也被稱為維生素B1，其是水溶性維生素B復(fù)合物中的一種，并且是哺乳動(dòng)物所需要的營養(yǎng)物質(zhì)。硫胺的焦磷酸鹽/酯形式在體內(nèi)作為輔酶發(fā)揮作用于多種碳水化合物和氨基酸的代謝途徑中，例如，被丙酮酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶和轉(zhuǎn)酮醇酶(transketolase)催化的那些。與其它維生素(例如核黃素和生物素)生物合成途徑不同，硫胺并非從頭途徑(de novopathway)中的一部分，事實(shí)上其是補(bǔ)救途徑(salvage pathway)中的一部分，這點(diǎn)需要特別注意。
硫胺生物合成中的大多數(shù)酶步驟和中間產(chǎn)物都已在E.coli里被研究過了，在Salmonella typhimurium和Rhizobium中也有較為粗淺的研究(參見Brown and Williamson(1987)pp.528-532，In F.C.Neidhardt et al.(ed.)Escherichia coli and Salmonella typhimuriumCellular and Molecular Biology，vol.1.American Society for Microbiology，Washington，D.C.；White andSpenser(1996)pp.680-686，In F.C.Neidhardt et al.(ed.)Escherichia coli andSalmonella typhimuriumCellular and Molecular Biology，vol.2.AmericanSociety for Microbiology，Washington，D.C.；Begley et al.(1999)Arch.Microbiol.171293-300)。編碼硫胺途徑中的步驟的E.coli基因定位于染色體的四個(gè)不同的區(qū)域上thiCEFSGH操縱子在90”上；thiMD操縱子在46”上；thiJ和thiL基因簇聯(lián)于9.5”附近，thiK在25”上。上述所有基因都已被克隆和測(cè)序，這些基因編碼的很多酶都已在E.coli中過量表達(dá)，其酶活性也已被測(cè)定。
嘧啶部分，4-氨基-5-羥甲基-2-甲基嘧啶磷酸酯(HMP-P)，來自5-氨基咪唑核糖酸(AIR)，后者是從頭的嘌呤生物合成途徑中的中間產(chǎn)物。在革蘭氏陰性細(xì)菌中，AIR向HMP-P的轉(zhuǎn)化是由thiC基因的產(chǎn)物催化的。HMP-P然后通過ThiD激酶被磷酸化成HMP-PP，這步發(fā)生于與噻唑單元結(jié)合之前。
噻唑部分，5-(2-羥乙基)-4-甲基噻唑磷酸酯(HET-P)，來自L-酪氨酸和1-去氧-D-木酮糖磷酸酯(DXP)；硫原子更像來自于L-半胱氨酸。該反應(yīng)需要至少五個(gè)基因(thiF、thiS、thiG、thiH和thiI)的表達(dá)。
HMP-PP和HET-P的結(jié)合是由thiE編碼的硫胺磷酸酯焦磷酸化酶催化的，這步得到硫胺單磷酸酯(TMP)。然后TMP再在thiI編碼的硫胺單磷酸酯激酶的作用下被磷酸化，形成硫胺焦磷酸酯(TPP)。因?yàn)榱虬凡⒎菑念^途徑的一部分，E.coli需要補(bǔ)救酶(thiK編碼的硫胺激酶)用于將外源硫胺轉(zhuǎn)化為TMP。
硫胺在B.subtilis中的合成看上去使用了跟E.coli中同樣的酶和中間產(chǎn)物(例如，見，Perkins and Pero(2001)pp.271-186，In Sonenshein et al，(ed.)Bacillus subtilis and its relativesfrom genes to cells，American society forMicrobiology，Washington，D.C.)。然而其中還有些重要的不同之處。傳統(tǒng)的基因名稱在E.coli和B.subtilis中是不同的。首先，來自E.coli的HMP生物合成酶ThiC、硫胺磷酸酯焦磷酸酯ThiE和羥乙基噻唑激酶ThiM的對(duì)應(yīng)物的名稱分別為ThiA、ThiC和ThiK。第二，已知的B.subtilis硫胺生物合成基因的組織也有所不同，其作為三個(gè)簇存在僅由thiA基因構(gòu)成的thiA座(locus)、由基因thiOSFGD1構(gòu)成的thiB座和由thiK和thiC基因構(gòu)成的thiC座。第三，噻唑生物合成中的至少一個(gè)酶步驟是不同的。B.subtilis基因組不含thiH的直向同源物(ortholog)。取而代之，thiO(thiB座上的yjbR)被預(yù)測(cè)能編碼噻唑生物合成中涉及到的氧化酶活性。該基因不存在于E.coli基因組中，也沒顯示出與ThiH的氨基酸同源性。其與來自Rhizobium etli的thi基因相關(guān)的基因(thiO)之一同源。第四，在B.subtilis中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了E.coli thiD的兩個(gè)直向同源物，yjbV(thiD1)和ywdB(thiD2)，其能編碼生物合成和補(bǔ)救HMP激酶。最后，thiC座含有一個(gè)未知基因，ywbI，其顯示出與轉(zhuǎn)錄調(diào)控子lysR家族的高度相似性。
本發(fā)明提供了一種微生物，其選自由Bacillaceae、Lactobacillaceae、Streptococcaceae、Corynebacteriaceae和Brevibacteriaceae所構(gòu)成的組，其中，所述微生物含有能對(duì)硫胺生產(chǎn)去調(diào)節(jié)并能使得硫胺產(chǎn)物從細(xì)胞中釋放出來的突變。
硫胺產(chǎn)物指單獨(dú)的硫胺、硫胺單磷酸酯(TMP)和/或硫胺焦磷酸酯(TPP)或其任意的組合。
應(yīng)當(dāng)理解，用于本發(fā)明的微生物指所述微生物的“生物學(xué)上純的培養(yǎng)物”，即與自然界中通常與該微生物相關(guān)聯(lián)的組分、細(xì)胞等物質(zhì)分離開的微生物。
按照《布達(dá)佩斯條約》的規(guī)定，下述材料于2003年5月12日和2004年4月5日被分別保藏于American Type Culture Collection(ATCC)，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108USA和Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)，Mascheroder Weg 1B，D-38124Braunschweig，Germany，其相應(yīng)的保藏編號(hào)如下所示Bacillus subtilis TH95(ATCC PTA-5221)、Bacillus subtilis TH 101(ATCC PTA-5222)、Bacillus subtilis TH 115(ATCC PTA-5223)、Bacillus subtilis TH 116(ATCC PTA-5224)、Bacillus subtilis TH 404(DSM 16333)和Bacillussubtilis TH 405(DSM 16334)。
本文中使用的“突變”可與“修飾”互換使用，其表示微生物(例如細(xì)菌)的野生型DNA的變化，使得該微生物較之野生型微生物產(chǎn)生了表型上的改變，例如，通過任何機(jī)制使得硫胺或硫胺產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)或外增加或減少。突變可由一系列方法導(dǎo)致，包括一次或多次框位移(frameshift)、取代、插入和/或缺失，包括無意義的突變(nonsense mutation)(琥珀型(UAG)、赭石型(T/UAA)和乳白型(T/UGA))。缺失可以是單個(gè)核苷酸或多個(gè)核苷酸的缺失，也包括整個(gè)基因的缺失。
“氨基酸取代”指一對(duì)一的氨基酸替換。當(dāng)被取代的氨基酸具有類似的結(jié)構(gòu)和/或化學(xué)性質(zhì)時(shí)，此類取代是保守的。保守替換的例子包括用異亮氨酸或纈氨酸來取代亮氨酸、用谷氨酸來取代天冬氨酸，或者用絲氨酸來取代蘇氨酸。本發(fā)明范圍內(nèi)的非保守取代包括用具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸來取代具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸，例如用苯丙氨酸取代亮氨酸。
氨基酸“插入”或“缺失”表示對(duì)氨基酸序列的改變或在其中的改變。它們典型地在大約1至5個(gè)氨基酸的范圍內(nèi)。對(duì)特定氨基酸序列而言，所允許的變化可由實(shí)驗(yàn)測(cè)定，通過合成生產(chǎn)肽或者通過用重組DNA技術(shù)系統(tǒng)性地在序列中制造核苷酸的插入、缺失或取代來進(jìn)行。
“去調(diào)節(jié)”(deregulate或deregulation)指對(duì)編碼生物合成途徑中的酶/蛋白質(zhì)的基因表達(dá)的改變或修飾，使得所述酶/蛋白質(zhì)的水平或活性被改變或修飾，其導(dǎo)致，但不限于，硫胺產(chǎn)物的產(chǎn)量增加，或硫胺產(chǎn)物向細(xì)胞外的釋放增加(例如，通過分泌、流出等)。對(duì)基因表達(dá)的改變或修飾可以通過改變基因本身的DNA序列或基因外面的區(qū)域(包括非編碼蛋白質(zhì)的DNA區(qū)域)來進(jìn)行?！叭フ{(diào)節(jié)”還可以指能改變細(xì)胞中生物合成基因的表達(dá)的代謝物胞內(nèi)水平的變化，使得硫胺產(chǎn)物的產(chǎn)量或釋放增加。
在一種實(shí)施方式中，如上文定義的對(duì)微生物中硫胺的生產(chǎn)去調(diào)節(jié)的突變選自由ΔthiL、tx1、tx26或其組合所構(gòu)成的組。此突變包括tx1與ΔthiL的組合、tx26與ΔthiL的組合、tx26與tx1的組合以及tx1和tx26一起與ΔthiL的組合。優(yōu)選的是包含全部三種突變?chǔ)hiL、tx1和tx26的微生物。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，微生物選自由Bacillus、Lactobacillus、Lactococcus、Corynebacterium和Brevibacterium所構(gòu)成的組。更優(yōu)選地，微生物選自Bacillus屬，最優(yōu)選地，其是B.subtilis細(xì)胞。
在一種實(shí)施方式中，含有如上文定義的突變的微生物是B.subtilisTH95。
在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了如上文定義的含有突變的微生物，所述突變選自由ΔthiL、tx1、tx26或其組合所構(gòu)成的組，所述微生物還包含下述DNA盒，該DNA盒含有編碼thiA基因產(chǎn)物的多核苷酸序列的至少一個(gè)拷貝，其中該多核苷酸序列受強(qiáng)組成型啟動(dòng)子可操作地控制。優(yōu)選的微生物是B.subtilis TH116。
在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了如上文定義的含有突變的微生物，所述突變選自由ΔthiL、tx1、tx26或其組合所構(gòu)成的組，所述微生物還包含下述DNA盒，該DNA盒含有編碼來自thiKC操縱子的基因產(chǎn)物的多核苷酸序列的至少一個(gè)拷貝，其中該多核苷酸序列受強(qiáng)組成型啟動(dòng)子可操作地控制。優(yōu)選的微生物是B.subtilis TH115。
在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了如上文定義的含有突變的微生物，所述突變選自由ΔthiL、tx1、tx26或其組合所構(gòu)成的組，所述微生物還包含下述DNA盒，該DNA盒含有編碼tenAl-thiOSGFD操縱子的基因產(chǎn)物的多核苷酸序列，其中多核苷酸序列受強(qiáng)組成型啟動(dòng)子可操作地控制。優(yōu)選的微生物是B.subtilis TH404。
在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了如上文定義的含有突變的微生物，所述突變選自由ΔthiL、tx1、tx26或其組合所構(gòu)成的組，所述微生物還包含下述DNA盒(a)含有編碼tenAl-thiOSGFD操縱子的基因產(chǎn)物的多核苷酸序列的DNA盒和(b)含有編碼thiA基因產(chǎn)物的多核苷酸序列的至少一個(gè)拷貝的DNA盒，其中該多核苷酸序列受強(qiáng)組成型啟動(dòng)子可操作地控制。優(yōu)選的微生物是B.subtilis TH405。
在本發(fā)明中，“DNA盒(DNA cassette)”指DNA編碼序列或DNA的片斷，其編碼可在規(guī)定的限制性位點(diǎn)被插入到載體中的表達(dá)產(chǎn)物。盒的限制性位點(diǎn)被設(shè)計(jì)為能確保所述的盒能被插入正確的閱讀框。通常，外源DNA被插入到載體DNA的一個(gè)或多個(gè)限制性位點(diǎn)上，然后其由載體攜帶，與轉(zhuǎn)運(yùn)載體DNA一起進(jìn)入宿主細(xì)胞。通過使用線性化載體DNA末端連接的拓?fù)洚悩?gòu)酶，也可在沒有限制酶的情況下將DNA片段插入到載體DNA中；這對(duì)于直接克隆由PCR制備的DNA片段來說是特別有用的。具有插入的或增加的DNA的DNA片斷或序列，例如表達(dá)載體，也被稱為“DNA構(gòu)建體”。載體通常的形式是“質(zhì)?！?，其通常是自包含的(self-contained)雙鏈DNA分子，通常來源于細(xì)菌，其能夠容易地接受額外的(外源)DNA，并容易被轉(zhuǎn)化到合適的宿主細(xì)胞中去。質(zhì)粒通常含有編碼DNA和啟動(dòng)子DNA，具有一個(gè)或多個(gè)適于插入外源DNA的限制性位點(diǎn)?！熬幋aDNA”是編碼用于特定蛋白質(zhì)或酶的特定氨基酸序列的DNA序列。除含有特定核苷酸序列之外，DNA盒還可以含有額外的轉(zhuǎn)錄控制元件，包括用于控制特定核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子?！皢?dòng)子DNA”是能對(duì)編碼DNA的表達(dá)進(jìn)行初始化、調(diào)控或反向調(diào)節(jié)或控制的DNA序列。啟動(dòng)子DNA和編碼DNA可以來自相同的基因，或者來自不同的基因，并且可以來自相同的或不同的生物。大量的載體，包括質(zhì)粒和真菌載體，都已被報(bào)道過可用于在一系列真核及原核宿主中。非限制性的例子包括在實(shí)施例中具體描述的那些，以及pKK質(zhì)粒(Clonetech)、pUC質(zhì)粒、pET質(zhì)粒(Novagen，Inc.，Madison，WI)、pRSET或pREP質(zhì)粒(Invitrogen，San Diego，CA)或pMAL質(zhì)粒(New England Biolabs，Beverly，MA)、pCR2.1Topo(Invitrogen，San Diego，CA)、pXLTopo(Invitrogen，San Diego，CA)，和很多適合的宿主細(xì)胞，使用本文中公開或引用的方法，以及相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法。重組克隆載體通常將包括一套或多套用于克隆或表達(dá)的復(fù)制系統(tǒng)、一個(gè)或多個(gè)用于在宿主中進(jìn)行選擇的標(biāo)記(例如，抗生素抗性)以及一個(gè)或多個(gè)表達(dá)盒。
DNA盒可以含有編碼DNA的一個(gè)或多個(gè)拷貝，例如該序列的1-50個(gè)拷貝，優(yōu)選地，1-25個(gè)拷貝，例如，1-5、1-10、1-15和1-20個(gè)拷貝。該序列可以以任何順序排列，包括，例如，串聯(lián)，即頭尾排列。
“可操作地控制”指編碼DNA的轉(zhuǎn)錄受到例如啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子的控制或調(diào)節(jié)。此類啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子與編碼DNA相鄰，或可定位于編碼DNA的上游或下游。
“強(qiáng)組成型啟動(dòng)子”能使mRNA以相對(duì)于天然的宿主細(xì)胞而言的高頻率被初始化。強(qiáng)組成型啟動(dòng)子是公知的，可以根據(jù)宿主細(xì)胞中將受到控制的特定序列來選擇一個(gè)合適的。來自革蘭氏陽性微生物的上述強(qiáng)組成型啟動(dòng)子的例子包括但不限于SP01-26、SP01-15、veg、pyc(丙酮酸羧化酶啟動(dòng)子)和amyE。來自革蘭氏陰性微生物的啟動(dòng)子的例子包括但不限于tac、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PR和λ-PL。
在另一方面，本發(fā)明提供了如上文定義的含有突變的微生物，所述突變選自由ΔthiL、tx1、tx26或其組合所構(gòu)成的組，所述微生物還包含下述DNA盒(a)對(duì)B.subtilis的嘌呤操縱子的表達(dá)去調(diào)節(jié)的第一種突變和(b)阻止5-氨基咪唑核糖酸(AIR)向羧基氨基咪唑核糖酸(CAIR)轉(zhuǎn)化的第二種突變。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，第一種突變包含pur操縱子的引導(dǎo)區(qū)域內(nèi)的突變，第二種突變包含編碼磷酸核糖氨基咪唑羧化酶I的purE基因內(nèi)部的突變。更優(yōu)選地，所述微生物是B.subtilis TH101。
術(shù)語“阻止……轉(zhuǎn)化”指該突變會(huì)阻止AIR向CAIR轉(zhuǎn)化的細(xì)胞內(nèi)過程。在本發(fā)明中，AIR向CAIR的轉(zhuǎn)化優(yōu)選被完全阻止；但是對(duì)該轉(zhuǎn)化阻止到70％以上，例如85-90％以上，也是可以接受的。
在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)硫胺產(chǎn)物的手段或方法。該方法包括在合適的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)如上文定義的含有突變的微生物，所述突變選自由ΔthiL、tx1、tx26或其組合所構(gòu)成的組，使得微生物能過量生產(chǎn)硫胺產(chǎn)物并釋放到培養(yǎng)基中。然后再從培養(yǎng)基中回收硫胺產(chǎn)物。
“過量生產(chǎn)”指本發(fā)明的微生物或用于本發(fā)明方法的微生物經(jīng)過改造，能生產(chǎn)一種或多種硫胺產(chǎn)物，用實(shí)施例中展示的任何方法進(jìn)行測(cè)量時(shí)，其產(chǎn)量相對(duì)于天然微生物所能生產(chǎn)的產(chǎn)量是過量的。相當(dāng)數(shù)量的此類硫胺產(chǎn)物被釋放到培養(yǎng)基中，例如通過分泌或流出。本文中使用的“相當(dāng)數(shù)量”意味著細(xì)胞生產(chǎn)的硫胺產(chǎn)物中，超過75％，優(yōu)選地，超過85％，例如在90-95％之間都被釋放到培養(yǎng)基中。
與“硫胺產(chǎn)物”聯(lián)合使用的“回收”指將硫胺產(chǎn)物與培養(yǎng)基分離和/或?qū)⒒厥盏牧虬樊a(chǎn)物分離為純的或半純的形式。任何用于從(例如)發(fā)酵培養(yǎng)基中回收硫胺產(chǎn)物的傳統(tǒng)方法都可用于本發(fā)明?；厥者€可指通過使用HPLC來分離硫胺產(chǎn)物。
在一個(gè)方面，上文定義的方法還包括在硫胺前體存在的情況下培養(yǎng)所述的微生物。優(yōu)選的前體選自由4-氨基-5-羥甲基-2-甲基嘧啶(HMP)，5-(2-羥乙基)-4-甲基噻唑(HET)和其組合所構(gòu)成的組。
如果在上文定義的生產(chǎn)硫胺產(chǎn)物的方法中，所述微生物還包含上文所述的對(duì)B.subtilis嘌呤操縱子的表達(dá)去調(diào)節(jié)的突變的話，本發(fā)明的另一個(gè)方面就提供了如下一種方法，其中，在存在硫胺前體和嘌呤源的情況下培養(yǎng)所述的微生物。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，硫胺前體是HET，嘌呤源是黃嘌呤。
在另一個(gè)方面，如上文定義的方法還包括在HET途徑的前體存在的情況下培養(yǎng)所述的微生物?！癏ET途徑的前體”指用于制造5-(2-羥乙基)-4-甲基噻唑(HET)的含碳化合物。此類前體優(yōu)選選自由甘氨酸、半胱氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸和其組合所構(gòu)成的組。
在另一個(gè)方面，如上文定義的方法還包括在HMP途徑的前體或HMP的衍生物存在的情況下培養(yǎng)所述的微生物。“HMP途徑的前體”指用于制造4-氨基-5-羥甲基-2-甲基嘧啶(HMP)的含碳化合物。此類前體非限制性的例子包括5-氨基咪唑核糖酸(AIR)?！癏MP的衍生物”指能與4-氨基-2-甲基-5-嘧啶甲烷胺(Grewe二胺)以同樣方式發(fā)揮作用的任何經(jīng)過化學(xué)修飾的HMP變異體。
因此，本發(fā)明涉及生產(chǎn)硫胺產(chǎn)物的方法，其中包括(a)在合適的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)選自由Bacillaceae、Lactobacillaceae、Streptococcaceae、Corynebacteriaceae和Brevibacteriaceae所構(gòu)成的組的微生物，所述微生物含有能使其向培養(yǎng)基中過量產(chǎn)生硫胺產(chǎn)物的突變；以及(b)回收硫胺產(chǎn)物。
在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及如上文定義的方法，其中所述微生物含有突變，所述突變包含ΔthiL、tx1和tx26。
在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及如上文定義的方法，其中所述微生物還包含下述DNA盒，該DNA盒含有編碼thiA基因產(chǎn)物的多核苷酸序列的至少一個(gè)拷貝，其中該多核苷酸序列受強(qiáng)組成型啟動(dòng)子可操作地控制。
在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及如上文定義的方法，其中所述微生物還包含對(duì)B.subtilis的嘌呤操縱子進(jìn)行去調(diào)節(jié)的突變以及阻止5-氨基咪唑核糖酸(AIR)向羧基氨基咪唑核糖酸(CAIR)轉(zhuǎn)化的突變。
在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了如上文定義的方法，其中所述微生物還包含下述DNA盒，該DNA盒含有編碼來自thiKC操縱子的基因產(chǎn)物的多核苷酸序列的至少一個(gè)拷貝，其中該多核苷酸序列受強(qiáng)組成型啟動(dòng)子可操作地控制。
在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了如上文定義的方法，其中所述微生物還包含下述DNA盒，該DNA盒含有編碼tenAl-thiOSGFD操縱子的基因產(chǎn)物的多核苷酸序列的至少一個(gè)拷貝，其中該多核苷酸序列受強(qiáng)組成型啟動(dòng)子可操作地控制。
在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了如上文定義的的方法，其中所述微生物還包含下述DNA盒(a)含有編碼tenAl-thiOSGFD操縱子的基因產(chǎn)物的多核苷酸序列的至少一個(gè)拷貝的DNA盒和(b)含有編碼thiA基因產(chǎn)物的多核苷酸序列的至少一個(gè)拷貝的DNA盒，其中該多核苷酸序列受強(qiáng)組成型啟動(dòng)子可操作地控制。
在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及經(jīng)過分離的多核苷酸序列，其中包含tx1突變。此類突變可用于構(gòu)建其中硫胺產(chǎn)量提高的重組微生物，例如，選自由Bacillaceae、Lactobacillaceae、Streptococcaceae、Corynebacteriaceae和Brevibacteriaceae所構(gòu)成的組的微生物，所述微生物含有使硫胺生產(chǎn)被去調(diào)節(jié)以及使硫胺產(chǎn)物釋放到培養(yǎng)基中的突變。優(yōu)選的是能導(dǎo)致第116位氨基酸殘基上發(fā)生亮氨酸到苯丙氨酸的取代的突變(關(guān)于第116位上發(fā)生Leu到Phe的取代的氨基酸序列的拷貝(與序列IDNO32的野生型YloS相比)，參見SEQ ID NO31)。
本文中使用的“經(jīng)過分離的”多核苷酸(例如，RNA、DNA或混合的聚合物)或“經(jīng)過分離的”多肽指已與天然狀態(tài)下其周圍的組分發(fā)生了實(shí)質(zhì)上的分離。在多核苷酸的情況下，“經(jīng)過分離的”指與天然序列周圍的細(xì)胞內(nèi)其它組分(例如，核糖體、聚合酶，很多其它基因組序列和蛋白質(zhì))分離。該術(shù)語包含已從其天然存在的環(huán)境中分離出來的多核苷酸，還包括重組的或克隆的DNA分離物以及化學(xué)合成的類似物或通過異源系統(tǒng)生物合成的類似物。就多肽而言，術(shù)語“經(jīng)過分離的”指已與天然狀態(tài)下其周圍的組分實(shí)質(zhì)上分離的蛋白質(zhì)或多肽。當(dāng)樣品中大約60至75％都展示出單一的多肽序列時(shí)，單體蛋白質(zhì)就是經(jīng)過分離的。典型地，經(jīng)過分離的蛋白質(zhì)包含蛋白質(zhì)樣品中的大約60至90％w/w，更通常地，大約95％，優(yōu)選地，其超過99％純。蛋白質(zhì)純度和同源性可通過本領(lǐng)域公知的很多方法來表示，例如對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，接著對(duì)凝膠染色之后顯示出單個(gè)多肽的條帶。就某些目的而言，使用HPLC或本領(lǐng)域內(nèi)公知的其它方法可以得到更高的純化分辨率。
在一種實(shí)施方式中，如上文定義的經(jīng)過分離的多核苷酸序列是SEQ IDNO30或在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與SEQ ID NO30雜交的多核苷酸序列，當(dāng)其存在于微生物中時(shí)，能導(dǎo)致硫胺生產(chǎn)被去調(diào)節(jié)。
在“嚴(yán)謹(jǐn)條件”下能與本文中確定的多核苷酸序列雜交并保持有同樣功能(即，當(dāng)引入到合適的細(xì)胞中時(shí)，能導(dǎo)致硫胺的生產(chǎn)被去調(diào)節(jié))的核酸，也在本發(fā)明的范圍內(nèi)?！皣?yán)謹(jǐn)條件”是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，例如見Maniatis et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，2d Edition，1989和Short Protocols in Molecular Biology，ed.Ausubel，et al.，它們都以引用的方式被包括進(jìn)本文。嚴(yán)謹(jǐn)條件是取決于序列的，在不同情況下有所不同。較長的序列能在較高的溫度下特異性地雜交。Tijssen，Techniques inBiochemistry and Molecular Biology--Hybridication with Nucleic Acid Probes，“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays”(1993)中可以找到關(guān)于核酸雜交的普適性指導(dǎo)。通常，嚴(yán)謹(jǐn)條件被選用為比給定的離子強(qiáng)度和pH下特定序列的熱熔點(diǎn)(Tm)低大約5-10℃。Tm是(在給定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)平衡時(shí)與目標(biāo)互補(bǔ)的探針中的50％與目標(biāo)序列雜交的溫度(當(dāng)目標(biāo)序列過量存在時(shí)，Tm時(shí)，50％的探針在平衡時(shí)是被結(jié)合的)。嚴(yán)謹(jǐn)條件將是如下這些鹽濃度小于大約1.0M鈉離子，典型地，在大約0.01至1.0M鈉離子(或其它鹽)濃度之間，pH 7.0至8.3，溫度為對(duì)短探針(例如，10至50個(gè)核苷酸)而言至少大約30℃，對(duì)長探針(例如，多于50個(gè)核苷酸)而言至少大約60℃。嚴(yán)謹(jǐn)條件還可以通過加入去穩(wěn)定試劑(例如甲酰胺)來獲得。就本發(fā)明的目的而言，用于此類雜交的合適的“嚴(yán)謹(jǐn)條件”包括在40％甲酰胺，1MNaCl，1％十二烷基磺酸鈉(SDS)緩沖液中進(jìn)行雜交，37℃，在至少大約50℃的溫度下(通常在大約55℃至大約60℃)用0.2X SSC洗至少一次(20分鐘)；或者等同條件。陽性雜交是背景水平的至少兩倍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員很容易理解，也可以利用其它雜交和洗滌條件來提供具有類似嚴(yán)謹(jǐn)度的條件。
短語“核酸序列”指按照5’至3’末端的順序來閱讀的去氧核糖核酸或核糖核酸堿基的單鏈或雙鏈聚合體。其包括染色體DNA、自主復(fù)制的質(zhì)粒、感染性的(infetious)的DNA或RNA聚合體，以及展現(xiàn)出基本結(jié)構(gòu)功能(primarily structural role)的DNA或RNA。除非另有指明，特定的核酸序列還隱含包含經(jīng)過保守修飾的其變異體(例如，簡并密碼子取代)和互補(bǔ)序列，以及明確指出的序列。具體而言，簡并密碼子取代可以通過制造下述序列來獲得，所述序列中，一個(gè)或多個(gè)被選出的(或所有)密碼子的第三位被混合堿基和/或脫氧肌苷(deoxyinosine)殘基所取代(Batzeret al.，Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka et al.，J.Biol.Chem.2602605-2608(1985)；Cassol et al.，1992；Rossolini et al.，Mol.Cell.Probes891-98(1994))。
在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及兩種不相連鎖的突變包含第一種突變tx26-1和第二種突變tx26-2的經(jīng)過分離的多核苷酸序列，其中，生產(chǎn)硫胺的微生物中兩種突變的同時(shí)存在使得硫胺生產(chǎn)被去調(diào)節(jié)。第一種突變，tx26-1，展示出與ΔyufR::Tn917(BGSC#1A642)具有70％的連鎖性，第二種突變，tx26-2，展示出與ΩmotA::Tn917(BGSC#1A631)具有59％的連鎖性。因此，本發(fā)明涉及一種經(jīng)過分離的多核苷酸序列，其中包含與ΔyufR::Tn917(BGSC#1A642)具有70％的連鎖性的第一種突變(tx26-1)和與ΩmotA::Tn917(BGSC#1A631)具有59％的連鎖性的第二種突變(tx26-2)，其中，生產(chǎn)硫胺的微生物中兩種突變的同時(shí)存在使得硫胺生產(chǎn)被去調(diào)節(jié)。
優(yōu)選地，tx26-1突變被SEQ ID NO33的多核苷酸序列或能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO33雜交的多核苷酸序列編碼，并且，當(dāng)其與tx26-2突變共同存在于微生物中時(shí)，能使硫胺的生產(chǎn)被去調(diào)節(jié)。
優(yōu)選地，tx26-2突變被SEQ ID NO36的多核苷酸序列或能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO36雜交的多核苷酸序列編碼，并且，當(dāng)其與tx26-1突變共同存在于微生物中時(shí)，能使硫胺的生產(chǎn)被去調(diào)節(jié)。
此外，本發(fā)明還提供了包含如上文定義的一條或多條多核苷酸的DNA盒，即(a)包含第一種突變tx26-1和第二種突變tx26-2的經(jīng)過分離的多核苷酸序列或(b)包含tx1突變的經(jīng)過分離的多核苷酸序列，并且提供了含有此類DNA盒的微生物。
另一種實(shí)施方式是在來自病患的臨床樣品中檢測(cè)病原微生物的方法。該方法包括測(cè)定樣品中是否存在革蘭氏陽性(Gram+)微生物，測(cè)定所述微生物是否含有yloS直向同源物，以及測(cè)定所述微生物是否含有thiL直向同源物，其中，在Gram+微生物中存在yloS直向同源物并且不存在thiL直向同源物就表示該微生物是病原性的。
“臨床樣品”指從病患(其是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選是人或被飼養(yǎng)的動(dòng)物)處取得的任何可被檢測(cè)的標(biāo)本?？杀粰z測(cè)的標(biāo)本可以選自血液、尿液、糞便、唾液、組織或其它生物源，其中如果存在微生物的話，可以按照實(shí)施例中公開的方法被鑒定和鑒別出來。
優(yōu)選地，在如上文定義的來自病患的臨床樣品中被探測(cè)的微生物選白Listeria、Staphylococcus、Clostridium、Enterococcus和Streptococcus所構(gòu)成的組，最優(yōu)選地，來自Listeria monocytogenes、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、Clostridium tetani、Clostridium perfringens、Enterococcus sp.、Streptococcus agalactiae、Streptococcus pyogenes和Streptococcus pneumoniae。
YloS蛋白質(zhì)是用于鑒定殺菌化合物的有價(jià)值的目標(biāo)，因?yàn)楹芏鄡H含有yloS直向同源物而不含thiL直向同源物的Gram+細(xì)菌是已知的病原體。因此，本發(fā)明還提供了一種篩選試驗(yàn)(或方法)，用于鑒定調(diào)節(jié)物(modulator)，即能與YloS結(jié)合，或?qū)鐈loS表達(dá)或YloS活性具有激活或抑制效果的待選或測(cè)試化合物或試劑(例如，肽、肽模擬物(peptidomimetics)、小分子或其它藥物)。
在一種實(shí)施方式中，提供了一種用于鑒定抗生素的試驗(yàn)方法，所述試驗(yàn)方法包括(a)將包含YloS蛋白質(zhì)的試驗(yàn)組合物(assay composition)與測(cè)試化合物接觸，以及(b)測(cè)定測(cè)試化合物是否抑制了YloS蛋白質(zhì)的活性，其中，基于所述化合物抑制YloS蛋白質(zhì)活性的能力將其鑒定為抗生素。優(yōu)選地，該試驗(yàn)包含經(jīng)純化的YloS蛋白質(zhì)、部分純化的YloS蛋白質(zhì)、來自生產(chǎn)YloS蛋白質(zhì)的細(xì)胞的粗制細(xì)胞提取物，或者，YloS蛋白質(zhì)由來自病原微生物的多核苷酸所編碼，所述微生物選自由如下物種所構(gòu)成的組Listeria、Staphylococcus、Clostridium、Enterococcus和Streptococcus。上述病原微生物包括但不限于Listeria monocytogenes、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、Clostridium tetani、Clostridium perfringens、Enterococcus sp.、Streptococcus agalactiae、Streptococcus pyogenes和Streptococcus pneumoniae。
與用于鑒定抗生素的試驗(yàn)相關(guān)的“試驗(yàn)組合物”指進(jìn)行此類試驗(yàn)所需要的組分的組合。此類試驗(yàn)組合物至少需要包含YloS蛋白質(zhì)或其具有生物活性的部分以及測(cè)試化合物，即，待測(cè)的肽、肽模擬物、小分子或其它藥物。
本文中使用的“YloS活性”指任何可被檢測(cè)到或被測(cè)量到的YloS蛋白質(zhì)的活性，即，由yloS基因編碼的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中，YloS活性是下述活性中的至少一種(1)對(duì)YloS生物合成途徑中的至少一步進(jìn)行調(diào)節(jié)；(2)促進(jìn)YloS生物合成；或者(3)與YloS突變體互補(bǔ)。對(duì)用于鑒定抗生素的試驗(yàn)而言，如果測(cè)試化合物導(dǎo)致YloS蛋白質(zhì)翻譯、yloS轉(zhuǎn)錄的降低或YloS活性的損失，則該測(cè)試化合物就“抑制了YloS蛋白質(zhì)的活性。”可以使用本領(lǐng)域已知的下述大量手段中的任何手段，來獲得本發(fā)明的測(cè)試化合物，其中包括化合物文庫的方法，包括天然化合物文庫、生物文庫、空間地址可設(shè)定的并行固相或液相文庫；需要反褶積(deconvolution)的合成文庫方法；“一珠一化合物式的”文庫方法；以及使用親和層析篩選的合成文庫方法。生物庫手段被限于肽文庫，而其它手段可用于肽、非肽類寡聚物或化合物的小分子文庫(Lam，K.S.(1997)Anticancer Drug Des.12145)。
用于分子文庫合成的方法的例子可在本領(lǐng)域中找到，例如在De Witt etal.(1993)PNAS 90:6909；Erb et al.(1994)PNAS 91:11422；Zuckermann et al.(1994)J.Med.Chem.37:2678；Cho et al.(1993)Science 261:1303；Carrell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059；Carell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061；以及Gallop et al.(1994)J.Med.Chem.37:1233中。化合物文庫可存在于溶液中、珠粒上、芯片上、細(xì)菌中、孢子中(U.S.Patent No.5223409)中、質(zhì)粒上或噬菌體上。
在一種實(shí)施方式中，所述試驗(yàn)是基于微生物的試驗(yàn)，其中，表達(dá)YloS蛋白質(zhì)或其具有生物活性的部分的重組微生物與測(cè)試化合物接觸，測(cè)試化合物對(duì)于調(diào)節(jié)YloS活性的能力就被測(cè)定出來了。對(duì)測(cè)試化合物調(diào)節(jié)YloS活性的能力的測(cè)定可以通過對(duì)例如生長、細(xì)胞內(nèi)YloS濃度或分泌的YloS濃度(因?yàn)橐种芛loS的化合物將導(dǎo)致YloS蛋白質(zhì)在測(cè)試微生物中積累)進(jìn)行監(jiān)測(cè)來進(jìn)行?？捎梅派湫酝凰?、酶標(biāo)記或其它可溶的或不可溶的信號(hào)產(chǎn)生基團(tuán)對(duì)YloS底物進(jìn)行標(biāo)記，使得對(duì)YloS活性的調(diào)節(jié)的測(cè)定可通過，例如，對(duì)被標(biāo)記的底物向中間產(chǎn)物或產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率進(jìn)行檢測(cè)來進(jìn)行。例如，可用32P、14C或3H對(duì)YloS底物直接或間接進(jìn)行標(biāo)記，通過閃爍計(jì)數(shù)對(duì)放射性輻射(radioemission)進(jìn)行直接計(jì)數(shù)來檢測(cè)放射性同位素?；蛘?，可用可溶的或不可溶的信號(hào)產(chǎn)生基團(tuán)對(duì)YloS底物直接或間接進(jìn)行標(biāo)記，通過色度、酶活或熒光試驗(yàn)來對(duì)信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)測(cè)試化合物調(diào)節(jié)YloS活性的能力的測(cè)定還可以通過對(duì)報(bào)道基因(reporter gene，包含yloS-應(yīng)答型調(diào)控元件，其與編碼可被探測(cè)到的標(biāo)記(例如螢光素酶)的核酸可操作地連接)誘導(dǎo)的檢測(cè)或?qū)oA-調(diào)節(jié)的細(xì)胞應(yīng)答的檢測(cè)來進(jìn)行。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的篩選試驗(yàn)是無細(xì)胞的試驗(yàn)，其中，YloS蛋白質(zhì)或其具有生物活性的部分與測(cè)試化合物在體外接觸，并測(cè)定化合物與YloS蛋白質(zhì)或其具有生物活性的部分結(jié)合的能力或?qū)ζ浠钚赃M(jìn)行調(diào)節(jié)的能力。在一種這樣的實(shí)施方式中，該試驗(yàn)包括將YloS蛋白質(zhì)或其具有生物活性的部分與已知底物接觸，形成試驗(yàn)混合物，將試驗(yàn)混合物與測(cè)試化合物接觸，并測(cè)定測(cè)試化合物調(diào)節(jié)底物上YloS蛋白質(zhì)的酶活的能力。在一種實(shí)施方式中，已知底物是YloS蛋白質(zhì)。在另一種實(shí)施方式中，已知底物是YloS類似物。術(shù)語“YloS類似物”指結(jié)構(gòu)上與YloS類似，功能上與YloS相同或類似的化合物。作為例子的類似物包括經(jīng)過標(biāo)記的YloS蛋白質(zhì)和/或其它可探測(cè)到的YloS蛋白質(zhì)衍生物。術(shù)語“YloS類似物”還包括與YloS蛋白質(zhì)緊密相關(guān)的化合物，或衍生白YloS蛋白質(zhì)的化合物，例如，能作為YloS底物發(fā)揮作用的結(jié)構(gòu)相關(guān)的化合物。
篩選試驗(yàn)可以在任何合適的容納微生物、蛋白質(zhì)和/或反應(yīng)物的容器中進(jìn)行。此類容器的例子包括微滴定板、試管和微離心管。在本發(fā)明的試驗(yàn)方法的不止一種實(shí)施方式中，都可能需要將YloS蛋白質(zhì)、YloS底物、底物類似物或表達(dá)YloS蛋白質(zhì)的重組微生物固定，以協(xié)助產(chǎn)物、配體和/或底物的分離，以及使得試驗(yàn)?zāi)軌蜻_(dá)到自動(dòng)化。例如，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶/YloS融合蛋白可被吸收到谷胱甘肽瓊脂糖珠粒(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MI)上，或谷胱甘肽衍生化的微滴定板上。其它用于將蛋白質(zhì)固定到基質(zhì)上的技術(shù)(例如，生物素結(jié)合以及鏈親和素(streptavidin)固定或抗體結(jié)合)也可用于本發(fā)明的篩選試驗(yàn)。
本發(fā)明還包括由上述篩選試驗(yàn)鑒定出的新穎的試劑。因此，進(jìn)一步地使用在合適的動(dòng)物模型中按照本文所述鑒定出的試劑，也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。例如，按照本文所述鑒定出的YloS調(diào)節(jié)試劑(例如，抗細(xì)菌化合物)可被用于感染動(dòng)物模型，以測(cè)定用此類試劑進(jìn)行治療的療效、毒性或副作用，并且/或者以對(duì)由病原微生物導(dǎo)致的或誘導(dǎo)的特定疾病狀態(tài)進(jìn)行治療。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述新穎的試劑是抗生素。
可基于本發(fā)明的任何一種YloS蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)，來對(duì)YloS調(diào)節(jié)物進(jìn)行進(jìn)一步的設(shè)計(jì)。特別地，至少部分基于在很多Gram+病原細(xì)菌中對(duì)YloS的發(fā)現(xiàn)，人們可以制造出相當(dāng)大量的YloS蛋白質(zhì)，例如使用本文所述的重組方法，并對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行純化和結(jié)晶，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行X射線晶體結(jié)構(gòu)分析，并且，基于測(cè)定的晶體結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)調(diào)節(jié)物(例如，活性位點(diǎn)調(diào)節(jié)物，例如，競(jìng)爭分子，活性位點(diǎn)抑制物等)，按照本文所述的試驗(yàn)中任何一種來檢測(cè)設(shè)計(jì)出的調(diào)節(jié)物。
附圖中概括了本發(fā)明最為重要的結(jié)果中的一些

圖1展示了具有氯霉素抗性基因的質(zhì)粒pTH43(A)和具有四環(huán)素抗性基因的質(zhì)粒pTH47(B)中含有的P26thiA表達(dá)盒的結(jié)構(gòu)。
圖2展示了具有四環(huán)素抗性基因的質(zhì)粒pTH48中含有的P26thiKC表達(dá)盒的結(jié)構(gòu)。
圖3展示了用于構(gòu)建菌株TH404(其過量表達(dá)B.subtilis thiB操縱子)的兩步式方法。在第一步中，通過用氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(cat)盒取代thiB啟動(dòng)子區(qū)域來構(gòu)建硫胺營養(yǎng)缺陷型(auxotroph)菌株。然后用原營養(yǎng)型(prototrophy)重建來篩選在thiB操縱子前面整合了細(xì)菌噬菌體強(qiáng)組成型P26啟動(dòng)子的菌株。
下述實(shí)施例僅作解釋用，并非欲以任何方式對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。
實(shí)施例1一般方法菌株本發(fā)明的Bacillus subtilis菌株來自菌株P(guān)Y79(原營養(yǎng)型SPβc；Cat.#1A747，Bacillus Genetic Stock Center(BGSC)，The Ohio State University，Columbus，Ohio 43210USA)和1012(leuA8 metB5；Saito et al.(1979)Mol.Gen.Genet.170117-122)。新霉素抗性基因(neo)盒和四環(huán)素抗性基因(tet)盒分別從質(zhì)粒pBEST501(Cat.#ECE47，BGSC)和pDG1514(Cat.#ECE100，BGSC)獲得。
培養(yǎng)基用于B.subtilis的標(biāo)準(zhǔn)最小限度培養(yǎng)基(MM)含有1 X Spizizen鹽、0.04％谷氨酸鈉和0.5％的葡萄糖。標(biāo)準(zhǔn)固體完全培養(yǎng)基是Tryptone BloodAgar Broth(TBAB，Difco)。標(biāo)準(zhǔn)液體完全培養(yǎng)基是Veal Infusion-YeastExtract培養(yǎng)液(VY)。為檢測(cè)液體試管培養(yǎng)物中的硫胺生產(chǎn)，使用沒有硫胺的培養(yǎng)基(Difco)。為進(jìn)行分批進(jìn)料發(fā)酵，使用VF培養(yǎng)基。上述培養(yǎng)基的組分在下文中有所描述，或者其是現(xiàn)有技術(shù)描述過的標(biāo)準(zhǔn)配方(Harwood and Archibald(1990)pp.1-26and 545-552(Appendix 1)，InCutting and Harwood(ed.)Molecular biologial methods for Bacillus.JohnWiley and Sons，New York)。
TBAB培養(yǎng)基33g Difco Tryptone Blood Agar Broth，加水定容(qsp)至1L。高壓滅菌。
VY培養(yǎng)基25g Difco Veal Infusion Broth、5g Difco Yeast Extract，加水定容至1L。高壓滅菌。
最小限度培養(yǎng)基(MM)100ml 10X Spizizen鹽、10ml 50％的葡萄糖、1ml 40％谷氨酸鈉，加水定容(qsp)至1L。
10X Spizizen鹽140g K2HPO4、20g(NH4)2SO4、60g KH2PO4、10gNa3(檸檬酸)·2H2O、MgSO4·7H2O，加水定容(qsp)至1L。
硫胺試驗(yàn)培養(yǎng)基85g Difco硫胺試驗(yàn)培養(yǎng)基，加水定容(qsp)至1L。高壓滅菌。(Difco Manual(1998)pp.499-501，Difco Laboratories，Maryland，USA)微量元素溶液1.4g MnSO4·H2O、0.4g CoCl2·6H2O、0.15g(NH4)6Mo7O24·4H2O、0.1g AlCl3·6H2O、0.075g CuCl2·2H2O，加水定容至200mL。過濾滅菌。
Fe-溶液0.21g FeSO4·7H2O，加水定容至10mL。過濾滅菌。
CaCl2-溶液15.6g CaCl2·2H2O，加水定容至500mL。過濾滅菌。
Mg/Zn-溶液100g MgSO4·7H2O、0.4g ZnSO4·7H2O，加水定容至200mL。過濾滅菌。
VF發(fā)酵培養(yǎng)基0.75g谷氨酸鈉、4.71g KH2PO4、4.71g K2HPO4、8.23g Na2HPO4·12H2O、0.23g NH4Cl、1.41g(NH4)2SO4、11.77g酵母提取物(Merck)、0.2ml Basildon消泡劑，加水定容至1L。恰當(dāng)?shù)販缇?br> ·將葡萄糖·H2O單獨(dú)加入到發(fā)酵罐中，至終濃度為27.3g/L。
·將下述物質(zhì)分別加入到發(fā)酵罐中(以終濃度表示)2ml/L的微量元素溶液；2ml/L的CaCl2-溶液、2ml/L的Mg/Zn-溶液、2ml/L的Fe-溶液。
·對(duì)進(jìn)料批次改變的研究將在下述實(shí)施例中具體展示。如果需要的話，可以補(bǔ)入葡萄糖。進(jìn)料溶液可以含有礦物質(zhì)、規(guī)定的或食物營養(yǎng)物，如下列組分所示用于分批進(jìn)料方法的具有NB(Nutrient Broth)的發(fā)酵進(jìn)料溶液終濃度為(高壓滅菌之后)660g/L葡萄糖·H2O、2g/L MgSO4·7H2O、14.6g/L MnSO4·H2O、4mg/L ZnSO4·H2O、47.8g/L Nutrient Broth(Difco，以1g/ml溶液的形式單獨(dú)高壓滅菌)。
用于分批進(jìn)料方法的具有HMP的發(fā)酵進(jìn)料溶液終濃度為(高壓滅菌之后)660g/L葡萄糖·H2O、2g/L MgSO4·7H2O、14.6g/LMnSO4·H2O、4mg/L ZnSO4·H2O。加入HMP至0.54g/L或2.7g/L(將HMP溶于水/HCl，過濾滅菌)。
用于分批進(jìn)料方法的具有HET的發(fā)酵進(jìn)料溶液終濃度為(高壓滅菌之后)660g/L葡萄糖·H2O、2g/L MgSO4·7H2O、14.6g/LMnSO4·H2O、4mg/L ZnSO4·H2O。加入HET至0.54g/L或2.7g/L(將HET溶于水，過濾滅菌)。
用于分批進(jìn)料方法的具有HMP和HET的發(fā)酵進(jìn)料溶液終濃度為(高壓滅菌之后)660g/L葡萄糖·H2O、2g/L MgSO4·7H2O、14.6g/LMnSO4·H2O、4mg/L ZnSO4·H2O。加入HMP至0.54g/L或2.7g/L(將HMP溶于水/HCl，過濾滅菌)。加入HET至0.54g/L或2.7g/L(將HET溶于水，過濾滅菌)。
硫胺試驗(yàn)生物試驗(yàn)用已知方法，使用來自Salmonella typhimurium的指示物，對(duì)總的硫胺化合物進(jìn)行檢測(cè)(Difco Manual(1998)pp.499-501，DifcoLaboratories，Maryland，USA)。菌株DM456(thiD906::MudJ)對(duì)最小限度培養(yǎng)基中的硫胺、TMP和TPP有應(yīng)答，而菌株DM1864(thiD934::Tn10d)則僅對(duì)TPP有應(yīng)答(Webb and Downs(1997)J.Biol.Chem.27215702-15707；Peterson and Downs(1997)J.Bacteriol.1794894-4900)。DM456對(duì)已知數(shù)量的硫胺、TMP和TPP的應(yīng)答是類似的，從0.0256至100μg/升之間。此外，還發(fā)現(xiàn)DM456對(duì)TPP比DM1854更敏感。為對(duì)B.subtilis的培養(yǎng)物進(jìn)行檢測(cè)，在制備稀釋液之前對(duì)上清液進(jìn)行過濾滅菌。從經(jīng)過過濾滅菌的細(xì)胞提取物的稀釋液來測(cè)量細(xì)胞內(nèi)的硫胺水平，所述提取物是通過對(duì)細(xì)胞進(jìn)行法壓破碎和在10000g離心10分鐘來獲得的。指示物菌株在硫胺試驗(yàn)培養(yǎng)基(TAM)中于37℃培養(yǎng)過夜?；鞚岫茸x數(shù)在600nm處測(cè)得，并與標(biāo)準(zhǔn)溶液的范圍相比。
HPLC/硫色素用現(xiàn)有技術(shù)描述的改良過的硫色素-HPLC試驗(yàn)方法，對(duì)單種硫胺化合物，硫胺、TMP和TPP進(jìn)行測(cè)量(Chie et al.(1999)Biochemistry 386460-6470)。簡言之，將100μl培養(yǎng)物上清液或細(xì)胞提取物加入到200μl 4M的乙酸鉀中。然后通過加入100μl新鮮的3.8mM的鐵氰化鉀(7M NaOH中的)對(duì)樣品進(jìn)行氧化。反應(yīng)物被猛烈混合，然后通過加入100μl飽和KH2PO4中的新鮮的0.06％H2O2來終止反應(yīng)。將樣品轉(zhuǎn)移到HPLC管中，上樣至Supelcosil LC-18-T柱(15cm×4.6mm，3μm)(Supelco-Ref.No 58970-U)中。在40％0.1M K2HPO4(pH 6.6)和4M硫酸氫四丁基銨存在的情況下，用10％-35％的甲醇(50％-25％的水)梯度進(jìn)行洗脫。在365nm處激發(fā)后，于444nm處測(cè)量熒光。從柱中洗脫下來的順序是硫胺、TMP和TPP。該方法被用于監(jiān)測(cè)發(fā)酵期間內(nèi)部和外部的硫胺生產(chǎn)。
HPLC/DAD為對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中的硫胺和中間產(chǎn)物HMP和HET進(jìn)行直接測(cè)量，用裝備有帶調(diào)溫儀的自動(dòng)取樣儀和二極管陣列探測(cè)器(DAD)的Agilent 1100 HPLC系統(tǒng)，在Phenomenex LUNA C18柱上，對(duì)樣品進(jìn)行色譜分析。柱的尺寸為150×4.6mm，顆粒尺寸為5微米。柱的溫度被保持恒定于20℃。移動(dòng)相為pH 2的水中0.4g磺酸戊烷(A)與甲醇(B)的混合物。使用梯度洗脫，其范圍為2％A(3分鐘)至20％A(在20分鐘內(nèi))。流速為1ml/分鐘。檢測(cè)手段為254nm處的UV吸收。該方法的選擇性通過如下方法得以驗(yàn)證注射10μl相關(guān)參比化合物(硫胺、HMP和HET)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每種都是100μg/ml的。在不需特別制備樣品的情況下，目標(biāo)化合物被完全分開。
分子和遺傳技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的遺傳和分子生物學(xué)技術(shù)通常是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，并在現(xiàn)有技術(shù)中有所描述(Maniatis et al.(1982)Molecular cloning:a laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.；Miller(1972)Experiments in molecular genetcs.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor)。DNA轉(zhuǎn)化、PBS 1B普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)和其它標(biāo)準(zhǔn)B.subtilis遺傳技術(shù)通常也是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，并在現(xiàn)有技術(shù)中有所描述(Cutting and Horn(1990)pp.27-74，In Cutting and Harwood(ed.)Molecular biological methodsfor Bacillus.John Wiley and Sons，New York)。
發(fā)酵在攪拌式深槽發(fā)酵罐中對(duì)能生產(chǎn)硫胺的菌株進(jìn)行培養(yǎng)，例如，在工作體積為6-12升的BIOFLO 4500 NewBrunswick 20升容器中。計(jì)算機(jī)控制和數(shù)據(jù)收集是通過NBS Biocammand 32商業(yè)軟件來進(jìn)行的(New BrunswickScientific Co.，Inc.，Edison，NJ，USA)。
接種體體積通常為容器中初始培養(yǎng)基體積的5％。通過自動(dòng)加入氫氧化銨溶液(28％水溶液)，將反應(yīng)器中的pH保持恒定于6.8。發(fā)酵溫度為39℃，提供6升/分鐘的恒定氣流。如果需要的話，手動(dòng)加入消泡劑(Basildon)，在容器中保持2psi的恒定壓力。通過攪拌器的自動(dòng)級(jí)聯(lián)，獲得15％的最小溶解氧(pO2)濃度。攪拌器的最低速率被設(shè)置為400rpm。
發(fā)酵可以是分批過程，但是優(yōu)選地，是碳水化合物受限的分批進(jìn)料過程。因此，最初的葡萄糖消耗完后，向反應(yīng)器中提供確定的進(jìn)料溶液(如上文所述)，這通常是在過程開始后6-8小時(shí)發(fā)生的。此時(shí)將壓力升高至8psi，加入進(jìn)料溶液的速度一開始為70g h-1，隨后在8小時(shí)的時(shí)間內(nèi)線形增長至102.5g h-1，然后在102.5g h-1保持恒定。
實(shí)施例2 培養(yǎng)能從頭生產(chǎn)硫胺和硫胺化合物的突變體微生物本實(shí)施例描述了對(duì)硫胺生物合成和去調(diào)節(jié)突變(ΔthiL、tx1、tx26突變)及其組合進(jìn)行的分離，以生產(chǎn)能過量產(chǎn)生硫胺化合物的B.subtilis菌株。
將野生型和經(jīng)過改造的B.subtilis菌株在30ml最小限度培養(yǎng)基的搖瓶培養(yǎng)物中于37℃培養(yǎng)24小時(shí)，然后測(cè)定其細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的硫胺產(chǎn)物水平。作為陽性對(duì)照，硫胺去調(diào)節(jié)的E.coli PT-R1突變體也被測(cè)試。生物試驗(yàn)結(jié)果顯示，從經(jīng)過超聲波破碎的細(xì)胞的提取物中很容易檢測(cè)到硫胺產(chǎn)物，但是從培養(yǎng)基中卻很少或不能檢測(cè)到(表1)。對(duì)數(shù)階段或穩(wěn)定階段的野生型B.subtilis的細(xì)胞內(nèi)硫胺產(chǎn)物水平被計(jì)算為100-200μg/L。如關(guān)于E.coli的報(bào)道一樣，B.subtilis的細(xì)胞內(nèi)硫胺產(chǎn)物傾向于以TPP的形式存在。在硫胺去調(diào)節(jié)的E.coli PT-R1菌株中，細(xì)胞內(nèi)硫胺產(chǎn)物水平明顯更高，在穩(wěn)定階段的細(xì)胞中達(dá)到了1.6mg/L。
表1 若干種E.coli和B.subtilis菌株中的硫胺生產(chǎn)
a在最小限度培養(yǎng)基(30ml)中于37℃培養(yǎng)24小時(shí)后的硫胺濃度。
b在30ml最小限度培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)24小時(shí)后收集的細(xì)胞經(jīng)超聲波破碎后1ml上清液中的硫胺濃度。
c假設(shè)所有的細(xì)胞內(nèi)硫胺產(chǎn)物都排出到培養(yǎng)基中。計(jì)算(細(xì)胞內(nèi)硫胺濃度(μg/L)×0.001L)×1000ml/L/30ml。
將E.coli ThiL蛋白質(zhì)序列與Subtilist蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，僅發(fā)現(xiàn)了與一條蛋白質(zhì)序列的明顯相似性YdiA(P(N)＝8.1e-15)。編碼該蛋白質(zhì)的基因，ydiA，長度為975個(gè)堿基對(duì)，其是B.subtilis染色體上55°處的五基因操縱子中的第一個(gè)基因。非極性的插入型載體pMUTIN2和4(其含有可被IPTG誘導(dǎo)的Pspac啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子控制插入位點(diǎn)下游基因的轉(zhuǎn)錄)被用于制造thiL破壞型突變體(Vagner et al.(1998)Microbiology1443097-3104)。用對(duì)應(yīng)于YdiA序列的核苷酸264至612之間的兩個(gè)寡核苷酸引物BsuydiA1(SEQ ID NO7)和BsuydiA2(SEQ ID NO8)，通過標(biāo)準(zhǔn)PCR方法，制備出348bp的DNA片段。將該片段克隆到pMUTIN2載體的HindIII和BamHI位點(diǎn)之間，產(chǎn)生了E.coli質(zhì)粒pTH1。然后通過DNA轉(zhuǎn)化將該質(zhì)粒插入到B.subtiils PY79的ydiA(thiL)基因中，篩選出對(duì)5μg/ml紅霉素具有抗性的菌落。回收一個(gè)Ermr菌落，將其命名為TH5(ΩthiL::pMUTIN)。通過比較有或沒有IPTG的帶紅霉素TBAB培養(yǎng)基上的細(xì)菌生長，確定出ydiA下游基因中一個(gè)或多個(gè)的表達(dá)是細(xì)胞生長所需要的。通過將含有(cat2)或不含(cat4)外源rho非依賴型轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶盒插入到y(tǒng)diA(thiL)的核苷酸267至272之間，產(chǎn)生額外的ydiA(thiL)破壞，也獲得了類似的結(jié)果。PCR引物對(duì)cat#1(SEQ ID NO9)-cat#2(SEQ ID NO10)和cat#1-cat#4(SEQ ID NO11)分別被用于制造cat2或cat4基因，其與ydiA(thiL)PCR DNA片段相聯(lián)，后者是用引物ydiA/atp/for/bam(SEQ ID NO12)-ydiA/atp/rev/sma(SEQ ID NO13)和ydiA/ctp/for/sma/2(SEQ ID NO14)-ydiA/ctp/rev/ecorI/2(SEQ ID NO15)得到的。然后通過DNA轉(zhuǎn)化，將ΔthiL::cat盒直接插入到菌株P(guān)Y79的染色體ydiA(thiL)基因中，篩選出對(duì)5μg/ml氯霉素具有抗性的菌落。僅有含有ΔthiL::cat4(TH12)的Cmr菌落在TBAB培養(yǎng)基上正常生長，含有ΔthiL::cat2的Cmr菌落僅能長出極其微小的菌落。含有ΔthiL::cat2和ΔydiA::cat4的TH11和TH112被分別保存。令人吃驚地，菌株TH5和TH12并非硫胺或TPP營養(yǎng)缺陷型。實(shí)際上，這兩種菌株是硫胺緩慢生長型(bradytroph)在最小限度培養(yǎng)基上，TH5和TH12的菌落大小僅為PY對(duì)照菌落直徑的一半。因?yàn)镾almonella和E.coli的thiL空突變體是嚴(yán)格的硫胺營養(yǎng)缺陷型，B.subtilis看上去含有能將TMP轉(zhuǎn)化為TPP的第二種激酶活性或另外的途徑。有意思的是，在最小限度培養(yǎng)基上于37℃培養(yǎng)一天后，ydiA(thiL)突變體能向B.subtilis thiF或thiG突變體(分別被稱為TH3和TH4的菌株)進(jìn)行橫向進(jìn)料(cross-feed)，而PY79則需要三天或更多時(shí)間。這暗示，ydiA突變體的硫胺生物合成是被部分去調(diào)節(jié)的，其較之野生型菌株能更為廣泛地釋放硫胺。生物試驗(yàn)結(jié)果(表2)顯示，TH5和TH12的細(xì)胞內(nèi)總的硫胺生產(chǎn)(硫胺+TMP+TPP)水平要比PY79略高(2至3倍)。在培養(yǎng)基中也檢測(cè)到了較PY79略高的總硫胺水平，但其要遠(yuǎn)比細(xì)胞內(nèi)水平低。有意思的是，硫胺生產(chǎn)的增長并不足以提供對(duì)硫胺類似物抗硫胺素(pyrithiamine)的抗性。
表2 B.subtilis thiL插入型突變體的硫胺生產(chǎn)
a在最小限度培養(yǎng)基(30ml)中于37℃培養(yǎng)24小時(shí)后的硫胺濃度。
b在30ml最小限度培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)24小時(shí)后收集的細(xì)胞經(jīng)超聲波破碎后1ml上清液中的硫胺濃度。
分離硫胺去調(diào)節(jié)的B.subtilis突變體的策略為對(duì)含有thiA-lacZ融合的細(xì)菌進(jìn)行誘變，然后在存在TPP或硫胺的情況下，在含有XGAL的培養(yǎng)基上篩選出Lac+菌落(即藍(lán)色菌落)。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過PCR制備出含有thiA 5’啟動(dòng)子區(qū)域(417bp)的732bp長的DNA片段，將其單向克隆到pDG1728載體的無啟動(dòng)子lacZ基因前面(Guerout-Fleury et al.(1996)Gene 18057-61)，得到質(zhì)粒pTH12。對(duì)該載體的設(shè)計(jì)使得可以將異位轉(zhuǎn)錄lacZ融合引入到B.subtilis的非必要amyE座上。通過限制性酶切割對(duì)質(zhì)粒pTH12進(jìn)行線性化，將其轉(zhuǎn)入B.subtilis PY79，篩選出對(duì)100μg/ml奇霉素具有抗性的菌落。得到的一個(gè)菌落被命名為TH21(ΩamyE::thiA-lacZ)，在不同的營養(yǎng)生長條件下進(jìn)行測(cè)試時(shí)，其展現(xiàn)了明確的硫胺調(diào)節(jié)。在含有1μM硫胺的搖瓶培養(yǎng)物中，被培養(yǎng)至對(duì)數(shù)早期(OD600＝0.8-0.9)時(shí)，thiA-lacZ的表達(dá)是在沒有硫胺的最小限度培養(yǎng)基上生長的細(xì)胞的大約80倍。HMP(1μM)也抑制該融合的表達(dá)，但程度較小(6至7倍)。噻唑和腺苷(每種1μM)也顯示出抑制活性。在一段時(shí)間的實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)早期(OD600＝0.8-0.9)時(shí)，thiA-lacZ的表達(dá)最高(200Miller單位)。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入穩(wěn)定階段(OD600≥1)，表達(dá)就會(huì)逐漸降低(至50Miller單位)。
對(duì)thiA-lacZ融合的調(diào)節(jié)還可以在若干種突變體中獲得。在孢子發(fā)生缺陷型突變體菌株(ΔspoOA::erm)中，該融合的表達(dá)受到調(diào)節(jié)，但是，硫胺造成的抑制的水平小于在野生型中的情況。在含有ydiA/thiL缺失的菌株(TH22(ΔthiL::cat4，ΩamyE::thA-lacZ))中，融合被部分去調(diào)節(jié)LacZ活性比抑制和去抑制生長條件下高2至3倍。
基于上述結(jié)果，thiA-lacZ報(bào)道基因菌株TH22(ΔthiL::cat4)被用于篩選在抑制生長條件下被去調(diào)節(jié)的突變體。兩種方法被用于分離此類突變體。第一種方法中，制備含有1μM硫胺和25μg/ml XGAL的MM瓊脂平板。對(duì)對(duì)數(shù)生長階段的TH22細(xì)胞進(jìn)行均一(uniform)稀釋后，將含有3滴甲基磺酸乙酯(EMS，d＝1.17g/ml溶液)的紙盤放到平板中心。Lac+菌落在于37℃培養(yǎng)7天后出現(xiàn)?；厥毡蝗フ{(diào)節(jié)的突變體Tx1-Tx10。在第二種方法中，制備經(jīng)過EMS誘變的細(xì)胞群，并對(duì)其進(jìn)行篩選。因此，用9.4mM EMS對(duì)處于對(duì)數(shù)階段的TH22細(xì)胞進(jìn)行90分鐘的處理，分成小份，在10％甘油中于-90℃冷凍。將來自冷凍貯液的細(xì)胞稀釋于VY培養(yǎng)基中，在室溫培養(yǎng)30分鐘，然后涂布到含有1μM硫胺和25μg/ml XGAL的MM培養(yǎng)基上。對(duì)Lac+菌落的篩選得到了突變體Tx11至Tx26?；诹虬?抑制和TPP-抑制條件下藍(lán)色的強(qiáng)度和出現(xiàn)時(shí)間(表3)，以及基于額外的表型，上述突變體可被分為三類。一種突變體(Tx1)被發(fā)現(xiàn)是強(qiáng)的硫胺緩慢生長型，這暗示該突變體能失活(1)殘余的TMP激酶活性，或(2)在通過TMP的第二條TMP至TPP途徑中涉及到的基因。另一種突變體，Tx26，對(duì)10μM抗硫胺素具有抗性。在對(duì)硫胺產(chǎn)物進(jìn)行合成的方面，突變體Tx7(第2類)排出的硫胺產(chǎn)物總量較之親本菌株，TH22(ΔthiL::cat4，ΩamyE::thiA-lacZ)，要高2至3倍，雖然其細(xì)胞內(nèi)硫胺產(chǎn)物水平相似(表4)。突變體Tx26(第1類)向培養(yǎng)基排出的細(xì)胞外硫胺產(chǎn)物總量較之對(duì)照菌株TH22要高10至15倍(表4)。排出的硫胺產(chǎn)物中，50％多一點(diǎn)是以TPP形式存在的。Tx1和Tx23代表的第3類突變體，看起來會(huì)受到(存在硫胺或TPP時(shí))基于不同Lac表達(dá)的硫胺-TMP-TPP途徑的影響。
表3 B.subtilis的硫胺去調(diào)節(jié)突變體的表型
表4 B.subtilis的硫胺去調(diào)節(jié)突變體的硫胺生產(chǎn)
a在最小限度培養(yǎng)基(30ml)中于37℃培養(yǎng)24小時(shí)后的硫胺濃度。
b在30ml最小限度培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)24小時(shí)后收集的細(xì)胞經(jīng)超聲波破碎后1ml上清液中的硫胺濃度。
在對(duì)外源前體進(jìn)料的研究中，Tx7和Tx26中，HMP和HET向總硫胺產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率是不同的(表5)。每種菌株都在含有HET和HMP(含量已標(biāo)明)的最小限度培養(yǎng)基培養(yǎng)物中于37℃培養(yǎng)18小時(shí)。對(duì)培養(yǎng)基和細(xì)胞提取物中的硫胺生產(chǎn)進(jìn)行分析。用S.typhimurium指示菌株DM456(ΩthiD906::MudJ)和DM1856(ΩthiL934::Tn10)，通過生物試驗(yàn)，對(duì)(硫胺+TMP+TPP)和(TPP)分別進(jìn)行測(cè)量。培養(yǎng)基中檢測(cè)不到硫胺產(chǎn)物。Tx7中，大多數(shù)硫胺產(chǎn)物都發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞內(nèi)，主要以TPP形式存在。相反，Tx26中，硫胺產(chǎn)物中的90％都發(fā)現(xiàn)于培養(yǎng)基中，大部分是硫胺+TMP。細(xì)胞外的積累比不加入HMP+HET對(duì)Tx26進(jìn)行培養(yǎng)的情況要高大約40倍。
表5 去B.subtilis的硫胺去調(diào)節(jié)突變體Tx7和Tx26進(jìn)行的HMP和HET進(jìn)料研究
含有突變tx26、thiL和tx1的組合的B.subtilis菌株被建立起來。該菌株能作為被整合和擴(kuò)增的經(jīng)過改造的硫胺生物合成基因的宿主。第一步，通過DNA轉(zhuǎn)化將Tx26突變轉(zhuǎn)入TH12(ΔthiL::cat4)，篩選出對(duì)10μM抗硫胺素具有抗性的菌落?；厥盏玫揭粋€(gè)Pyrr菌落，存在硫胺時(shí)其也是Lac+，將其命名為TH48。每種菌株都在補(bǔ)充有微營養(yǎng)物和2.5％Difco營養(yǎng)培養(yǎng)基(NB)的最小限度培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)18小時(shí)。用Salmonella指示菌株DM456(thiD906::MudJ)(用于(硫胺+TMP+TPP))和Salmonela DM1856(thiL934::Tn10)(用于(TPP))，通過生物試驗(yàn)，對(duì)上清液中的硫胺生產(chǎn)進(jìn)行分析。TH48生長于最小限度培養(yǎng)基的搖瓶培養(yǎng)物中時(shí)，其產(chǎn)生的硫胺培養(yǎng)物的水平與Tx26親本近似(表6)。接著用框內(nèi)缺失來替換cat被破壞的thiL(cat-interrupted thiL)基因。用標(biāo)準(zhǔn)PCR方法，首先構(gòu)建thiL的框內(nèi)缺失(移去氨基酸殘基Gly79和Gly202)，并將其插入到E.coli質(zhì)粒載體pEpUCΔ1的BamH1和EcoRI位點(diǎn)之間，得到pTH30。pEpUCΔ1(S.Seror，UniversitéParis-Sud，91405Orsay，F(xiàn)rance)含有具有選擇性的紅霉素抗性(erm)盒和溫度敏感性的復(fù)制起點(diǎn)，其在高于51℃不發(fā)揮作用。用pTH30于51℃對(duì)TH48細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，篩選對(duì)紅霉素的抗性。一個(gè)Ermr菌落(也是Cmr)被回收，在沒有抗生素選擇的條件下，于28℃培養(yǎng)過夜，72小時(shí)。然后將細(xì)菌涂布到TBAB瓊脂平板上，將平板在37℃培養(yǎng)過夜。菌落中的大約25％被發(fā)現(xiàn)對(duì)紅霉素和氯霉素抗生素都敏感。對(duì)若干種ErmsCms菌落的染色體DNA進(jìn)行PCR分析，證實(shí)了框內(nèi)ΔthiL突變的存在和ΔthiL::cat4突變的不存在。由此得到了菌株TH83。然后，用與沉默Tn917插入ΩyloA::Tn917(60％連鎖于tx1；Bacillus Genetic Stock Center的菌株1A633，也被稱為CU4153或Ωzdi-82::Tn917)的連鎖，通過標(biāo)準(zhǔn)方法，通過PBS1轉(zhuǎn)導(dǎo)，將tx1突變通過轉(zhuǎn)導(dǎo)引入到TH83中。得到的菌株被稱為TH95。
表6 含有ΔthiL和tx26突變的B.subtilis硫胺去調(diào)節(jié)菌株的硫胺生產(chǎn)情況
在使用20升的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的發(fā)酵罐進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)分批進(jìn)料發(fā)酵中，NB被發(fā)現(xiàn)能提高TH95中的硫胺生產(chǎn)。結(jié)果顯示，用含有4％NB的進(jìn)料培養(yǎng)基獲得的細(xì)胞外硫胺產(chǎn)物水平要比不用NB進(jìn)行進(jìn)料的情況高2至3倍(表7)。生長30-48小時(shí)之間，產(chǎn)量達(dá)到最高水平，為6-7mg/升。更重要地，如硫色素/HPLC試驗(yàn)結(jié)果所示，細(xì)胞外的硫胺產(chǎn)物中至少65％都以硫胺形式存在，而不用含NB的進(jìn)料進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，大多數(shù)的產(chǎn)物都是TMP和TPP。同時(shí)，增加接種物中NB的量(10％)，并將NB從進(jìn)料中去除，使得硫胺相關(guān)產(chǎn)物的生產(chǎn)被延遲至24小時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間。此外，排出的硫胺產(chǎn)物減少，并且主要是以TMP形式存在的。向批次中加入NB(4％)也導(dǎo)致硫胺生產(chǎn)總量的降低以及排出形式的變化，其中所有的硫胺形式(THI、TMP和TPP)都幾乎是等摩爾量的。
表7 加入營養(yǎng)物培養(yǎng)基(NB)的6升發(fā)酵過程中TH95的硫胺生產(chǎn)情況
實(shí)施例3用HMP和HET生產(chǎn)硫胺化合物本實(shí)施例描述了一種生產(chǎn)硫胺化合物的方法，其中涉及到在存在硫胺前體HMP和HET的情況下對(duì)硫胺去調(diào)節(jié)菌株進(jìn)行培養(yǎng)。
在分批進(jìn)料條件下，于6升和1升的規(guī)模下，對(duì)菌株TH95(tx26 tx1ΔthiL yloA::Tn917)進(jìn)行發(fā)酵，其中存在有共進(jìn)料(co-feed)的前體。進(jìn)料溶液(含有0.54g/升羥乙基噻唑(HET)和0.54g/升羥甲基嘧啶(HMP))使得硫胺在培養(yǎng)基中明顯積累。48小時(shí)后硫胺效價(jià)達(dá)到120mg/L(表8)，其表示摩爾產(chǎn)率為25％(基于任何一種前體的濃度)。相反，TMP和TPP的效價(jià)非常低(分別為4和2mg/升)，僅占排出的硫胺相關(guān)產(chǎn)物總量的3％。將HMP或HET單獨(dú)進(jìn)料，獲得的所有硫胺產(chǎn)物的效價(jià)都非常低。將HMP和HET的濃度增加到每種或總共2.7g/升都不會(huì)使得硫胺生產(chǎn)水平顯著增加。在存在0.54g/升HET和0.54g/升HMP的情況下，延長對(duì)TH95進(jìn)行的發(fā)酵，硫胺效價(jià)優(yōu)先增加。70小時(shí)后，硫胺(THI)效價(jià)達(dá)到250mg/升，而TMP和TPP水平(7和2mg/升)與其在48小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)的水平相似(表9)。
表8 加入HMP或HET的6升發(fā)酵過程中TH95的硫胺生產(chǎn)情況
表9 加入HMP或HET的1升發(fā)酵過程中TH95的硫胺生產(chǎn)情況
實(shí)施例4ThiA合成被提高的硫胺生產(chǎn)菌株本實(shí)施例描述了對(duì)含有B.substilis thiA基因的DNA盒的構(gòu)建，其可用于過量表達(dá)所述的基因，使得硫胺產(chǎn)物被過量生產(chǎn)并被排出。
為增加表達(dá)，構(gòu)建一種可擴(kuò)增的經(jīng)過改造的thiA盒，其中天然啟動(dòng)子區(qū)域被來自B.substilis細(xì)菌噬菌體SP01的強(qiáng)組成型SP01-26啟動(dòng)子所替換(被命名為P26)。首先，使用標(biāo)準(zhǔn)方法和合成的寡聚DNA引物thiA/for/pXI22/NdeI(SEQ ID NO1)和thiA/rev/pXI22/Bam(SEQ IDNO2)，通過PCR擴(kuò)增出含有整個(gè)thiA基因的1770bp長的DNA片段。用NdeI和BamHI消化之后，將PCR產(chǎn)物插入到pXI22mod的NdeI和BamHI位點(diǎn)之間，然后使用標(biāo)準(zhǔn)方法將其轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E.coli細(xì)胞中。pXI22mod是7.2kb的E.coli質(zhì)粒，其中含有P26啟動(dòng)子、合成的BacillusRBA、cryT終止子、選擇性的氨芐青霉素(bla)抗性和氯霉素(cat)抗性基因以及定位于RBS和cryT終止子之間的NdeI/BamHI克隆位點(diǎn)(NdeI位點(diǎn)產(chǎn)生了ATG起始位點(diǎn))。由于E.coli ColE1復(fù)制子和bla基因定位于啟動(dòng)子的-35至-10保守區(qū)域(consensus region)間，P26啟動(dòng)子被失活。此外，通過標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)pXI22中的NdeI位點(diǎn)進(jìn)行修飾，以去掉不想要的定位于復(fù)制子中間的NdeI限制性位點(diǎn)。這得到了質(zhì)粒pTH43(圖1)。通過用選擇性四環(huán)素-抗性(tet)基因替換掉cat盒，還制備得到了另一種thiA表達(dá)盒。為達(dá)到此目的，使用標(biāo)準(zhǔn)方法，和合成的寡聚DNA引物tet/for/PmeI(SEQ ID NO3)和tet/rev/NotI(SEQ ID NO4)，通過PCR擴(kuò)增出含有來自質(zhì)粒pDG1514(BGSC，Cat#ECE100)的tet基因的2042bp長的DNA片段。然后將該片段克隆到pTH43的PmeI和NotI位點(diǎn)之間，得到pTH47(圖1)。
下一個(gè)任務(wù)是將P26thiA-cat盒整合到硫胺去調(diào)節(jié)的菌株中。首先，通過BsaI對(duì)質(zhì)粒pTH43進(jìn)行消化，用標(biāo)準(zhǔn)方法從瓊脂糖凝膠中純化出3352bp長的片段。將純化出的片段在高DNA濃度下自身連接，用標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)化進(jìn)TH95感受態(tài)細(xì)胞中。在含有5μg/ml氯霉素的TBAB培養(yǎng)基上對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選。一個(gè)被稱為TH116的Cmr菌落，被保存下來，用于進(jìn)一步的研究。通過獲得對(duì)連續(xù)增高的氯霉素水平具有抗性的菌落，使得thiA的表達(dá)被提高。具體而言，可以獲得對(duì)60μg/ml氯霉素具有抗性的TH116菌株。對(duì)60μg/ml氯霉素具有抗性的TH116菌株的粗制細(xì)胞提取物被用來進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，其ThiA蛋白質(zhì)的水平較之僅對(duì)5μg/ml氯霉素具有抗性的TH116菌株明顯更高。
用標(biāo)準(zhǔn)分批進(jìn)料條件(具有HET共進(jìn)料，0.54g/升，w/w)，在20升實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的發(fā)酵罐中，對(duì)經(jīng)過改造的TH116菌株的硫胺生產(chǎn)進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)60μg/ml氯霉素具有抗性的菌株TH116能產(chǎn)生18-21mg/升的硫胺(表10)，其比TH95(表8)發(fā)酵的硫胺產(chǎn)量增加了3倍。但是，硫胺產(chǎn)量比進(jìn)料研究(見實(shí)施例3)中觀察到的明顯要低。該結(jié)果顯示，HMP的形成會(huì)是速度限制型，其可能是額外的酶活性不足或低水平的AIR類物質(zhì)造成的。
表10 6升發(fā)酵過程中TH116的硫胺生產(chǎn)情況
實(shí)施例5用AIR的形成被增加的微生物來生產(chǎn)硫胺化合物的方法本實(shí)施例描述了通過改變嘌呤途徑以增加氨基咪唑核糖酸(AIR)的形成來提高硫胺生產(chǎn)的實(shí)驗(yàn)。這是通過下述方法實(shí)現(xiàn)的使用嘌呤操縱子(purO)的引導(dǎo)區(qū)域中的突變，使B.subtilis嘌呤操縱子的表達(dá)去調(diào)節(jié)，同時(shí)通過引入突變到編碼磷酸核糖氨基咪唑羧化酶I的purE基因中，阻止AIR向羧基氨基咪唑核糖酸(CAIR)的轉(zhuǎn)化。
為構(gòu)建purO突變，使用引物YebF+1(SEQ ID NO18)和YebG-1(SEQ ID NO19)，通過pCR擴(kuò)增出操縱子啟動(dòng)子的上游區(qū)域，得到了667bp的產(chǎn)物。從野生型B.subtilis 1012制得的基因組DNA被用作為模板，PCR反應(yīng)條件由30個(gè)循環(huán)組成，其中每個(gè)循環(huán)包括95℃變性1分鐘、55℃退火1分鐘以及72℃延伸1分鐘。用Wizard PCR純化試劑盒(Promega)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，用EcoRI-BamHI進(jìn)行雙消化。將PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)EcoRI-BamHI消化過的pUC19中，得到質(zhì)粒pNMR72。
使用引物PurE+3(SEQ ID NO20)和PurE-1(SEQ ID NO21)，通過PCR擴(kuò)增出purE啟動(dòng)子，得到了768bp的產(chǎn)物。用Wizard PCR純化試劑盒(Promega)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，用BamHI-PstI進(jìn)行雙消化，并將其克隆進(jìn)BamHI-PstI消化過的pNMR72中，得到質(zhì)粒pNMR76。
用BamHI對(duì)質(zhì)粒pNMR76進(jìn)行線性化，將其連接到用BclI消化過的來自pBEST50的新霉素抗性(neo)基因盒上，得到質(zhì)粒pNMR79(neo盒與pur轉(zhuǎn)錄方向相同)和pNMR80(neo盒處于反方向)。用ScaI對(duì)兩種質(zhì)粒都進(jìn)行線性化，將其轉(zhuǎn)化到感受態(tài)B.subtilis 1012細(xì)胞中。在含有終濃度為2.5μg ml-1新霉素的TBAB平板上對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選。觀察到67個(gè)菌落經(jīng)過了pNMR79的轉(zhuǎn)化，18個(gè)菌落經(jīng)過了pNMR80的轉(zhuǎn)化。從每項(xiàng)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)挑出6個(gè)菌落，通過PCR進(jìn)行分析。對(duì)每項(xiàng)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)而言，兩個(gè)克隆被鑒定為含有截短的pur操縱子，其作為雙交叉(doublecrossover)被整合。上述克隆被命名為BS1566和BS1567(對(duì)pNMR79轉(zhuǎn)化而言)和BS1568和BS1569(對(duì)pNMR80轉(zhuǎn)化而言)。
為將purO缺失突變和purE6突變組合起來，用來自菌株BS1567的染色體DNA對(duì)B.subtilis菌株1A320(purE6trpC2；Bacillus Genetic StockCenter，The Ohio State University，Columbus，Ohio 43210 USA)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到菌株TH94。因?yàn)閜urO::neo purE6緊密連鎖，這兩種突變被同時(shí)轉(zhuǎn)移到硫胺去調(diào)節(jié)的菌株TH95中，這是在標(biāo)準(zhǔn)條件下通過PBS1普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)來進(jìn)行的，得到了菌株TH101(tx26 tx1 ΔthiL yloA::Tn917 ΔpurO::neopurE)。為測(cè)定硫胺生產(chǎn)情況，在標(biāo)準(zhǔn)的1L分批進(jìn)料條件(具有HET(0.54g/升)共進(jìn)料)下，對(duì)菌株TH101進(jìn)行培養(yǎng)。還向分批培養(yǎng)基和進(jìn)料溶液中分別加入0.01％(w/w)和1％(w/w，溶于7.35N NaOH)的黃嘌呤，以滿足對(duì)嘌呤的需求。黃嘌呤不會(huì)對(duì)任何嘌呤從頭合成的酶形成反饋抑制，其在高濃度下也不具有毒性。此外，進(jìn)料中還含有NH4Cl(9.6％w/w)，用H2SO4(10％)和NaOH(7.35M)對(duì)pH進(jìn)行控制。結(jié)果顯示，相同實(shí)驗(yàn)條件下，TH101在培養(yǎng)基中產(chǎn)生的硫胺要比用作對(duì)照的TH95發(fā)酵多6倍(表11)。
表11 在含有purOE突變的1升發(fā)酵過程中TH95的硫胺生產(chǎn)情況
BD，低于檢測(cè)限實(shí)施例6通過增強(qiáng)硫胺結(jié)合基因來提高硫胺化合物生產(chǎn)的方法本實(shí)施例描述了對(duì)含有B.subtilis thiC基因的DNA盒的構(gòu)建，其可用于過量表達(dá)所述的基因，使得硫胺產(chǎn)物被過量生產(chǎn)并被排出。該基因定位于含有thiK的操縱子上，thiK是編碼補(bǔ)救酶(HET激酶)的基因。
為增加thiC的表達(dá)，構(gòu)建一種可擴(kuò)增的盒，其中天然啟動(dòng)子區(qū)域被來自B.substilis細(xì)菌噬菌體SP01的強(qiáng)組成型SP01-26啟動(dòng)子所替換(被命名為P26)。為達(dá)到此目的，從pTH47上除去thiA盒，用含有thiKC的DNA片段進(jìn)行替換。
首先，使用標(biāo)準(zhǔn)方法和合成的寡聚DNA引物thiKC/for3/pXI22/NdeI(SEQ ID NO5)和thiCop/rev2/pXI22/SmaI(SEQ ID NO6)，通過PCR擴(kuò)增出含有thiKC結(jié)構(gòu)基因的1555bp長的DNA片段。用NdeI和BamHI消化之后，將PCR產(chǎn)物插入到TH43的NdeI和BamHI位點(diǎn)之間，得到質(zhì)粒pTH48(圖2)。
將該P(yáng)26thiKC-tet盒引入到TH95中，這是通過下述方法來進(jìn)行的首先，用BsaI對(duì)pTH48進(jìn)行消化，使用標(biāo)準(zhǔn)方法從瓊脂糖凝膠中純化出4078bp的片段。將純化出的片段在高DNA濃度下自身連接，用標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)化進(jìn)TH95感受態(tài)細(xì)胞中。在含有20μg/ml四環(huán)素的TBAB培養(yǎng)基上對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選。一個(gè)被稱為TH115的Tetr菌落，被保存下來，用于進(jìn)一步的研究。通過獲得對(duì)連續(xù)增高的四環(huán)素水平具有抗性的菌落，使得thiKC的表達(dá)被提高。具體而言，可以獲得對(duì)45μg/ml四環(huán)素具有抗性的TH115菌株。其粗制細(xì)胞提取物被用來進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，其ThiK和ThiC蛋白質(zhì)的水平較之僅對(duì)20μg/ml四環(huán)素具有抗性的TH115菌株明顯更高。
在存在HMP和HET共進(jìn)料(每種0.54g/升)的情況下，對(duì)TH115的兩次分批進(jìn)料發(fā)酵都獲得了硫胺產(chǎn)量的增加(48小時(shí)，210mg/L；以及78小時(shí)，300mg/L)。在48或78小時(shí)處，相對(duì)于底物HMP或HET的摩爾產(chǎn)率都是45％。兩項(xiàng)另外的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，硫胺生產(chǎn)被略微降低。有意思的是，較高的硫胺排出量與發(fā)酵初期若干小時(shí)內(nèi)發(fā)生的生長限制事件(growth-limiting event)相一致，所述生長限制事件可通過向6L的培養(yǎng)物中加入25g營養(yǎng)物培養(yǎng)基(NB)和1.6mg TPP來克服。HPLC/DAD證實(shí)了發(fā)酵培養(yǎng)基中硫胺的存在，其可被用于將硫胺從其它可被UV探測(cè)到的化合物中純化出來。有意思的是，HPLC/DAD無法探測(cè)到HMP或HET，說明0.54g/升的共進(jìn)料被完全吸收。在任何情況下，上述結(jié)果都顯示，TH115具有強(qiáng)大的如下能力從外源加入的前體來合成TMP的能力、將TMP去磷酸化為硫胺的能力以及將硫胺排出到培養(yǎng)基中的能力。此外，ThiC結(jié)合能力在本方法中明顯不是速度限制型。
實(shí)施例7通過增加噻唑生物合成酶的表達(dá)水平來增加硫胺化合物的方法本實(shí)施例描述了對(duì)含有B.subtilis thiB操縱子(其含有tenAI-thiOSGFD基因)的DNA盒的構(gòu)建，其可用于過量表達(dá)所述的基因，使得硫胺產(chǎn)物被過量生產(chǎn)并被排出。
首先制造出一種噻唑營養(yǎng)缺陷型菌株，其tenAI-thiOSGFD操縱子前面的天然啟動(dòng)子區(qū)域缺失。為達(dá)到此目的，首先用引物對(duì)YjbQ+_BamHI(SEQ ID NO22)/YjbQ-_MluI(SEQ ID NO23)和TenA+_KpnI(SEQ ID NO24)/TenA-_XhoI(SEQ ID NO25)，從B.subtilis PY79中擴(kuò)增出定位于啟動(dòng)子區(qū)域兩側(cè)的兩條DNA片段(下游的TenA和上游的YjbQ片段)。用引物TenA-cat+_KpnI(SEQ ID NO26)/TenA-cat-_MluI(SEQ ID NO27)，從TH11染色體DNA(PY79ΔthiL::cat2)擴(kuò)增得到第三條片段，其含有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶盒。然后將上述三條片段在pUC19中組合起來，形成質(zhì)粒pTH401，其含有插入到PstI和EcoRI限制性位點(diǎn)之間的‘yjbQ3-MluI-3’cat5’-KpnI-5’tenA’DNA構(gòu)建體。將質(zhì)粒pTH401轉(zhuǎn)化進(jìn)TH95，在Cm 5μg/ml上進(jìn)行篩選，得到硫胺-和噻唑-營養(yǎng)缺陷型的TH403。
為構(gòu)建P26tenAI-thiOSGFD盒，用KpnI和MluI對(duì)pTH401中的cat盒進(jìn)行切割，然后用含有來自細(xì)菌噬菌體SPO1的P26強(qiáng)組成型啟動(dòng)子的PCR片段進(jìn)行取代。用引物P26+_MluI(SEQ ID NO28)/P26-KpnI(SEQ ID NO29)，從質(zhì)粒pUCSPO1-26中擴(kuò)增出該片段。然后引入過量表達(dá)thiB的盒，這是通過在TH403背景中針對(duì)原營養(yǎng)型重建進(jìn)行篩選來開展的。將能制造P26tenA’框內(nèi)融合的連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)TH403后，針對(duì)其在最小限度培養(yǎng)基平板上生長的能力，篩選出原營養(yǎng)型轉(zhuǎn)化子。它們的氯霉素敏感性和tenAI-thiOSGFD操縱子前面的P26啟動(dòng)子的存在得到了驗(yàn)證。得到的菌株被命名為TH404(圖3)。
用具有HMP共進(jìn)料(0.54g/升，w/w)的標(biāo)準(zhǔn)分批進(jìn)料條件(起始體積6升)，在20升實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的發(fā)酵罐中，對(duì)經(jīng)過改造的菌株TH404的硫胺生產(chǎn)情況進(jìn)行了檢測(cè)。菌株TH404能生產(chǎn)多達(dá)315mg/升的硫胺(表12)。該數(shù)字明顯高于菌株TH95被培養(yǎng)48小時(shí)后的數(shù)字(110mg/升，表9)。
表12 6升發(fā)酵過程中TH404的硫胺生產(chǎn)情況
實(shí)施例8通過增加ThiA和噻唑生物合成酶的表達(dá)水平來增加硫胺化合物的方法本實(shí)施例描述了對(duì)含有B.subtilis thiA基因和B.subtilis thiB操縱子(其含有tenAI-thiOSGFD基因)的DNA盒的組合的構(gòu)建，其可用于過量表達(dá)所述的基因，使得硫胺產(chǎn)物被過量生產(chǎn)并被排出。
為將B.subtilis P26tenAI-thiOSGFD盒(實(shí)施例7中描述的)和P26thiA-cat盒(實(shí)施例4中描述的)組合起來，使用標(biāo)準(zhǔn)方法，用從菌株TH116提取的染色體DNA(非集合(non-congressional)濃度)對(duì)菌株TH404的感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。對(duì)5μg/ml氯霉素具有抗性的轉(zhuǎn)化子被選出。PCR分析證實(shí)，它們含有P26tenAI-thiOSGFD和P26thiA-cat盒。一個(gè)被稱為TH405的Cmr菌落，被保存下來，用于進(jìn)一步的研究。通過獲得對(duì)連續(xù)增高的氯霉素水平具有抗性的菌落，使得thiA在TH405中的表達(dá)被提高。具體而言，可以獲得對(duì)60μg/ml氯霉素具有抗性的TH405菌株。對(duì)60μg/ml氯霉素具有抗性的TH405菌株的粗制細(xì)胞提取物被用來進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，其ThiA蛋白質(zhì)的水平較之僅對(duì)5μg/ml氯霉素具有抗性的TH405菌株明顯更高，這與在菌株TH116中擴(kuò)增P26thiA-cat盒之后獲得的水平相同(實(shí)施例4)。
用標(biāo)準(zhǔn)分批進(jìn)料條件，在20升實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的發(fā)酵罐中，對(duì)經(jīng)過改造的TH405菌株的硫胺生產(chǎn)進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)60μg/ml氯霉素具有抗性的菌株TH405在48小時(shí)內(nèi)能產(chǎn)生34-37mg/升的硫胺(表13)，其比TH95(表8)發(fā)酵的硫胺產(chǎn)量(具有0.54g/升共進(jìn)料的HMP的情況下)增加了6倍。但是，硫胺產(chǎn)量比共進(jìn)料研究(見實(shí)施例3)中，或僅存在過量表達(dá)的thiB操縱子的情況下觀察到的明顯要低(表12，實(shí)施例7)。該結(jié)果證實(shí)了我們從實(shí)施例4中觀察到的結(jié)果，即，HMP的形成是速度限制型，并證實(shí)了除thiA和thiB操縱子之外，可能的需要被過量表達(dá)的缺失基因，并非thiB操縱子的一部分。
表13 在6升發(fā)酵過程中TH405的硫胺生產(chǎn)情況
實(shí)施例9通過增加甘氨酸或半胱氨酸的可獲得性來提高硫胺化合物生產(chǎn)的方法本實(shí)施例描述了通過在甘氨酸或半胱氨酸存在的情況下培養(yǎng)硫胺去調(diào)節(jié)的菌株來提高硫胺產(chǎn)量的實(shí)驗(yàn)，甘氨酸和半胱氨酸都是HET途徑的前體。
在具有HMP(0.54g/升)和甘氨酸(2g/升)共進(jìn)料的標(biāo)準(zhǔn)分批進(jìn)料條件下，于6升的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模下，對(duì)B.subtilis TH95(tx26 tx1 ΔthiL)的硫胺生產(chǎn)情況進(jìn)行檢測(cè)。硫胺、TMP和TPP產(chǎn)量在48小時(shí)內(nèi)分別達(dá)到了14mg/升、3mg/升和0.5mg/升(表14)，其明顯高于僅存在HMP進(jìn)料情況下對(duì)TH95進(jìn)行培養(yǎng)所獲得的硫胺產(chǎn)物的水平(表8)。
然后，在具有HMP(0.54g/升)和半胱氨酸(0.5g/升)共進(jìn)料的標(biāo)準(zhǔn)分批進(jìn)料條件下，于6升的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模下，對(duì)B.subtilis TH95(tx26 tx1ΔthiL)的硫胺生產(chǎn)情況進(jìn)行檢測(cè)，其中還加入了蘇氨酸(0.4g/升)和異亮氨酸(0.2g/升)以促進(jìn)半胱氨酸的同化。硫胺產(chǎn)量在48小時(shí)內(nèi)達(dá)到了8mg/升(表14)，其明顯高于僅存在HMP進(jìn)料情況下對(duì)TH95進(jìn)行培養(yǎng)所獲得的硫胺效價(jià)(表8)。
硫胺產(chǎn)量的增加可以通過將全部四種氨基酸(甘氨酸、半胱氨酸、異亮氨酸和蘇氨酸)加入到TH95發(fā)酵過程中來獲得(表14)。此外，增加上述氨基酸合成過程中所涉及到的生物合成基因的表達(dá)，或向調(diào)控基因或順式作用調(diào)控位點(diǎn)引入突變，使得所述氨基酸生物合成基因的表達(dá)增加，或者通過引入能導(dǎo)致所述生物合成酶活性增加的突變，都能使得硫胺產(chǎn)量增加。
表14 加入甘氨酸、半胱氨酸-異亮氨酸-蘇氨酸或甘氨酸-半胱氨酸-異亮氨酸-蘇氨酸的6升發(fā)酵過程中TH95的硫胺生產(chǎn)情況
實(shí)施例10用Grewe二胺作為前體生產(chǎn)硫胺化合物的方法本實(shí)施例描述了下述實(shí)驗(yàn)，其展示了在HMP的衍生物，4-氨基-2-甲基-5-嘧啶甲烷胺(Grewe二胺)存在的情況下，通過培養(yǎng)硫胺去調(diào)節(jié)的菌株來進(jìn)行的對(duì)硫胺的生產(chǎn)。
Grewe二胺是HMP的衍生物，其中C-5羥甲基被氨基甲基所取代。在具有Grewe二胺和HET共進(jìn)料(每種均為0.54g/升)的標(biāo)準(zhǔn)分批進(jìn)料條件下，于6升的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模下，對(duì)B.subtilis TH95(tx26 tx1 ΔthiL)的硫胺生產(chǎn)情況進(jìn)行檢測(cè)。硫胺產(chǎn)量在45.5小時(shí)內(nèi)達(dá)到了53mg/升(表15)。進(jìn)料溶液中Grewe二胺水平的增加至2.7g/升，能使硫胺產(chǎn)量增加，在46.5小時(shí)內(nèi)達(dá)到120mg/升(表15)。上述結(jié)果顯示了開發(fā)從Grewe二胺和HET來生產(chǎn)硫胺的發(fā)酵方法的可行性。此外，上述結(jié)果還顯示，Bacillus subtilis編碼一種或多種能將Grewe二胺轉(zhuǎn)化為HMP(或然后可用于生產(chǎn)硫胺的結(jié)構(gòu)類似的化合物)的酶活性。
表15 存在Grewe二胺和HET共進(jìn)料的6升發(fā)酵過程中TH95的硫胺生產(chǎn)情況
實(shí)施例11經(jīng)過分離的基因和突變yloS/tx1菌株Tx1攜帶有tx1突變(關(guān)于具有該突變的多核苷酸序列，見SEQID NO30)，其是通過在TPP存在時(shí)，針對(duì)Lac+表型對(duì)含有thiA-lacZ融合的細(xì)菌進(jìn)行篩選來分離得到的。該菌株(ΔthiL::cat4，amyE::thiA-lacZtx1)被顯示為強(qiáng)的硫胺緩慢生長型，這表明，該突變能使殘余的TMP激酶活性失活或使從硫胺形成TPP的次級(jí)途徑中涉及到的未知基因產(chǎn)物失活。重建研究顯示，如對(duì)HET(ΩthiF::pMUTIN)或HMP-P(ΩthiA::Tn917)途徑受到阻礙的TH22衍生物的分析結(jié)果所示，Tx1的Lac+表型并非是噻唑或HMP途徑的普通缺陷導(dǎo)致的。
具有tx1的菌株是緩慢生長型，這是基于其能在補(bǔ)充有2.5％營養(yǎng)物培養(yǎng)基、卻不含任何可見量的硫胺產(chǎn)物的最小限度培養(yǎng)基中生長的能力來驗(yàn)證的。在上述培養(yǎng)物中，Tx1生產(chǎn)出的細(xì)胞外硫胺產(chǎn)物要比對(duì)照菌株TH22(ΩthiL::cat4，ΩamyE::thiA-lacZ)多大約10倍。有意思的是，所有可檢測(cè)到的硫胺產(chǎn)物都以硫胺或TPP的形式存在；在培養(yǎng)基中檢測(cè)不到TMP。遺傳研究顯示，Tx1硫胺緩慢生長型表型需要ΔthiL::cat4。
在標(biāo)準(zhǔn)條件下使用PBS1普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行的遺傳圖譜研究顯示，tx1突變與ΔthiL::cat4或ΩamyE::thiA-lacZ都不連鎖。但是，tx1顯示出與定位于140°的zdi82::Tn917(BGSC# 1A633)具有90％的轉(zhuǎn)導(dǎo)連鎖性。對(duì)于相同標(biāo)記的轉(zhuǎn)化連鎖性為8％。若干種定位于121°和140°之間的與Tn917連鎖的突變也明顯顯示出與tx1的連鎖性。一種突變，urc83::Tn917(菌株1A611)顯示出高度轉(zhuǎn)導(dǎo)連鎖性(＞60％)和顯著的轉(zhuǎn)化連鎖性(10％)。該插入導(dǎo)致尿嘧啶+半胱氨酸或尿嘧啶+甲硫氨酸的營養(yǎng)缺陷型，其處于pry操縱子和cys操縱子(139°)之間的交叉點(diǎn)。第二種突變，yloA::Tn917顯示類似的與tx1的連鎖性。我們觀察到，tx1與ΩspoVM::Tn917突變具有高得多的轉(zhuǎn)導(dǎo)和DNA轉(zhuǎn)化連鎖性，這暗示tx1與yloS等位，其與spoVM相鄰。該yloS基因顯示出與Schizosaccharomyces pombe的TNR3基因蛋白質(zhì)具有弱的氨基酸相似性(P＝0.23)，其在現(xiàn)有技術(shù)中顯示出具有硫胺焦磷酸激酶活性。為確定tx1是否與yloS等位，使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過PCR構(gòu)建出一條穩(wěn)定的長448bp的缺失突變，其始自yloS基因(ΔyloS::cat4)的第124號(hào)堿基，并將其轉(zhuǎn)化進(jìn)PY79。引入ΩthiL::pMUTIN后，得到的雙突變體表型近于原始的Tx1突變體。此外，對(duì)Tx1突變體中的yloS進(jìn)行DNA測(cè)序揭示了一個(gè)單個(gè)堿基的突變，其導(dǎo)致氨基酸殘基116處發(fā)生了亮氨酸對(duì)苯丙氨酸的取代(L116＞F116；見SEQ ID NO31)。
基于上述結(jié)果，B.subtilis含有兩條用于從TMP合成TPP的生物合成路徑(1)通過thiL的產(chǎn)物進(jìn)行的從TMP到TPP的直接的酶轉(zhuǎn)化；和(2)通過未知的磷酸酶進(jìn)行的從TMP到THI的酶轉(zhuǎn)化，接著是通過yloS的產(chǎn)物進(jìn)行的從THI到TPP的磷酸化。
路徑(1)已被顯示存在于革蘭氏陰性生物(例如，Salmonellatyphimurium和E.coli)中。路徑(2)僅存在于某些Gram+細(xì)菌和一些其它的真核微生物中，包括酵母(Llorente et al.(1999)Mol.Microbiol.321140-1152)。此外，B.subtilis必須含有將硫胺轉(zhuǎn)化為TMP的激酶活性。該結(jié)論是基于遺傳學(xué)研究做出的，其顯示，含有突變?chǔ)loS::cat4和ΩthiA84::Tn917的TH109菌株能生長于含有硫胺的最小限度培養(yǎng)基上。
蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索顯示，至少13個(gè)細(xì)菌的屬含有一個(gè)或多個(gè)編碼與YloS具有相當(dāng)程度的同源性的蛋白質(zhì)的基因Oceanobacillus、Listeria、Staphyococcus、Enterococcus、Streptococcus、Clostridium、Fusobacterium、Tropheryma、Mesorhizobium、Brucella、Thermotoga、Agrobacterium和Helicobacter。上述微生物中的大多數(shù)都是Gram+細(xì)菌。還檢測(cè)到了與來自非細(xì)菌生物(例如，酵母、Drosophila melanogaster、Mus musculus和Treponema pallidum)的基因的較弱的同源性。有意思的是，含有yloS的細(xì)菌種類中的大多數(shù)都不含thiL的直向同源物基因，反過來，含有thiL的細(xì)菌種類中的大多數(shù)也都不含yloS的直向同源物(表16)。后一個(gè)組主要由革蘭氏陰性的屬構(gòu)成。和B.subtilis一樣，Oceanobacillus iheyensis含有上述兩種基因。上述結(jié)果顯示，按照通過對(duì)硫胺進(jìn)行焦磷酸化或通過對(duì)TMP進(jìn)行磷酸化形成TPP的能力，可將真細(xì)菌分為兩大類。此外，很多僅含yloS直向同源物而不含thiL直向同源物的Gram+細(xì)菌是病原體，這暗示yloS基因可被用作發(fā)展抗細(xì)菌試劑的目標(biāo)。
表16 各種細(xì)菌屬中yloS和thiL直向同源物的存在情況
yuaJ/tx26-1
用標(biāo)準(zhǔn)條件進(jìn)行的PBS1普遍性實(shí)驗(yàn)顯示，Tx26突變體含有定位于染色體上不同區(qū)域的兩種突變。上述實(shí)驗(yàn)中，首先在標(biāo)準(zhǔn)的野生型B.subtilis菌株(其含有表型沉默的Tn917插入，該插入位于染色體周圍)(BacillusGenetic Stock Center)上制得噬菌體裂解物。上述裂解物中的兩種，一種攜帶有圖譜位置277°處的ΩyufR::Tn917(BGSC# 1A642)，另一種攜帶有圖譜位置122.5°處的ΩmotA::Tn917(BGSC# 1A631)，都能將Tx26表型回復(fù)為野生型(在含有1μM TPP的最小限度培養(yǎng)基上將Lac+回復(fù)為Lac-，或?qū)⑹褂?.1μM抗硫胺素時(shí)的抗硫胺素抗性回復(fù)為抗硫胺素敏感性)。上述未預(yù)料到的結(jié)果顯示，這兩種突變都是Tx26展現(xiàn)的硫胺去調(diào)節(jié)表型所需要的。一種被稱為tx26-1的突變，顯示出與ΩyufR::Tn917具有70％的連鎖性，另一種被稱為tx26-2的突變，顯示出與ΩmotA::Tn917具有59％的連鎖性。此外，在回交(back-cross)實(shí)驗(yàn)中，可通過集合(congression)DNA轉(zhuǎn)化，將Tx26的抗硫胺素抗性標(biāo)記轉(zhuǎn)入敏感型B.subtilis菌株。上述抗硫胺素抗性轉(zhuǎn)化子也是硫胺去調(diào)節(jié)的(在含有1μMTPP的最小限度培養(yǎng)基上展示出Lac+，對(duì)0.1μM抗硫胺素具有抗性)。
用含有抗生素插入(yufR/maeN(277.1°)、yuiGH(281°)、yurI(285.6°)、gerAB和yvaC(294°))的不同組合的供體菌株來進(jìn)行三因子交叉實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步地將tx26-1突變?cè)趫D譜上定位于yuaJ附近，后者是硫胺調(diào)節(jié)基因，其是通過微陣列分析鑒定出來的(見下文)。為確定tx26-1是否與yuaJ等位，首先用標(biāo)準(zhǔn)PCR方法構(gòu)建yuaJ的缺失突變。為達(dá)到此目的，使用引物BsyuaJ/for/Hind3(SEQ ID NO16)和BsyuaJ/rev/Bam(SEQ ID NO17)，通過PCR擴(kuò)增出一條324bp長的yuaJ的內(nèi)部片段，其起始于353位，并將該片段插入到pMUTIN2的BamHI和HindIII位點(diǎn)之間，產(chǎn)生質(zhì)粒pTH31。同預(yù)料的一樣，將ΩyuaJ::pMUTIN引入到野生型菌株(例如PY79)或thiA突變體中，是不產(chǎn)生表型的。但是，在若干種遺傳交叉中，ΩyuaJ::pMUTIN2破壞型顯示出與tx26-1之間具有非常高的轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)化連鎖性(100％)。上述連鎖性結(jié)果使得tx26-1被定位于yuaJ內(nèi)部或附近。此外，將ΩyuaJ::pMUTIN轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化進(jìn)菌株TH112(tx26-1+tx26-2 ΔthiL)，得到對(duì)0.1μM抗硫胺素具有抗性的Ermr菌落。最后，對(duì)來自Tx26的yuaJ進(jìn)行DNA序列分析，驗(yàn)證了tx26-1(關(guān)于含有該突變的多核苷酸序列的拷貝，見SEQ ID NO33)是yuaJ的等位基因。對(duì)來自Tx26的四條獨(dú)立PCR片段和來自野生型親本菌株(PY79)的兩條片段的DNA序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)單獨(dú)堿基的突變，其導(dǎo)致第35位氨基酸的谷氨酰胺殘基變?yōu)轸魍两K止密碼子(Q35(CAA)＞終止子(TAA)；見SEQ ID NO34，將其與野生型YuaJ的氨基酸序列ID NO35相比可以發(fā)現(xiàn))。蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索表明，yuaJ編碼硫胺透性酶，或表面抗原蛋白質(zhì)基因的調(diào)控子。疏水性分析表明，YuaJ含有六個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。將tx26-1引入，預(yù)計(jì)會(huì)產(chǎn)生被截短的35個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，其很可能經(jīng)歷蛋白質(zhì)水解。上述結(jié)果，連同前文所述的遺傳數(shù)據(jù)暗示yuaJ的功能丟失導(dǎo)致了硫胺去調(diào)節(jié)表型的出現(xiàn)。此外，微陣列數(shù)據(jù)(見下文)表明，yuaJ的表達(dá)受TPP調(diào)控，對(duì)預(yù)計(jì)的5’-引導(dǎo)區(qū)域的研究揭示了一段與保守的THI盒調(diào)控序列具有高度同源性的DNA序列。
tx26-2用在含有Tn917插入的菌株上制備的PBS1噬菌體裂解物的集合進(jìn)行普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)圖譜研究(兩因子交叉)，其顯示，tx26-2與定位于B.subtilis基因組122.5°上的ΩmotA::Tn917(BGSC# 1A631)具有60％的連鎖性。該遺傳圖譜位置對(duì)應(yīng)于基因簇ykoFEDC，在對(duì)硫胺去調(diào)節(jié)的Tx26菌株進(jìn)行的微陣列研究中，其轉(zhuǎn)錄水平顯示出有所增加(見表17)。此外，上述基因看起來是組織成操縱子的，其在ykoF上游的啟動(dòng)子區(qū)域含有THI盒調(diào)控元件。對(duì)該操縱子(包括ykoF上游400bp的區(qū)域)的DNA測(cè)序檢測(cè)到了ykoD基因中一個(gè)單堿基突變，其導(dǎo)致了Asn180(AAC)對(duì)Asp180(GAC)的取代(見SEQ ID NO37，將其氨基酸序列與野生型YkoD的氨基酸序列ID NO38進(jìn)行比較)。蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索顯示，ykoD編碼與ATP結(jié)合的HMP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。該操縱子中的另外兩個(gè)基因，ykoE和C被預(yù)測(cè)能編碼HMP轉(zhuǎn)運(yùn)透性酶。上述結(jié)果顯示，tx26-2突變是ykoD的等位基因，并且影響硫胺的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)(關(guān)于含有該突變的多核苷酸序列的拷貝，見SEQ ID NO36)。
通過微陣列分析鑒定出來的硫胺調(diào)節(jié)基因?yàn)檫M(jìn)行微陣列分析，在含有50ml Spizizen最小限度培養(yǎng)基的搖瓶培養(yǎng)物中，加或不加硫胺焦磷酸酯，對(duì)PY79進(jìn)行培養(yǎng)。將過夜培養(yǎng)物稀釋到新鮮培養(yǎng)基中，至Klett＝10單位，并培養(yǎng)至指數(shù)生長階段(Klett＝100單位)。通過離心收集來自一半培養(yǎng)物中的細(xì)胞，按照現(xiàn)有技術(shù)所述立即抽提總RNA(Lee et al.(2001)J.Bacteriol.1837371-7380)。剩下的培養(yǎng)物繼續(xù)生長至穩(wěn)定階段早期，再進(jìn)行RNA提取。穩(wěn)定階段早期被定義為葡萄糖耗盡之后30分鐘；使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過葡萄糖分析儀2(Beckman，F(xiàn)ullerton，CA)對(duì)培養(yǎng)基中的葡萄糖含量進(jìn)行測(cè)量。對(duì)經(jīng)標(biāo)記的cDNA靶的制備、微陣列雜交和染色工藝以及數(shù)據(jù)分析都見上述Lee et al.所述。
除已知的硫胺調(diào)節(jié)B.subtilis基因thiA和tenAI-thiOSGFD之外，對(duì)上述結(jié)果的分析還顯示，TPP不存在的情況下培養(yǎng)的細(xì)胞中若干種其它基因的轉(zhuǎn)錄水平為3倍或更高。上述基因列于表17中。通過對(duì)TPP存在的情況下最小限度培養(yǎng)基中野生型和硫胺去調(diào)節(jié)(Tx26)菌株的微陣列數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，證實(shí)了上述結(jié)果。此外，在若干種上述基因中，在5’引導(dǎo)區(qū)域內(nèi)可發(fā)現(xiàn)保守的順式作用調(diào)控位點(diǎn)(thi盒)?？梢酝茢喑觯鲜龌虮磉_(dá)單獨(dú)或一起的增加或降低，或與已知的生物合成基因組合起來升高或降低，也可能導(dǎo)致更高的硫胺、HMP和/或噻唑產(chǎn)量。
表17 B.subtilis中與TPPa應(yīng)答的基因的轉(zhuǎn)錄水平的變化
a轉(zhuǎn)錄比例是通過用沒有TPP處理的最小限度培養(yǎng)基中指數(shù)階段生長的野生型細(xì)胞進(jìn)行的雜交實(shí)驗(yàn)的均差值(average difference value)(經(jīng)過均一化后)去除以有TPP處理的情況下(wt-/wt+)的該值計(jì)算得到的，或者，用有維生素(viz)處理的最小限度培養(yǎng)基中指數(shù)階段生長的去調(diào)節(jié)突變體Tx26細(xì)胞進(jìn)行的雜交實(shí)驗(yàn)的均差值去除以相同條件下生長的野生型細(xì)胞的該值(deg+/wt+)計(jì)算得到。對(duì)于某些基因(黑體字)，從每個(gè)雜交實(shí)驗(yàn)的雙重探針集合獲得均插值。
bn/c，均差值無變化序列表<110>帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司<120>通過發(fā)酵生產(chǎn)硫胺的方法<130>Case 21807<150>US 60/475,323<151>2003-06-02<160>38<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>29<212>DNA<213>人工<220>
<223>PCR引物<400>1atgccatatg caaaacaatt cagtgcagc 29<210>2<211>36<212>DNA<213>人工<220>
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<220>
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<223>PCR引物<400>29gggttggtac ctttaattct cgagtgttaa g 31<210>30<211>642<212>DNA<213>Bacillus subtilis<220>
<221>突變<222>(346)..(346)<223>ylos基因中的突變tx1<400>30atgaaaacaa ttaatatcgt tgcgggaggc ccgaaaaatc tcattcccga tctaaccggc60tatacggatg aacacacgct ttggatcggt gttgacaaag gcaccgtcac tctcttagat120gccgggatca ttcctgttga agccttcgga gattttgaca gcataacgga gcaagaacgc180cggcgaatag aaaaagccgc tcccgccctt catgtgtatc aagcagaaaa agatcaaaca240gatttagacc tcgcccttga ttgggcgctg gaaaagcagc cggatattat tcagattttc300ggcattacag gcggcagagc tgatcatttt ttaggaaaca ttcagtttct gtataaaggt360gtaaaaacga acataaaaat taggctgata gacaaacaaa atcatattca aatgttccct420cctggtgaat atgatattga gaaggatgaa aataagcgat atatctcctt cataccgttt480tccgaagaca tacatgagct gaccctgacc ggttttaaat atcctctaaa taattgtcat540attacgctcg gttcaacact atgtattagt aacgaactca ttcattcacg aggtactttt600tcgtttgcaa aaggcatatt aataatgata agaagcacgg at 642<210>31<211>214<212>PRT<213>Bacillus subtilis<400>31Met Lys Thr Ile Asn Ile Val Ala Gly Gly Pro Lys Asn Leu Ile Pro1 5 10 15
Asp Leu Thr Gly Tyr Thr Asp Glu His Thr Leu Trp Ile Gly Val Asp20 25 30Lys Gly Thr Val Thr Leu Leu Asp Ala Gly Ile Ile Pro Val Glu Ala35 40 45Phe Gly Asp Phe Asp Ser Ile Thr Glu Gln Glu Arg Arg Arg Ile Glu50 55 60Lys Ala Ala Pro Ala Leu His Val Tyr Gln Ala Glu Lys Asp Gln Thr65 70 75 80Asp Leu Asp Leu Ala Leu Asp Trp Ala Leu Glu Lys Gln Pro Asp Ile85 90 95Ile Gln Ile Phe Gly Ile Thr Gly Gly Arg Ala Asp His Phe Leu Gly100 105 110Asn Ile Gln Phe Leu Tyr Lys Gly Val Lys Thr Asn Ile Lys Ile Arg115 120 125Leu Ile Asp Lys Gln Asn His Ile Gln Met Phe Pro Pro Gly Glu Tyr130 135 140Asp Ile Glu Lys Asp Glu Asn Lys Arg Tyr Ile Ser Phe Ile Pro Phe145 150 155 160Ser Glu Asp Ile His Glu Leu Thr Leu Thr Gly Phe Lys Tyr Pro Leu165 170 175Asn Asn Cys His Ile Thr Leu Gly Ser Thr Leu Cys Ile Ser Asn Glu180 185 190Leu Ile His Ser Arg Gly Thr Phe Ser Phe Ala Lys Gly Ile Leu Ile195 200 205Met Ile Arg Ser Thr Asp210<210>32<211>214<212>PRT<213>Bacillus subtilis<400>32
Met Lys Thr Ile Asn Ile Val Ala Gly Gly Pro Lys Asn Leu Ile Pro1 5 10 15Asp Leu Thr Gly Tyr Thr Asp Glu His Thr Leu Trp Ile Gly Val Asp20 25 30Lys Gly Thr Val Thr Leu Leu Asp Ala Gly Ile Ile Pro Val Glu Ala35 40 45Phe Gly Asp Phe Asp Ser Ile Thr Glu Gln Glu Arg Arg Arg Ile Glu50 55 60Lys Ala Ala Pro Ala Leu His Val Tyr Gln Ala Glu Lys Asp Gln Thr65 70 75 80Asp Leu Asp Leu Ala Leu Asp Trp Ala Leu Glu Lys Gln Pro Asp Ile85 90 95Ile Gln Ile Phe Gly Ile Thr Gly Gly Arg Ala Asp His Phe Leu Gly100 105 110Asn Ile Gln Leu Leu Tyr Lys Gly Val Lys Thr Asn Ile Lys Ile Arg115 120 125Leu Ile Asp Lys Gln Asn His Ile Gln Met Phe Pro Pro Gly Glu Tyr130 135 140Asp Ile Glu Lys Asp Glu Asn Lys Arg Tyr Ile Ser Phe Ile Pro Phe145 150 155 160Ser Glu Asp Ile His Glu Leu Thr Leu Thr Gly Phe Lys Tyr Pro Leu165 170 175Asn Asn Cys His Ile Thr Leu Gly Ser Thr Leu Cys Ile Ser Asn Glu180 185 190Leu Ile His Ser Arg Gly Thr Phe Ser Phe Ala Lys Gly Ile Leu Ile195 200 205Met Ile Arg Ser Thr Asp210<210>33<211>576<212>DNA
<213>Bacillus subtilis<220>
<221>突變<222>(103)..(103)<223>yuaJ中的突變tx26-1<400>33atgaatcaat ctaagcaact ggttcgcctt attgaaattg ccattatgac agcggcagcc60gttattttag acattgtctc aggaatgttt cttagcatgc cttaaggagg ctcggtctcc120atcatgatga ttccgatctt tttaatttcg tttcgctggg gtgtcaaagc aggtcttact180acaggtttgt tgacaggtct agtacaaata gcaatcggaa acttgtttgc tcaacatcct240gtacagctat tgttagatta cattgtcgct ttcgcagcaa tcggcataag cggctgtttc300gcttcttctg tccgtaaagc cgctgtatca aaaacaaaag ggaaattgat tgtttcagtg360gtcagcgcag tttttatcgg cagtttgctg cgctatgccg cgcatgtcat ttcaggagct420gtgtttttcg gcagctttgc tccaaaagga acaccggtat ggatttattc tttaacttat480aatgcgactt acatggttcc ttcattcatt atttgtgcaa ttgtcctatg tttattattt540atgacagcac cccgtctgct taaaagtgac aaagcg 576<210>34<211>34<212>PRT<213>Bacillus subtilis<400>34Met Asn Gln Ser Lys Gln Leu Val Arg Leu Ile Glu Ile Ala Ile Met1 5 10 15Thr Ala Ala Ala Val Ile Leu Asp Ile Val Ser Gly Met Phe Leu Ser20 25 30Met Pro<210>35<211>192<212>PRT<213>Bacillus subtilis<400>35Met Asn Gln Ser Lys Gln Leu Val Arg Leu Ile Glu Ile Ala Ile Met1 5 10 15
Thr Ala Ala Ala Val Ile Leu Asp Ile Val Ser Gly Met Phe Leu Ser20 25 30Met Pro Gln Gly Gly Ser Val Ser Ile Met Met Ile Pro Ile Phe Leu35 40 45Ile Ser Phe Arg Trp Gly Val Lys Ala Gly Leu Thr Thr Gly Leu Leu50 55 60Thr Gly Leu Val Gln Ile Ala Ile Gly Asn Leu Phe Ala Gln His Pro65 70 75 80Val Gln Leu Leu Leu Asp Tyr Ile Val Ala Phe Ala Ala Ile Gly Ile85 90 95Ser Gly Cys Phe Ala Ser Ser Val Arg Lys Ala Ala Val Ser Lys Thr100 105 110Lys Gly Lys Leu Ile Val Ser Val Val Ser Ala Val Phe Ile Gly Ser115 120 125Leu Leu Arg Tyr Ala Ala His Val Ile Ser Gly Ala Val Phe Phe Gly130 135 140Ser Phe Ala Pro Lys Gly Thr Pro Val Trp Ile Tyr Ser Leu Thr Tyr145 150 155 160Asn Ala Thr Tyr Met Val Pro Ser Phe Ile Ile Cys Ala Ile Val Leu165 170 175Cys Leu Leu Phe Met Thr Ala Pro Arg Leu Leu Lys Ser Asp Lys Ala180 185 190<210>36<211>1470<212>DNA<213>Bacillus subtilis<220>
<221>突變<222>(538)..(538)<223>ykoD中的突變tx26-2<400>36atgcaagcct ttgatgagct tctgacggtt gagcagctca gcttctctta tgaagaagac60
gagaaaccgg tttttcaaga catttcgttt gagcttcaaa aaggagaatg tgttttatta120ttaggaccga gcggatgcgg taaaagctcg ctcgcccttt gtttaaacgg tctatatccg180gaggcttgcg acggcattca gtccggacat gtatttctat ttcaaaagcc ggtcacagat240gctgaaacct ccgaaacgat tactcagcat gccggggtcg tttttcagga tcctgatcag300cagttctgca tgctgacggt ggaggacgaa atagcgttcg ggctggaaaa tctgcaaatt360ccaaaagaag aaatgacaga gaaaatcaac gccgtattag gaaaattacg cattacccat420ttaaaagaaa aaatgatctc aaccctttca ggaggacaaa agcagaaagt ggctctcgcc480tgtattttgg cgatggagcc tgagcttatt attttagatg agccgacctc tcttttaaac540cctttctcag ctcgggagtt cgttcatctg atgaaggatc ttcagcggga aaaaggtttc600agcctcctcg tcattgagca ccagcttgat gaatgggcgc cttggattga gagaacgatc660gtactcgaca aatcaggcaa aaaggcactg gatggcctga cgaaaaatct atttcagcat720gaagcggaga cactaaagaa attgggcatc gcaattccaa aggtctgtca tctgcaggaa780aagctgagta tgccgtttac tttatcaaaa gagatgctgt tcaaagagcc tattcctgcc840gggcatgtca aaaagaagaa agccccttct ggggagagtg tgcttgaagt cagcagcctt900tcgttcgcga gaggacagca ggcgattttc aaagacatca gcttttcgtt gcgcgaaggc960tctttaacgg cgcttgtcgg tccgaacgga actggaaaat cgacgctcct atcagttctg1020gccagtctca tgaaaccgca aagcggcaaa atccttctct atgatcagcc gctgcagaaa1080tataaagaaa aagaattgcg taaacggatg ggatttgttt ttcaaaaccc tgagcatcaa1140ttcgtcaccg atacggtgta tgacgagctt ctgttcggcc agaaagcaaa tgctgaaact1200gagaaaaaag cgcaacacct gctgcagcgt tttggtcttg cgcatttggc tgatcatcat1260ccgtttgcga tcagccaagg gcaaaaacgg cgactgagcg tagctactat gctcatgcat1320gacgtaaagg ttttattatt agacgaacca acctttggcc aggatgcccg cacggcggct1380gaatgcatgg aaatgattca acgtatcaag gcagagggaa ctgctgtcct tatgattaca1440caaggatatg gagcaagtct cttcgtatgc 1470<210>37<211>490<212>PRT<213>Bacillus subtilis<400>37Met Gln Ala Phe Asp Glu Leu Leu Thr Val Glu Gln Leu Ser Phe Ser1 5 10 15
Tyr Glu Glu Asp Glu Lys Pro Val Phe Gln Asp Ile Ser Phe Glu Leu20 25 30Gln Lys Gly Glu Cys Val Leu Leu Leu Gly Pro Ser Gly Cys Gly Lys35 40 45Ser Ser Leu Ala Leu Cys Leu Asn Gly Leu Tyr Pro Glu Ala Cys Asp50 55 60Gly Ile Gln Ser Gly His Val Phe Leu Phe Gln Lys Pro Val Thr Asp65 70 75 80Ala Glu Thr Ser Glu Thr Ile Thr Gln His Ala Gly Val Val Phe Gln85 90 95Asp Pro Asp Gln Gln Phe Cys Met Leu Thr Val Glu Asp Glu Ile Ala100 105 110Phe Gly Leu Glu Asn Leu Gln Ile Pro Lys Glu Glu Met Thr Glu Lys115 120 125Ile Asn Ala Val Leu Gly Lys Leu Arg Ile Thr His Leu Lys Glu Lys130 135 140Met Ile Ser Thr Leu Ser Gly Gly Gln Lys Gln Lys Val Ala Leu Ala145 150 155 160Cys Ile Leu Ala Met Glu Pro Glu Leu Ile Ile Leu Asp Glu Pro Thr165 170 175Ser Leu Leu Asn Pro Phe Ser Ala Arg Glu Phe Val His Leu Met Lys180 185 190Asp Leu Gln Arg Glu Lys Gly Phe Ser Leu Leu Val Ile Glu His Gln195 200 205Leu Asp Glu Trp Ala Pro Trp Ile Glu Arg Thr Ile Val Leu Asp Lys210 215 220Ser Gly Lys Lys Ala Leu Asp Gly Leu Thr Lys Asn Leu Phe Gln His225 230 235 240Glu Ala Glu Thr Leu Lys Lys Leu Gly Ile Ala Ile Pro Lys Val Cys245 250 255
His Leu Gln Glu Lys Leu Ser Met Pro Phe Thr Leu Ser Lys Glu Met260 265 270Leu Phe Lys Glu Pro Ile Pro Ala Gly His Val Lys Lys Lys Lys Ala275 280 285Pro Ser Gly Glu Ser Val Leu Glu Val Ser Ser Leu Ser Phe Ala Arg290 295 300Gly Gln Gln Ala Ile Phe Lys Asp Ile Ser Phe Ser Leu Arg Glu Gly305 310 315 320Ser Leu Thr Ala Leu Val Gly Pro Asn Gly Thr Gly Lys Ser Thr Leu325 330 335Leu Ser Val Leu Ala Ser Leu Met Lys Pro Gln Ser Gly Lys Ile Leu340 345 350Leu Tyr Asp Gln Pro Leu Gln Lys Tyr Lys Glu Lys Glu Leu Arg Lys355 360 365Arg Met Gly Phe Val Phe Gln Asn Pro Glu His Gln Phe Val Thr Asp370 375 380Thr Val Tyr Asp Glu Leu Leu Phe Gly Gln Lys Ala Asn Ala Glu Thr385 390 395 400Glu Lys Lys Ala Gln His Leu Leu Gln Arg Phe Gly Leu Ala His Leu405 410 415Ala Asp His His Pro Phe Ala Ile Ser Gln Gly Gln Lys Arg Arg Leu420 425 430Ser Val Ala Thr Met Leu Met His Asp Val Lys Val Leu Leu Leu Asp435 440 445Glu Pro Thr Phe Gly Gln Asp Ala Arg Thr Ala Ala Glu Cys Met Glu450 455 460Met Ile Gln Arg Ile Lys Ala Glu Gly Thr Ala Val Leu Met Ile Thr465 470 475 480Gln Gly Tyr Gly Ala Ser Leu Phe Val Cys
485490<210>38<211>490<212>PRT<213>Bacillus subtilis<400>38Met Gln Ala Phe Asp Glu Leu Leu Thr Val Glu Gln Leu Ser Phe Ser1 5 10 15Tyr Glu Glu Asp Glu Lys Pro Val Phe Gln Asp Ile Ser Phe Glu Leu20 25 30Gln Lys Gly Glu Cys Val Leu Leu Leu Gly Pro Ser Gly Cys Gly Lys35 40 45Ser Ser Leu Ala Leu Cys Leu Asn Gly Leu Tyr Pro Glu Ala Cys Asp50 55 60Gly Ile Gln Ser Gly His Val Phe Leu Phe Gln Lys Pro Val Thr Asp65 70 75 80Ala Glu Thr Ser Glu Thr Ile Thr Gln His Ala Gly Val Val Phe Gln85 90 95Asp Pro Asp Gln Gln Phe Cys Met Leu Thr Val Glu Asp Glu Ile Ala100 105 110Phe Gly Leu Glu Asn Leu Gln Ile Pro Lys Glu Glu Met Thr Glu Lys115 120 125Ile Asn Ala Val Leu Gly Lys Leu Arg Ile Thr His Leu Lys Glu Lys130 135 140Met Ile Ser Thr Leu Ser Gly Gly Gln Lys Gln Lys Val Ala Leu Ala145 150 155 160Cys Ile Leu Ala Met Glu Pro Glu Leu Ile Ile Leu Asp Glu Pro Thr165 170 175Ser Leu Leu Asp Pro Phe Ser Ala Arg Glu Phe Val His Leu Met Lys180 185 190Asp Leu Gln Arg Glu Lys Gly Phe Ser Leu Leu Val Ile Glu His Gln
195 200 205Leu Asp Glu Trp Ala Pro Trp Ile Glu Arg Thr Ile Val Leu Asp Lys210 215 220Ser Gly Lys Lys Ala Leu Asp Gly Leu Thr Lys Asn Leu Phe Gln His225 230 235 240Glu Ala Glu Thr Leu Lys Lys Leu Gly Ile Ala Ile Pro Lys Val Cys245 250 255His Leu Gln Glu Lys Leu Ser Met Pro Phe Thr Leu Ser Lys Glu Met260 265 270Leu Phe Lys Glu Pro Ile Pro Ala Gly His Val Lys Lys Lys Lys Ala275 280 285Pro Ser Gly Glu Ser Val Leu Glu Val Ser Ser Leu Ser Phe Ala Arg290 295 300Gly Gln Gln Ala Ile Phe Lys Asp Ile Ser Phe Ser Leu Arg Glu Gly305 310 315 320Ser Leu Thr Ala Leu Val Gly Pro Asn Gly Thr Gly Lys Ser Thr Leu325 330 335Leu Ser Val Leu Ala Ser Leu Met Lys Pro Gln Ser Gly Lys Ile Leu340 345 350Leu Tyr Asp Gln Pro Leu Gln Lys Tyr Lys Glu Lys Glu Leu Arg Lys355 360 365Arg Met Gly Phe Val Phe Gln Asn Pro Glu His Gln Phe Val Thr Asp370 375 380Thr Val Tyr Asp Glu Leu Leu Phe Gly Gln Iys Ala Asn Ala Glu Thr385 390 395 400Glu Lys Lys Ala Gln His Leu Leu Gln Arg Phe Gly Leu Ala His Leu405 410 415Ala Asp His His Pro Phe Ala Ile Ser Gln Gly Gln Lys Arg Arg Leu420 425 430
Ser Val Ala Thr Met Leu Met His Asp Val Lys Val Leu Leu Leu Asp435 440 445Glu Pro Thr Phe Gly Gln Asp Ala Arg Thr Ala Ala Glu Cys Met Glu450 455 460Met Ile Gln Arg Ile Lys Ala Glu Gly Thr Ala Val Leu Met Ile Thr465 470 475 480Gln Gly Tyr Gly Ala Ser Leu Phe Val Cys485 490
權(quán)利要求
1.一種微生物，選自由Bacillaceae、Lactobacillaceae、Streptococcaceae、Corynebacteriaceae和Brevibacteriaceae所構(gòu)成的組，其中，所述微生物含有能對(duì)硫胺生產(chǎn)進(jìn)行去調(diào)節(jié)并能使得硫胺產(chǎn)物釋放到培養(yǎng)基中的突變。
2.如權(quán)利要求1所述的微生物，其中，所述突變選自由ΔthiL、tx1、tx26或其組合所構(gòu)成的組。
3.如權(quán)利要求1或2所述的微生物，其選自由Bacillus、Lactobacillus、Lactococcus、Corynebacterium和Brevibacterium所構(gòu)成的組。
4.如權(quán)利要求3所述的微生物，其是Bacillus subtilis細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求4所述的微生物，其是B.subtilis TH95(ATCC PTA-5221)。
6.如權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的微生物，還包含DNA盒，所述DNA盒含有選自由下述序列構(gòu)成的組的多核苷酸序列(a)編碼thiA基因產(chǎn)物的多核苷酸序列，其中，所述DNA盒中含有所述多核苷酸序列的一個(gè)或多個(gè)拷貝；(b)編碼來自thiKC操縱子的基因產(chǎn)物的多核苷酸序列，其中，所述DNA盒中含有所述多核苷酸序列的一個(gè)或多個(gè)拷貝；以及(c)編碼tenAI-thiOSGFD操縱子的基因產(chǎn)物的多核苷酸序列，其中，該多核苷酸序列受強(qiáng)組成型啟動(dòng)子可操作地控制。
7.如權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的微生物，還包含(a)DNA盒，其中含有編碼tenAI-thiOSGFD操縱子的基因產(chǎn)物的多核苷酸序列，和(b)DNA盒，其中含有編碼thiA基因產(chǎn)物的多核苷酸序列的至少一個(gè)拷貝，該多核苷酸序列受強(qiáng)組成型啟動(dòng)子可操作地控制。
8.如權(quán)利要求6或7所述的微生物，選自由B.subtilis TH116(ATCCPTA5224)、TH115(ATCC PTA-5223)、TH404(DSM 16333)和TH405(DSM 16334)所構(gòu)成的組。
9.如權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的微生物，還包含對(duì)B.substilis的嘌呤操縱子的表達(dá)進(jìn)行去調(diào)節(jié)的第一種突變和阻止5-氨基咪唑核糖酸(AIR)向羧基氨基咪唑核糖酸(CAIR)轉(zhuǎn)化的第二種突變。
10.如權(quán)利要求9所述的微生物，其中，所述第一種突變包含pur操縱子的引導(dǎo)區(qū)域內(nèi)的突變，所述第二種突變包含編碼磷酸核糖氨基咪唑羧化酶I的purE基因內(nèi)部的突變。
11.如權(quán)利要求10所述的微生物，是B.subtilis TH101(ATCCPTA5222)。
12.一種生產(chǎn)硫胺化合物的方法，所述方法包括(a)在合適的培養(yǎng)基中，對(duì)根據(jù)權(quán)利要求1至11中任意一項(xiàng)所述的、過量產(chǎn)生硫胺產(chǎn)物到培養(yǎng)基中的微生物進(jìn)行培養(yǎng)；以及(b)回收所述的硫胺產(chǎn)物。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，還包括在選自如下物質(zhì)構(gòu)成的組的組分存在的情況下，對(duì)所述微生物進(jìn)行培養(yǎng)(a)硫胺前體，(b)硫胺前體和嘌呤源，(c)HET途徑的前體，(d)HMP途徑的前體，以及(e)HMP的衍生物。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述的硫胺前體選自由4-氨基-5-羥甲基-2-甲基嘧啶(HMP)和5-(2-羥乙基)-4-甲基噻唑(HET)和其組合所構(gòu)成的組。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的硫胺前體是HET，所述的嘌呤源是黃嘌呤。
16.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的HET途徑的前體選自由甘氨酸、半胱氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸和其組合所構(gòu)成的組。
17.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的HMP的衍生物是4-氨基-2-甲基-5-嘧啶甲烷胺(Grewe二胺)。
18.一種經(jīng)過分離的多核苷酸序列，所述序列包含tx1突變。
19.如權(quán)利要求18所述的經(jīng)過分離的多核苷酸序列，其中所述突變使得第116位氨基酸殘基上的苯丙氨酸到亮氨酸的取代。
20.如權(quán)利要求18或19所述的經(jīng)過分離的多核苷酸序列，其中所述序列是SEQ ID NO31或能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO31雜交的多核苷酸序列，并且，當(dāng)存在于微生物中時(shí)，所述序列能導(dǎo)致硫胺生產(chǎn)被去調(diào)節(jié)。
21.一種經(jīng)過分離的多核苷酸序列，其中包含與ΔyufR∷Tn917具有70％的連鎖性的第一種突變(tx26-1)，以及與ΩmotA∷Tn917具有59％連鎖性的第二種突變(tx26-2)，其中，生產(chǎn)硫胺的微生物中同時(shí)存在所述的兩種突變會(huì)導(dǎo)致硫胺生產(chǎn)被去調(diào)節(jié)。
22.如權(quán)利要求21所述的經(jīng)過分離的多核苷酸序列，其中所述tx26-1突變是被一種多核苷酸序列編碼的，所述多核苷酸序列是SEQ ID NO33或能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO33雜交的多核苷酸序列；并且，其中所述tx26-2突變是被一種多核苷酸序列編碼的，所述多核苷酸序列是SEQID NO36或能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO36雜交的多核苷酸序列，并且，當(dāng)存在于微生物中時(shí)，所述序列能導(dǎo)致硫胺生產(chǎn)被去調(diào)節(jié)。
23.一種DNA盒，其包含如權(quán)利要求18至22中任意一項(xiàng)所述的多核苷酸中的一條或多條。
24.一種微生物，其中含有如權(quán)利要求23所述的DNA盒。
25.一種在來自病患的臨床樣品中檢測(cè)病原微生物的方法，所述方法包括(a)測(cè)定樣品中是否存在Gram+微生物，(b)測(cè)定所述微生物是否含有yloS直向同源物，以及(c)測(cè)定所述微生物是否含有thiL直向同源物，其中，在Gram+微生物中存在yloS直向同源物，并且不存在thiL直向同源物就表示該微生物是病原性的。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述微生物選自由Listeria、Staphylococcus、Clostridium、Enterococcus和Streptococcus所構(gòu)成的組。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述微生物選自由Listeriamonocytogenes、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、Clostridium tetani、Clostridium perfringens、Enterococcus sp.、Streptococcusagalactiae、Streptococcus pyogenes和Streptococcus pneumoniae所構(gòu)成的組。
28.一種試驗(yàn)方法，用于鑒定抗生素，所述方法包括(a)將包含YloS蛋白質(zhì)的試驗(yàn)組合物與測(cè)試化合物接觸，以及(b)測(cè)定測(cè)試化合物是否抑制了YloS蛋白質(zhì)的活性，其中，基于所述化合物抑制YloS蛋白質(zhì)活性的能力將所述化合物鑒定為抗生素。
29.如權(quán)利要求28所述的試驗(yàn)方法，其中，所述試驗(yàn)組合物中包含的所述YloS蛋白質(zhì)選自由如下物質(zhì)所構(gòu)成的組經(jīng)純化的YloS蛋白質(zhì)、經(jīng)部分純化的YloS蛋白質(zhì)以及來自生產(chǎn)YloS蛋白質(zhì)的細(xì)胞的粗制細(xì)胞提取物。
30.如權(quán)利要求28或29所述的試驗(yàn)方法，其中所述的YloS蛋白質(zhì)由來自病原微生物的多核苷酸編碼，所述病原微生物選自由Listeria、Staphylococcus、Clostridium、Enterococcus和Streptococcus所構(gòu)成的組。
31.如權(quán)利要求30所述的試驗(yàn)方法，其中所述微生物選自由Listeriamonocytogenes、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、Clostridium tetani、Clostridium perfringens、Enterococcus sp.、Streptococcusagalactiae、Streptococcus pyogenes和Streptococcus pneumoniae所構(gòu)成的組。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)硫胺化合物的方法，其中使用了含有突變的微生物，所述突變使得該微生物得以過量產(chǎn)生硫胺并將其釋放到培養(yǎng)基中。本發(fā)明還提供了生物學(xué)上純的微生物培養(yǎng)物，以及經(jīng)過分離的含有突變的多核苷酸。此外，本發(fā)明還提供了在臨床樣品中探測(cè)病原微生物的方法、用于鑒定抗生素的試驗(yàn)以及通過上述試驗(yàn)鑒定出來的抗生素。
文檔編號(hào)C12Q1/18GK1894424SQ200480015297
公開日2007年1月10日 申請(qǐng)日期2004年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月2日
發(fā)明者馬卡斯·剛特·戈瑟, 約翰·B·伯金斯, 格赫斯蘭·舍恩斯 申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司