專利名稱：基因組比較雜交的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因組比較雜交的方法以及適合于基因組比較雜交的與固體基質(zhì)連接的核酸。
背景技術(shù)：
染色體異常往往與遺傳紊亂、變性疾病和癌癥有關(guān)。染色體異?？捎袔追N類型，包括額外的單個染色體或缺少的單個染色體、額外的部分染色體或缺少的部分染色體、斷裂和染色體重排。染色體重排包括易位(從一個染色體上的一片轉(zhuǎn)移至另一個染色體上)、雙著絲粒(具有兩個著絲粒的染色體)、倒位(染色體片段極性的反轉(zhuǎn))、插入、擴增和缺失。
許多原因使得檢測胞內(nèi)染色體的異常是重要的，不限于檢產(chǎn)前染色體異常和植入前的遺傳診斷，以及測定一些癌癥的核型。
產(chǎn)前診斷涉及對胎兒物質(zhì)的遺傳測試。這通常包括取出圍繞胎兒的羊水并分析羊水中細胞的染色體異常情況。產(chǎn)前診斷對于檢測具有明顯的染色體錯誤的胎兒是重要的。可檢測到的染色體異常的頻率約是每250人出生中僅有一人，而涉及染色體物質(zhì)缺失或添加的異常往往導(dǎo)致胎兒的死亡或嚴重的智力或身體缺陷。例如，染色體21具有三份拷貝而非通常的兩份拷貝或染色體21上亞區(qū)的部分復(fù)制會導(dǎo)致唐氏綜合癥。
植入前異常診斷(PGD)涉及植入前測試胚胎或卵(卵母細胞)的遺傳物質(zhì)。該方法通常涉及從體外受精的胚胎中取出一個或多個細胞并分析來確定胚胎是否適合于植入。在染色體異常是衍生自母體的情況中，也可取出卵母細胞的極體并檢測到存在染色體異常。
植入前遺傳診斷染色體異常對于檢測適合于植入的胚胎或卵母細胞是重要的。早期人類胚胎有很高頻率的染色體錯誤，包括非整倍性、多倍性和鑲嵌現(xiàn)象，并且這些染色體錯誤可能會造成體外受精胚胎植入顯著的失敗率。此外，當胚胎或卵母細胞可能含有遺傳自雙親的已知的染色體異常時，也可進行植入前診斷來選擇不具有已知的染色體異常的胚胎或卵母細胞。
全染色體或染色體片段的拷貝的缺失或增殖也經(jīng)常發(fā)生于癌性細胞中，在許多情況中這些染色體異常有助于細胞獲得癌性表型。測定這種染色體異常不僅對于了解一些細胞如何從非癌性階段發(fā)展到癌性階段的遺傳基礎(chǔ)是重要的，而且在一些情況下對診斷和治療具體的癌癥提供有用的信息。
細胞遺傳或熒光原位雜交法(FISH)技術(shù)常規(guī)用于檢測染色體異常。然而，現(xiàn)在基因組比較雜交(CGH)提供了一種克服常規(guī)細胞遺傳和FISH方法的許多局限性的強有力方法。CGH涉及用一種熒光染料標記的參考核酸群和用第二種熒光染料標記的樣品核酸群與參考基因組(例如人中期染色體擴散)的全部或部分進行比較性、多染料的雜交。對參考基因組中各位置得到的熒光強度的比較確定了樣品群中染色體序列的拷貝數(shù)。
雖然CGH改進了常規(guī)的細胞遺傳和FISH技術(shù)，它仍有許多與CGH相關(guān)的缺陷，包括進行分析所需時間的長度。例如，完成具有中期擴散的標準CGH至少需要72小時，并且如果在取自胚胎的單細胞上進行PGD，然后胚胎在植入前必須基序冷凍保存以提供充足的時間來完成該過程。
本發(fā)明涉及鑒定一種進行基因組比較雜交的改進方法以及適合于基因組比較雜交的核酸陣列。
本說明書出于描述本發(fā)明各種方面的目的引用一些參考文獻。然而，說明書中引用的任何參考文獻均不構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)。特別要理解的是，文中參考的任何文獻在澳大利亞或任何其它國家均不構(gòu)成本領(lǐng)域公知知識的一部分。對參考文獻的討論表明了其作者宣稱的內(nèi)容，申請人保留質(zhì)疑文中所引用的任何文獻的精確性和相關(guān)性的權(quán)利。
發(fā)明概述本發(fā)明提供將具有第一個核型的細胞的至少一條染色體或其一部分與具有第二個核型的細胞的對應(yīng)染色體或其一部分進行比較的方法，所述的方法包括以下步驟(a)從分離的染色體或分離的染色體的一部分擴增DNA；(b)將擴增的DNA與固體基質(zhì)相連；(c)從具有第一核型的一個或多個細胞擴增DNA和從具有第二核型的一個或多個細胞擴增DNA；(d)用第一標記來標記擴增自具有第一核型的一個或多個細胞的DNA以及用第二標記來標記擴增自具有第二核型的一個或多個細胞的DNA，其中第一種和第二標記有可檢測的不同；(e)將來自具有一種核型的一個或多個細胞的擴增且標記的DNA與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交，并將來自具有第二核型的一個或多個細胞的擴增且標記的DNA與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交；和(f)比較與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交的第一種和第二標記的相對量。
本發(fā)明也提供一種在檢測具有未知核型的細胞中染色體異常的方法，所述的方法包括以下步驟(a)從分離的染色體或分離的染色體的一部分擴增DNA；(b)將擴增的DNA與固體基質(zhì)相連；(c)從具有未知核型的一個或多個細胞擴增DNA和從具有參考核型的一個或多個細胞擴增DNA；(d)用第一標記來標記具有未知核型的一個或多個細胞的擴增DNA以及用第二標記來標記具有參考核型的一個或多個細胞的擴增DNA，其中第一種和第二標記有可檢測的不同；(e)將來自具有未知核型的一個或多個細胞的擴增且標記的DNA與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交，并將來自具有參考核型的一個或多個細胞的擴增且標記的DNA與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交；和(f)通過比較與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交的第一標記的的相對量和與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交的第二標記的量來檢測具有未知核型的細胞內(nèi)染色體異常的存在。
本發(fā)明也提供一種與固體基質(zhì)相連的核酸，其中所述核酸衍生自分離的染色體或分離的染色體的一部分并且所述的核酸排除了重復(fù)序列。
本發(fā)明也提供一種與固體基質(zhì)相連的核酸陣列，其中所述陣列中的每個核酸衍生自分離的染色體或分離的染色體的一部分并且每個核酸排除了重復(fù)序列。
本發(fā)明也提供一種與固體基質(zhì)相連的核酸，其中所述核酸衍生自分離的染色體或分離的染色體的一部分的隨機引物擴增，并且所述的核酸排除了重復(fù)序列、非染色體序列或由于擴增而超表現(xiàn)的序列中的一種或多種。
本發(fā)明也提供一種與固體基質(zhì)相連的核酸陣列，其中所述陣列中的每個核酸衍生自分離的染色體或分離的染色體的一部分的隨機引物擴增，并且每個核酸排了重復(fù)序列、非染色體序列或由于染色體或其一部分擴增而超表現(xiàn)的序列中的一種或多種。
本發(fā)明也提供一種衍生自分離染色體或分離染色體的一部分的隨機引物擴增的核酸，其中所述核酸排除了重復(fù)序列。
本發(fā)明起因于在單一的羊水細胞和淋巴細胞中檢測三體性13和18的研究。尤其是，驚人地發(fā)現(xiàn)，通過用與固體基質(zhì)相連的分離的染色體或其一部分的隨機引物擴增的產(chǎn)物取代通常使用的中期擴散可顯著提高在單細胞中用基因組比較雜交檢測這種三體性。以這種方式進行的基因組比較雜交需要的時間比使用中期擴散基序常規(guī)方法需要的時間少(總共約30小時)。
說明書中使用的各種術(shù)語具有可被技術(shù)人員很好地理解的意義。然而，為了便于參考，現(xiàn)定義一些術(shù)語。
說明書中使用的術(shù)語“細胞”應(yīng)理解為指一種體細胞、一種生殖細胞、一種任何倍性的細胞或其中具有一種或多種染色體(或一種或多種染色體的一部分)的任何細胞衍生體。細胞衍生體的例子包括與未受精卵母細胞相關(guān)的極體、在卵母細胞被精子受精時被卵母細胞逐出的極體、分離自細胞的核或核的一部分、線粒體或葉綠體。
文中使用的術(shù)語“核型”應(yīng)理解為指細胞的染色體構(gòu)成，其在單一種類的個體之間有變化。
在這方面，術(shù)語“未知的核型”應(yīng)理解為指細胞內(nèi)的一種或多種染色體的核型是未知的。術(shù)語“參考核型”應(yīng)理解為指另一種細胞的核型要靠這種核型來測試的一種細胞的核型。具有參考核型的細胞可具有一種已知的核型(例如一種常規(guī)核型或一種具體的染色體的已知的缺失或增殖)或可具有一種或多種染色體的未知核型。具有未知核型的細胞是來自胎兒、胚胎、卵母細胞或癌癥細胞，而具有參考核型的細胞是具有常規(guī)核型的相同類型的細胞或類似的細胞。
說明書中使用的術(shù)語“分離的染色體或分離的染色體的一部分”應(yīng)理解為指一種分離的染色體或一種分離的染色體的任何部分。在這方面，染色體的一部分應(yīng)理解為包括通過，例如顯微切割或流式細胞術(shù)或含有染色體(基因組)DNA的任何克隆來分離的染色體的一部分。這種克隆的例子包括含有基因組DNA的BAC、YAC和P1克隆，或者具有基因組DNA克隆進合適載體的任何其它克隆。
在這方面，術(shù)語“染色體”也應(yīng)理解為指存在于任何倍性(例如單倍體、二倍體或多倍體)的細胞中的染色體，包括性染色體、常染色體、線粒體染色體、葉綠體染色體或附加體。
說明書中使用的術(shù)語“擴增”或其變體應(yīng)理解為指核酸序列的額外拷貝的生產(chǎn)。例如，可使用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)(基本上如Dieffenbach，C.W.和G.S.Dveksler所述，(1995).《PCR引物，一本實驗室手冊》(PCR Primer，a LaboratoryManual)，冷泉港出版社，Plainview，紐約)或通過其它擴增方法(例如在環(huán)形模板上進行滾環(huán)擴增，如Fire，A.和Xu，S-Q.所述，(1995)，Proc.Natl.Acad.Sci924641-4645)實現(xiàn)擴增。
在這方面，術(shù)語“隨機引物擴增”應(yīng)理解為指利用一種或多種引物的擴增，該引物基本上導(dǎo)致整個目標的擴增。例如，可使用一種或多種引物實現(xiàn)隨機擴增，所述引物包括一種或多種隨機核苷酸的序列、長度足夠使引物在選擇的條件下與靶核酸在隨機位置雜交并用作聚合酶延長的引物的隨機核苷酸序列。例如，引物可是包括隨機序列的六個或多個毗鄰核苷酸的延伸段的引物。
此外，可用固定序列的一種或多種引物實現(xiàn)隨機擴增，但為能隨機擴增目標，擴增反應(yīng)的嚴謹性要足夠低，特別是在擴增過程的早期循環(huán)中。
此外，將會意識到從一種或多種細胞中擴增DNA不僅包括擴增一種或多種細胞的整個染色體內(nèi)含物，還包括擴增衍生自一種或多種細胞的分離的染色體或其任何部分。例如，擴增用于分析的DNA可通過顯微切割或流式細胞術(shù)分離的單一染色體、通過顯微切割分離的染色體的一部分或作為基因組DNA的克隆片段的染色體的一部分。
說明書中使用的與擴增的DNA相關(guān)的術(shù)語“連接”或其變體應(yīng)理解為指任何形式的固定到固體基質(zhì)上的擴增DNA，包括被動吸收到固體基質(zhì)上、通過合適的化學(xué)基團使DNA與固體基質(zhì)共價連接或使用特定的彼此具有高親和力的化學(xué)基團將DNA固定到固體基質(zhì)上(例如生物素和鏈霉抗生物素蛋白)。
說明書中使用的術(shù)語“固體基質(zhì)”應(yīng)理解為指能使核酸空間固定到支持物上并使核酸在雜交過程中在支持物上保持固定的任何固體支持物。固體支持物的例子包括玻璃、尼龍或其它類型的膜、過濾器和芯片。
在這方面，應(yīng)理解的是該核酸無需永久固定在支持物上，并且如果需要該核酸可被固定在支持物上，然后在選擇的條件下從支持物上移走核酸。
說明書中使用的術(shù)語“染色體異常”應(yīng)理解為指可使用基因組比較雜交來雜交檢測的部分染色體的任何變化或改變。
說明書中使用的術(shù)語“生殖細胞”應(yīng)理解為指一種生殖的細胞、一種配子或可發(fā)育為生殖細胞的細胞。例如，生殖細胞包括精母細胞或卵母細胞。
說明書中使用的術(shù)語“重復(fù)序列”應(yīng)理解為指基因組中存在多于一份拷貝的核酸中存在的任何序列。重復(fù)序列的每份拷貝與所有其它的拷貝無需相同，只要序列充分相似使得在使用雜交條件下相同的探針核酸片段能與每份拷貝形成穩(wěn)定的雜交體。重復(fù)序列的例子包括簡單重復(fù)的DNA(例如，Alu或Kpn元件)、衛(wèi)星重復(fù)序列、小衛(wèi)星重復(fù)序列、染色體特異的重復(fù)序列、微衛(wèi)星重復(fù)序列、重復(fù)基因(例如，rRNA基因)、衍生自轉(zhuǎn)座元件的序列(例如，具有DNA或RNA中間體的轉(zhuǎn)座子)、衍生自病毒(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒)的多拷貝的元件、與著絲?；蚨肆Ｏ嚓P(guān)的重復(fù)序列或與異染色質(zhì)相關(guān)的重復(fù)序列。
說明書中使用的術(shù)語“核酸”應(yīng)理解為指一種單鏈或雙鏈形式的、由脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸組成的多核苷酸。
說明書中使用的與核酸相關(guān)的術(shù)語“分離的”應(yīng)理解為指從至少一種其它成分(例如，核酸或多肽)分離的核酸，該成分在其天然資源中與所述的核酸一起存在。
說明書中使用的術(shù)語“非染色體序列”應(yīng)理解為指核酸樣品中的任何序列，該序列一般不出現(xiàn)在核酸樣品的基因組的核苷酸序列中或不出現(xiàn)在一種或多種染色體或其一部分的核苷酸序列中。這種非染色體序列的例子包括衍生自載體或質(zhì)粒的序列、或因制備而出現(xiàn)在核酸樣品中的污染序列，例如細菌(例如，大腸桿菌)的序列。
說明書中使用的術(shù)語“由于擴增而超表現(xiàn)的序列”或“超表現(xiàn)序列”應(yīng)理解為指相比于其它正常出現(xiàn)在目標中的序列，那些在目標擴增后出現(xiàn)的、被不成比例地擴增的序列。
附圖簡述

圖1顯示了如實施例2所述的人染色體(常染色體1-22；性染色體X、Y)的再擴增DNA文庫的電泳。也顯示了大小標記(λHindll，Puc19 Hpall)。
圖2顯示了如實施例3所述的人染色體的再擴增DNA文庫的FISH結(jié)果。使用來自正常男性外周血的淋巴細胞的中期染色體擴散進行。使用SpectrumGreen-dUTP或SpectrumRed-dUTP通過DOP-PCR擴增來標記DNA探針。除了染色體21的DNA文庫信號微弱外，所有其它均勻地上其整個靶染色體或q臂。
圖3顯示了如實施例4所述使用加載的384孔板描述預(yù)期的DNA陣列樣式。
圖4顯示了如實施例4(ii)生產(chǎn)第二代陣列中所述的在大小選擇之前、期間或之后再擴增的DNA文庫的電泳結(jié)果。
圖5顯示了如實施例10所述的47、XX、+13(綠)細胞對46、XY(紅)細胞的分析數(shù)據(jù)的圖像和圖示。
圖6顯示了如實施例10所述的47、XY、+18細胞對46、XX細胞的分析數(shù)據(jù)的圖像和圖示。
圖7是如實施例11所述的代表實驗的圖像之一。
圖8顯示了如實施例12所述的用核型47、XY、+18對46、XX單細胞進行的分析實驗的圖像。
圖9顯示了分離成纖維細胞的方法。成纖維細胞懸浮液通過顯微鏡載玻片上建立的4個池稀釋到在1×PCR緩沖液#3池中僅有約100個細胞的點。這100個細胞在該池內(nèi)洗滌數(shù)次，然后轉(zhuǎn)移至0.5ml無菌的PCR管中。從#3池中吸出1×PCR緩沖液(＜0.3μl)并用作陰性對照。
圖10中上面一幅顯示了100個成纖維細胞(47、XY、+18、Cy3)對正常男性基因組DNA(46、XY、Cy5)的陣列CGH實驗的結(jié)果。圖10中下面一幅顯示了100個成纖維細胞(47、XY、+18、Cy3)對5到10個單一正常男性細胞的合并混合物(46、XY、Cy5)的陣列CGH實驗的結(jié)果。
圖11中上面一幅顯示了DOP-PCR擴增的Cot-1 DNA的瓊脂糖電泳。圖11中下面一幅顯示了用Cy3-dUTP標記的單一女性細胞對用Cy5-dUTP標記的多于5個單一男性細胞的合并混合物的陣列CGH實驗的結(jié)果，該實驗使用140μl的DOP-PCR擴增的Cot-1 DNA代替70μg市售的Cot-1 DNA(Invitrogen)。
圖12顯示了從IVF形成的卵裂階段胚胎的單一裂球產(chǎn)生的Cy3標記的DOP-PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。三個供研究用的冷凍胚胎中的每一個均存在四個裂球并且所有的四個裂球解離導(dǎo)致總共12個分離的單一裂球。預(yù)擴增每個細胞的DNA，然后通過DOP-PCR用Cy3標記。每個樣品的起點顯示于每條泳道的上面。DNA標記是SPP-1/EcoR1(M1)和pUC19/Hpall(M2)。要注意的是，每個標記的產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上得到從300bp到2,500bp的成片條帶并在約450bp和600bp處含有兩個特異的條帶。
圖13的上面一幅顯示了DOP-PCR擴增的BAC的DNA的瓊脂糖電泳。樣品的起點顯示在每條泳道的上面1(RP-11-265k23)、2(RP-11-849)、3(RP-11-354m20)、4(RP-11-280F22)、5(RP-11-113m14)、6(RP-11-70E19)、7(RP-11-10P15)和8(RP-11-506P9)。DNA標記是SPP-1/EcoRI(M1)和pUC19/Hpall(M2)。圖13的下面一幅顯示了DOP-PCR擴增的除去重復(fù)序列的BAC的DNA的瓊脂糖電泳。樣品的起點顯示在每條泳道的上面1(RP-11-265k23)和2(RP-11-354m20m、RP-11-280F22、RP-11-113m14、RP-11-70E19、RP-11-10P15和RP-11-506P9的混合物)。DNA標記是SPP-1/EcoR1(M1)和pUC 19/Hpall(M2)。
圖14的上面一幅顯示了擴展的長模板PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳。樣品的起點顯示在每條泳道的上面。DNA標記是SPP-1/EcoR1(M1)。圖14的下面一幅顯示了使用擴展的長模板PCR擴增產(chǎn)物作為模板的DOP-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳。DYS基因座的起點顯示在每條泳道的上面。DNA標記是SPP-1/EcoR1(M1)和pUC19/Hpall(M2)。
圖15的上面一幅顯示了Cy3標記的女性單細胞SEP-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳。使用四種不同的條件進行PCR擴增并且四種單細胞分別在每種條件下擴增。每個樣品的起點顯示在每條泳道的上面。DNA標記是SPP-1/EcoR1(M1)和pUC19/Hpall(M2)。要注意的是，每個標記的產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上得到從300bp到2,500bp的成片條帶并在約450bp和600bp處含有兩個特異的條帶。圖15的下面一幅顯示了Cy5標記的男性單細胞SEP-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳。使用四種不同的條件(細節(jié)見上文)進行PCR擴增并且四種單細胞分別在每種條件下擴增。每個樣品的起點顯示在每條泳道的上面。DNA標記是SPP-1/EcoR1(M1)和pUC19/Hpall(M2)。要注意的是，每個標記的產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上得到從300bp到2,500bp的成片條帶。
發(fā)明詳述如上所述，本發(fā)明的一個實施形式是提供將具有第一個核型的細胞的至少一條染色體或其一部分與具有第二個核型的細胞的對應(yīng)染色體或其一部分進行比較的方法，所述的方法包括以下步驟(a)從分離的染色體或分離的染色體的一部分擴增DNA；(b)將擴增的DNA與固體基質(zhì)相連；(c)從具有第一核型的一個或多個細胞擴增DNA和從具有第二核型的一個或多個細胞擴增DNA；(d)用第一標記來標記具有第一核型的一個或多個細胞的擴增DNA以及用第二標記來標記具有第二核型的一個或多個細胞的擴增DNA，其中第一種和第二標記有可檢測的不同；(e)將來自具有第一核型的一個或多個細胞的擴增且標記的DNA與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交，并將來自具有第二核型的一個或多個細胞的擴增且標記的DNA與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交；和
(f)比較與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交的第一種和第二標記的相對量。
本發(fā)明的這種實施形式使得具有第一核型的細胞中的一種或多種染色體或一種或多種染色體的區(qū)域的拷貝數(shù)可與具有第二核型的細胞中的對應(yīng)的染色體或區(qū)域相比。這樣，本發(fā)明的這種實施形式可用于，例如產(chǎn)前遺傳診斷、植入前遺傳診斷、性別測定或選擇或測定癌性或其它體細胞的核型。
本發(fā)明的這種實施形式的方法優(yōu)選用于胚胎或卵母細胞的植入前診斷染色體異常、或產(chǎn)前診斷胎兒的染色體異常。
具有第一核型的細胞優(yōu)選是未知核型的，而具有第二核型的細胞優(yōu)選是已知核型的。例如，具有第一核型的細胞在特定的染色體位置可具有未知的染色體異常，而具有第二核型的細胞在對應(yīng)的染色體位置可具有已知的正常染色體。
在這方面，本發(fā)明的這種實施形式在檢測細胞內(nèi)總的染色體區(qū)別(例如缺失、復(fù)制或擴增)中是有用的。可用本發(fā)明檢測的病癥的例子包括三體性21、13和18，并且也可用于檢測缺少染色體，例如特納綜合癥(45，XO)。
應(yīng)該明白的是，本發(fā)明可用于比較具有第一核型的細胞和具有第二核型的細胞中的所有染色體。然而，依賴連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA，本發(fā)明也可用于在細胞之間比較一種或多種具體染色體的部分。
待比較的染色體可是有任何倍性(單倍體、二倍體或多倍體)的細胞中的任何染色體，包括性染色體、常染色體、線粒體染色體、葉綠體染色體或附加體。染色體優(yōu)選性染色體或常染色體。最優(yōu)選的染色體是常染色體。
類似地，待比較的分離染色體的一部分可是在有任何倍性(單倍體、二倍體或多倍體)的細胞中存在的任何染色體的一部分，包括性染色體、常染色體、線粒體染色體、葉綠體染色體或附加體。染色體的一部分優(yōu)選性染色體或常染色體的一部分。染色體的一部分最優(yōu)選常染色體的一部分。
具有第一核型的細胞可是任何細胞，只要其核型(第一核型)與另一種細胞的核型(第二核型)進行比較。具有第一核型的細胞可是真核細胞或原核細胞。優(yōu)選的細胞是真核細胞。更優(yōu)選的細胞是動物或人的細胞。最優(yōu)選的細胞是人的細胞。
具有第一核型的細胞優(yōu)選胎兒細胞、衍生自胚胎的細胞、生殖細胞、癌性細胞或任何其它類型的體細胞，該體細胞具有與其它細胞的核型相比較的核型。具有第一核型的細胞更優(yōu)選胎兒細胞、胚胎細胞(包括裂球)或生殖細胞。最優(yōu)選的細胞是胚胎細胞或卵母細胞。
胎兒細胞的例子包括取自圍繞胎兒的羊水的胎兒細胞、取自母體循環(huán)的胎兒血細胞或取自母親生殖道(例如，宮頸或陰道灌洗)的胎兒細胞。在這方面，胎兒血細胞不同于成熟的血細胞，它是有核的并可從母體循環(huán)中分離。
就胚胎細胞而言，可從胚胎中取出少量的細胞(通常是一個或兩個細胞)。在該方法中，通過卵裂階段胚胎活檢取出胚胎中一個或多個細胞。該方法一般在發(fā)育的第三天，當胚胎處于6-8個細胞階段進行?；顧z由兩個階段組成。在此時，首先一般用酸性臺氏液或非接觸性激光在圍繞胚胎的透明帶中開個孔?？滓坏╅_好，就可從胚胎中取出細胞。
就生殖細胞(例如卵母細胞或精細胞)而言，生殖細胞可直接分析。此外，就篩選母體異常而言，可從卵母細胞分離極體。
就癌性細胞或任何其它體細胞而言，可通過合適的本領(lǐng)域已知方法從受試者獲得一個或多個細胞，例如細胞的直接活檢或從血液中分離。
在這方面，更精確地測定核型無需大量細胞，并且在某些情況中，優(yōu)選分離相對小量(例如1到20個細胞)的細胞。
具有第二核型的細胞可是任何細胞，只要其核型是要與具有第一核型的細胞的核型進行比較。具有第二核型的細胞優(yōu)選與具有第一核型的細胞的類型相同或類似。
在本發(fā)明的各種實施形式中，分離的染色體可是通過本領(lǐng)域已知的方法基本上從其它染色體純化得到的任何染色體。例如，可通過如Meltzer等所述的顯微切割((1992)Nature Genetics124-28)分離染色體。此外，可通過如Telenius等所述的流式細胞術(shù)((1992)Genes，Chromosomes & Cancer4257-263)分離染色體。
就顯微切割而言，首先處理細胞迫使它們進入中期并用極細的針分離出完整的染色體。就流式細胞術(shù)而言，染色體可用具體的染色體染色試劑染色并通過分選和每個染色體相關(guān)的熒光程度來分離染色體。
在本發(fā)明的各種實施形式中，分離染色體的一部分可是分離的染色體的任何部分，該染色體的核型與另一個細胞中相同染色體的對應(yīng)部分比較。
染色體的一部分可通過合適的已知方法分離，包括從上述的中期染色體中顯微切割特定的染色體條帶。
此外，染色體的一部分可是通過將基因組DNA片段克隆進合適的載體分離的染色體的克隆片段。分離大的和小的基因組片段及其克隆進載體的方法基本上描述于Sambrook，J，F(xiàn)risch，E.F.和Maniais，T.《分子克隆實驗室手冊》(MolecularCloningALaboratory Manual)，第二版.冷泉港實驗室出版社，紐約，(1989)。例如，為生產(chǎn)用于克隆進載體(例如，YAC)的大基因組片段，用限制性內(nèi)切酶部分消化基因組DNA并將得到的片段克隆進載體。然后可用合適的本領(lǐng)域已知方法純化具有克隆的插入DNA的分離載體。適合用于克隆大基因組片段的載體的例子是YAC載體、BAC載體、P1載體或粘粒。
在本發(fā)明的各種實施形式中，從分離的染色體或分離的染色體的一部分擴增DNA可通過允許生產(chǎn)該DNA其它拷貝的本領(lǐng)域已知的合適方法實現(xiàn)。例如，就通過顯微切割或流式細胞術(shù)分離的完整染色體而言，或通過顯微切割分離的其一部分而言，該DNA可用基本上如Dieffenbach，C.W.和G.S.Dveksler((1995)，《PCR引物，實驗室手冊》(PCR Primer，a Laboratory Manual)，冷泉港出版社，紐約)所述的PCR技術(shù)擴增。
在這方面，如果核酸通過擴增方法生產(chǎn)，該核酸就可衍生自擴增產(chǎn)物，并且包括衍生自擴增方法、接著在擴增后經(jīng)過一次或多次處理的核酸。
就克隆進環(huán)形載體的染色體的一部分而言，擴增可通過如PCR擴增或使用如Fire，A.和Xu，S-Q所述的滾環(huán)擴增((1995)，Proc.Natl.Acad.Sci924641-4645)實現(xiàn)。
從分離的染色體或分離的染色體的一部分的擴增DNA優(yōu)選導(dǎo)致基本上整個目標的擴增。
因此，在本發(fā)明各種實施形式中，分離染色體或分離染色體的一部分的擴增優(yōu)選隨機引物擴增來實現(xiàn)基本上整個目標的擴增。
可使用一種或多種合適的引物從分離的染色體或分離的染色體其一部分擴增DNA。如上所述，優(yōu)選使用一種或多種引物導(dǎo)致分離的染色體或分離的染色體的一部分的隨機擴增。
使用的一種或多種引物優(yōu)選是包括隨機序列的一個或多個核苷酸的寡核苷酸。一種或多種引物更優(yōu)選是包括隨機序列的一個或多個毗鄰核苷酸的寡核苷酸。一種或多種引物更優(yōu)選是包括隨機序列的6個或更多毗鄰核苷酸的寡核苷酸，例如DOP引物(簡并寡核苷酸引物)。一種或多種引物最優(yōu)選是具有以下核苷酸序列的引物5′-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3′；其中NNNNNN代表簡并序列?！癗”是任何核苷酸，即N代表DNA序列中四種可能的核苷酸，分別是“A”(腺嘌呤)、“T”(胸腺嘧啶)、“C”(胞嘧啶)、“G”(鳥嘌呤)。這樣，簡并序列含有各種核苷酸序列的混合物包括在“N”位置處A、T、C和G的所有可能的組合。
如果需要，簡并序列的核苷酸序列也可偏向于特定的核苷酸組成，例如富含GC或AT。
在使用DOP引物通過顯微切割或克隆進載體而分離的染色體或染色體的一部分上進行擴增的情況下，基本上可如Telenius等(Genomics，18718-725，(1992))所述進行擴增。簡言之，在低嚴謹條件下進行循環(huán)數(shù)量少(例如，5輪)的擴增，而在較高的嚴謹條件下進行循環(huán)數(shù)量多(例如，35輪)的第二階段擴增。
此外，隨機引物擴增可通過以下步驟進行使用一個或多個固定序列的引物并在低嚴謹條件下進行循環(huán)數(shù)量少的擴增，這使得一個或多個引物在整個目標上隨機引發(fā)合成，然后在更嚴謹條件下進行通常循環(huán)數(shù)量較多的第二階段擴增。
此外，為說明可能會給實現(xiàn)基本上整個目標的隨機引物擴增帶來困難的小染色體的區(qū)域，區(qū)域特異性引物也可與允許隨機擴增的其它引物聯(lián)用。例如，對染色體21和22的區(qū)域特異的引物可與DOP引物聯(lián)用。
因此，在本發(fā)明優(yōu)選的實施形式中，從分離染色體或分離染色體的一部分擴增DNA還包括擴增特異性的染色體區(qū)域。
其它合適的用于擴增分離的染色體或分離染色體的一部分的技術(shù)包括引物延伸預(yù)擴增PCR(PEP-PCR)，這種技術(shù)基本上如Zhang等((1992)，Proc Natl.Acad.Sci895847-5851)所述進行；連接介導(dǎo)的PCR可基本上如Klein等((1999)ProcNatl.Acad.Sci964494-4499)所述進行；或alu-PCR可基本上如Nelson等((1989)Proc.Natl.Acad.Sci.866686-6690)所述進行。
就在環(huán)形載體中克隆的基因組插入體上使用滾環(huán)擴增而言，滾環(huán)擴增可在本領(lǐng)域已知的合適的條件下進行，例如Fire，A.和Xu，S-Q在(1995)，Proc.Natl.Acad.Sci924641-4645中所述。
在本發(fā)明的各種實施形式中，從分離的染色體或分離染色體的一部分擴增的DNA在與固體基質(zhì)連接之前還優(yōu)選要經(jīng)過大小選擇。與固體基質(zhì)連接的擴增DNA的大小優(yōu)選小于10kb。與固體基質(zhì)連接的擴增DNA的大小更優(yōu)選小于3kb。
大小選擇可通過本領(lǐng)域已知的合適方法進行。例如，擴增的DNA可在瓊脂糖凝膠上進行電泳，并分離大小150到3000bp的DNA。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施形式中，與固體基質(zhì)連接的核酸是分離的染色體或分離染色體的一部分的隨機引物擴增產(chǎn)物，其中核酸已經(jīng)過大小選擇。
在這種情況中，與固體基質(zhì)相連的隨機擴增DNA的體積優(yōu)選小于10kb。與固體基質(zhì)相連的隨機擴增DNA的大小更優(yōu)選小于3kb。例如，隨機擴增的DNA可在瓊脂糖凝膠上進行電泳，并分離大小150到3000bp的DNA。
在其它的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的各種實施形式中從分離的染色體或分離染色體的一部分擴增DNA排除了重復(fù)序列、非染色體序列或由于擴增而超表現(xiàn)的序列中的一種或多種。本領(lǐng)域大量的已知方法可用于排除這種序列的擴增DNA。
重復(fù)序列是要擴增的靶序列中存在于多于一份拷貝中的序列。非染色體序列是染色體或其一部分中一般不存在的序列，例如衍生自載體或質(zhì)粒的序列、或存在于要擴增的最初靶樣品中的污染序列，例如細菌的序列(例如，衍生自大腸桿菌的序列)。由于染色體擴增而超表現(xiàn)的序列指相比于其它正常出現(xiàn)在目標中的序列，那些在目標擴增后出現(xiàn)的、被不成比例地擴增的序列。
重復(fù)序列和/或非染色體序列可在擴增前或后除去。例如，可分離染色體DNA并除去重復(fù)序列和/或非染色體序列。此外，首先可用合適的引物擴增DNA，再從核酸的擴增庫中除去重復(fù)的DNA序列和/或非染色體序列。
重復(fù)序列的例子包括簡單重復(fù)的DNA(例如，Alu或Kpn元件)、衛(wèi)星重復(fù)序列、小衛(wèi)星重復(fù)序列、染色體特異性的重復(fù)序列、微衛(wèi)星重復(fù)序列、重復(fù)基因(例如，rRNA基因)、衍生自轉(zhuǎn)座元件的序列(例如，具有DNA或RNA中間體的轉(zhuǎn)座子)、衍生自病毒(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒)的多拷貝的元件、與著絲?；蚨肆Ｏ嚓P(guān)的重復(fù)序列或與異染色質(zhì)相關(guān)的重復(fù)序列。
大量本領(lǐng)域已知的方法可用于除去重復(fù)序列。例如，在許多基因組(例如人基因組)中，重復(fù)DNA的主要部分包含于一些種類的高度重復(fù)序列(例如，Alu)中。為除去這種重復(fù)序列，可使用一種封閉方法。這些方法主要基于互補核酸鏈的雜交率隨濃度增加而增加的事實。所以，如果核酸片段的混合物被變性并在允許雜交的條件下孵育，高濃度時出現(xiàn)的序列比其它序列更快變?yōu)殡p鏈。然后該雙鏈核酸可用本領(lǐng)域已知的方法直接除去這些序列而除去。
例如，單鏈和雙鏈核酸對羥基磷灰石具有不同的結(jié)合特性。這種特性提供了通常用于核酸分級的基礎(chǔ)。包含具有特定程度重復(fù)的序列的基因組DNA組分可通過以下方式獲得使基因組DNA變性、在合適的條件下使之重締合、然后用羥基磷灰石分離。這種技術(shù)描述于Britten等.，“通過重締合分析重復(fù)DNA序列”(Analysis of Repeating DNA Sequences by Reassociation)，Methods in Enzymology22363-418(1974)。
可用于排除擴增DNA的重復(fù)序列的這種序列的例子包括人Cot-1 DNA和含有DNA的Alu-重復(fù)序列。
此外，可進行與固定化核酸的反應(yīng)。例如，最小剪切的人基因組DNA與重氮纖維素等支持物結(jié)合。適當?shù)厍谐善蔚臄U增DNA與固定化DNA進行雜交至Cot值約為1到100。然后，未與固定化核酸結(jié)合的物質(zhì)可與固體基質(zhì)相連。
就從基因組克隆中排除的重復(fù)序列而言，重復(fù)序列也可從基因組DNA的克隆中排除(例如，在克隆過程中除去)，得到的排除了重復(fù)序列的克隆用于擴增。此外，在克隆擴增后可以上述方式排除重復(fù)序列。
類似地，非染色體序列可在靶序列擴增之前或之后排除?？梢院蜕鲜雠懦貜?fù)序列相似的方式，在與目標或擴增DNA的雜交反應(yīng)中過量使用非染色體序列來排除非染色體序列，或通過將非染色體序列與固體支持物相連并使用這些序列來排除這些序列的DNA。
在排除由于擴增而超表現(xiàn)的序列的情況中，這些序列可通過與上述類似的方法從靶序列中排除或在擴增后排除超表現(xiàn)序列。應(yīng)該明白的是，需要了解被超表現(xiàn)的實際序列，并且這取決于使用的引物和擴增的靶序列的性質(zhì)。
使用相同引物擴增重復(fù)序列來源從而同時排除超表現(xiàn)序列和重復(fù)序列，該引物用于從分離的染色體或分離染色體的一部分擴增DNA。然后，擴增的重復(fù)核酸可用于排除超表現(xiàn)和重復(fù)序列的擴增DNA。例如，可在Cot-1 DNA上進行DOP-PCR，并且得到的擴增產(chǎn)物用于從分離的染色體或分離染色體的一部分除去擴增的DNA。
在本發(fā)明的各種實施形式中，固體基質(zhì)是能使核酸空間固定到支持物上并使核酸在雜交期間和以后在支持物上保持固定的任何固體支持物。固體支持物的例子包括玻璃、尼龍或其它類型的膜、過濾器和芯片。
擴增的DNA可通過合適的本領(lǐng)域已知的方法與各種形式的固體基質(zhì)相連，包括被動吸附或共價連接。例如，擴增的DNA可通過以下方式經(jīng)被動吸附與玻璃基質(zhì)相連將樣品點樣在PolysineTM顯微鏡載玻片(Menzel-Glaser，德國)上，然后通過脫水、快干、通過紫外交聯(lián)固定并使用琥珀酸酐化學(xué)封閉來處理載玻片。就共價連接而言，擴增的DNA可通過本領(lǐng)域已知的合適方法與固體基質(zhì)相連。
優(yōu)選多種擴增的DNA與固體基質(zhì)相連來產(chǎn)生沉積DNA的陣列。這種陣列可以本領(lǐng)域已知的任何所需的方式生產(chǎn)，包括擴增DNA的機器人沉積。生產(chǎn)陣列的方法的例子基本上描述于美國專利5,486,452；5,830,645；5,807,552；5,800,992和5,445,934。
可在固體基質(zhì)上沉積任何適量的DNA。沉積核酸的量可從約0.05nl到5.0nl的核酸溶液，該核酸的濃度為0.15-1μg/μl。例如，就1,000DNA沉積/cm的密度而言，沉積的個體量約是0.2nl到2.0nl的1μg/ml溶液。DNA可以允許核酸沉積的任何的溶劑提供。
具有沉積DNA的陣列可以任何排列方式。例如，DNA可位于陣列的一個部分或分散在其它沉積的核酸中。優(yōu)選兩維陣列的一致性。
陣列還優(yōu)選包括各種控制核酸，例如具體表達基因或基因組序列的拷貝數(shù)已知的打點核酸。例如，可使用從細胞系中提取的具有1份或多份特定染色體拷貝的基因組DNA，或也可使用從單細胞擴增DNA的整個DOP-PCR產(chǎn)物。
有待分析的細胞數(shù)目不受具體限制，可從單個細胞(例如分離自胚胎)到大量的細胞(例如分離自組織活檢或血液)。例如，本發(fā)明的方法可應(yīng)用于對分離自胚胎或卵母細胞的極體的單細胞進行PGD，胎兒細胞的產(chǎn)前診斷或測定通過活檢分離自受試者或從血液中分離的癌性細胞或其它體細胞的核型。
在產(chǎn)前診斷的情況中，例如，有待分析的細胞的數(shù)目也不受具體限制，優(yōu)選少于500個細胞，更優(yōu)選少于400個細胞，最優(yōu)選少于100個細胞。合適的范圍是50-400個細胞。
具有第一核型的一個或多個細胞的擴增DNA優(yōu)選是從1到20個細胞擴增的DNA。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施形式中，有待分析的細胞是單細胞或少量的細胞，其范圍是2到20個細胞。
要從中提取和擴增DNA的具有第一核型的細胞數(shù)目優(yōu)選與要從中提取和擴增DNA的具有第二核型的細胞數(shù)目相同或相似。例如，在對分離自胚胎或卵母細胞的極體的單細胞進行PGD的情況中，優(yōu)選使用另一來源的單細胞作比較。
在本發(fā)明的各種實施形式中，為從細胞中獲取DNA用于擴增，可使用本領(lǐng)域已知的合適方法來裂解細胞并取得DNA。例如，用氫氧化物水溶液處理細胞，接著中和裂解細胞并使得提取的DNA直接擴增。
擴增優(yōu)選導(dǎo)致基本上整個提取的DNA的擴增。因此，DNA的擴增優(yōu)選隨機引物擴增。
因此，從具有第一核型的一個或多個細胞和具有第二核型的一個或多個細胞擴增DNA優(yōu)選隨機引物擴增。
在本發(fā)明的各種實施形式中，從細胞擴增DNA可用一個或多個合適的引物進行。如上所述，一些使用一個或多個引物可導(dǎo)致DNA的隨機擴增。
為從一個或多個細胞中擴增DNA，可用一個或多個合適的引物通過本領(lǐng)域已知的合適方法(PCR)擴增提取的DNA。
用于擴增的所述一個或多個引物優(yōu)選包括隨機序列的一個或多個核苷酸的寡核苷酸。所述的一個或多個引物更優(yōu)選包括隨機序列的一個或多個毗鄰核苷酸的寡核苷酸。所述的一個或多個引物還要優(yōu)選包括隨機序列的6個或更多毗鄰核苷酸的寡核苷酸，例如DOP引物(簡并寡核苷酸引物)。所述的一個或多個引物最優(yōu)選是具有以下核苷酸序列的引物5′-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3′；其中NNNNNN代表簡并序列。“N”是任何核苷酸，即N代表DNA序列中四種可能的核苷酸，分別是“A”(腺嘌呤)、“T”(胸腺嘧啶)、“C”(胞嘧啶)、“G”(鳥嘌呤)。這樣，簡并探針序列含有各種探針的混合物包括在“N”位置處A、T、C和G的所有可能的組合。
如果需要，簡并序列的核苷酸序列也可偏向于特定的核苷酸組成，例如富含GC或AT。
在使用DOP引物擴增的情況中，擴增基本上可如Telenius等((1992)Genomics18718-725，(1992))所述進行。簡言之，在低嚴謹條件下進行循環(huán)數(shù)量少(例如，5輪)的擴增，而在更嚴謹條件下進行循環(huán)數(shù)量較多(例如，35輪)的第二階段擴增。
此外，隨機引物擴增可通過以下步驟進行使用一個或多個固定序列的引物并在低嚴謹條件下進行循環(huán)數(shù)量較少的擴增，這使得一個或多個引物在整個目標序列上引發(fā)隨機合成，然后在更嚴謹條件下進行循環(huán)數(shù)量較多的第二階段擴增。
其它擴增提取的DNA的合適技術(shù)包括引物延伸預(yù)擴增PCR(PEP-PCR)，這種技術(shù)基本上如Zhang等((1992)，Proc Natl.Acad.Sci895847-5851)所述進行；連接介導(dǎo)PCR，該技術(shù)基本上如Klein等((1999)Proc Natl.Acad.Sci964494-4499)所述進行；或alu-PCR，該技術(shù)基本上如Nelson等((1989)Proc.Natl.Acad.Sci.866686-6690)所述進行。
擴增可在本領(lǐng)域已知的合適條件下進行。例如，為通過PCR擴增從分離自血液的單一淋巴細胞的基因組DNA，通過以下方式實現(xiàn)單細胞的裂解用裂解緩沖液(200mM KOH，20mM二硫蘇糖醇)于65℃處理10分鐘，然后用pH8.3的300mMKCl、900mM Tris-HCl中和?？上蛄呀夂椭泻腿芤褐屑尤牒线m的PCR緩沖液、Taq聚合酶并按以下步驟進行擴增95℃5分鐘的初始變性步驟；然后以94℃1分鐘、30℃1.5分鐘和72℃3分鐘(上升幅度為每4秒1℃將溫度從30℃升至72℃)為循環(huán)條件進行8輪低嚴謹擴增；然后以94℃1分鐘、30℃1.5分鐘和72℃3分鐘以及每輪循環(huán)加14秒的延伸步驟為條件進行26輪的高嚴謹擴增。然后可進行72℃10分鐘的延伸步驟來完成擴增。
從具有第一核型的一個或多個細胞提取的DNA和從具有第二核型的一個或多個細胞提取的DNA優(yōu)選用相同的引物擴增，并優(yōu)選也在相同的條件下擴增。以此種方式，擴增反應(yīng)得到的延伸產(chǎn)物的質(zhì)量與數(shù)量是可比較的。
從具有第一核型的一個或多個細胞擴增的DNA和從具有第二核型的一個或多個細胞擴增的DNA均優(yōu)選排除重復(fù)序列。排除擴增自細胞的DNA的方法如前述的從分離的染色體或分離染色體的一部分中排除重復(fù)序列的相關(guān)方法。
重復(fù)序列優(yōu)選是Cot-1序列。
也可期望將具有第一核型的細胞中的特定染色體區(qū)域或基因與具有第二核型的細胞中的相同區(qū)域或基因進行比較。
所以，可在反應(yīng)混合物中存在的其它引物中加入一種特定的引物或一組特定的引物。此外，該特定的引物或一組特定的引物也可用作僅有的引物來擴增提取的DNA。
用于擴增染色體的特定區(qū)域的引物的例子是小染色體(例如，染色體21和22)的引物。在這種情況中，優(yōu)選將這種引物加入隨機擴增基因組DNA的一組引物中，例如DOP引物。
在需要擴增特定的染色體區(qū)域、特定的基因座、或一個或多個特定的基因的情況中，針對特定區(qū)域的引物可單獨使用或與其它引物聯(lián)用，例如隨機擴增基因組DNA的DOP引物。例如，可擴增染色體區(qū)域來分析染色體異常，包括涉及各種疾病(例如地中海貧血、杜興肌營養(yǎng)不良、X-連鎖疾病(X-linked disorders)和血友病)的區(qū)域。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的方法在檢測主要的染色體異常(例如缺失和增殖)中有用，并且擴增的特定基因座需要攜帶這種異常使其可被本發(fā)明的方法檢測。
合適的擴增特定的染色體區(qū)域的引物可從已知的核苷酸序列鑒定。在擴增人的特定染色體區(qū)域的情況中，合適的引物可通過商業(yè)化的Celera核苷酸序列數(shù)據(jù)庫或來自NCBI的公開可用的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫來選擇。
例如，囊性纖維化基因(CFTR)的外顯子11可使用嵌套式PCR方法擴增。第一輪可使用以下引物5′-TGAAATAATGGAGATGCAATGTTC-3′；和5′GCACAGATTCTGAGTA ACCATAAT3′第二輪可使用以下引物5′-CAACTGTGGTAAAGCAATAGTGT-3′；和5′-TACCAAATCTGGATACTATACCAT-3′
合適的第一輪擴增條件包括來自從單細胞擴增DNA的1/10DOP-PCR混合物、50mM KCl、10mM Tris-HCl、pH8.3、100μM各種dNTP、2.5mM MgCl2和1U taq聚合酶，在具有熱閥帽(hot bonnet)的MJ Researcher PTC-100PCR儀上按以下條件進行將反應(yīng)試管置于96℃封閉并進行初始的94℃5分鐘的變性步驟，以94℃30秒、62℃45秒、72℃45秒為循環(huán)條件，共進行30輪。第二輪PCR由3μl第一輪PCR的擴增產(chǎn)物、50mM KCl、10mM Tris-HCl、pH8.3、100μM各種dNTP、2.5mMMgCl2和1U taq聚合酶組成。在具有熱閥帽(hot bonnet)的MJ Researcher PTC-100PCR儀上按以下循環(huán)條件進行以94℃30秒、52(℃45秒、72℃45秒，共進行30輪。擴增后，產(chǎn)物基本上如Hussey等((2000)，Mol.Hum.Repord.81136-1143)所述進行測序。
在本發(fā)明的各種實施形式中，可通過本領(lǐng)域已知的合適方法用合適的標記來標記擴增的基因組DNA。標記可在擴增后進行，或者可在擴增過程中進行或可作為初始擴增的一部分。
例如，擴增的基因組DNA的直接標記可通過將熒光部分連接到要引入的核苷酸上進行另幾輪PCR來實現(xiàn)。其它間接標記的方法也是本領(lǐng)域已知的。此外，擴增的DNA可按基本上如Kirchhoff等((1998).Cytometry 31163-173)所述用標記的核苷酸使DNA進行缺口平移來標記。
從具有第一核型的一個或多個細胞的擴增DNA用第一標記來標記，而從具有第二核型的一個或多個細胞的擴增DNA用第二標記來標記，第二標記在檢測時與第一標記不同。用于引入DNA并在檢測時不同的標記的例子包括SpectrumGreen-dUTP和SpectrumRed-dUTP(均來自Vysis)，或Cy3-dUTP和Cy5-dUTP。
在本發(fā)明的各種實施形式中，為使擴增并標記的DNA與連接到固體基質(zhì)上的DNA雜交，重復(fù)序列、非染色體序列或由于擴增產(chǎn)生的超表現(xiàn)序列優(yōu)選不控制信號，而且優(yōu)選從庫中排除這些序列或需要抑制其雜交的能力。
這種序列可在擴增前或擴增后排除。例如，可提取基因組DNA并排除重復(fù)序列、非染色體序列或由于擴增產(chǎn)生的超表現(xiàn)序列?；蛘撸梢允紫扔煤线m的引物擴增基因組DNA，然后從核酸的擴增庫中排除這些序列。
大量本領(lǐng)域已知的方法可用于除去這些序列，和/或使這種序列喪失雜交能力。
例如，在許多基因組(例如人基因組)中，重復(fù)DNA的主要部分包含于一些種類的高度重復(fù)序列(例如，Alu)中。為除去這種重復(fù)序列，可使用已知封閉方法。這些方法主要基于互補核酸鏈的雜交率隨濃度增加而增加的事實。所以，如果核酸片段的混合物被變性并在允許雜交的條件下孵育，高濃度時出現(xiàn)的序列比其它序列更快變?yōu)殡p鏈。然后可除去雙鏈核酸，而剩余的可用在雜交中。封閉方法一般見Sealy等的Southern分析“從雜交探針中除去重復(fù)序列”(Removal of RepeatSequences form Hybridization Probes)，Nucleic Acid Research 131905(1985))所述的內(nèi)容。
可用于排除擴增DNA的重復(fù)序列的這種序列的例子包括人Cot-1 DNA和含有DNA的Alu-重復(fù)序列。重復(fù)序列可通過本領(lǐng)域已知的方法直接除去這些序列。例如，單鏈和雙鏈核酸對羥基磷灰石具有不同的結(jié)合特性。這種特性提供了通常用于核酸分級的基礎(chǔ)。包含具有特定程度重復(fù)的序列的基因組DNA組分可通過在合適的條件下使之重締合、然后用羥基磷灰石分離來獲得。這種技術(shù)描述于Britten等.，“通過重締合分析重復(fù)DNA序列”(Analysis of Repeating DNA Sequences byReassociation)，Methods in Enzymology22363-418(1974)。
此外，可進行與固定化核酸的反應(yīng)。例如，最小剪切的人基因組DNA與重氮纖維素等支持物結(jié)合。適當?shù)厍谐善蔚臄U增基因組DNA與固定化DNA進行雜交至Cot值約為1到100。
非染色體序列或超表現(xiàn)序列可通過與上述類似的方法除去。當非染色體序列和超表現(xiàn)序列在以下情況中用于除去DNA時，載體和/或污染序列用于排除這些序列的DNA。
超表現(xiàn)序列和重復(fù)序列可通過從一個或多個細胞擴增DNA并使用相同引物擴增重復(fù)序列源來一起排除，該引物用于從一個或多個細胞擴增DNA。然后，擴增的重復(fù)核酸可用于雜交反應(yīng)。例如，可在Cot-1 DNA上進行DOP-PCR，如果存在超表現(xiàn)序列和重復(fù)序列，得到的擴增產(chǎn)物用于排除來自一個或多個細胞的擴增DNA。
在本發(fā)明的各種實施形式中，擴增和標記的DAN與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA的雜交可通過本領(lǐng)域已知的合適方法進行。具有第一核型的來自一個或多個細胞的擴增DNA與連接在固體基質(zhì)上的DNA雜交，以及具有第二核型的來自一個或多個細胞的擴增DNA與連接在固體基質(zhì)上的DNA雜交可同時進行或依次進行。
DNA在合適的條件下與連接在固體基質(zhì)上的DNA雜交。雜交條件包括緩沖液、變性劑(例如甲酰胺)、鹽添加劑和加速劑的選擇。緩沖液優(yōu)選pH約為6.8到約7.2，鹽含量約1.5×SSC到約2.5×SSC，甲酰胺的含量約為40-50％。合適的條件包括約40到80℃的溫度，約1到72小時的時間來充分對照背景檢測基因組和表達的信號，優(yōu)選12-24小時。如果需要可使用雜交加速劑，例如葡聚糖硫酸酯。雜交后優(yōu)選在比雜交的嚴謹性更高的條件下洗滌。
雜交過程中，也優(yōu)選加入過量的未標記人重復(fù)序列DNA，例如Cot-1 DNA。雜交混合物中使用的未標記重復(fù)序列DNA的量一般為每ng總的標記基因組DNA約0.01到5.0μg。
雜交可在維持擴增和標記的DNA與連接在固體基質(zhì)上的DNA接觸的任何合適的設(shè)備中進行。
雜交后，使用任何合適的檢測儀或閱讀設(shè)備以及方法來檢測和確定每個標記的熒光強度。
在本發(fā)明的各種實施方式中，成像設(shè)備和方法可利用數(shù)字圖像處理算法，該算法用在數(shù)據(jù)分析、存儲和顯示來自成像設(shè)備的數(shù)字圖像數(shù)據(jù)的編程計算機中。任何合適的數(shù)字圖像處理、數(shù)據(jù)存儲和顯示軟件可用于分析雜交的結(jié)果。
每個靶元件的熒光數(shù)據(jù)可自動比較來產(chǎn)生所用的檢測時不同的標記之間的比值。
與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交的第一種和第二標記的相對量的比較可用于檢測具有第一核型的細胞在特定的染色體位置是否和具有第二核型的細胞具有相同的核型，或者檢測具有第一核型的細胞在特定的染色體位置是否和具有第二核型的細胞具有不同的核型。
具有第一核型的細胞和具有第二核型的細胞在特定的染色體位置具有相同核型的話，與擴增的DNA雜交的第一種(例如綠色)和第二種(例如紅色)標記的比值優(yōu)選是常染色體為0.80(即，紅色/綠色之比)、或性染色體為0.75(即，紅色/綠色之比)，到常染色體為1.20(即，紅色/綠色之比)、或性染色體為1.25(即，紅色/綠色之比)。
此外，具有第一核型的細胞在特定的染色體位置和具有第二核型的細胞相比，缺乏染色體區(qū)域拷貝的話，與擴增的DNA雜交的第一種(例如綠色)和第二種(例如紅色)標記的比值優(yōu)選是常染色體大于1.20(即，紅色/綠色之比)、或性染色體大于1.25(即，紅色/綠色之比)。相反，具有第一核型的細胞在特定的染色體位置上和具有第二核型的細胞相比，具有額外染色體區(qū)域拷貝的話，與擴增的DNA雜交的第一種(例如綠色)和第二種(例如紅色)標記的比值優(yōu)選是常染色體小于0.80(即，紅色/綠色之比)、或性染色體小于0.75(即，紅色/綠色之比)。
本發(fā)明也提供一種在具有未知核型的細胞中檢測染色體異常的方法，所述的方法包括以下步驟(a)從分離的染色體或分離的染色體的一部分擴增DNA；(b)將擴增的DNA與固體基質(zhì)相連；(c)從具有未知核型的一個或多個細胞擴增DNA和從具有參考核型的一個或多個細胞擴增DNA；(d)用第一標記來標記具有未知核型的一個或多個細胞的擴增DNA以及用第二標記來標記具有參考核型的一個或多個細胞的擴增DNA，其中第一種和第二標記有可檢測的不同；(e)將具有未知核型的一個或多個細胞的擴增且標記的DNA與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交，并將具有參考核型的一個或多個細胞的擴增且標記的DNA與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交；和(f)通過比較與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交的第一標記的相對量和與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交的第二標記的量來測定具有未知核型的細胞內(nèi)染色體異常的存在。
染色體異?？墒抢没蚪M比較雜交檢測的染色體中的任何變化或改變。可用本發(fā)明的這種實施形式檢測的染色體異常的例子包括額外的單個染色體或缺失單個染色體、額外的部分染色體或缺失部分染色體、斷裂和染色體重排(例如易位、雙著絲粒、倒位、插入、擴增和缺失)。
本發(fā)明這種實施形式的方法優(yōu)選用于染色體異常的胚胎或卵母細胞植入前診斷或胎兒的產(chǎn)前診斷。
就分離的染色體而言，該染色體優(yōu)選通過顯微切割或流式細胞術(shù)分離。就分離染色體的一部分而言，該分離染色體的一部分優(yōu)選是染色體的克隆片段。來自分離的染色體的DNA或分離染色體的一部分的擴增DNA優(yōu)選排除非染色體序列。
擴增來自分離的染色體或分離染色體的一部分的DNA優(yōu)選隨機引物擴增。隨機引物擴增更優(yōu)選包括使用簡并寡核苷酸引物。最優(yōu)選的是簡并寡核苷酸引物由核苷酸序列5′-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3′組成，其中N是任何核苷酸。
來自分離的染色體和分離染色體的一部分的擴增DNA優(yōu)選排除了重復(fù)序列和/或由于DAN擴增而產(chǎn)生的超表現(xiàn)序列。
重復(fù)序列優(yōu)選是Cot-1序列。
來自分離的染色體或分離染色體的一部分的擴增DNA優(yōu)選在連接到固體基質(zhì)之前進行大小選擇。來自分離的染色體或分離染色體的一部分的擴增DNA更優(yōu)選大小選擇為小于10kb的DNA。來自分離的染色體或分離染色體的一部分的擴增DNA更優(yōu)選大小選擇為小于3kb的DNA。
來自具有未知核型的一個或多個細胞的擴增DNA和來自具有參考核型的一個或多個細胞的擴增DNA優(yōu)選是隨機引物DNA擴增。擴增更優(yōu)選包括使用簡并寡核苷酸引物。最優(yōu)選的是簡并寡核苷酸引物由核苷酸序列5′-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3′組成，其中N是任何核苷酸。
來自具有未知核型的一個或多個細胞的擴增DNA和來自具有參考核型的一個或多個細胞的擴增DNA優(yōu)選均排除了重復(fù)序列。
重復(fù)序列優(yōu)選是Cot-1序列。
具有未知核型的細胞可是待篩選其中是否存在染色體異常的任何細胞。可用本發(fā)明檢測的染色體異常的例子包括三體性21、13和18，和檢測缺失染色體，例如發(fā)生于特納綜合癥(45，XO)中的。
染色體異?？膳c任何倍性(單倍體、二倍體或多倍體)的細胞中存在的任何染色體有關(guān)，包括性染色體、常染色體、線粒體染色體、葉綠體染色體或附加體。染色體異常優(yōu)選存在于性染色體或常染色體。染色體異常最優(yōu)選存在于常染色體。
具有未知核型的細胞可是真核細胞或原核細胞。優(yōu)選細胞是真核細胞。更優(yōu)選細胞是動物或人的細胞。最優(yōu)選細胞是人的細胞。
具有未知核型的細胞優(yōu)選胎兒細胞、衍生自胚胎(包括裂球)的細胞、生殖細胞、癌性細胞或任何其它類型的具有要篩選的染色體異常的體細胞。具有未知核型的細胞更優(yōu)選胎兒細胞、胚胎細胞或生殖細胞。具有未知核型的細胞最優(yōu)選胚胎細胞或生殖細胞。
因此，在優(yōu)選的實施形式中，本發(fā)明也提供了一種在胚胎或生殖細胞內(nèi)檢測染色體異常的方法，該方法包括以下步驟(a)從分離的染色體或分離的染色體的一部分擴增DNA；(b)將擴增的DNA與固體基質(zhì)相連；(c)從胚胎或生殖細胞中分離細胞；(d)從分離自胚胎或生殖細胞的細胞擴增DNA；(e)從具有參考核型的一個或多個細胞擴增DNA；(f)用第一標記來標記分離自胚胎或生殖細胞的細胞的擴增DNA以及用第二標記來標記具有參考核型的一個或多個細胞的擴增DNA，其中第一種和第二標記有可檢測的不同；(g)將分離自胚胎或生殖細胞的細胞的擴增且標記的DNA與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交，并將具有參考核型的一個或多個細胞的擴增且標記的DNA與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交；和(h)通過比較與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交的第一標記的相對量和與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交的第二標記的量來檢測胚胎或生殖細胞內(nèi)染色體異常的存在。
在檢測染色體異常中，更精確地測定特定染色體異常的存在無需大量細胞，并且在某些情況中，優(yōu)選分離單細胞或相對少量的細胞。
因此，在優(yōu)選的實施形式中，本發(fā)明也提供了一種在具有未知核型的單細胞內(nèi)檢測染色體異常的方法，該方法包括以下步驟(a)從分離的染色體或分離染色體的一部分隨機擴增DNA；(b)將擴增的DNA與固體基質(zhì)相連；(c)從具有未知核型的單細胞隨機擴增DNA和從具有參考核型的一個或多個細胞擴增DNA；(d)用第一標記來標記具有未知核型的單細胞的擴增DNA以及用第二標記來標記具有參考核型的一個或多個細胞的擴增DNA，其中第一種和第二標記有可檢測的不同；(e)將具有未知核型的單細胞的擴增且標記的DNA與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交，并將具有參考核型的一個或多個細胞的擴增且標記的DNA與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交；和(f)通過比較與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交的第一標記的相對量和與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交的第二標記的量來測定具有未知核型的單細胞內(nèi)染色體異常的存在。
具有參考核型的細胞可是其核型要與具有未知核型的細胞比較的任何細胞。具有參考核型的細胞優(yōu)選與具有未知核型的細胞是同一種的，也優(yōu)選與具有未知核型的細胞是同一型的或類似型的。
具有參考核型的一個或多個細胞優(yōu)選是與具有未知核型的一個或多個細胞是同一型的。
在本發(fā)明的這種實施形式中，有待分析的細胞數(shù)目不受具體限制，其范圍可從單細胞(例如分離自胚胎)到大量的細胞(例如分離自組織活檢或血液)。例如，本發(fā)明的方法可應(yīng)用于對分離自胚胎或卵母細胞的極體的單細胞進行PGD，胎兒細胞的產(chǎn)前診斷或測定通過活檢分離自受試者或從血液中分離的癌性細胞或其它體細胞中染色體異常的存在。
在產(chǎn)前診斷的情況中，例如，有待分析的細胞的數(shù)目也不受具體限制，優(yōu)選少于500個細胞，更優(yōu)選少于400個細胞，最優(yōu)選少于100個細胞。合適的范圍是50-400個細胞。
具有未知核型的一個或多個細胞的擴增DNA優(yōu)選擴增自1到20個細胞的DNA。在本發(fā)明優(yōu)選的實施形式中，有待分析的細胞是單細胞或少量的細胞，其范圍是2到20個細胞。
要從中提取和擴增DNA的具有未知核型的細胞數(shù)目優(yōu)選和要從中抽提和擴增DNA的具有參考核型的細胞數(shù)目相同或相似。例如，在對分離自胚胎或卵母細胞的極體的單細胞進行PGD的情況中，優(yōu)選使用另一來源的單細胞作比較。
在一個實施方案中，也可期望具有未知核型的細胞中的染色體異常可用具有參考核型的細胞中的相同區(qū)域來檢測。在這種實施形式中，可將一種特定的引物或一組特定的引物加入來自具有未知核型的細胞和具有參考區(qū)域的細胞的提取DNA中。
出于，例如隨機擴增提取的DNA的目的，可在反應(yīng)混合物的中存在的其它引物中加入特定的引物或一組引物。此外，特定的引物或一組引物也可用作僅有的引物來擴增提取的DNA。
用于在特定區(qū)域檢測染色體異常的引物的例子是擴增小染色體的特定區(qū)域的引物(例如，染色體21和22)。在這種情況中，優(yōu)選將這種引物加入隨機擴增基因組DNA的一組引物中，例如DOP引物。
在需要擴增特定的染色體區(qū)域、特定的基因座、或一個或多個特定的基因的情況中，針對特定區(qū)域的引物可單獨使用或與其它引物聯(lián)用，例如隨機擴增基因組DNA的DOP引物。例如，可擴增染色體區(qū)域來分析染色體異常，包括涉及各種疾病(例如地中海貧血、杜興肌營養(yǎng)不良、X-連鎖疾病和血友病)的區(qū)域。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的方法在檢測主要的染色體異常(例如缺失和增殖)中有用，并且擴增的特定基因座需要攜帶這種異常使其可被本發(fā)明的方法檢測。
所以，從具有未知核型的一個或多個細胞擴增DNA和從具有參考核型的一個或多個細胞擴增DNA也可包括擴增相同的特定染色體區(qū)域。
從具有未知核型的一個或多個細胞的擴增DNA用第一標記來標記，而從具有參考核型的一個或多個細胞的擴增DNA用第二標記來標記，第二標記在檢測時與第一標記不同。用于引入DNA的檢測不同的標記的例子包括SpectrumGreen-dUTP和SpectrumRed-dUTP(均來自Vysis)，或Cy3-dUTP和Cy5-dUTP。
比較與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交的第一種和第二標記的相對量可用于檢測具有未知核型的細胞在特定的染色體位置上是否和具有參考核型的細胞一樣具有染色體異常。
就檢測缺乏染色體區(qū)域的拷貝而言，與擴增DNA雜交的第一種(例如綠色)和第二種(例如紅色)標記的比值優(yōu)選是常染色體大于1.20(即，紅色/綠色之比)、或性染色體大于1.25(即，紅色/綠色之比)。相反，就檢測染色體區(qū)域的額外拷貝而言，與擴增DNA雜交的第一種(例如綠色)和第二種(例如紅色)標記的比值優(yōu)選是常染色體小于0.80(即，紅色/綠色之比)、或性染色體小于0.75(即，紅色/綠色之比)。
在另一優(yōu)選的實施形式中，本發(fā)明提供了一種胚胎的植入前遺傳診斷的方法，該方法包括以下步驟(a)從分離的染色體或分離染色體的一部分隨機擴增DNA；(b)將擴增的DNA與固體基質(zhì)相連；(c)從具有未知核型的一個或多個胚胎細胞隨機擴增DNA和從具有參考核型的一個或多個細胞擴增DNA；(d)用第一標記來標記具有未知核型的一個或多個胚胎細胞的擴增DNA以及用第二標記來標記具有參考核型的一個或多個細胞的擴增DNA，其中第一種和第二標記有可檢測的不同；(e)將具有未知核型的一個或多個細胞的擴增且標記的DNA與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交，并將具有參考核型的一個或多個細胞的擴增且標記的DNA與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交；(f)通過比較與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交的第一標記的相對量和與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交的第二標記的量來測定具有未知核型的胚胎細胞內(nèi)染色體異常的存在；和(g)通過一個或多個胚胎細胞中不存在染色體異常來確定胚胎或卵母細胞植入的適合性。
在另一優(yōu)選的實施形式中，本發(fā)明提供了一種卵母細胞的植入前遺傳診斷的方法，該方法包括以下步驟(a)從分離的染色體或分離染色體的一部分隨機擴增DNA；
(b)將擴增的DNA與固體基質(zhì)相連；(c)從具有未知核型的卵母細胞的極體隨機擴增DNA和從具有參考核型的一個或多個細胞擴增DNA；(d)用第一標記來標記具有未知核型的卵母細胞的極體的擴增DNA以及用第二標記來標記具有參考核型的一個或多個細胞的擴增DNA，其中第一種和第二標記有可檢測的不同；(e)將具有未知核型的卵母細胞的極體的擴增且標記的DNA與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交，并將具有參考核型的一個或多個細胞的擴增且標記的DNA與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交；(f)通過比較與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交的第一標記的相對量和與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交的第二標記的量來測定具有未知核型的卵母細胞的極體內(nèi)染色體異常的存在；和(g)通過卵母細胞的極體中不存在染色體異常來確定卵母細胞植入的適合性。
在另一優(yōu)選的實施形式中，本發(fā)明提供了一種胎兒的出生前診斷的方法，該方法包括以下步驟(a)從分離的染色體或分離染色體的一部分隨機擴增DNA；(b)將擴增的DNA與固體基質(zhì)相連；(c)從具有未知核型的一個或多個胎兒細胞隨機擴增DNA和從具有參考核型的一個或多個細胞擴增DNA(d)用第一標記來標記具有未知核型的一個或多個胎兒細胞的擴增DNA以及用第二標記來標記具有參考核型的一個或多個細胞的擴增DNA，其中第一種和第二標記有可檢測的不同；(e)將具有未知核型的一個或多個胎兒細胞的擴增且標記的DNA與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交，并將具有參考核型的一個或多個細胞的擴增且標記的DNA與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交；和(f)通過比較與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交的第一標記的相對量和與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交的第二標記的量來測定胎兒內(nèi)染色體異常的存在；本發(fā)明也提供一種連接在固體基質(zhì)上的核酸，其中所述核酸衍生自分離的染色體或分離染色體的一部分并且所述核酸排除了重復(fù)序列。
本發(fā)明的這種實施形式提供一種與固體基質(zhì)相連的核酸，該核酸不僅在基因組比較雜交中有用，還可在任何基于雜交的系統(tǒng)中用作檢測核酸的靶。
就分離的染色體而言，該染色體優(yōu)選由顯微切割或流式細胞術(shù)分離。
就分離的染色體的一部分而言，該染色體的一部分優(yōu)選由顯微切割或流式細胞術(shù)分離，或是染色體的克隆片段。
與固體基質(zhì)相連的核酸可是衍生自分離的染色體或分離染色體的一部分的任何核酸。該核酸可從分離的染色體或分離染色體的一部分直接衍生。例如來自一種或多種分離的染色體的DNA可排除重復(fù)序列并直接與固體基質(zhì)相連，或者來自含有基因組DNA的一個或多個克隆的DNA可排除重復(fù)序列并直接與固體基質(zhì)相連。
此外，與固體基質(zhì)相連的核酸可是分離的染色體或分離染色體的一部分擴增的產(chǎn)物。
與固體基質(zhì)相連的核酸優(yōu)選是分離的染色體或其一部分的DNA的擴增產(chǎn)物。重復(fù)序列可再次在擴增前或擴增后從DNA中排除。
在從分離的染色體或分離染色體的一部分的擴增DNA的情況中，優(yōu)選導(dǎo)致基本上整個目標序列的擴增。因此，擴增分離染色體或分離染色體的一部分優(yōu)選隨機引物擴增。
在優(yōu)選的實施形式中，本發(fā)明提供一種與固體基質(zhì)相連的核酸，該核酸衍生自分離的染色體或分離染色體的一部分的隨機引物擴增，其中該核酸排除了重復(fù)序列。
可使用一種或多種合適的引物來擴增分離的染色體或分離染色體的一部分的DNA。如上所述，使用的一種或多種引物優(yōu)選可導(dǎo)致分離的染色體或分離染色體的一部分的DNA隨機擴增。
使用的一種或多種引物優(yōu)選包括隨機序列的一個或多個核苷酸的寡核苷酸。一種或多種引物更優(yōu)選包括隨機序列的一個或多個毗鄰核苷酸的寡核苷酸。該一種或多種引物還要優(yōu)選包括隨機序列的6個或更多毗鄰核苷酸的寡核苷酸，例如DOP引物(簡并寡核苷酸引物)。該一種或多種引物最優(yōu)選包括以下核苷酸序列的引物5′-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3′；其中NNNNNN代表簡并序列。“N”是任何核苷酸，即N代表DNA序列中四種可能的核苷酸，分別是“A”(腺嘌呤)、“T”(胸腺嘧啶)、“C”(胞嘧啶)、“G”(鳥嘌呤)。這樣，簡并序列含有各種核苷酸序列的混合物包括在“N”位置的A、T、C和G所有可能的組合。
如果需要，簡并序列的核苷酸序列也可偏向于特定的核苷酸組成，例如富含GC或AT。
在使用DOP引物在由顯微切割分離得到的分離的染色體上或分離染色體的一部分上進行擴增的情況中，基本上可如Telenius等((1992)，Genomics，18718-725)所述進行擴增。簡言之，在低嚴謹條件下進行循環(huán)數(shù)量少(例如，5輪)的擴增，而在更嚴謹條件下進行循環(huán)數(shù)量較多(例如，35輪)的第二階段擴增。
此外，隨機引物擴增可通過以下步驟進行使用一種或多種固定序列的引物并在低嚴謹條件下進行循環(huán)數(shù)量少的擴增，這使得該一個或多個引物在整個目標序列上隨機引發(fā)合成，然后在更嚴謹條件下進行循環(huán)數(shù)量較多的第二階段擴增。
此外，為說明可能會給實現(xiàn)隨機引物擴增帶來困難的小染色體的區(qū)域，區(qū)域特異性引物也可與其它允許隨機擴增的引物聯(lián)用來。例如，對染色體21和22的區(qū)域具有特異性的引物可與DOP引物聯(lián)用。
其它用于擴增分離的染色體或分離染色體的一部分的合適技術(shù)包括引物延伸預(yù)擴增PCR(PEP-PCR)，這種技術(shù)基本上如Zhang等((1992)，Proc Natl.Acad.Sci895847-5851)所述進行；連接介導(dǎo)PCR基本上如Klein等((1999)Proc Natl.Acad.Sci964494-4499)所述進行；或alu-PCR基本上如Nelson等((1989)Proc.Natl.Acad.Sci.866686-6690)所述進行。
在環(huán)形載體中的克隆基因組插入體上使用滾環(huán)擴增的情況中，滾環(huán)擴增可在本領(lǐng)域已知的合適條件下進行，例如Fire，A.和Xu，S-Q在(1995)，Proc.Natl.Acad.Sci924641-4645中所述的。
大量本領(lǐng)域已知的方法可用于排除擴增的DNA重復(fù)序列。
如上所述，重復(fù)序列可在擴增前或擴增后除去。例如，可分離染色體DNA并除去重復(fù)序列?；蛘撸紫瓤捎煤线m的引物擴增DNA再從核酸的擴增庫中除去重復(fù)DNA序列。
重復(fù)序列的例子包括簡單重復(fù)的DNA(例如，Alu或Kpn元件)、衛(wèi)星重復(fù)序列、小衛(wèi)星重復(fù)序列、染色體特異性重復(fù)序列、微衛(wèi)星重復(fù)序列、重復(fù)基因(例如，rRNA基因)、衍生自轉(zhuǎn)座元件的序列(例如，具有DNA或RNA中間體的轉(zhuǎn)座子)、衍生自病毒(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒)的多拷貝的元件、與著絲?；蚨肆Ｏ嚓P(guān)的重復(fù)序列或與異染色質(zhì)相關(guān)的重復(fù)序列。
大量本領(lǐng)域已知的方法可用于除去重復(fù)序列。例如，在許多基因組(例如人基因組)中，重復(fù)DNA的主要部分包含于一些種類的高度重復(fù)序列(例如，Alu)中。為除去這種重復(fù)序列，可使用一種封閉方法。這些方法主要基于互補核酸鏈的雜交率隨濃度的增加而增加的事實。所以，如果核酸片段的混合物被變性并在允許雜交的條件下孵育，高濃度出現(xiàn)的序列比其它序列更快變?yōu)殡p鏈。然后該雙鏈核酸可用本領(lǐng)域已知的方法直接除去這些序列而除去。
例如，單鏈和雙鏈核酸對羥基磷灰石具有不同的結(jié)合特性。這種特性提供了通常用于核酸分級的基礎(chǔ)。包含具有特定程度重復(fù)序列的基因組DNA組分可通過以下方式獲得使基因組DNA變性、在合適的條件下使之重締合、然后用羥基磷灰石分離。這種技術(shù)描述于Britten等.，“通過重締合分析重復(fù)DNA序列”(Analysisof Repeating DNA Sequences by Reassociation)，Methods in Enzymology22363-418(1974)。
可用于排除擴增的DNA重復(fù)序列的這種序列的例子包括人Cot-1 DNA和含有DNA的Alu-重復(fù)序列。
此外，可進行與固定化核酸的反應(yīng)。例如，最小剪切的人基因組DNA與重氮纖維素等支持物結(jié)合。適當?shù)厍谐善蔚臄U增DNA與固定化DNA進行雜交至Cot值約為1到100。然后，未與固定化核酸結(jié)合的物質(zhì)可與固體基質(zhì)相連。
在優(yōu)選的實施方案中，要與固體基質(zhì)相連的、衍生自分離的染色體或其一部分的核酸還要排除非染色體序列。
非染色體序列是染色體或其一部分的核苷酸序列中一般不存在的序列，例如衍生自載體或質(zhì)粒的序列、或存在于要擴增的最初靶樣品中的污染序列，例如細菌的序列(例如，衍生自大腸桿菌的序列)。由于染色體擴增而超表現(xiàn)的序列指相比于其它正常出現(xiàn)在目標序列中的序列，那些在目標序列擴增后出現(xiàn)的、被不成比例地擴增的序列。
非染色體序列可用上述方式排除。在從擴增的核酸中排除非染色體序列的情況中，在與目標序列或擴增DNA的雜交反應(yīng)中過量使用非染色體序列來排除非染色體序列，或通過將非染色體序列與固體支持物相連并使用這些序列來排除含有這些序列的DNA。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，要與固體基質(zhì)相連的、衍生自分離的染色體或其一部分的隨機擴增的核酸還要排除由于擴增而超表現(xiàn)的序列。
在排除擴增導(dǎo)致的超表現(xiàn)序列的情況中，目標序列可在擴增前通過與上述類似的方法從靶序列中排除或在擴增后排除超表現(xiàn)序列。應(yīng)該理解的是，需要鑒定被超表現(xiàn)的實際序列，并且這取決于使用的引物和擴增的靶序列的性質(zhì)。
使用相同引物擴增重復(fù)序列來源從而可同時排除超表現(xiàn)序列和重復(fù)序列，該引物用于從分離的染色體或分離染色體的一部分擴增DNA。然后，擴增的重復(fù)核酸可用于排除超表現(xiàn)和重復(fù)序列的擴增DNA。例如，可在Cot-1 DNA上進行DOP-PCR，并且得到的擴增產(chǎn)物用于從分離的染色體或分離染色體的一部分排除擴增的DNA。
在優(yōu)選的實施形式中，本發(fā)明也提供了一種與固體基質(zhì)相連的核酸，其中該核酸衍生自分離的染色體或分離染色體的一部分的隨機引物擴增并且該核酸排除了重復(fù)序列、非染色體相連或由于染色體或分離染色體的一部分的擴增而超表現(xiàn)的序列中的一種或多種。
分離的染色體或分離染色體的一部分的核酸在與固體基質(zhì)連接之前也要經(jīng)過大小選擇。與固體基質(zhì)連接的擴增核酸的大小優(yōu)選小于10kb。與固體基質(zhì)連接的擴增核酸的大小更優(yōu)選小于3kb。
大小選擇可通過本領(lǐng)域已知的合適方法進行。例如，擴增的核酸可在瓊脂糖凝膠上進行電泳，并分離大小在150到3000bp的DNA。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施形式中，與固體基質(zhì)連接的核酸是分離染色體或分離染色體的一部分的隨機引物擴增產(chǎn)物，其中該核酸進行過大小選擇。
在這種情況中，與固體基質(zhì)相連的隨機擴增核酸的大小優(yōu)選小于10kb。與固體基質(zhì)相連的隨機擴增核酸的大小更優(yōu)選小于3kb。例如，隨機擴增的DNA可在瓊脂糖凝膠上進行電泳，并分離大小在150到3000bp的DNA。
核酸可通過本領(lǐng)域已知的合適方法與固體基質(zhì)相連，包括被動吸附或共價連接。例如，擴增的DNA可通過以下方式經(jīng)被動吸附與玻璃基質(zhì)相連將樣品點樣在PolysineTM顯微鏡載玻片(Menzel-Glaser，德國)上，然后通過脫水、快干、通過紫外交聯(lián)固定并使用琥珀酸酐化學(xué)封閉來處理載玻片。就共價連接而言，核酸可通過本領(lǐng)域已知合適方法與固體基質(zhì)相連。
優(yōu)選多種核酸與固體基質(zhì)相連來產(chǎn)生沉積核酸的陣列。這種陣列可用本領(lǐng)域已知的任何所需方式生產(chǎn)，包括核酸的機器人沉積。生產(chǎn)陣列的方法的例子基本上描述于美國專利5,486,452；5,830,645；5,807,552；5,800,992和5,445,934。
因此，在優(yōu)選的實施形式中，本發(fā)明也提供一種與固體基質(zhì)相連的核酸陣列，其中所述陣列中的每個核酸衍生自分離的染色體或分離染色體的一部分并且每個核酸排除了重復(fù)序列。
在另一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明也提供一種與固體基質(zhì)相連的核酸陣列，其中所述陣列中的每個核酸是分離的染色體或分離的染色體的一部分的隨機引物擴增的產(chǎn)物，并且每個核酸排除了重復(fù)序列、非染色體序列或由于染色體或其一部分擴增而超表現(xiàn)的序列中的一種或多種。
也應(yīng)該明白的是，所述的陣列無需由本發(fā)明的核酸構(gòu)成，而是除了與固體基質(zhì)相連的一種或多種本發(fā)明的核酸外還可包括其它靶核酸。
可在固體基質(zhì)上沉積任何適量的核酸。沉積核酸的量可從約0.05nl到5.0nl的核酸溶液，該核酸的濃度為0.15-1μg/μl。例如，就1,000DNA沉積/cm的密度而言，沉積的個體量約是0.2nl到2.0nl的1μg/μl溶液。DNA可以允許核酸沉積的任何的溶劑提供。
具有沉積核酸的陣列可以任何陣列方式生產(chǎn)。例如，核酸可位于陣列的一個部分或分散在其它沉積的核酸中。優(yōu)選兩維陣列的一致性。
陣列也優(yōu)選包括各種控制核酸，例如具體表達基因或基因組序列的拷貝數(shù)已知的打點核酸。例如，可使用從細胞系中提取的具有1份或多份拷貝的特定染色體基因組DNA，或也可使用從單細胞擴增的DNA的整個DOP-PCR產(chǎn)物。
在另一個實施形式中，本發(fā)明也提供一種用于比較具有第一核型的細胞的至少條種染色體或其片段與對應(yīng)的具有第二核型的細胞的染色體或其片段的試劑盒，該試劑盒包括含有一種連接到固體基質(zhì)上的核酸，其中該核酸衍生自分離的染色體或分離染色體的一部分并且核酸排除了重復(fù)序列。
在其它的實施形式中，本發(fā)明也提供一種用于比較具有第一核型的細胞的至少一條染色體或其片段與對應(yīng)的具有第二核型的細胞的染色體或其片段的試劑盒，該試劑盒包括一種連接到固體基質(zhì)上的核酸，其中該核酸是分離的染色體或分離染色體的一部分的隨機引物擴增的產(chǎn)物并且核酸排除了重復(fù)序列、非染色體序列或由于擴增而超表現(xiàn)的序列中的一種或多種。
本發(fā)明的各種試劑盒也適用于檢測細胞內(nèi)的染色體異常。
因此，在另一個實施形式中，本發(fā)明也提供一種用于檢測具有未知核型的細胞內(nèi)的染色體異常的試劑盒，該試劑盒包括一種連接到固體基質(zhì)上的核酸，其中該核酸衍生自分離的染色體或分離染色體的一部分并且核酸排除了重復(fù)序列。
在另一個實施形式中，本發(fā)明也提供一種用于檢測具有未知核型的細胞內(nèi)的染色體異常的試劑盒，該試劑盒包括一種連接到固體基質(zhì)上的核酸，其中該核酸是分離的染色體或分離染色體的一部分的隨機引物擴增產(chǎn)物并且核酸排除了重復(fù)序列、非染色體序列或由于染色體或其一部分擴增而超表現(xiàn)的序列中的一種或多種。
本發(fā)明也提供一種衍生自分離的染色體或分離染色體的一部分的隨機引物擴增的核酸，其中所述核酸排除了重復(fù)序列。
本發(fā)明的這種實施形式的核酸可用作雜交的靶核酸，特別是可用作基因組比較雜交的靶核酸。
核酸優(yōu)選衍生自包括使用簡并寡核苷酸引物的隨機引物擴增。核酸更最優(yōu)選衍生自包括使用有以下核苷酸序列組成的簡并寡核苷酸引物的隨機引物擴增5′-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3′，其中N是任何核苷酸。
在核酸是衍生自分離的染色體擴增的情況中，該分離的染色體優(yōu)選通過顯微切割或流式細胞術(shù)分離。
在核酸是衍生自分離的染色體的一部分擴增的情況中，該分離染色體的一部分優(yōu)選通過顯微切割或流式細胞術(shù)分離。此外，分離染色體的一部分可是染色體的克隆片段。在這種情況中，從克隆的基因組片段的隨機引物擴增的核酸優(yōu)選排除了非染色體序列。
該核酸也優(yōu)選排除去了由于擴增而超表現(xiàn)的序列。
重復(fù)序列優(yōu)選是Cot-1序列。
該核酸也是大小選擇的。該核酸的大小選擇優(yōu)選小于10kb。該核酸的大小選擇更優(yōu)選小于3kb。
在優(yōu)選的實施形式中，本發(fā)明也提供一種衍生自分離的染色體或分離染色體的一部分的隨機引物擴增的核酸，其中所述的核酸排除了重復(fù)序列并且核酸是大小選擇的。
優(yōu)選實施方案的描述現(xiàn)在，參考體現(xiàn)本發(fā)明的上述的一般原理所做的實驗。然而，要理解的是以下的描述并不限制上述說明的普遍性。
實施例1人染色體特異性的DNA文庫完整的一套排除充分序列的、PCR可擴增的人染色體特異的染色探針由A.Bolzer和M.R.Speicher博士(人類學(xué)和人類遺傳學(xué)研究所(Institut frAnthropologie and Humangenetik)，LMU慕尼黑，慕尼黑，德國)惠贈。
由于這些探針能均勻地對整個靶染色體(臂)染色，它們在本項目中選為人染色體的DNA文庫。DNA文庫通過對15種染色體(No.1、3、6、7、9、12、13、14、15、17、19、20、21、22和X)進行顯微切割或?qū)?種染色體(No.2、4、5、8、10、11、16、18和Y)進行流式分選產(chǎn)生。為避免在5種近端著絲粒染色體(13-15、21和22)的p臂之間的交叉雜交，僅將這些染色體的q臂顯微切割入其對應(yīng)的DNA文庫(Guan等.，(1994)，Genomics22101-107)。
使用包括人Cot-1 DNA、染色體著絲粒特異性探針和aphoid區(qū)域特異性探針的扣除物(subtracter)進行親和層析成功地從這些探針中進一步除去了重復(fù)序列。簡言之，用生物素標記重復(fù)序列并允許與含有重復(fù)序列的文庫雜交。雜交后，使用鏈霉抗生物素蛋白-磁性珠親和層析來除去與生物素標記的重復(fù)序列結(jié)合的重復(fù)序列。如Craig等((1997)，Hum.Genet100472-474)和Bolzer等((1999)，Cytogenet.CellGenet.84233-240)所述，這些排除重復(fù)序列的DNA文庫無需加入人Cot-1 DNA來抑制重復(fù)序列，就可在其對應(yīng)的靶染色體(q臂)上獲得高特異性的FISH信號。
實施例2制備人染色體特異性DNA文庫通過高嚴謹循環(huán)條件的一次30-35輪的簡并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)成功地再擴增了如實施例1所述的人DNA文庫，該循環(huán)條件基本上如Telenius等((1992)Genomics 13718-725)所述。
簡言之，在體積為50μl的Minicycler(MJ Research，USA)中進行擴增，其中含有約50～100ng的源探針，Taq DNA聚合酶緩沖液(50mM KCl、10mM Tris-HCl[pH8.3]，Perkin Elmer，美國)，2.0μM引物6MW(5′-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3′)，2.5mM MgCl2，0.25mM的各種dNTP和5U Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer，美國)。在95℃4分鐘的初始變性步驟之后，以94℃1分鐘，62℃1分鐘和72℃3分鐘，每輪加上10秒的延伸時間為循環(huán)條件，共進行30-35輪。最后在循環(huán)擴增結(jié)束時加上72℃10分鐘的延伸步驟。
5μl的PCR產(chǎn)物在0.5×TBE(Tris，硼酸鹽，EDTA)中用溴化乙錠預(yù)染色的1％瓊脂糖凝膠上進行電泳并拍照。結(jié)果示于圖1。
可以看到，使用高嚴謹循環(huán)條件的傳統(tǒng)DOP-PCR通過一次30-35輪的DOP-PCR擴增成功地擴增了全套排除重復(fù)序列的人染色體特異性的DNA文庫。在1％瓊脂糖上展開30分鐘后，所有的再擴增DNA文庫的PCR產(chǎn)物形成主要小于1kb的成片條帶。然而，成片條帶的區(qū)別是明顯的。11種不同的染色體(No.1、2、4、5、8、9、10、11、16、21和Y)的產(chǎn)物見到延伸至大于3kb的較寬的成片條帶，僅有3種是獲得自顯微切割的探針(No.1、9和21)。
綜合地優(yōu)化DOP-PCR的循環(huán)條件未能去除PCR產(chǎn)物在大小上的差異，這些條件包括退火和延伸步驟的溫度和持續(xù)時間，擴增循環(huán)的數(shù)量，模板的初始DNA量和MgCl2的鹽濃度。
然后使用Ultrapure PCR純化試劑盒(#12500-250，Mo Bio Laboratories，Inc.，CA，美國)純化PCR產(chǎn)物。純化的PCR產(chǎn)物可立即使用也可于-20℃儲存1年而用FISH信號測定其特異性無任何可見的喪失。
實施例3使用再擴增的DNA文庫進行熒光原位雜交使用來自正常男性的外周淋巴細胞的中期染色體進行FISH實驗來確認再擴增的人染色體DNA文庫的特異性。
熒光原位雜交按以下步驟進行SpectrumGreen-dUTP或SpectrumRed-dUTP(Vysis，美國)用于標記擴增的DNA文庫。使用以上用于擴增DNA文庫的源探針(實施例2)的相似DOP-PCR循環(huán)條件在體積為50μl的Minicycler(MJ Research，美國)中進行標記反應(yīng)。
該實施例中唯一例外是使用低濃度的dNTPdGTP、dCTP和dATP分別是0.16mM，0.12mM的dTTP，以及加入了0.04mM的SpectrumGreen-dUTP或SpectrumRed-dUTP。使用Ultrapure PCR純化試劑盒(#12500-250，Mo BioLaboratories，Inc.，CA，美國)純化PCR產(chǎn)物。對于FISH實驗，1μg純化的標記產(chǎn)物與20μg人Cot-1 DNA(GIBICO，BRL)和50μg鮭精DNA(GIBICO，BRL)混合。用乙醇沉淀探針混合物并重懸于10μl雜交溶液中，該溶液由50％去離子甲酰胺，3×SSC，0.1％SDS，10％葡聚糖硫酸酯和5×Denhardt溶液組成。
在80℃變性10分鐘并在37℃預(yù)退火30分鐘后，探針與變性的中期擴散染色體于37℃雜交過夜。雜交后，于60℃用2×SSC洗滌載玻片兩次，10分鐘；然后于60℃用0.1×SSC洗滌載玻片一次，5分鐘。此后，于室溫用0.1×SSC洗滌載玻片一次，5分鐘，然后在水中簡單沖洗數(shù)秒。于黑暗中空氣干燥后，載玻片用含有防褪色介質(zhì)的40μl DAPI溶液復(fù)染并用指甲膏密封的蓋玻片覆蓋。通過AHBT3顯微鏡(Olympus，東京，日本)使用(1)以藍光激發(fā)綠色信號(2)以Triple激發(fā)紅色信號，得到FISH信號并拍照。
如圖2所示，除了染色體21的DNA文庫發(fā)出微弱的信號外，所有其它標記均對其完整的靶染色體或q臂進行均勻的染色。
實施例4生產(chǎn)DNA陣列(i)人染色體DNA的PCR擴增文庫的DNA陣列(第一代陣列)
使用南澳大利亞，阿德萊德大學(xué)(University of Adelaide，South Australia)的微陣列設(shè)備進行DNA陣列。
簡言之，人染色體的所有再擴增DNA文庫重懸在3×SSC的點樣緩沖液中，其中DNA的終濃度約100ng/μl，然后將8μl的每種懸浮液加入384孔板的孔中。然后，使用微陣列儀(microarrayer)從此板的孔中取樣并在PolysinTM顯微鏡玻璃載玻片(Menzel-Glaser，德國)上每份DNA樣品點8份復(fù)制品。點好樣的陣列載玻片的后處理包括脫水、快干、紫外交聯(lián)固定和使用琥珀酸酐進行化學(xué)封閉。最后，以500rpm離心5分鐘干燥后，陣列載玻片可立即使用或于黑暗中短時儲存于載玻片盒中。
制造了30塊陣列載玻片。如圖3所示，兩個復(fù)制陣列點樣在每塊載玻片上。每個陣列具有四個區(qū)。從左到右，每個陣列內(nèi)四個區(qū)命名為第一區(qū)、第二區(qū)、第三區(qū)和第四區(qū)，每個區(qū)分別具有7列、7列、6列和6列。每列由單一人染色體的一個DNA文庫的4個復(fù)制品組成。從左到右，對應(yīng)于人染色體的DNA文庫的列的次序分別是第一區(qū)、第二區(qū)、第三區(qū)和第四區(qū)的No.1-5-9-3-17-21-陰性、No.2-6-10-14-18-22-陽性、No.3-7-11-15-19-X-空白和No.4-8-12-16-20-Y-空白。
(ii)大小選擇后人染色體DNA的PCR擴增文庫的DNA陣列(第二代陣列)將實施例2所述的再擴增DNA文庫在1％的瓊脂糖凝膠上進行電泳來生產(chǎn)具有大小選擇產(chǎn)物的DNA陣列。染色后，如圖4所示，從凝膠上切下大小范圍是150-3000bp的DNA并分離。
然后將得到的大小選擇的DNA連同前述的大小選擇之前的原始DNA文庫點樣到陣列上，其中與前述的區(qū)別在于DNA是重懸于pH8.0的150mM磷酸鈉中，其濃度約為170ng/μl。使用TeleChem的Stealth Micro Spotting Pins(目錄SMP3)在每個點上點約0.6nl的量。使用的載玻片是從盒中直接取用的TeleChem(Sunnyvale，CA)的SuperAmine載玻片。進行微陣的陣列設(shè)備是位于新南威爾士大學(xué)的基因功能分析Clive & Vera Ramaciotti中心的微陣設(shè)備，該設(shè)備使用ChipWriter Pro(BioRad)微陣儀。
實施例5單細胞的分離與制備分離自正常男性或正常女性外周血的單淋巴細胞用作參考細胞，13和18三體性的妊娠羊水細胞培養(yǎng)物的單羊水細胞用作測試細胞。使用細胞遺傳分析來確認46、XX和46、XY參考樣品的正常核型。使用倒置顯微鏡和細拉長的玻璃移液管基本上如Hussey等((1999)Mol.Hum.Reprod.51089-1094)所述來選擇單細胞并轉(zhuǎn)移至0.5ml PCR管，這些單細胞可立即使用或冷凍一段時間。
實施例6隨機擴增的第一輪DOP-PCR于65℃用5μl裂解緩沖液(200mM KOH、50mM二硫蘇糖醇)處理10分鐘，然后用5μl中和緩沖液(300mM KClI、900mM Tris-HCl、pH8.3、200mM HCl)中和獲得單細胞的裂解。向10μl的單細胞裂解和中和溶液加入5μl的無K+PCR緩沖液(100mM Tris-HCl、pH8.3、1mg/ml明膠)，5μl的25mM MgCl2，4μl的2.5mM的各種dNTP，5μl的20μM DOP-PCR 6MW，5U的Taq聚合酶(Perkin Elmer，Norwalk，CT，美國)，以及超純水(Biotech International，Perth，WA，澳大利亞)至體積為50μl。這些PCR管放入MJ Research Minicycler(波士頓，馬薩諸塞州，美國)進行95℃5分鐘的初始變性步驟。然后以94℃1分鐘，30℃1.5分鐘和72℃3分鐘(上升幅度為每4秒1℃將溫度從30℃升至72℃)為循環(huán)條件進行8輪的低嚴謹擴增；然后以94℃1分鐘，62℃1分鐘和72℃3分鐘以及每輪循環(huán)加14秒的延伸步驟為條件進行26輪的高嚴謹擴增。最后在循環(huán)擴增結(jié)束時加上72℃、10分鐘的延伸步驟。PCR產(chǎn)物準備好用于標記的強化第二輪DOP-PCR。
實施例7用于Cy3/Cy5標記的第二輪DOP-PCR5μl的第一輪DOP-PCR產(chǎn)物(1/10體積)轉(zhuǎn)移到0.5ml新鮮的PCR管并進行用于Cy3-dUTP/Cy5-dUTP(PA 53022/PA 55022，Amersham Phamacia Biotech，美國)標記的第二輪DOP-PCR擴增。使用MJ Research Mimicycler(波士頓，WA，美國)進行體積為50μl的25輪擴增，并且循環(huán)條件與FISH實驗(上述)中用于標記DNA文庫的相似，除了用Cy3-dUTP或Cy5-dUTP取代SpectrumRed或SpectrumGreen。Cy3-dUTP或Cy5-dUTP均以0.04mM的濃度使用。然后使用UltracleanTMPCR清除試劑盒(#12500-250，Mo Bio Laboratories，Inc.，CA，美國)純化PCR產(chǎn)物并用50μl的10mM Tris-HCl或H2O洗脫。5μl的PCR產(chǎn)物在0.5×TBE(Tris，硼酸鹽，EDTA)中溴化乙錠預(yù)染色的1％瓊脂糖凝膠上進行電泳并拍照。剩余的可立即用于微陣/CGH實驗或于-20℃短時儲存幾周。
實施例8微陣/CGH分析等量(5～10μl)的Cy3標記的測試單細胞DOP-PCR產(chǎn)物和Cy5標記的參考單細胞DOP-PCR產(chǎn)物與70μg的人Cot-1 DNA(GIBICO，BRL)和20μg的鮭精DNA(GIBICO，BRL)混合。用乙醇沉淀所得到的DNA混合物并重懸于10μl雜交溶液中，該溶液含有50％去離子甲酰胺，2×SSC，0.1％SDS，10％葡聚糖硫酸酯和5×Denhardt溶液。雜交混合物加熱至80℃10分鐘使DNA探針變性，然后在37℃進行重復(fù)序列預(yù)退火180分鐘。于37℃進行雜交17～20小時。雜交后洗滌包括用50％的甲酰胺/2×SSC、pH7.0于45℃洗滌3次，10分鐘；2X SSC于45℃洗滌片兩次，5分鐘；1×SSC于室溫洗滌一次，10分鐘。最終，載玻片在水中簡單洗滌數(shù)秒并于黑暗中空氣干燥，然后盡可能立即掃描。
實施例9載玻片掃描和數(shù)據(jù)分析使用稱為GenePix 4000B(Axon Instruments，Inc.，CA，美國)的雙重激光掃描儀掃描微陣載玻片，該掃描儀可同時掃描Cy3(532nm處)和Cy5(635nm處)并實時產(chǎn)生比值圖像。這些圖像進一步用GenePix Pro 3.0.6.66(Axon Instruments，Inc.，美國)的軟件分析。該軟件計算所有DNA點在兩種波長(Cy3/Cy5)處的信號強度和局部背景強度并產(chǎn)生大量的原始數(shù)據(jù)，其中5種不同的比值是最重要的中值比、平均值比、比值的中值、比值的平均值和回歸比。該軟件也通過使用全球標準化方法提供了5種比值各自的標準化因子，該方法基于所有分析特性的平均值是1.0的假定。標準化的比值可通過不同的陣列實驗結(jié)合或比較。本項研究中選擇中值比，而相同探針的所有合適點的標準化比值(Cy5/Cy3)的平均值最后用于最終的分析。1.0的標準化比值被認為測試與參考之間拷貝數(shù)無差異。比值變化大說明拷貝數(shù)的顯著差異。本項研究使用小于0.8(常染色體)或0.75(性染色體)作為三體性的截斷閾值以及大于1.2(常染色體)或1.25(性染色體)作為單體性的截斷閾值來確定單拷貝變化的非整倍性。這些截斷閾值的標準經(jīng)常用在診斷基因組序列的單拷貝變化的基因組比較雜交中。
中值比的定義是每種波長的每個性能(DNA點)的中值強度減去中值背景的比值。以下是通過該軟件確定中值比的標準化因子所使用的步驟1)確定每種性能的中值比的對數(shù)值；2)計算所有對數(shù)值的平均值(“Avglog”)；3)計算真實平均值(“TrueAvg”)。TrueAvg＝10^Avglog4)確定標準化因子(NF)。NF＝1/TrueAvg。
5)通過NF×中值比來計算標準化的中值比。
實施例10單細胞DNA微陣/CGH的結(jié)果47、XX、+13和47、XY、+18的單羊水細胞用作測試樣品并用Cy3-dUTP(綠色)標記，而正常男性46、XY的單淋巴細胞用作參考樣品并用Cy5-dUTP(紅色)標記。雜交后洗滌之后，干燥陣列載玻片并立即用能產(chǎn)生單波長和雙波長圖像的GenePix 4000B掃描。這些圖像可以24-字節(jié)的JPEG圖像保存，也可默認為16-字節(jié)的無符號TIFF圖像。整個CGH過程約需30小時。
圖5是得自47、XX、+13對46、XY的單細胞微陣/CGH實驗?；A(chǔ)分析表明在靶DNA點上有幾個出現(xiàn)更綠或更紅的染色體區(qū)域。然而，最終對靶染色體拷貝數(shù)的解釋得自其對應(yīng)的DNA點的比值(見圖)。
類似地，圖6是得自47、XX、+18對46、XY的單細胞微陣/CGH實驗。該圖給出最終對靶染色體拷貝數(shù)的解釋獲得自其對應(yīng)的DNA點的比值。
16-字節(jié)的無符號TIFF圖像是可由許多圖形和圖像程序閱讀的標準未未壓縮圖形文件形式。這些圖像用于提取數(shù)據(jù)。本項研究中使用GenePix Pro 3.0.6.66分析TIFF圖像，該軟件對每個微陣/CGH實驗產(chǎn)生了綜合的數(shù)據(jù)報表(Excel格式)。本項研究中選擇的中值比來解釋最終的結(jié)果，并且最終使用相同DNA探針的所有合適的DNA點的平均中值比。圖5和6的圖像中所有人染色體的平均中值比示于表1。
表1

表1中結(jié)果的圖形說明見圖6。
表1中的數(shù)據(jù)表明在單細胞微陣/CGH實驗中，47、XX、+13對46、XY的點13、18、X和Y處的平均中值比分別是0.6470、0.9321、0.7328和1.568。
在47、XY、+18對46、XX的情況中，染色體13、18、X和Y的比值分別變?yōu)?.1038、0.6691、1.4254和0.6601。如果將0.75-1.25的截斷閾值應(yīng)用于確定染色體、三性體13和+18的單拷貝變化，加上染色體X和Y的拷貝數(shù)差異可正確地建立用于這兩個單細胞微陣/CGH實驗的所有測試和參考樣品。
所有其它20種不同的染色體的預(yù)期的平均中值比應(yīng)在截斷閾值0.75-1.25內(nèi)，因為這些染色體的拷貝數(shù)在測試樣品與參考樣品之間沒有任何差異。表1中的數(shù)據(jù)表明其它20種染色體的大部分很好在該閾值范圍內(nèi)。47、XX、+13對46、XY的染色體21的平均中值比是1.2860，而47、XY、+18對46、XX的染色體5、10和18的平均中值比是1.47660、1.2996和0.72339。
實施例11使用具有大小選擇的PCR擴增DNA的DNA陣列(第二代陣列)進行的CGH的重現(xiàn)性除了使用具有大小選擇的DNA的第二代陣列外，實驗方案與上述相同。該陣列也含有大小選擇之前的原始DNA文庫。等份的正常男性和正常女性細胞DOP-PCR反應(yīng)產(chǎn)物用Cy3或Cy5標記并根據(jù)下表2中所述的組合進行雜交。
表2

(1)本項研究所用的所有單淋巴細胞包括10DH細胞和11NH細胞。
(2)使用超過一次的細胞包括DH1、NH9、DH13。
表2(續(xù))

(1)這里使用的總單淋巴細胞包括10DH細胞和11NH細胞。
(2)使用超過一次的細胞包括DH1、NH9、DH13。
表2顯示了使用我們的陣列的單細胞基因組比較雜交實驗是高度重現(xiàn)的，所有的染色體(除了Y染色體)在14個實驗中至少13個產(chǎn)生了完美的結(jié)果。大小選擇的Y染色體點比非大小在先額的點更精確。對應(yīng)于上述實驗(NH7 1h)中的一個數(shù)據(jù)示于圖7。表3顯示了用計算機計算的比值
表3

實施例12使用具有大小選擇的PCR擴增DNA文庫的DNA陣列(第二代陣列)檢測18三體性和性別的單細胞CGH使用上述的第二代陣列，將47、XY、+18的單羊水細胞用作對單淋巴細胞46、XX的測試樣品。圖8顯示了與陣列雜交的結(jié)果。原始數(shù)據(jù)和標準化的比值示于圖4?？梢钥吹?，成功地檢測到存在18三體性。
表4

實施例13使用約100個細胞的樣品陣列CGH(i)制備樣品含有成纖維細胞系(47、XY、+18)的兩個試管從液氮中解凍并立即于37℃孵育10分鐘，用1×PBS洗滌兩次，然后懸浮于500μl的1×PBS。
如圖10所示使用倒置顯微鏡以20×10的放大率(CK2，Olympus，日本)在超凍(superfrost)顯微鏡的玻璃載玻片(Menzel-Glaser，德國)上進行細胞分選。簡言之，載玻片以無菌的70％乙醇(Delta West Pty Ltd，澳大利亞)徹底洗滌并裝在顯微鏡上。在載玻片的左側(cè)吸取100μl RPMI培養(yǎng)基(Sigma)并加入1μl成纖維細胞懸浮液。在RPMI池的右側(cè)依次形成另三個1×PCR緩沖液(50mMKCl，10mM Tris-HCl，pH8.3)較小池(約50μl)并分別命名為(從左到右)1×PCR緩沖液池#1、池#2和池#3(圖10)。使用9”、擠壓的、塞有棉花的玻璃巴斯德移液管從RPMI池中吸取成纖維細胞，然后將約500個細胞轉(zhuǎn)移至1×PCR緩沖液池#1。使用新鮮的移液管將少于200個細胞轉(zhuǎn)移至1×PCR緩沖液池#2。用新鮮的移液管從池#2中吸取約100個細胞并轉(zhuǎn)移至1×PCR緩沖液池#3。用新鮮的移液管吸出這些細胞并在新鮮的位置慢慢地抽入和抽出吸管的末端。洗滌后使用最少量的PCR緩沖液將這些細胞吸入移液管的末端，然后轉(zhuǎn)移進0.5ml無菌PCR管。立即使用分離的細胞。
(ii)使用約100個細胞的陣列CGH約100個細胞的樣品如實施例6和7所述用Cy3-dUTP標記。
進行以下的兩個獨立的陣列CGH實驗(實驗A和實驗B)實驗A在該實驗中，使用100個成纖維細胞(48、XY、+18、Cy3)對正常男性基因組DNA(46、XY、Cy5)進行陣列CGH。該實驗的結(jié)果示于圖10(上幅)。如預(yù)期的一樣，得到染色體18的預(yù)計比值＞1.25以及所有其它的21種常染色體的預(yù)計比值在0.75-1.25范圍內(nèi)。得到的X染色體的比值也在0.75-1.25范圍內(nèi)，這表明正確確定了測試成纖維細胞系的男性性別。
實驗B在該實驗中，使用100個成纖維細胞(48、XY、+18、Cy3)對5到10個單一正常男性細胞的合并混合物(46、XY、Cy5)進行陣列CGH。該實驗的結(jié)果示于圖10(下幅)。得到染色體18的預(yù)計比值＞1.25以及所有其它的21種常染色體的預(yù)計比值在0.75-1.25范圍內(nèi)。X染色體的比值也在0.75-1.25范圍內(nèi)，這表明正確診斷了測試成纖維細胞系的男性性別。
實施例14使用DOP-PCR擴增的Cot-1 DNA的陣列CGH(i)擴增Cot-1 DNA使用DOP-PCR在Minicycler(MJ Research，美國)中擴增體積為50μl的100ngCot-1 DNA(目錄號，15279-011，Invitrogen)，其中含有5U Taq聚合酶(AppliedBiosystems)，和終濃度50mM KCl、10mM Tris-HCl pH8.3、0.1mg/ml明膠、2.5mMMgCl2、200μM的各種dNTP、2μM DOP-PCR 6MW引物(5′CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3′)(Telenius等.，1992)。簡單離心樣品，于95℃變性5分鐘，以94℃1分鐘，30℃1.5分鐘和72℃3分鐘(在退火和延伸步驟之間的升溫幅度為每4秒1℃)為循環(huán)條件進行8輪擴增；然后以94℃1分鐘，62℃1分鐘和72℃3分鐘開始但每輪循環(huán)加14秒為條件進行29輪擴增，以及72℃10分鐘的最終延伸步驟。5μl擴增產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上展開(圖11上幅)，剩余的進行純化。
如泳道1所示，擴增的Cot-1 DNA是具有主要從250kp到2kb范圍的成片條帶。DNA標記是SPP-1/EcoR1(M1)和pUC 19/Hpall(M2)。
(ii)使用DOP-PCR擴增的Cot-1 DNA的陣列CGH的結(jié)果用Cy3-dUTP標記的女性單細胞對用Cy5-dUTP標記的5個男性單細胞的合并混合物的一個陣列CGH實驗完全按照上述進行，除了使用140μl DOP-PCR擴增的Cot-1 DNA取代70μg Cot-1 DNA(目錄號，15279-011，Invitrogen)。從該實驗得到的所有24種染色體的比值示于圖11的下幅，該圖表明所有22種常染色體的比值均在0.75-1.25范圍內(nèi)，并且得到了X染色體的＞1.25的預(yù)期比值。然而，Y染色體的結(jié)果是不能允許的。
如預(yù)期的一樣，所有22種常染色體的比值在0.75-1.25范圍內(nèi)，X染色體得到＞1.25的比值，該結(jié)果正確地表明測試單細胞的女性性別。
實施例15裂球陣列CGH分析1.材料與方法(i)制備單裂球使用的3個冷凍的人IVF胚胎得自IVF澳大利亞，Westmead，新南威爾士州，澳大利亞胚胎解凍、簡單孵育、解聚并將每種細胞吸入聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)試管。這些PCR試管置于干冰并通過郵政快遞寄到我們實驗室。從三個冷凍胚胎中得到總數(shù)為12個單裂球。
(ii)裂解單裂球使用5μl裂解緩沖液(200mM KOH，50mM二硫蘇糖醇)于65℃單裂球裂解10分鐘，然后使用5μl的中和溶液(300mM KCl，900mM Tris-HCl，200mM HCl，pH8.3)中和。
(iii)隨機擴增單細胞的第一輪DOP-PCR第一輪DOP-PCR在Minicycler(MJ Research，美國)中進行，反應(yīng)液體積為50μl，其中含有單細胞裂解和中和液(10μl)，5U Taq聚合酶(Applied Biosystems)和終濃度50mM KCl、10mM Tris-HCl pH8.3、0.1mg/ml明膠、2.5mM MgCl2、200μM的各種dNTP、2μM DOP-PCR 6MW 引物(5′CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3′)(Telenius等.，1992)。簡單離心樣品，于95℃變性5分鐘，以94℃1分鐘，30℃1.5分鐘和72℃3分鐘(在退火和延伸步驟之間的升溫幅度為每4秒1℃)為循環(huán)條件進行8輪擴增；然后以94℃1分鐘，62℃1分鐘和72℃3分鐘開始以及每輪循環(huán)加14秒為條件進行26輪擴增，以及72℃10分鐘的最終延伸步驟。
(iv)用于Cy3/Cy5標記的第二輪DOP-PCR第一輪DOP-PCR產(chǎn)物(5μl)在體積為50μl的反應(yīng)液中標記，其中含有5U Taq聚合酶(Applied Biosystems)和終濃度50mM KCl，10mM Tris-HCl pH8.3，2.5mMMgCl2，160μM的各種dGTP、dCTP和dATP，120μM dTTP，40μM的Cy3-dUTP或Cy5-dUTP(Amersham Phamacia Biotech，美國)和2μM DOP-PCR 6MW引物。簡單離心樣品，于95℃變性4分鐘，以94℃1分鐘，62℃1分鐘和72℃3分鐘開始以及每輪循環(huán)加10秒為條件進行25輪擴增。最后加上72℃10分鐘的延伸步驟。通常5μl各種DOP-PCR產(chǎn)物以0.5×TBE在1％瓊脂糖凝膠上展開來檢測擴增的質(zhì)量，剩余的產(chǎn)物進行純化。
(v)純化Cy3-和Cy5-標記的產(chǎn)物Cy3-或Cy5-標記的DOP-PCR產(chǎn)物用UltraCleanTMPCR清除試劑盒(Mo BioLaboratories，美國)按照廠家的使用說明進行純化。簡言之，5體積的SpinBind(鹽酸胍/異丙醇)加入PCR產(chǎn)物(45μl)，然后通過移液管抽吸徹底混合。PCR/SpinBind混合物轉(zhuǎn)移至離心過濾元件并在微型離心機中以14,000rpm離心10-30秒。棄去收集管中的液流并向同一個離心過濾元件加入300μl SpinClean緩沖液(乙醇溶液)，然后以14,000rpm離心30-60秒。用新鮮的收集管取代含有液流的收集管并向同一個離心過濾元件的過濾膜上直接加入50μl的洗脫緩沖液(10mM Tris，pH8.0，無DNA酶)，然后以14,000rpm離心30-60秒。棄去離心過濾籃，收集管含有純化的Cy3-后Cy5-標記探針。這些純化的探針不含任何PCR反應(yīng)成分，例如DOP-PCR 6MW引物、Taq聚合酶和Cy3-dUTP與Cy5-dUTP，并且可立即用于陣列CGH或在陣列CGH分析前于-20℃保存至少兩個月。5μl各種純化產(chǎn)物總是在1％瓊脂糖上展開來檢測標記和純化的效率。
(vi)陣列CGH等體積(5～10μl)的各種Cy3-標記(測試)與Cy5-標記(參考)的DOP-PCR產(chǎn)物與70μg的人Cot-1 DNA(GIBCO，BRL)、20μg的剪切鮭精DNA(GIBCO，BRL)混合并用兩體積的100％乙醇和1/10體積的3M NaAC(pH5.2)沉淀。得到的混合物置于-20℃兩小時，然后于4℃以14,000rpm離心25分鐘。得到的DNA沉淀用70％乙醇洗滌一次，然后于4℃以14,000rpm離心10分鐘，在黑暗中空氣干燥或于60℃烘箱中干燥，最后溶解于10μl雜交溶液(50％去離子甲酰胺、3×SSC、0.1％葡聚糖硫酸酯和5×Denhardt溶液)。80℃、10分鐘變性和37℃80分鐘預(yù)退火后，探針混合物涂布于陣列區(qū)域并用蓋玻片覆蓋。于37℃在潮濕孵育箱內(nèi)雜交15～20小時。雜交后，載玻片浸在50％甲酰胺/2×SSC中直至蓋玻片自動脫落(通常需要10分鐘)。雜交后洗滌包括于45℃在50％甲酰胺/2×SSC中洗滌兩次，每次10分鐘；于45℃在2×SSC中洗滌兩次，5分鐘；于室溫在1×SSC中洗滌一次，10分鐘，和在MilliQ H2O中簡單清洗三次。上述所有用于洗滌的溶液在洗滌之前均用0.22μm過濾器(MILLIPORE，美國)過濾。洗滌后，載玻片在黑暗中干燥，然后立即掃描，或者載玻片可在黑暗中于室溫至少保存73天。
(vii)陣列掃描和數(shù)據(jù)分析GenePix4000B是一臺完整的科學(xué)儀器，具有用于掃描載玻片的GenePix4000B掃描儀和用于數(shù)據(jù)分析的軟件GenePix Pro(Axon Instruments，Union City，CA，美國)。GenePix 4000B激光儀于532nm(綠色)和635nm(紅色)處激發(fā)。發(fā)射濾光器是575DF35(綠色；～557-592nm)和670DF40(紅色；～650-690nm)。這些激光儀和過濾器是為Cy3和Cy5優(yōu)選的。GenePix 4000B掃描儀同時掃描Cy3和Cy5，以10μm的分辨率全部掃描一塊標準的顯微鏡載玻片(25mm×75mm)需要約5分鐘(以5μm的分辨率進行全掃描需要不到12分鐘)，而用戶自定義的亞掃描需時更少。
陣列掃描簡言之，預(yù)覽掃描(40μm分辨率)用于在載玻片上定位陣列并設(shè)置包括光電倍增管(PMT)電壓、掃描區(qū)域和激光功率在內(nèi)的掃描參數(shù)。然后使用高分辨率(10μm)數(shù)據(jù)掃描以獲得用于CGH分析的圖像。光電倍增管(PMT)獲得用于本項研究的范圍在400-900的兩個信道的電壓，而兩個信道的激光功率總數(shù)為100％水平。由GenePix4000B獲得的基本數(shù)據(jù)是單波長圖像，并且這些圖像默認以16-字節(jié)灰度的TIFF(標簽圖像文件格式)保存于單個多重圖像中，其中包括保存于TIFF和JPEG(聯(lián)合圖像專家組)格式的Cy5/Cy3比值圖像。TIFF文件用于分析，而JPEG文件僅用于說明。
數(shù)據(jù)分析GenePix Pro 4.0.1.12軟件用于分析TIFF圖像。簡言之，GenePix Pro使用GenePix陣列列表文件(GAL file)來定位所有性能的大小和位置。分析后，結(jié)果以GPR文件(GenePix結(jié)果格式)保存，該文件包括由圖像獲得和分析的一般信息以及從每種性能中析取出的包括40多種不同參數(shù)的數(shù)據(jù)組成的標題(header)。在該研究中，選擇減去中等背景的像素強度的像素對像素(pixel-by-pixel)比值(Cy3/Cy5)的中值進行解釋。
排除用于數(shù)據(jù)分析的點GPR文件的7種不同的參數(shù)在該項研究中用于數(shù)據(jù)過濾，包括1.Dia.性能指示器的直徑(μm)2.＞％B635+2SD在1#波長(635nm，Cy5)處的性能像素百分率，具有的強度在背景像素強度之上多于兩個標準偏差3.＞％B532+2SD在2#波長(523nm，Cy3)處的性能像素百分率，具有的強度背景像素強度之上多于兩個標準偏差4.SNR6351#波長(635nm，Cy5)信-噪比，確定為(前景1的平均值-背景1的平均值)/(背景1的標準偏差)5.SNR5322#波長(532nm，Cy3)信-噪比，確定為(前景1的平均值-背景1的平均值)/(背景1的標準偏差)6.F635％Sat.波長#1(Cy5)處飽和的性能像素的百分率7.F532％Sat.波長#2(Cy3)處飽和的性能像素的百分率未能通過以下參數(shù)之一的點從分析中排除(1)Dia.＞50pm，(2)＞％B635+2SD＞70，(3)＞％B532+2SD＞70，(4)SNR635＞3.0，(5)SNR532＞3.0，(6)F635％Sat.＝O和(7)F532％Sat.＝O。這些參數(shù)的定義如Axon儀器所給予的。
比值標準化從8個合格的復(fù)制品計算每種染色體比值的平均值。然后假定每個陣列CGH雜交中所有常染色體的平均比值是1.0，使用所有常染色體的22個比值的平均值進行標準化。該標準化方法按生產(chǎn)商(Axon儀器)所述進行并可簡單地描述為以下步驟均分每個染色體的所有包括點的比值的中值得到原始平均值確定每個比值的中值的原始平均值的對數(shù)值計算所有對數(shù)值的平均值(“Avglog”)計算真實平均值(“TrueAvg”)，TrueAvg＝＝10^Avglog確定標準化因子(NF)(NF＝1/TrueAvg)應(yīng)用標準化因子將所有比值的中值的原始平均值重定標(比值的中值的標準化平均值＝NF×比值的中值的原始平均值)得到標準化的比值。
2.裂球陣列CGH的結(jié)果
(i)通過DOP-PCR的單裂球的隨機擴增和標記如圖12所示，DOP-PCR預(yù)擴增和用Cy3標記后，獲得自供研究的3個冷凍VIF產(chǎn)生的卵裂階段胚胎的所有12個裂球產(chǎn)生了令人滿意的Cy3標記產(chǎn)物，這些產(chǎn)物在用溴化乙錠染色的1％瓊脂糖凝膠上進行大小分級分離后得到300bp到2500bp的條帶，其中含有約為450bp和600bp的兩個特異條帶。
(ii)使用陣列CGH的單裂球染色體分析使用5-10個用Cy5標記的正常男性單細胞DOP-PCR產(chǎn)物的合并混合物作為參考物質(zhì)進行陣列CGH分析。由于陣列的可用性有限，僅可分析12個可用裂球中的10個。使用陣列CGH分析的10個裂球中，2個由于高熒光背景未能產(chǎn)生可分析的結(jié)果，這可能是雜交步驟采用的相對濕度偶然太低于標準95％。
8個產(chǎn)生可分析陣列CGH結(jié)果的裂球中，發(fā)現(xiàn)3個正常具有明顯的女性核型(46，XX)(胚胎A的裂球1和4，胚胎C的裂球2)。4個細胞是非整倍性的，其中兩個具有21三體性和明顯的女性核型(胚胎A的裂球2，胚胎B的裂球1)。其它兩個細胞對于染色體2l(胚胎B的裂球2)和18(胚胎C的裂球3)是非整倍性的，而對于染色體1和12分別可能是單體性的。最后，一個裂球(胚胎A的裂球3)得到明顯的混亂核型并對6種不同的CSL(包括CSLl、7、8、14、17和20)具有＜0.75的比值，而對其它7種CSL(包括CSL2、5、10、12、13、18和21)具有＞1.25的比值。此結(jié)果表明該裂球?qū)?種染色體(染色體1、7、8、14、17和20)具有單體性，而對其它7種(染色體2、5、10、12、13、18和21)具有三體性。
觀察到分析的所有3個胚胎均是鑲嵌型的。胚胎A的四個分析細胞中兩個是正常的，一個是21三體性的，另一個具有廣泛的非整倍性(混亂的)。胚胎B的二個分析細胞均是21三體性，其中的一個可能具有1單體性。胚胎C的兩個分析細胞中，一個是正常的，另一個是18三體性并可能具有12單體性。性別測定表明所有三個胚胎均具有明顯的女性核型并且這與每個胚胎的除混亂裂球(胚胎A的裂球3)以外的所有細胞一致，該裂球未能得到用于性別測定的CSLx的觀察比值0.9的重量。
實施例16制備用于陣列印刷的BAC DNA探針BAC DNA探針來源(來自婦女兒童醫(yī)院，阿德萊德)RP-11-265k23(5q35)RP-11-849(17p11.2)RP-11-354m20(10q25.2-26.11) RP-11-280F22(10q25.3)
RP-11-113m14(10q26.13)RP-11-70E19(10q26.12)RP-11-10P15(10126.13) RP-11-506P9(10q25.3)源BAC DNA稀釋并通過DOP-PCR擴增使用一輪常規(guī)的DOP-PCR(Telenius，1992)擴增100ng的各種稀釋的BACDNA，5μl的每種擴增產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上展開，純化剩余產(chǎn)物并用PCR純化試劑盒將其洗脫進50μl超純水。如圖13所示，除了RP-11-849(17p11.2)，所有其它的7種探針均成功地通過DOP-PCR擴增。
制備用于陣列印刷的缺失BAC DNA通過切口平移試劑盒(目錄號976776)用生物素-16-dUTP(目錄號1,093070，Roche)標記25μg人Cot-1 DNA(目錄號15279-011，Invitrogen)并使用按照生產(chǎn)商的使用說明使用Ultrapure PCR純化試劑盒(目錄號12500-250，Mo Bio Laboratories Inc.美國)純化，然后用0.1體積的3M NaAc(pH5.2)和2體積的100％冷乙醇沉淀，在烘箱內(nèi)60℃干燥并重懸于100μl TE緩沖液中。
按照生產(chǎn)商的使用說明制備4.4mg(440μl)鏈霉抗生物素蛋白磁性顆粒并重懸于125μl 10mM TRIS-HCl、pH8.0，1mM EDTA、pH 8.0，2M NaCl(2×結(jié)合和洗滌緩沖液)中。
125μl制備的鏈霉抗生物素蛋白磁性顆粒與100μl生物素化的Cot-1 DNA混合并于室溫軸向旋轉(zhuǎn)孵育40分鐘。然后將試管應(yīng)用于磁性顆粒分離器10分鐘。
這些珠在0.1×SSC、0.1％SDS中于室溫洗滌三次，然后于65℃在0.1×SSC、0.1％SDS中洗滌三次以除去未結(jié)合的Cot-1 DNA。這些珠懸浮進100μl的6×SSC、0.1％SDS。
用1/10體積的3M NaAc(pH5.2)和2體積的100％冷乙醇沉淀混合有6 BACDNA的分別為1μg的5q25 BAC DNA和10q25-26，在烘箱內(nèi)65℃干燥并重懸于100μl 6×SSC、0.1％SDS。
100μl制備的珠和100μl各種源BAC DNA一起混合，煮沸10分鐘變性，并于65℃雜交過夜。
然后將試管應(yīng)用于磁性顆粒分離器3分鐘，小心地棄去上清液，按照生產(chǎn)商的使用說明使用Ultrapure PCR純化試劑盒純化并懸浮于50μl TE緩沖液(10mMTRIS-HCl、pH8.0，0.1mM EDTA、pH8.0)。
5μl的洗脫產(chǎn)物經(jīng)過CAT4DOP-PCR擴增(Craig，1997)。5μl的各種產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠上檢測(圖13下幅)，剩余的純化、洗脫進50μl超純水并點樣于前述的芯片上。
實施例17制備用于陣列印刷的SEP-PCR探針(i)Y染色體特異性序列10個不同的DYS基因座選自DYS19(3682bp) DYS385(4676bp)DYS389(4244bp)DYS390(3872bp)DYS391(4039bp)DYS392(3252bp)DYS393(3454bp)DYS437(3043bp)DYS438(3010bp)DYS439(2054bp)(ii)男性基因組DNA樣品的來源使用Qiagen試劑盒標準方案合并基本上來自淋巴細胞制備物的DNA，該淋巴細胞制備物是來自十多種正常男性的不同樣品，這些正常男性包括不同的國籍，例如亞洲人、高加索人和希臘人等。將10μl的各種樣品混合在一起以制得合并的男性DNA。
(ii)擴展的長模板PCR(ELT-PCR)擴增按照生產(chǎn)商的使用說明使用擴展的長模板PCR系統(tǒng)(目錄號1681 842，Roche)為每個基因座進行總體積為50μl的PCR。10個DYS基因座中僅成功擴增了7個，并且如圖14的上幅所示，10μl的各種擴增產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上展開。這些擴增產(chǎn)物命名為S1-S7，包括S1(DYS 19)、S2(DYS 385)、S3(DYS 389)、S4(DYS 390)、S5(DYS 437)、S6(DYS 439)和S7(DYS 393)。S1、S2、S3和S4的樣品合并在一起且命名為SP1。用于擴增這10種不同DYS基因座的引物的序列列于表5。
(iii)使用ELT-PCR擴增產(chǎn)物的DOP-PCR1μl的各四種DYS基因座特異的ELT-PCR擴增產(chǎn)物(DYS17、DYS385、DYS389和DYS390)再經(jīng)過另一輪的DOP-PCR擴增。如圖14下幅所示，5μl的每種擴增產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上展開，剩余的使用Ultrapure純化試劑盒純化并保存于-20℃。這些擴增產(chǎn)物命名為SD1-SD4，包括SD1(DYS19)、SD2(DYS385)、SD3(DYS389)和SD4(DYS390)。SD1、SD2、SD3、和SD4的樣品合在一起并且命名為SPD1。
表5.
為了制備用于陣列印刷的探針和制備用于使用選擇性增強的引物延伸預(yù)擴增(SEP)的陣列CGH分析的單細胞靶位而擴增10個不同的DYS基因座所用的引物

實施例18使用SEP-PCR技術(shù)制備用于陣列CGH分析的Cy3-和Cy5-dUTP-標記的靶序列(i)Y染色體特異性序列7個不同的DYS基因座選自DYS19(3682bp) DYS385(4676bp)DYS389(4244bp)DYS390(3872bp)DYS393(3454bp)DYS437(3043bp)DYS439(2054bp)(ii)SEP擴增策略單細胞DOP-PCR按上述進行，除了向第一輪和第二輪DOP-PCR中加入不同組合的DYS引物，包括第一組合在第一輪和第二輪DOP-PCR中均加入1μl的合并引物(0.1pmol，僅是F-引物)第二組合在第一輪和第二輪DOP-PCR中均加入1μl的合并引物(0.1pmol，F(xiàn)-和R-引物)第三組合在第一輪和第二輪DOP-PCR中均加入1μl的合并引物(0.1pmol，F(xiàn)-引物)第四組合在第一輪和第二輪DOP-PCR中均加入1μl的合并引物(0.1pmol，F(xiàn)-和R-引物)4個女性的單細胞(圖15的上幅)和4個男性的單細胞(圖15的下幅)使用上述各自的條件獨立擴增。如圖15所示，5μl的每種擴增產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上展開，剩余的使用Ultrapure純化試劑盒純化。
最后，應(yīng)該理解的是，在不脫離本發(fā)明的范圍和精神的條件下，對文中描述的本發(fā)明方法和組合物做出各種改進和改變對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。雖然用具體的優(yōu)選實施方案對本發(fā)明進行了描述，但應(yīng)該理解要求權(quán)利的本發(fā)明不應(yīng)該被不恰當?shù)叵拗朴谶@些特定的實施方案。實際上，實踐本發(fā)明的所述方式的各種改進形式也要包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，這種改進形式對于檢測染色體異常、產(chǎn)前診斷和植入前遺傳診斷、分子生物學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。
權(quán)利要求
1.一種將具有第一核型的細胞的至少一條染色體或其一部分與具有第二核型的細胞的對應(yīng)染色體或其一部分進行比較的方法，所述方法包括以下步驟(a)從分離的染色體或分離染色體的一部分擴增DNA；(b)將擴增的DNA與固體基質(zhì)相連；(c)從具有第一核型的一個或多個細胞擴增DNA并從具有第二核型的一個或多個細胞擴增DNA；(d)用第一標記來標記擴增自具有第一核型的一個或多個細胞的DNA，并用第二標記來標記擴增自具有第二核型的一個或多個細胞的DNA，其中所述第一種和第二標記有可檢測的不同；(e)將來自具有第一核型的一個或多個細胞的擴增并標記的DNA與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交，并將來自具有第二核型的一個或多個細胞的擴增并標記的DNA與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交；和(f)比較與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交的第一種和第二標記的相對量。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述從分離的染色體或分離染色體的一部分擴增DNA是隨機引物擴增。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述隨機引物擴增包括使用簡并寡核苷酸引物。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述簡并寡核苷酸引物由以下核苷酸序列組成5′-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3′，其中N是任何核苷酸。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其特征在于，所述分離的染色體是通過顯微切割或流式細胞術(shù)分離的染色體。
6.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其特征在于，所述分離染色體的一部分是染色體的克隆片段。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述來自分離染色體的一部分的擴增DNA排除了非染色體序列。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項所述的方法，其特征在于，所述來自分離的染色體或分離染色體的一部分的擴增DNA排除了重復(fù)序列和/或由于擴增DNA而超表現(xiàn)的序列。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述來自分離的染色體或分離染色體的一部分的擴增DNA排除了重復(fù)序列。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述重復(fù)序列是Cot-1序列。
11.如權(quán)利要求1-10中任一項所述的方法，其特征在于，將擴增DNA連接到固體基質(zhì)之前，所述來自分離的染色體或分離染色體的一部分的擴增DNA是經(jīng)過大小選擇的。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述來自分離的染色體或分離染色體的一部分的擴增DNA是經(jīng)過大小選擇的，其DNA大小小于10kb。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述來自分離的染色體或分離染色體的一部分的擴增DNA是經(jīng)過大小選擇的，其DNA大小小于3kb。
14.如權(quán)利要求1-13中任一項所述的方法，其特征在于，所述從具有第一核型的一個或多個細胞擴增DNA和從具有第二核型的一個或多個細胞擴增DNA是隨機引物擴增。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述隨機引物擴增包括使用簡并寡核苷酸引物。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述簡并寡核苷酸引物由以下核苷酸序列組成5′-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3′，其中N是任何核苷酸。
17.如權(quán)利要求1-16中任一項所述的方法，其特征在于，所述來自具有第一核型的一個或多個細胞的擴增DNA和來自具有第二核型的一個或多個細胞的擴增DNA均排除了重復(fù)序列。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述重復(fù)序列是Cot-1序列。
19.如權(quán)利要求1-18中任一項所述的方法，其特征在于，所述來自具有第一核型的一個或多個細胞的擴增DNA是擴增自1-20個細胞的DNA。
20.如權(quán)利要求1-18中任一項所述的方法，其特征在于，所述來自具有第一核型的一個或多個細胞的擴增DNA是擴增自單細胞的DNA。
21.如權(quán)利要求1-19中任一項所述的方法，其特征在于，所述具有第一核型的一個或多個細胞是胚胎細胞、胎兒細胞、生殖細胞、癌性細胞或極體。
22.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述單細胞是胚胎細胞、卵母細胞或極體。
23.如權(quán)利要求1-22中任一項所述的方法，其特征在于，所述具有第二核型的一個或多個細胞是與具有第一核型的一個或多個細胞相同類型的細胞。
24.如權(quán)利要求1-23中任一項所述的方法，其特征在于，所述來自具有第二核型的一個或多個細胞的擴增DNA是擴增自與具有第一核型的一個或多個細胞相同數(shù)目的細胞的DNA。
25.如權(quán)利要求1-24中任一項所述的方法，其特征在于，所述從分離的染色體或分離染色體的一部分擴增DNA還包括擴增特定的染色體區(qū)域。
26.如權(quán)利要求1-25中任一項所述的方法，其特征在于，所述從具有第一核型的一個或多個細胞擴增DNA和從具有第二核型的一個或多個細胞擴增DNA還包括擴增相同的特定染色體區(qū)域。
27.如權(quán)利要求1-26中任一項所述的方法，其特征在于，所述第一標記是Cy3-dUTP，第二標記是Cy5-dUTP。
28.如權(quán)利要求1-27中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法用于胚胎或卵母細胞的植入前診斷。
29.如權(quán)利要求1-27中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法用于產(chǎn)前診斷胎兒的染色體異常。
30.一種檢測具有未知核型的細胞內(nèi)染色體異常的方法，所述方法包括以下步驟(a)從分離的染色體或分離的染色體的一部分擴增DNA；(b)將擴增的DNA與固體基質(zhì)相連；(c)從具有未知核型的一個或多個細胞擴增DNA并從具有參考核型的一個或多個細胞擴增DNA；(d)用第一標記來標記具有未知核型的一個或多個細胞的擴增DNA，并用第二標記來標記具有參考核型的一個或多個細胞的擴增DNA，其中第一種和第二標記有可檢測的不同；(e)將來自具有未知核型的一個或多個細胞的擴增并標記的DNA與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交，并將來自具有參考核型的一個或多個細胞的擴增并標記的DNA與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交；和(f)通過比較與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交的第一種標記的相對量和與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交的第二標記的量來檢測具有未知核型的細胞內(nèi)是否存在染色體異常。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述從分離的染色體或分離染色體的一部分擴增DNA是隨機引物擴增。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述隨機引物擴增包括使用簡并寡核苷酸引物。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述簡并寡核苷酸引物由以下核苷酸序列組成5′-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3′，其中N是任何核苷酸。
34.如權(quán)利要求30-33中任一項所述的方法，其特征在于，所述分離的染色體是通過顯微切割或流式細胞術(shù)分離的染色體。
35.如權(quán)利要求30-33中任一項所述的方法，其特征在于，所述分離染色體的一部分是染色體的克隆片段。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述來自分離染色體的一部分的擴增DNA排除了非染色體序列。
37.如權(quán)利要求30-36中任一項所述的方法，其特征在于，所述來自分離的染色體或分離染色體的一部分的擴增DNA排除了重復(fù)序列和/或由于擴增DNA而超表現(xiàn)的序列。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述來自分離的染色體或分離染色體的一部分的擴增DNA排除了重復(fù)序列。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述重復(fù)序列是Cot-1序列。
40.如權(quán)利要求30-39中任一項所述的方法，其特征在于，將擴增DNA連接到固體基質(zhì)之前，所述來自分離的染色體或分離染色體的一部分的擴增DNA是經(jīng)過大小選擇的。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，所述來自分離的染色體或分離染色體的一部分的擴增DNA是經(jīng)過大小選擇的，其DNA大小小于10kb。
42.如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，所述來自分離的染色體或分離染色體的一部分的擴增DNA是經(jīng)過大小選擇的，其DNA大小小于3kb。
43.如權(quán)利要求30-42中任一項所述的方法，其特征在于，所述從具有未知核型的一個或多個細胞擴增DNA和從具有參考核型的一個或多個細胞擴增DNA是隨機引物擴增。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于，所述擴增包括使用簡并寡核苷酸引物。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述簡并寡核苷酸引物由以下核苷酸序列組成5′-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3′，其中N是任何核苷酸。
46.如權(quán)利要求30-45中任一項所述的方法，其特征在于，所述來自具有未知核型的一個或多個細胞的擴增DNA和來自具有參考核型的一個或多個細胞的擴增DNA均除去了重復(fù)序列。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，其特征在于，所述重復(fù)序列是Cot-1序列。
48.如權(quán)利要求30-47中任一項所述的方法，其特征在于，所述來自具有未知核型的一個或多個細胞的擴增DNA是擴增自1-20個細胞的DNA。
49.如權(quán)利要求30-47中任一項所述的方法，其特征在于，所述來自具有未知核型的一個或多個細胞的擴增DNA是擴增自單細胞的DNA。
50.如權(quán)利要求30-48中任一項所述的方法，其特征在于，所述具有未知核型的一個或多個細胞是胚胎細胞、胎兒細胞、生殖細胞、癌性細胞或極體。
51.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述單細胞是胚胎細胞、卵母細胞或極體。
52.如權(quán)利要求30-51中任一項所述的方法，其特征在于，所述具有參考核型的一個或多個細胞是與具有未知核型的一個或多個細胞相同類型的細胞。
53.如權(quán)利要求30-52中任一項所述的方法，其特征在于，所述來自具有參考核型的一個或多個細胞的擴增DNA是擴增自與具有未知核型的一個或多個細胞相同數(shù)目的細胞的DNA。
54.如權(quán)利要求30-53中任一項所述的方法，其特征在于，所述從分離的染色體或分離染色體的一部分擴增DNA還包括擴增特定的染色體區(qū)域。
55.如權(quán)利要求30-54中任一項所述的方法，其特征在于，所述從具有未知核型的一個或多個細胞擴增DNA和從具有參考核型的一個或多個細胞擴增DNA還包括擴增相同的特定染色體區(qū)域。
56.如權(quán)利要求30-55中任一項所述的方法，其特征在于，所述第一標記是Cy3-dUTP，第二標記是Cy5-dUTP。
57.如權(quán)利要求30-56中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法用于胚胎或卵母細胞的植入前診斷。
58.如權(quán)利要求30-56中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法用于產(chǎn)前診斷胎兒的染色體異常。
59.一種與固體基質(zhì)相連的核酸，其中所述核酸衍生自分離的染色體或分離染色體的一部分并且所述核酸排除了重復(fù)序列。
60.如權(quán)利要求59所述的核酸，其特征在于，所述核酸衍生自分離的染色體或分離染色體的一部分的擴增。
61.如權(quán)利要求60所述的核酸，其特征在于，所述從分離的染色體或分離染色體的一部分擴增是隨機引物擴增。
62.如權(quán)利要求61所述的核酸，其特征在于，所述從分離的染色體或分離染色體的一部分擴增包括使用簡并寡核苷酸引物。
63.如權(quán)利要求62所述的核酸，其特征在于，所述簡并寡核苷酸引物由以下核苷酸序列組成5′-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3′，其中N是任何核苷酸。
64.如權(quán)利要求59-63中任一項所述的核酸，其特征在于，所述分離的染色體是通過顯微切割或流式細胞術(shù)分離的染色體。
65.如權(quán)利要求59-63中任一項所述的核酸，其特征在于，所述分離染色體的一部分是通過顯微切割或流式細胞術(shù)分離的染色體的一部分。
66.如權(quán)利要求59-63中任一項所述的核酸，其特征在于，所述分離染色體的一部分是染色體的克隆片段。
67.如權(quán)利要求66所述的核酸，其特征在于，所述核酸也排除了非染色體序列。
68.如權(quán)利要求60-67中任一項所述的核酸，其特征在于，所述來自分離的染色體或分離染色體的一部分的擴增DNA也排除了由于擴增而超表現(xiàn)的序列。
69.如權(quán)利要求59-68中任一項所述的核酸，其特征在于，所述重復(fù)序列是Cot-1序列。
70.如權(quán)利要求59-69中任一項所述的核酸，其特征在于，所述來自分離的染色體或分離染色體的一部分的擴增核酸是經(jīng)過大小選擇的。
71.如權(quán)利要求70所述的核酸，其特征在于，所述來自分離的染色體或分離染色體的一部分的擴增核酸是經(jīng)過大小選擇的，其大小小于10kb。
72.如權(quán)利要求70所述的核酸，其特征在于，所述來自分離的染色體或分離染色體的一部分的擴增核酸是經(jīng)過大小選擇的，其大小小于3kb。
73.如權(quán)利要求59-72中任一項所述的核酸，其特征在于，所述與基質(zhì)相連的核酸是雜交的靶。
74.如權(quán)利要求73所述的核酸，其特征在于，所述與基質(zhì)相連的核酸是基因組比較雜交的靶。
75.一種核酸陣列，所述陣列包括如權(quán)利要求59-74中任一項所述的與固體基質(zhì)相連的一種或多種核酸。
76.一種與固體基質(zhì)相連的核酸，其中所述核酸衍生自分離的染色體或分離染色體的一部分的隨機引物擴增，且所述核酸排除去了重復(fù)序列、非染色體序列或由于擴增而超表現(xiàn)的序列中的一種或多種。
77.如權(quán)利要求76所述的核酸，其特征在于，所述隨機引物擴增包括使用簡并寡核苷酸引物。
78.如權(quán)利要求77所述的核酸，其特征在于，所述簡并寡核苷酸引物由以下核苷酸序列組成5′-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3′，其中N是任何核苷酸。
79.如權(quán)利要求76-78中任一項所述的核酸，其特征在于，所述分離的染色體是通過顯微切割或流式細胞術(shù)分離的染色體。
80.如權(quán)利要求76-78中任一項所述的核酸，其特征在于，所述分離染色體的一部分是通過顯微切割或流式細胞術(shù)分離的染色體的一部分。
81.如權(quán)利要求76-78中任一項所述的核酸，其特征在于，所述分離染色體的一部分是染色體的克隆片段。
82.如權(quán)利要求76-81所述的核酸，其特征在于，所述重復(fù)序列是Cot-1序列。
83.如權(quán)利要求76-82所述的核酸，其特征在于，所述非染色體序列是細菌序列。
84.如權(quán)利要求76-83所述的核酸，其特征在于，所述來自分離的染色體或分離染色體的一部分的擴增核酸是經(jīng)過大小選擇的。
85.如權(quán)利要求84所述的核酸，其特征在于，所述來自分離的染色體或分離染色體的一部分的擴增核酸是經(jīng)過大小選擇的，其大小小于10kb。
86.如權(quán)利要求84所述的核酸，其特征在于，所述來自分離的染色體或分離染色體的一部分的擴增核酸是經(jīng)過大小選擇的，其大小小于3kb。
87.如權(quán)利要求76-86中任一項所述的核酸，其特征在于，所述與固體基質(zhì)相連的核酸是雜交的靶。
88.如權(quán)利要求87所述的核酸，其特征在于，所述與固體基質(zhì)相連的核酸是基因組比較雜交的靶。
89.一種與固體基質(zhì)相連的核酸陣列，所述陣列包括如權(quán)利要求76-88中任一項所述的與固體基質(zhì)相連的一種或多種核酸。
90.一種衍生自分離的染色體或分離染色體的一部分的隨機引物擴增的核酸，其中，所述核酸排除了重復(fù)序列。
91.如權(quán)利要求90所述的核酸，其特征在于，所述隨機引物擴增包括使用簡并寡核苷酸引物。
92.如權(quán)利要求91所述的核酸，其特征在于，所述簡并寡核苷酸引物由以下核苷酸序列組成5′-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3′，其中N是任何核苷酸。
93.如權(quán)利要求90-92中任一項所述的核酸，其特征在于，所述分離的染色體是通過顯微切割或流式細胞術(shù)分離的。
94.如權(quán)利要求90-92中任一項所述的核酸，其特征在于，所述分離染色體的一部分是通過顯微切割或流式細胞術(shù)分離的染色體的一部分。
95.如權(quán)利要求90-92中任一項所述的核酸，其特征在于，所述分離染色體的一部分是染色體的克隆片段。
96.如權(quán)利要求95所述的核酸，其特征在于，所述核酸也排除了非染色體序列。
97.如權(quán)利要求91-96中任一項所述的核酸，其特征在于，所述核酸還排除了由于擴增而超表現(xiàn)的序列。
98.如權(quán)利要求90-97中任一項所述的核酸，其特征在于，所述重復(fù)序列是Cot-1序列。
99.如權(quán)利要求90-98中任一項所述的核酸，其特征在于，所述核酸是經(jīng)過大小選擇的。
100.如權(quán)利要求99所述的核酸，其特征在于，所述核酸大小是經(jīng)過大小選擇的，其大小小于10kb。
101.如權(quán)利要求88所述的核酸，其特征在于，所述核酸大小是經(jīng)過大小選擇的，其大小小于3kb。
102.如權(quán)利要求90-101中任一項所述的核酸，其特征在于，所述核酸是雜交的靶核酸。
103.如權(quán)利要求102所述的核酸，其特征在于，所述核酸是基因組比較雜交的靶核酸。
104.一種將具有第一核型的單細胞的至少一條染色體或其一部分與具有第二核型的細胞的對應(yīng)染色體或其一部分進行比較的方法，所述方法包括以下步驟(a)從分離的染色體或分離染色體的一部分擴增DNA；(b)將擴增的DNA與固體基質(zhì)相連；(c)從具有第一核型的單細胞隨機擴增DNA并從具有第二核型的一個或多個細胞隨機擴增DNA；(d)用第一標記來標記來自具有第一核型的單細胞的擴增DNA，并用第二標記來標記來自具有第二核型的一個或多個細胞的擴增DNA，其中第一種和第二標記有可檢測的不同；(e)將來自具有第一核型的單細胞的擴增并標記的DNA與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交，并將來自具有第二核型的一個或多個細胞的擴增并標記的DNA與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交；和(f)比較與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交的第一種和第二標記的相對量。
105.一種在具有未知核型的單細胞中檢測染色體異常的方法，所述方法包括以下步驟(a)從分離的染色體或分離的染色體的一部分隨機擴增DNA；(b)將擴增的DNA與固體基質(zhì)相連；(c)從具有未知核型的單細胞隨機擴增DNA并從具有參考核型的一個或多個細胞擴增DNA；(d)用第一標記來標記來自具有未知核型的單細胞的擴增DNA，并用第二標記來標記來自具有參考核型的一個或多個細胞的擴增DNA，其中第一種和第二標記有可檢測的不同；(e)將來自具有未知核型的單細胞的擴增并標記的DNA與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交，并將來自具有參考核型的一個或多個細胞的擴增并標記的DNA與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交；和(g)通過比較與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交的第一標記的相對量和與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交的第二標記的量來檢測具有未知核型的細胞內(nèi)是否存在染色體異常。
106.一種胚胎的植入前遺傳診斷方法，該方法包括以下步驟(a)從分離的染色體或分離染色體的一部分隨機擴增DNA；(b)將擴增的DNA與固體基質(zhì)相連；(c)從具有未知核型的一個或多個胚胎細胞隨機擴增DNA并從具有參考核型的一個或多個細胞擴增DNA；(d)用第一標記來標記具有未知核型的一個或多個胚胎細胞的擴增DNA，并用第二標記來標記具有參考核型的一個或多個細胞的擴增DNA，其中第一種和第二標記有可檢測的不同；(e)將具有未知核型的一個或多個細胞的擴增并標記的DNA與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交，并將具有參考核型的一個或多個細胞的擴增并標記的DNA與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交；(f)通過比較與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交的第一標記的相對量和與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交的第二標記的量來檢測具有未知核型的胚胎細胞內(nèi)是否存在染色體異常；和(g)通過一個或多個胚胎細胞中不存在染色體異常來確定胚胎或卵母細胞植入的適合性。
107.一種卵母細胞的植入前遺傳診斷方法，該方法包括以下步驟(a)從分離的染色體或分離染色體的一部分隨機擴增DNA；(b)將擴增的DNA與固體基質(zhì)相連；(c)從具有未知核型的卵母細胞的極體隨機擴增DNA并從具有參考核型的一個或多個細胞擴增DNA；(d)用第一標記來標記具有未知核型的卵母細胞的極體的擴增DNA，并用第二標記來標記具有參考核型的一個或多個細胞的擴增DNA，其中第一種和第二標記有可檢測的不同；(e)將具有未知核型的卵母細胞的極體的擴增并標記的DNA與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交，并將具有參考核型的一個或多個細胞的擴增并標記的DNA與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交；(f)通過比較與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交的第一標記的相對量和與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交的第二標記的量來檢測具有未知核型的卵母細胞的極體內(nèi)是否存在染色體異常；和(g)通過卵母細胞的極體中不存在染色體異常來確定卵母細胞植入的適合性。
108.一種出生前診斷胎兒染色體異常的方法，該方法包括以下步驟(a)從分離的染色體或分離染色體的一部分隨機擴增DNA；(b)將擴增的DNA與固體基質(zhì)相連；(c)從具有未知核型的一個或多個胎兒細胞隨機擴增DNA并從具有參考核型的一個或多個細胞擴增DNA；(d)用第一標記來標記具有未知核型的一個或多個胎兒細胞的擴增DNA，并用第二標記來標記具有參考核型的一個或多個細胞的擴增DNA，其中第一種和第二標記有可檢測的不同；(e)將具有未知核型的一個或多個胎兒細胞的擴增并標記的DNA與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交，并將具有參考核型的一個或多個細胞的擴增并標記的DNA與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交；和(f)通過比較與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交的第一標記的相對量和與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交的第二標記的量來檢測胎兒內(nèi)是否存在染色體異常。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種將具有第一核型的細胞的至少一條染色體或其一部分與具有第二核型的細胞的對應(yīng)染色體或其一部分進行比較的方法。所述方法包括以下步驟(a)從分離的染色體或分離染色體的一部分擴增DNA；(b)將擴增的DNA與固體基質(zhì)相連；(c)從具有第一核型的一個或多個細胞擴增DNA和從具有第二核型的一個或多個細胞擴增DNA；(d)用第一標記來標記具有第一核型的一個或多個細胞的擴增DNA以及用第二標記來標記具有第二核型的一個或多個細胞的擴增DNA，其中第一種和第二標記有可檢測的不同；(e)將來自具有第一核型的一個或多個細胞的擴增且標記的DNA與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交，并將來自具有第二核型的一個或多個細胞的擴增且標記的DNA與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交；和(f)比較與連接在固體基質(zhì)上的擴增DNA雜交的第一種和第二標記的相對量。
文檔編號C12Q1/68GK1798974SQ200480015169
公開日2006年7月5日 申請日期2004年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月2日
發(fā)明者N·D·赫西, D·G·胡 申請人:阿德萊德研究及創(chuàng)新控股有限公司