專利名稱：經(jīng)修飾的腈水解酶及它們在產(chǎn)生羧酸的方法中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有經(jīng)修飾的底物接納性的新腈水解酶，以及獲得它們的方法和上述腈水解酶的用途。該腈水解酶由多肽序列編碼，其中所述多肽序列在相應(yīng)于野生型糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenes faecalis)296位的位置包含非酪氨酸的氨基酸。本發(fā)明還涉及編碼該腈水解酶的核酸序列和氨基酸序列、包含所述核酸序列的表達(dá)構(gòu)建體、包含所述核酸序列或表達(dá)構(gòu)建體的載體，以及包含核酸序列、表達(dá)構(gòu)建體或載體的生物，優(yōu)選微生物。本發(fā)明還涉及制備羧酸的方法，優(yōu)選從外消旋腈制備經(jīng)取代的手性羧酸的方法。
背景技術(shù)：
有機化學(xué)合成中需要手性和光學(xué)活性羧酸作為大量藥物和作物保護活性成分的起始材料。手性羧酸可用于通過非對映異構(gòu)體鹽的經(jīng)典消旋物分解。特別相關(guān)的是取代或非取代的R-(-)-或S-(+)-扁桃酸。該化合物的酶促合成基于腈水解酶。
腈水解酶為催化腈水解成相應(yīng)的羧酸和銨離子的酶(Faber，Biotransformations in Organic Chemistry，Springer Verlag，Berlin/Heidelberg，1992，ISBN 3-540-55762-8)。腈水解酶最初發(fā)現(xiàn)于植物中(Thimann和Mahadevan(1964)Arch Biochem Biophys 105133-141)并隨后從多種微生物中分離出(Kobayashi和Shimizu(1994)FEMSMicrobiology Letters 120217-224)，像假單胞菌屬(Pseudomonas)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、鐮孢霉屬(Fusarium)、紅球菌屬(Rhodoccocus)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、金桿菌屬(Aureobacterium)、產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)、紅假單胞菌屬(RhodoPseudomonas)、棒桿菌屬(Corynebacterium)KO-2-4菌株、不動桿菌屬(Acinetobacter)、桿菌屬(Bacillus)、貪噬菌屬(Variovorax)、短桿菌屬(Brevibacterium)、乳酪桿菌屬(Caseobacter)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)和假絲酵母屬(Candida)。腈水解酶具有不同的底物特異性，但根據(jù)其特異性可粗略地分成三組脂肪族腈特異的腈水解酶、芳香族腈特異的腈水解酶和芳基乙酰腈特異的腈水解酶(Kobayashi等，(1993)Proc Natl Acad Sci USA 90247-251；前述Kobayashi和Shimizu(1994)；Lévy-Schil等(1995)Gene 16115-20；Layh等(1998)J Mol Catal BEnzymatic 5467-474)。
使用腈水解酶的手性和非手性羧酸和α-羥基羧酸的酶促合成在本領(lǐng)域中有所描述(例如Yamamoto等(1991)Appl Environ Microb573028-3032；Faber，《Biotransformations in Organic Chemistry》，第二版，Springer-Verlag，Berlin，1995；Lévy-Schil等(1995)Gene 16115-20；Cowan等(1998)Extremophiles 2207-216；WO 03/000840、WO 96/09403、WO 92/05275、EP-B 0 348 901、US 5,283,193、EP-A-0 449 648、EP-B-0473 328、EP-B-0 527 553、EP-B-0 332 379、US 5,296,373、EP-A-0 610 048、EP-A-0 610 049、EP-A 0 666 320、WO97/32030)。這些方法的缺點為其經(jīng)常導(dǎo)致僅有低光學(xué)純度的產(chǎn)物和/或其僅得到低的時空得率。WO 01/34786描述了具有162位半胱氨酸殘基氨基酸改變的經(jīng)修飾的腈水解酶。該腈水解酶用于水解2-羥基-4-(甲基硫代)丁腈。WO 01/34786中的“選擇性”定義為得到的產(chǎn)物2-羥基-4-(甲基硫代)丁酰胺和2-羥基-4-(甲基硫代)丁酸的比例。未提及腈水解酶對不同底物的選擇性。
大多數(shù)腈水解酶具有非常狹窄的底物接納性范圍，這使其僅對一種或數(shù)種腈具有可接受效率的轉(zhuǎn)化。這是發(fā)展新產(chǎn)物生物催化方法的障礙并產(chǎn)生不經(jīng)濟的方法。因此提供經(jīng)修飾的，優(yōu)選更寬底物接納性的腈水解酶成為一個目標(biāo)。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明首要的實施方案涉及分離的編碼腈水解酶的多肽，其中該多肽包含至少選自以下序列的一個序列a)(K/R/H)XXDXXGX(X*)，b)與的腈水解酶共有序列具有至少50％同源性，且選自以下的序列i)KAINDPVGH(X*)ii)GH(X*)SRPDV，和c)與的腈水解酶共有序列具有至少35％同源性，且選自以下的序列i)DP(A/V)GH(X*)SRPDV(L/T)(S/R)L，和ii)DPAGH(X*)SRPDVLSLLV，條件是包含于所述分離的多肽的該序列中，X*表示非酪氨酸氨基酸殘基，并且其中X*位于如SEQ ID NO2所述的野生型糞產(chǎn)堿菌腈水解酶中296位相應(yīng)的位置。優(yōu)選與所述腈水解酶共有序列的同源性至少為40％，更優(yōu)選至少為60％或80％，最優(yōu)選至少為90％或95％。
更優(yōu)選地，腈水解酶共有序列為DP(A/V)GH(X*)SRPDV(L/T)(S/R)L，最優(yōu)選腈水解酶共有序列為DPAGH(X*)SRPDVLSLLV。
尤其優(yōu)選本發(fā)明的腈水解酶含有選自如下的序列a)(K/R)XXXDXXG(H/Y/S)(X*)，b)KXXXDXXGX(X*)，c)KAINDPVGH(X*)，d)GH(X*)SRPDV，e)DP(A/V)GH(X*)SRPDV(L/T)(S/R)L，和f)DPAGH(X*)SRPDVLSLLV，其中X代表任一氨基酸，條件是含于本發(fā)明所述腈水解酶的所述序列中，X*代表非酪氨酸的氨基酸殘基，并且其中X*位于如SEQ ID NO2所述的野生型糞產(chǎn)堿菌腈水解酶中296位相應(yīng)的位置。優(yōu)選本發(fā)明腈水解酶含有選自以下的序列a)KAINDPVGH(X*)，
b)DP(A/V)GH(X*)SRPDV(L/T)(S/R)L，或最優(yōu)選DPAGH(X*)SRPDVLSLLV，位于如SEQ ID NO2所述的野生型糞產(chǎn)堿菌腈水解酶中296位相應(yīng)的位置的X*氨基酸殘基優(yōu)選選自半胱氨酸、丙氨酸、天冬酰氨、甘氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸和蘇氨酸。更優(yōu)選X*氨基酸殘基選自丙氨酸、半胱氨酸、天冬酰氨和絲氨酸。最優(yōu)選X*氨基酸殘基選自丙氨酸和半胱氨酸。
優(yōu)選本發(fā)明腈水解酶與同本發(fā)明的該腈水解酶除SEQ ID NO2所述野生型糞產(chǎn)堿菌腈水解酶中296位相應(yīng)位置的氨基酸殘基外相同的腈水解酶相比表現(xiàn)出經(jīng)調(diào)節(jié)的(更優(yōu)選為更廣的)底物接納性。
本發(fā)明的另一個實施方案涉及編碼本發(fā)明腈水解酶的核酸序列。
本發(fā)明的另一個實施方案還涉及包含至少一個編碼本發(fā)明腈水解酶的核酸序列的重組表達(dá)構(gòu)建體。
本發(fā)明的另一個實施方案還涉及包含至少一個本發(fā)明重組表達(dá)構(gòu)建體和/或至少一個編碼本發(fā)明腈水解酶的核酸的重組表達(dá)載體。
本發(fā)明的另一個實施方案涉及產(chǎn)生優(yōu)選地具有經(jīng)調(diào)節(jié)底物接納性的腈水解酶的方法，其中該方法至少包含用另一氨基酸置換位于如SEQ IDNO2所述野生型糞產(chǎn)堿菌腈水解酶中296位相應(yīng)位置的至少一個酪氨酸的步驟。優(yōu)選突變編碼該腈水解酶的核酸實現(xiàn)所述置換。
本發(fā)明的另一個實施方案涉及通過用另一氨基酸置換該腈水解酶中位于如SEQ ID NO2所述野生型糞產(chǎn)堿菌腈水解酶中296位相應(yīng)位置的至少一個酪氨酸來調(diào)節(jié)腈水解酶底物接納性的方法。優(yōu)選突變編碼該腈水解酶的核酸實現(xiàn)所述置換。
本發(fā)明的另一實施方案涉及產(chǎn)生羧酸的方法，其中腈通過本發(fā)明一種或多種腈水解酶的作用轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的羧酸。
附圖簡述

圖1以Y296野生型作為對照/標(biāo)準(zhǔn)，不同Y296突變就轉(zhuǎn)變外消旋2-氯扁桃腈的相對比活性[RSA]比較(見實施例2)。y-軸代表相對比活性[RSA]。比活性如下測量。通過將野生型(Y296)酶的活性設(shè)成1.0計算相對比活性。X-軸代表不同的突變A(Y296A)、F(Y296F)、C(Y296C)、G(Y296G)、N(Y296N)、T(Y296T)、S(Y296S)。每一測試的突變體與野生型Y296腈水解酶相比表現(xiàn)更高的活性。
圖2突變體腈水解酶Y296C和野生型腈水解酶Y296就轉(zhuǎn)變不同芳基乙酰腈的比較。y-軸代表相對比活性[RSA]。比活性如下測量。相對比活性通過將針對未取代扁桃腈的活性設(shè)成100％計算。X-軸代表不同的檢測底物MN(扁桃腈)、2-CMN(2-氯扁桃腈)、3-CMN(3-氯扁桃腈)、4-CMN(4-R-氯扁桃腈)、4-BMN(4-溴扁桃腈)和4-MeMN(4-甲基扁桃腈)。突變體對每一測試的取代扁桃腈表現(xiàn)顯著更高的活性，而對未取代的扁桃腈的活性保持不變。
圖3不同突變體腈水解酶就轉(zhuǎn)變2-氯扁桃腈的比較。y-軸代表相對比活性[RSA]，其如下使用扁桃腈作為100％標(biāo)準(zhǔn)測量和計算。X-軸代表測試的不同腈水解酶1650SEQ ID NO2所述的糞產(chǎn)堿菌腈水解酶(野生型)；1650Y296C來自SEQ ID NO2所述的糞產(chǎn)堿菌腈水解酶，但具有Y296C變異；1650Y296A來自SEQ ID NO2所述的糞產(chǎn)堿菌腈水解酶，但具有Y296A變異；8750SEQ ID NO4所述的糞產(chǎn)堿菌腈水解酶(野生型)；8750Y296A來自SEQ ID NO4所述的糞產(chǎn)堿菌腈水解酶，但具有Y296A變異；338SEQ ID NO6所述的假單胞菌腈水解酶(野生型)；338Y297A來自SEQ ID NO6所述的假單胞菌腈水解酶，但具有Y297A突變；所有檢測的突變體比相應(yīng)的野生型酶表現(xiàn)對2-氯扁桃腈顯著更高的活性。
圖4a-f全長腈水解酶氨基酸序列的比對展示的為下列序列的比對表1圖4中比對序列的來源和參考文獻(xiàn)
*提供的為GenBank或者SwissProt登錄號或?qū)＠?專利申請?zhí)?。圖4e中箭頭所示的為SEQ ID NO2中所述與野生型糞產(chǎn)堿菌腈水解酶中296位相應(yīng)的保守酪氨酸殘基。
圖5a-e全長腈水解酶氨基酸序列的比對
WO 03/000840中公開并且描述為表現(xiàn)R-2-氯扁桃腈轉(zhuǎn)變活性的序列與糞產(chǎn)堿菌腈水解酶Nit1650(DE19848129-A1)、糞產(chǎn)堿菌腈水解酶NitJM3_(P20960；EP0527553)、糞產(chǎn)堿菌腈水解酶Nit8750(WO9964607)和來自假單胞菌屬菌種的腈水解酶進行比對。來源于WO 03/000840序列通過其專利申請?zhí)栔蟮男蛄刑栔甘?例如WO2003000840.332代表來自WO 03/000840的序列號332)。圖5d中箭頭所示的為SEQ ID NO2中所述與野生型糞產(chǎn)堿菌腈水解酶中296位相應(yīng)的保守酪氨酸殘基。
發(fā)明詳述野生型糞產(chǎn)堿菌中296位相應(yīng)酪氨酸殘基的置換導(dǎo)致腈水解酶底物接納性的修飾。觀察到得到的腈水解酶可以轉(zhuǎn)變未修飾腈水解酶不能或僅能很少轉(zhuǎn)變的腈底物。這允許以能夠令人滿意的經(jīng)濟的效益大范圍轉(zhuǎn)變腈，而這不能通過本領(lǐng)域已知的腈水解酶實現(xiàn)。這種效果伴隨酶對所述腈底物催化活性的增加。
因此本發(fā)明首要的實施方案涉及編碼具有腈水解酶活性的蛋白質(zhì)的分離的多肽序列，其在與SEQ ID NO2中所述的野生型糞產(chǎn)堿菌腈水解酶中296位相應(yīng)的位置包含非酪氨酸的氨基酸。
在本領(lǐng)域中所述的幾乎所有的腈水解酶中，相應(yīng)于SEQ ID NO2中所述的野生型糞產(chǎn)堿菌296位的酪氨酸殘基都是保守的。一小部分注釋為腈水解酶的多肽(例如WO 03/000840中所述的)在酶的這部分含有不同的氨基酸序列(根據(jù)相應(yīng)DNA的電子結(jié)果)。然而因為這些酶中的一些不包含為所有已知腈水解酶特征的催化三元體(triad)(見下文；Pace&Brenner(2001)Genome Biology 2(1)1-9)，所以很可能這些差別為測序錯誤的結(jié)果(例如，造成移碼)或者這些序列不屬于腈水解酶超家族類型的酶。然而這些酶與SEQ ID NO2中所述的野生型糞產(chǎn)堿菌296位周圍區(qū)域僅具有非常低或者無顯著的同源性，并且不含有上述序列標(biāo)簽。
在此使用的術(shù)語“相應(yīng)于與SEQ ID NO2中所述的野生型糞產(chǎn)堿菌296位”優(yōu)選意指編碼腈水解酶的多肽序列中該多肽序列與SEQ ID NO2中所述序列進行比對之后與SEQ ID NO2中所述野生型糞產(chǎn)堿菌296位殘基適合或匹配的位置。此類比對可通過使用計算機軟件工具進行，如FASTA(例如，3.3t09版，2001年5月18日；評分矩陣(scoring matrix)blosum62；Henikoff & Henikoff(1992)Proc Natl Acad Sci USA 8910915-10919；Pearson WR & Lipman DJ(1988)Proc Natl Acad Sci USA852444-2448)、GAP或GAP-ENDWeight(“-Endweight”penalizes endgaps like other gaps；評分矩陣blosum62Henikoff&Henikoff(1992)ProcNatl Acad Sci USA 8910915-10919；Needleman&Wunsch(1970)J MolBiol 48443-453)。其他腈水解酶中相應(yīng)于SEQ ID NO2中所述的野生型糞產(chǎn)堿菌296位的位置也可通過多重比對鑒定(例如圖4和圖5所展示的)。下表(表2)代表了包含相應(yīng)于SEQ ID NO2中所述的野生型糞產(chǎn)堿菌296位殘基的區(qū)域的比對。序列來源于GenBank/SwissProt和其他來源(例如，專利申請?zhí)朩O 03/000840)。例如如圖4和圖5展示的比對使用下列參數(shù)配置Gap開放罰分10；Gap延伸罰分0.05；Gap分離罰分范圍8；同一性％用于比對延遲40的ClustalW算法(如Vector NTI Suite 7軟件包的AlignX特征中包括的版本1.7；Informax；加權(quán)矩陣(Weight Matrix)用于蛋白質(zhì)的Blosum)；Thompson JD等(1994)Nucl Acids Res224673-4680；Higgins DG等，(1996)Methods Enzymol 266383-402)進行。
表2代表相應(yīng)于SEQ ID NO2中所述的野生型糞產(chǎn)堿菌296位區(qū)域(箭頭所示)的腈水解酶部分序列?！咫嫠饷浮?第2列)代表比對序列的來源。定義與圖例給出的定義相對應(yīng)(圖4和圖5)?！捌瘘c(1)”指第4列中展示的相應(yīng)腈水解酶序列中的序列標(biāo)簽的第一個氨基酸殘基的位置。此位置可容易地用于計算相應(yīng)于SEQ ID NO2中所述的野生型糞產(chǎn)堿菌296位的準(zhǔn)確位置。相似性和同一性通過GAP-ENDWeight算法使用評分矩陣blosum62和下面限定的參數(shù)計算。
共有序列(395) D GHYSRPDV LLV
術(shù)語“大約”用于此處是指近似地、粗略地、左右或在……范圍之內(nèi)。當(dāng)術(shù)語“大約”與數(shù)字范圍連用時，其通過將界限擴展至高于或低于所列數(shù)值而修飾此范圍。一般地，術(shù)語“大約”用于此處是修飾所述數(shù)值以百分之二十上下(或高或低)變動的數(shù)值。
正如在此使用的，詞語“或者”是指具體列表中的任一成員并且也包括此列表成員的任一組合。
術(shù)語“核酸”指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸和其聚合體或單鏈或雙鏈、正義或反義形式的雜合體。該術(shù)語包括含已知核苷酸類似物或經(jīng)修飾的主鏈殘基或連接的核酸，其為合成、天然存在和非天然存在的，具有與參照核酸相似的結(jié)合特性，并以與參照核酸相似的方式代謝。此類類似物的例子不局限地包括硫代磷酸酰、氨基磷酸、甲基磷酸酯、手性-甲基磷酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、核酸肽(PNAs)等等。
除非另外指出，特定核酸序列也暗含包括其保守性修飾的變體(例如簡并密碼子置換)和互補序列，以及明確指出的序列。術(shù)語“核酸”在此可與“基因”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”互換地使用。
在此使用的短語“核酸序列”指代表核苷酸的簡寫、字母、文字或詞語的連續(xù)列表。在一個實施方案中，核酸可為“探針”，它是相對較短的核酸，通常長度少于100個核苷酸。核酸探針通常為長度從約50個核苷酸到約10個核苷酸。核酸的“靶區(qū)域”為鑒定為有關(guān)的核酸部分。核酸的“編碼區(qū)”為當(dāng)置于適當(dāng)調(diào)節(jié)序列控制之下時，以序列特異方式轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)生特定多肽或蛋白質(zhì)的核酸部分。編碼區(qū)被認(rèn)為是編碼多肽或蛋白質(zhì)。
術(shù)語“基因”指與能以某種方式調(diào)節(jié)多肽表達(dá)的適當(dāng)調(diào)節(jié)序列有效連接的編碼區(qū)?；虬ň幋a區(qū)(開放閱讀框，ORF)前面(上游)和后面(下游)的DNA非翻譯調(diào)節(jié)序列(例如啟動子、增強子、阻抑物等等)，以及各編碼區(qū)(即外顯子)之間適當(dāng)?shù)拈g插序列(即內(nèi)含子)。
術(shù)語“多肽”、“肽”、“寡肽”、“基因產(chǎn)物”、“表達(dá)產(chǎn)物”和“蛋白質(zhì)”在此可互換地用來指連續(xù)氨基酸殘基的聚合物或寡聚物。術(shù)語適用于其中一個或多個氨基酸為相應(yīng)天然氨基酸和天然氨基酸聚合物的類似物或模擬物的氨基酸聚合物。此外，在此使用的術(shù)語“多肽”指通過肽鍵或經(jīng)修飾的肽鍵互相連接的氨基酸，并可含有非基因編碼的20個氨基酸的經(jīng)修飾的氨基酸。多肽可通過天然加工(如翻譯后加工)或通過本領(lǐng)域熟知的化學(xué)修飾技術(shù)修飾。
修飾可發(fā)生在于多肽中的任一處，包括肽主鏈、氨基酸側(cè)鏈和氨基或羧基端。同樣類型的修飾以相同的或不同的程度存在于給定多肽中多個位點是受歡迎的。給定多肽也可具有多種類型的修飾。修飾不局限地包括乙?；Ⅴ；DP核糖基化、酰胺化、共價交聯(lián)或環(huán)化、黃素或血紅素部分的共價連接、核苷酸或核苷酸衍生物的共價附著、脂類或脂類衍生物的共價附著、磷脂酰肌醇的共價附著、二硫鍵結(jié)構(gòu)、去甲基化、半胱氨酸或焦谷氨酸結(jié)構(gòu)、甲?；?、γ-羧化、糖基化、GPI錨定結(jié)構(gòu)、羥基化、碘化、甲基化、豆蔻?；⒀趸?、pergylation、蛋白酶解加工、磷酸化、異戊烯化、外消旋化、selenoylation、硫酸鹽化和轉(zhuǎn)移RNA介導(dǎo)向蛋白質(zhì)加入氨基酸(如精氨酰化)(見《Proteins-Structure and Molecular Properties》，第二版，Creighton TE，F(xiàn)reeman WH和Company，New York(1993)；《Posttranslational Covalent Modification of Proteins》，Johnson BC編，Academic Press，New York，1-12頁(1983))。修飾也包括與短肽(“標(biāo)簽”如6×HIS-標(biāo)簽)或更大結(jié)構(gòu)域(例如麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)、GST-蛋白質(zhì)、硫氧還蛋白)的N端或C端融合。
術(shù)語“氨基酸”指天然存在或合成的氨基酸，以及以與天然氨基酸相似的方式發(fā)揮作用的氨基酸類似物或氨基酸模擬物。天然存在氨基酸為遺傳密碼編碼的氨基酸以及后來修飾的氨基酸，例如羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物指與天然氨基酸具有相同的基礎(chǔ)化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，即與氫、羧基、氨基或R基結(jié)合的碳(例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍)。
如在此使用的，術(shù)語“氨基酸序列”指代表氨基酸殘基的簡寫、字母、文字或詞語的列表。在此可用通常已知的三字母標(biāo)志或IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會推薦的一字母標(biāo)志指代氨基酸。核酸同樣可用其通常接受的單字母代碼指代。在此使用的簡寫為氨基酸的常規(guī)一字母代碼A，丙氨酸；B，天冬酰胺或天冬氨酸；C，半胱氨酸；D，天冬氨酸；E，谷氨酸；F，苯丙氨酸；G，甘氨酸；H，組氨酸；I，異亮氨酸；K，賴氨酸；L，亮氨酸；M，甲硫氨酸；N，天冬酰胺；P，脯氨酸；Q，谷氨酰胺；R，精氨酸；S，絲氨酸；T，蘇氨酸；V，纈氨酸；W，色氨酸；Y，酪氨酸；Z，谷氨酰胺或谷氨酸(見L. Stryer，Biochemistry，1988，W.H.Freemanand Company，New York)。在此使用的字母“X”在氨基酸序列中可代表任一氨基酸殘基。
此處所用術(shù)語“分離的”指從其原始環(huán)境中取出的物質(zhì)。例如活的動物中存在的天然多核苷酸或多肽不是分離的，但是從一些或全部天然系統(tǒng)中共存材料分離的同一多核苷酸或多肽是分離的。此類多核苷酸可為載體部分和/或此類多核苷酸或多肽可為組合物的部分，并仍然為分離的，因為這樣的載體或組合物不是其原始環(huán)境的部分。
術(shù)語“天然的”或“天然來源的”在本文中指至少可在一種未改變、突變或人為操縱的生物體中獲得的有機組織、多肽、核酸序列。
術(shù)語與例如核酸序列(或生物體、表達(dá)盒或包含該核酸序列的載體)相關(guān)的“重組體”指所有通過重組方法來源的構(gòu)建體，其中a)該核酸序列或b)與該核酸序列a)有效連接的遺傳控制序列，例如啟動子，或c)(a)和(b)不位于其天然遺傳環(huán)境中或已被重組方法修飾，修飾的例子為一個或多個核苷酸殘基的置換、加入、缺失、倒位或插入。天然遺傳環(huán)境指來源生物體中的天然染色體位點，或指存在于基因組文庫中。就基因組文庫而言，優(yōu)選保持(至少部分地保持)核酸序列的天然環(huán)境。此環(huán)境與核酸序列至少在一面相鄰并具有長度至少為50bp，優(yōu)選至少500bp，尤其優(yōu)選至少1000bp，極其優(yōu)選至少5000bp的序列。天然存在的表達(dá)框-例如天然存在的啟動子與相應(yīng)基因的組合-當(dāng)其通過非天然的、合成的“人工”方法(如誘變)修飾時即成為重組表達(dá)盒。此類方法已有描述(US 5,565,350；WO 00/15815；也見上文)。優(yōu)選地，在此使用的與核酸相關(guān)的術(shù)語“重組”指核酸與其在天然環(huán)境中不相鄰的核酸共價連接并相鄰。
“重組”多肽或蛋白質(zhì)指通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的多肽或蛋白質(zhì)，即從編碼所需多肽或蛋白質(zhì)的外源重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中產(chǎn)生。
重組核酸和多肽也可包含自然中不存在，但經(jīng)人修飾、改變、突變或另外其他操作的分子。“重組多肽”為與天然存在多肽至少一個氨基酸殘基不同的非天然存在多肽。產(chǎn)生所述重組多肽和/或核酸的優(yōu)選方法可包含定向或非定向誘變、DNA改組或其他循環(huán)重組(recursive recombinant)方法。尤其優(yōu)選的獲得此類重組分子的方法可包括基因改組。改組方法為本領(lǐng)域公知，并描述于例如WO 01/12817和它所引用的參考文獻(xiàn)中。在此使用術(shù)語“改組”來指出不同序列間的重組，在一些實施方案中改組可包括通過同源重組或通過非同源重組的交換，如通過cre/lox和/或flp/frt系統(tǒng)。改組可通過使用多種不同形式進行，這包括例如體外和體內(nèi)改組形式、計算機模擬(in silico)改組形式、使用單鏈或雙鏈模板的改組形式、基于引物的改組形式、基于核酸斷裂的改組形式、寡核苷酸介導(dǎo)的改組形式，所有基于不同序列間的重組事件并更詳細(xì)地描述或在此處下文中參考的改組形式，以及其他相似的基于重組的形式。
“合成的”多肽或蛋白質(zhì)為通過化學(xué)合成(例如固相肽合成)制備的多肽或蛋白質(zhì)?；瘜W(xué)肽合成為本領(lǐng)域所熟知(例如見Merrifield(1963)，Am.Chem.Soc.852149-2154；Geysen等(1984)Proc Natl Acad Sci USA 813998)并且合成試劑盒和自動肽合成儀可商業(yè)購買(例如CambridgeResearch Biochemicals，Cleveland，United Kingdom；Applied Biosystems，Inc.的431A型合成儀，F(xiàn)oster City，CA)。此類設(shè)備通過直接合成或者通過合成一系列能用其他已知技術(shù)耦聯(lián)的片段，提供得到本發(fā)明肽的簡便方法。
在此使用的關(guān)于兩個核酸序列的術(shù)語“同一性”應(yīng)理解為指借助程序算法(program algorithm)GAP(Wisconsin Package版本10.0，Universityof Wisconsin，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，USA；Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.253389及以下)計算的同一性，其中設(shè)置下列參數(shù)缺口權(quán)重(Gap weight)50 長度權(quán)重(Length weight)3平均匹配(Average match)10 平均錯誤匹配(Average mismatch)0例如與序列SEQ ID NO1在核酸水平具有至少60％同源性的序列應(yīng)理解為指通過利用以上系列參數(shù)的程序算法與序列SEQ ID NO1比較具有至少60％同一性的序列。其中適當(dāng)使用評分矩陣(blosum62)。
在此使用的關(guān)于兩個多肽的術(shù)語“同一性”應(yīng)理解為指借助程序算法GAP(Wisconsin Package版本10.0，University of Wisconsin，GeneticsComputer Group(GCG)，Madison，USA；)計算的同一性，其中設(shè)置下列參數(shù)缺口權(quán)重8 長度權(quán)重2平均匹配2,912 平均錯誤匹配-2,003例如與序列SEQ ID NO2在蛋白質(zhì)水平具有至少60％同源性的序列理解為是指通過利用以上系列參數(shù)的程序算法與序列SEQ ID NO2比較具有至少60％同一性的序列。
正如在此使用的，“同源性”與“同一性”在本文的核苷酸序列中有相同的意思。然而就氨基酸序列而言，“同源性”包括相同的或保守的氨基酸置換的百分比。同源性百分比可根據(jù)Smith和Waterman(1981)Adv ApplMath 2482和Needleman&Wunsch(1970)J Mol Biol 48443-453的算法使用評分矩陣blosum62計算。
正如在此使用的，就兩個或多個核酸序列而言，當(dāng)使用上述已知的序列比較算法比較和排比最大相應(yīng)序列時，兩核酸序列具有至少99.5％的核苷酸同一性，則為“基本相同”。此外為確定序列是否基本相同，編碼區(qū)中的同義密碼子可看作相同的，以解釋遺傳密碼的簡并性。一般地，確定基本同一性的區(qū)域必須跨越至少20個殘基，最常見的是序列在至少約25-200個殘基中基本相同。
正如在此使用的，就兩個或多個氨基酸序列而言，當(dāng)使用上述已知的序列比較算法比較和排比最大相應(yīng)序列時，兩個氨基酸序列具有至少99.5％同一性時，則為“基本相同”。此外為確定序列是否基本相同，如果多肽基本保持其生物學(xué)功能，則保守氨基酸置換可看作是相同。
“雜交”指核酸鏈與互補鏈在互補堿基處通過氫鍵連接的過程。雜交鑒定法可為靈敏的并且為選擇性的，以便可以在甚至以低濃度存在的樣品中鑒定特定的目的序列。嚴(yán)格條件通過預(yù)雜交和雜交溶液中的鹽或甲酰胺濃度和/或雜交溫度限定，并為本領(lǐng)域所熟知。嚴(yán)格性可通過降低鹽濃度，增加甲酰胺濃度或提高雜交溫度而增加。此處使用的術(shù)語“標(biāo)準(zhǔn)條件”指例如依賴于核酸，0.1至5×SSC (1×SSC＝0.15M NaCl，15mM檸檬酸鈉，pH 7.2)之間濃度或另外存在50％甲酰胺的緩沖水溶液中42-58℃溫度，例如5×SSC，50％甲酰胺中42℃。DNADNA雜合體的雜交條件優(yōu)選包含0.1×SSC和溫度約20-45℃，優(yōu)選為約30-45℃。DNARNA雜合體的雜交條件優(yōu)選包含0.1×SSC和溫度約30-55℃，優(yōu)選為45-55℃。這些陳述的雜交溫度為例如100個核苷酸長度和50％G+C含量的核酸在無甲酰胺的條件下計算的解鏈溫度。DNA雜交的實驗條件描述于遺傳學(xué)相關(guān)教科書如Sambrook等，《Molecular Cloning》，Cold Spring HarborLaboratory，1989，并可通過技術(shù)人員已知的公式計算，例如依賴于核酸長度、雜合體的性質(zhì)或G+C含量計算。技術(shù)人員可在下列教科書中找到關(guān)于雜交的其他信息Ausubel等(編)，1985，《Current Protocols inMolecular Biology》，John Wiley&Sons，New York；Hames和Higgins(編)，1985，《Nucleic Acids HybridizationA Practical Approach》，IRLPress at Oxford University Press，Oxford；Brown(編)，1991，《EssentialMolecular BiologyA Practical Approach》，IRL Press at Oxford UniversityPress，Oxford。具體而言，如在此使用的，“嚴(yán)格雜交條件”包括50％甲酰胺、5×SSPE、0.3％SDS和200ng/ml的剪切和變性的鮭精DNA中42℃的溫度和其等價條件。以上范圍和條件的改變?yōu)楸绢I(lǐng)域所熟知。
此處使用的術(shù)語“變體”指在一個或多個核苷酸或氨基酸殘基(分別地)修飾的本發(fā)明多核苷酸或多肽，并且其中多肽或編碼的多肽保留腈水解酶活性?？赏ㄟ^任何數(shù)量的方法產(chǎn)生變體，例如易錯PCR、改組、寡核苷酸定向誘變、裝配PCR、有性PCR誘變、體內(nèi)誘變、盒式誘變、遞歸集團誘變(reaursive ensemble mutagenesis)、指數(shù)集團誘變、定點誘變、基因重組(reassembly)、基因定點飽和誘變或它們的任意組合。
“保守性修飾變體”用于氨基酸和核酸序列。就特定核酸序列而言，保守性修飾變體指編碼相同或基本相同氨基酸序列的核酸或就不編碼氨基酸序列的核酸而言，指基本相同的序列。具體地，可通過產(chǎn)生其一個或多個所選(或全部)密碼子的第三個位點被混合堿基和/或脫氧次黃苷殘基置換的序列實現(xiàn)簡并密碼置換(Batzer等(1991)Nucleic Acid Res 195081；Ohtsuka等(1985)J Biol Chem 2602605-2608；Rossolini等(1994)Mol CellProbes 891-98)。由于遺傳密碼的簡并性，大量功能相同的核酸編碼任一給定的蛋白質(zhì)。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼氨基酸丙氨酸。這樣在密碼子限定丙氨酸的每一位點，密碼子可變?yōu)槿我凰龅南鄳?yīng)密碼子而不改變編碼的多肽。此類核酸變異為“沉默變異”，其為一種保守性修飾變異。在此引用的編碼多肽的每一個核酸序列也描述了核酸的每一個可能沉默變異。技術(shù)人員會認(rèn)識到核酸中的每一密碼子(除AUG，(在一些生物中與GUG一起)通常為甲硫氨酸的唯一密碼子，TGG通常為色氨酸的唯一密碼子)可以被修飾來產(chǎn)生功能相同的分子。因此編碼多肽的核酸的每一個沉默變異包含在每一個所述序列中。
關(guān)于氨基酸序列，技術(shù)人員會認(rèn)識到改變、添加或刪除編碼序列中單個氨基酸或小部分氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白質(zhì)的單個置換、缺失和添加為改變造成用化學(xué)相似的氨基酸置換氨基酸的“保守性修飾變體”。提供功能相似氨基酸的保守置換表為本領(lǐng)域所熟知。此類保守性修飾變體除之外并且不排除多態(tài)變異體、種間同系物和本發(fā)明的等位基因。
此處使用的術(shù)語“腈水解酶”包括表現(xiàn)腈水解酶活性的所有多肽。
術(shù)語“腈水解酶活性”一般指將腈水解成其相應(yīng)羧酸和氨的能力?！半嫠饷富钚浴眱?yōu)選地指催化兩摩爾等價水加入腈基引起相應(yīng)羧酸形成的特性
術(shù)語“腈水解酶”優(yōu)選地包含EC-類3.5.5.1(腈水解酶)、3.5.5.2(蓖麻堿腈水解酶)、3.5.5.4(氰丙氨酸腈水解酶)、3.5.5.5(芳基乙酰腈水解酶)、3.5.5.6(溴苯腈腈水解酶)和3.5.5.7(脂肪族腈水解酶)的酶。更優(yōu)選的為芳基乙酰腈水解酶(EC 3.5.5.5)。
腈水解酶可包含一般在具有腈水解酶活性的酶中保守的保守氨基酸殘基或基序。這些保守殘基可通過例如多個腈水解酶序列的比對鑒定。保守殘基包含例如SEQ ID NO2所述野生型糞產(chǎn)堿菌腈水解酶序列163位的半胱氨酸殘基，其參與了腈水解酶的反應(yīng)機制(Kobayashi等(1993)ProcNatl Acad Sci USA 90247-251)。在腈水解酶多肽中鑒定了保守基序的三個區(qū)域。這與腈水解酶中存在的催化三聯(lián)體(E-K-C)對應(yīng)(Pace&Brenner(2001)Genome Biology 2(1)1-9)1.fPEaf2.hRKl.pT3.l.CWEn..p大寫字母表示腈水解酶中90％或更高的一致，小寫字母表示50％或更高的一致。盒中的點表示非保守的殘基。優(yōu)選地，下列殘基(下劃線的)在所有鑒定的腈水解酶中完全保守第一個基序或區(qū)域的第三個氨基酸(E，谷氨酸)；第二個基序中的第二個殘基(R，精氨酸)；第二個基序在的第三個殘基(K，賴氨酸)；第三個基序中的第三個殘基(C，半胱氨酸)；和第三個基序中的第五個殘基(E，谷氨酸)。
本發(fā)明中參考序列為SEQ ID NO2所述來源于糞產(chǎn)堿菌腈水解酶的腈水解酶。特定氨基酸或核酸位點的所有定義、標(biāo)記和描述是與該序列的原始序列比較而完成，并可由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用例如圖4或圖5描述的序列比對轉(zhuǎn)變成其他腈水解酶。
腈水解酶可為天然的、合成的或重組來源。本領(lǐng)域已知大量天然表達(dá)腈水解酶的生物。根據(jù)本發(fā)明，修飾的腈水解酶優(yōu)選地選自細(xì)菌、酵母、真菌、植物或動物來源的腈水解酶。腈水解酶更優(yōu)選地來源于微生物、最優(yōu)選地為細(xì)菌來源。也可從環(huán)境源，例如未經(jīng)詳細(xì)生物鑒定的土壤或海洋材料中分離腈水解酶。
大量腈水解酶及其序列為本領(lǐng)域公知。這些腈水解酶包括但不限于來源于Acidovorax facilis 72W(Gavagan JE等(1999)Appl MicrobiolBiotechnol 52654-659)、不動桿菌屬菌種AK 226(Yamamoto K undKomatsu K(1991)Agric Biol Chem 55(6)1459-1466)、不動桿菌屬菌種RFB1(Finnegan I等(1991)Appl Microbiol Biotechnol 36142-144)、糞產(chǎn)堿菌ATCC 8750(Yamamoto K等(1991)Appl Environ Microbiol 57(10)3028-3032)，糞產(chǎn)堿菌JM3(Nagasawa T等(1990)Eur J Biochem 194765-772)、擬南芥(NIT1/NIT2/NIT3；Vorwerk S等(2001)Planta 212508-516)、節(jié)桿菌屬菌種J-1(Bandyopadhyay AK等(1986)Appl EnvironMicrobiol 51(2)302-306)、蒼白芽孢桿菌(Bacillus pallidus)Dac521(Cramp R等(1997)Microbiology 1432313-2320)、叢毛單胞菌(Comamonas)屬菌種NI1(Cerbelaud E等(1996)Ind Chem Libr8189-200)、睪丸酮叢毛單胞菌(Levy-Schil S等(1995)Gene 16115-20)、尖孢鐮孢菌(Fusarium oxysporum f.sp.)melonis(Goldlust A und Bohak Z(1989)Biotechnol Appl Biochem 11581-601)、茄病鐮孢菌(Fusariumsolani)(Harper BH(1977)Biochem J 167685-692)、臭鼻克雷白氏桿菌(Klebsiella ozaenae)(McBride KE等(1986)Appl Environ Microbiol52(2)325-330)、假單胞菌屬fluoreszenz DSM 7155(Layh N等(1998)JMol Catal BEnzym 5467-474)、假單胞菌屬菌種(Layh N等(1992)ArchMircobiol 158405-411)的腈水解酶，假單胞菌屬菌種aus的腈水解酶(S1)(Dhillon J等(1999)Can J Microbiol 45811-815)、來源于假單胞菌屬菌種13的腈水解酶(Yanase H等(1982)Agric Biol Chem 462925)，玫瑰色紅球菌J1(Kobayashi M等(1989)Eur J Biochem 182349-356)、玫瑰色紅球菌K22(Kobayashi M等(1990)J Bacteriol 172(9)4807-4815)、玫瑰色紅球菌NCIB 11215(Harper BH(1985)Int J Biochem 17(6)677-683)、玫瑰色紅球菌NCIB 11216(Harper BH(1977)Biochem J 165309-319)、玫瑰色紅球菌PA34(Bhalla TC等(1992)Appl Microbiol Biotechnol 37184-190)、玫瑰色紅球菌屬菌種ATCC 39484(Stevenson DE等(1992)Biotechnol Appl Biochem 15283-302)的腈水解酶和從環(huán)境源分離和例如WO 03/000840、WO 01/48175和WO 02/279079中所述的腈水解酶。
分離的本發(fā)明的多肽編碼腈水解酶活性的酶，其包含至少一個選自以下的序列a)(K/R/H)XXDXXGX(X*)，b)與腈水解酶共有序列具有至少50％，優(yōu)選至少60％，更優(yōu)選至少70％或80％，最優(yōu)選至少90％或95％的同源性的序列，其中所述的共有序列選以下序列i)KAINDPVGH(X*)ii)GH(X*)SRPDV，c)與腈水解酶共有序列具有至少35％，優(yōu)選至少40％，更優(yōu)選至少60％或80％，最優(yōu)選至少90％或95％的同源性的序列，其中所述的共有序列選自以下序列i)DP(A/V)GH(X*)SRPDV(L/T)(S/R)L，和ii)DPAGH(X*)SRPDVLSLLV，條件是包含于所述具有腈水解酶活性的酶的該序列中，所述X*殘基代表非酪氨酸的氨基酸殘基，并且其中X*位于SEQ ID NO2所述的野生型糞產(chǎn)堿菌腈水解酶中296位相應(yīng)的位置。
尤其優(yōu)選地，本發(fā)明的腈水解酶包含選自下組的序列a)(K/R)XXXDXXG(H/Y/S)(X*)，b)KXXXDXXGX(X*)，c)KAINDPVGH(X*)，d)GH(X*)SRPDV，e)DP(A/V)GH(X*)SRPDV(L/T)(S/R)L，和f)DPAGH(X*)SRPDVLSLLV，
其中X代表任一氨基酸，條件是包含于本發(fā)明所述腈水解酶的該序列中，X*代表非酪氨酸的氨基酸殘基，并且其中X*位于SEQ ID NO2所述的野生型糞產(chǎn)堿菌腈水解酶中296位相應(yīng)的位置。本發(fā)明的腈水解酶優(yōu)選包含選自以下的序列a)KAINDPVGH(X*)。
b)DP(A/V)GH(X*)SRPDV(L/T)(S/R)L ，或者最優(yōu)選DPAGH(X*)SRPDVLSLLV，在優(yōu)選的實施方案中，X*殘基選自半胱氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸和蘇氨酸。更優(yōu)選地，X*殘基選自丙氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和絲氨酸。最優(yōu)選地，X*殘基選自丙氨酸和半胱氨酸。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的腈水解酶被選自以下的多肽序列所進一步表征a)包含與SEQ ID NO2、4、6或8的氨基酸序列至少60％，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％相同的多肽分子；和b)包含至少一個SEQ ID NO2、4、6或8所述序列的至少20個連續(xù)氨基酸，優(yōu)選50個連續(xù)氨基酸的多肽分子。
本領(lǐng)域公知的腈水解酶可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的大量方法突變或轉(zhuǎn)變成本發(fā)明的腈水解酶。誘變方法可為隨機或定向的，并可包括，例如W098/42727中所述的方法；定點誘變(Ling等(1997)Anal Biochem.254(2)157-78；Dale等(1996)Methods Mol Biol 57369-74；Smith(1985)Ann Rev Genet 19423-462；Botstein&Shortle(1985)Science 2291193-1201；Carter(1986)Biochem J 2371-7；Kunkel(1987)“寡核苷酸定向誘變的效能”Nucleic Acids&Molecular Biology，Eckstein F和LilleyDMJ編，Springer Verlag，Berlin)；使用含尿嘧啶的模板的誘變(Kunkel(1985)Proc Natl Acad Sci USA 82488-492；Kunkel TA等(1987)Methods in Enzymol 154,367-382；Bass SV等(1988)Science242240-245)；寡核苷酸指導(dǎo)的誘變(綜述見Smith(1985)Ann Rev Genet19423-462；Botstein&Shortle(1985)Science 2291193-1201；Carter(1986)Biochem J 2371-7，Zoller & Smith(1982)Nucleic Acids Res 106487-6500，Zoller & Smith(1983)Methods in Enzymol 100，468-500，Zoller& Smith(1987)Methods in Enzymol.154，329-350)；硫代磷酸酯修飾的DNA誘變(Taylor等(1985)Nucl Acids Res 138749-8764；Taylor等(1985)Nucl Acids Res 138765-8787(1985)；Nakamaye和Eckstein(1986)Nucl Acids Res 149679-9698；Sayers等(1988)Nucl Acids Res 16791-802；Sayers等(1988)Nucl Acids Res 16803-814)；使用缺口雙鏈DNA的誘變(Kramer等(1984)Nucl Acids Res 129441-9456；Kramer和Fritz(1987)Methods in Enzymol 154350-367；Kramer等(1988)NuclAcids Res.167207；Fritz等(1988)Nucl Acids Res 166987-6999)。
腈水解酶序列的修飾可通過例如在編碼天然來源的酶的序列上誘變實現(xiàn)(Skandalis等(1997)Chemistry&Biology 48889-898；Crameri等(1998)Nature 391288-291)。誘變可包括化學(xué)試劑誘變(Singer和Fraenkel-Conrat(1969)Prog Nucl Acid Res Mol Biol 91-29)、易錯PCR誘變(Leung等(1989)Technique 111-15)、組合PCR(combinative PCR)誘變(上面提到的Crameri等(1998)；Shao等(1998)Nucleic Acids Res26681-683)或定向誘變(《Directed MutagenesisA Practical Approach》(1991)McPherson MJ編，IRL PRESS)等等。此外在本發(fā)明中使用的腈水解酶可通過篩選DNA庫獲得，尤其是多種來源的cDNA或基因組DNA，尤其是通過腈水解酶重組或隨機改變，通過定向分子進化或者篩選陸地或其他群落生境的DNA文庫獲得的DNA庫。
其他適當(dāng)?shù)姆椒òc錯配修復(fù)(Kramer等(1984)Cell 38879-887)、使用修復(fù)缺陷的宿主菌株的誘變(Carter等(1985)Nucl Acids Res 134431-4443(1985)；Carter(1987)Methods in Enzymol.154382-403)、缺失誘變(Eghtedarzadeh&Henikoff(1986)Nucl Acids Res 145115)、限制—選擇和限制—純化(Wells等(1986)Phil Trans R Soc Lond A317415-423)、全基因合成誘變(Nambiar等(1984)Science 2231299-1304；Sakamar&Khorana(1988)Nucl Acids Res 146361-6372；Wells等(1985)Gene 34315-323(1985)；Grundstrom等(1985)Nucl Acids Res.133305-3346)、雙鏈斷裂修復(fù)(Mandecki(1986)Proc Natl Acad Sci.USA 837177-7181)。關(guān)于多個上述方法的其它細(xì)節(jié)可在Methods in Enzymology，Vol.154中找到，其也描述了解決多種誘變方法問題的有用控制。此外，可使用其他隨機誘變方法引入突變(例如，通過誘變菌株的傳代等等)。
誘變的試劑盒可商業(yè)購買。例如可從Stratagene、Bio-Rad、Roche、Clontech Laboratories、Life Technologies(Gibco BRL)、New EnglandBiolabs、Pharmacia Biotech和Promega Corp.獲得。
除了SEQ ID NO2所述野生型糞產(chǎn)堿菌腈水解酶296位相應(yīng)位置被另一氨基酸改變外，還可對腈水解酶進行其他改變以獲得新的或經(jīng)修飾的特性。這可通過本領(lǐng)域已知的“定向進化”方法實現(xiàn)。當(dāng)反復(fù)選擇具有改進性能的變體時，它組合了在相當(dāng)程度上改變酶的方法(Arnold&Volkov(1999)Current Opin Chem Biol 354-59；Kuchner和Arnold(1997)Tibtech 15523-530)。例如可以使用WO 01/12817中所述的方法以及其引用的方法。獲得經(jīng)修飾的腈水解酶的優(yōu)選方法可包含定向或非定向誘變、DNA改組或其他循環(huán)重組方法。在優(yōu)選的實施方案中，核酸“家族”(例如編碼不同物種腈水解酶的核酸序列)的改組用于建立重組多核苷酸文庫。當(dāng)核酸家族改組后，編碼不同菌株、物種同源多肽的核酸或基因家族或其部分用作核酸的不同形式。
本發(fā)明可以包括建立編碼腈水解酶的多核苷酸重組體文庫，然后篩選以鑒定編碼表現(xiàn)所需特性的腈水解酶的文庫成員，例如提高的酶促活性、立體專一性、區(qū)域?qū)Ｒ恍院蛯τ程禺愋?enantiospecificity)、對抑制劑降低的敏感性、改變的穩(wěn)定性(例如，溶解穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性等)等。重組體文庫可使用多種方法中的任一種建立，所述方法包括但不限于例如WO 01/12817中所述的改組方案和其引用的參考文獻(xiàn)。
此處所用術(shù)語“底物接納性”指腈水解酶轉(zhuǎn)變特異腈底物的能力。優(yōu)選通過酶的腈水解酶活性測量底物接納性。
術(shù)語“更廣的底物接納性”對本發(fā)明特定腈水解酶而言指該特定腈水解酶與同該特定腈水解酶具相同氨基酸序列但在SEQ ID NO2所述的野生型糞產(chǎn)堿菌腈水解酶296位相應(yīng)的位置包含酪氨酸的腈水解酶相比對至少一種腈水解底物表現(xiàn)更高的腈水解酶活性。優(yōu)選所述活性增加至少10％，優(yōu)選20％，更優(yōu)選地50％，最優(yōu)選100％或更高。
優(yōu)選本發(fā)明的腈水解酶表現(xiàn)出關(guān)于芳基乙酰腈的增加的活性，更優(yōu)選表現(xiàn)出關(guān)于取代的扁桃腈的增加的活性。扁桃腈芳基可攜帶一個或多個取代。優(yōu)選的取代為烷基(優(yōu)選為甲基)、烷氧基(優(yōu)選地為甲氧基)、鹵素或硝基。取代扁桃腈可選自但不限于鄰氟扁桃腈、對氟扁桃腈、間氟扁桃腈、鄰氯扁桃腈、對氯扁桃腈、間氯扁桃腈、鄰溴扁桃腈、對溴扁桃腈、間溴扁桃腈、鄰硝基扁桃腈、對硝基扁桃腈、間硝基扁桃腈、鄰甲基扁桃腈、對甲基扁桃腈、間甲基扁桃腈、鄰甲氧基扁桃腈、對甲氧基扁桃腈或間甲氧基扁桃腈。更優(yōu)選的為鄰氯扁桃腈.
優(yōu)選使用本發(fā)明方法產(chǎn)生光學(xué)活性羧酸，其中所述的方法包含至少一種選自以下的化合物R-扁桃酸、S-扁桃酸、R-對氯扁桃酸、S-對氯扁桃酸、R-間氯扁桃酸、S-間氯扁桃酸、R-鄰氯扁桃酸、S-鄰氯扁桃酸、S-鄰溴扁桃酸、S-對溴扁桃酸、S-間溴扁桃酸、S-鄰甲基扁桃酸、S-對甲基扁桃酸、S-間甲基扁桃酸、R-鄰溴扁桃酸、R-對溴扁桃酸、R-間溴扁桃酸、R-鄰甲基扁桃酸、R-對甲基扁桃酸或R-間甲基扁桃酸。更優(yōu)選的為R-鄰氯扁桃酸。
而本發(fā)明的另一個實施方案包含編碼本發(fā)明腈水解酶的核酸序列。優(yōu)選所述核酸序列編碼具有腈水解酶活性的酶，其包含至少一個選自以下的序列a)(K/R/H)XXDXXGX(X*)，b)與腈水解酶共有序列具有至少50％，優(yōu)選至少60％，更優(yōu)選至少70％或80％，最優(yōu)選至少90％或95％的同源性的序列，其中所述的共有序列選自以下序列i)KAINDPVGH(X*)
ii)GH(X*)SRPDV，和c)與腈水解酶共有序列具有至少35％，優(yōu)選至少40％，更優(yōu)選至少60％或80％，最優(yōu)選至少90％或95％的同源性的序列，其中所述的共有序列選自以下序列i)DP(A/V)GH(X*)SRPDV(L/T)(S/R)L，和ii)DPAGH(X*)SRPDVLSLLV，條件是包含于具有腈水解酶活性的酶的該序列中，所述X*殘基代表非酪氨酸的氨基酸殘基，并且其中X*位于SEQ ID NO2所述的野生型糞產(chǎn)堿菌腈水解酶中296位相應(yīng)的位置。
更優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸序列編碼包含選自以下序列的腈水解酶a)(K/R)XXXDXXG(H/Y/S)(X*)，b)KXXXDXXGX(X*)，c)KAINDPVGH(X*)，d)GH(X*)SRPDV，e)DP(A/V)GH(X*)SRPDV(L/T)(S/R)L，和f)DPAGH(X*)SRPDVLSLLV，其中X代表任一氨基酸，條件是該含于本發(fā)明所述腈水解酶的序列中，X*代表非酪氨酸的氨基酸殘基并且其中，X*位于SEQ ID NO2所述的野生型糞產(chǎn)堿菌腈水解酶中296位相應(yīng)的位置。
甚至更優(yōu)選地，編碼具有腈水解酶活性的酶的本發(fā)明核酸，包含選自以下的序列a)KAINDPVGH(X*)，b)DP(A/V)GH(X*)SRPDV(L/T)(S/R)L 或，最優(yōu)選地，DPAGH(X*)SRPDVLSLLV，在優(yōu)選的實施方案中X*殘基選自半胱氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸和蘇氨酸。更優(yōu)選的，X*殘基選自丙氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和絲氨酸。最優(yōu)選的，X*殘基選自丙氨酸和半胱氨酸.
最優(yōu)選地，本發(fā)明核酸序列被選自以下序列所進一步表征
a)與SEQ ID NO4、3、5或7的核酸序列至少60％，優(yōu)選80％，更優(yōu)選90％，最優(yōu)選地95％一致的核酸序列；b)包含至少一個SEQ ID NO4、3、5或7所述序列的至少20個連續(xù)堿基，優(yōu)選50個連續(xù)堿基，更優(yōu)選100個連續(xù)堿基的核酸序列。
為重組表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的腈水解酶，可將編碼該腈水解酶的核酸序列引入表達(dá)構(gòu)建體。
術(shù)語“表達(dá)構(gòu)建體”一般指任何核酸構(gòu)建體，其中其表達(dá)(轉(zhuǎn)錄以及如果適當(dāng)?shù)脑挿g)產(chǎn)生腈水解酶的核酸分子優(yōu)選與至少一個遺傳控制元件有效連接。術(shù)語“遺傳控制序列”應(yīng)廣義理解，并指所有對表達(dá)盒或本發(fā)明重組微生物的實體化(materialization)、復(fù)制或功能具有影響的序列。這些遺傳控制元件為例如誘導(dǎo)物或阻抑物結(jié)合并因此調(diào)節(jié)核酸表達(dá)的序列。遺傳控制元件可提高、調(diào)節(jié)、保證或修飾在原核或真核生物中的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。遺傳控制序列在例如“Goeddel；《Gene ExpressionTechnologyMethods in Enzymology 185》，Academic Press，San Diego，CA(1990)”、“Gruber和Crosby，《Methods in Plant Molecular Biologyand Biotechnolgy》中，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)lorida，Glick和Thompson編，第七章，89-108”和在其引用的參考文獻(xiàn)中有所描述。
除這些新的調(diào)節(jié)序列之外，也可能存在于實際的結(jié)構(gòu)基因上游(前面)的這些天然調(diào)節(jié)序列的調(diào)節(jié)，其中這些序列在適當(dāng)時被遺傳修飾，以使天然調(diào)節(jié)關(guān)閉，并且基因表達(dá)增加。然而核酸構(gòu)建體也可具有更簡單的結(jié)構(gòu)，也就是說沒有其他調(diào)節(jié)信號插入本發(fā)明核酸序列的上游，并且未刪除天然啟動子及其調(diào)節(jié)。相反，以不再發(fā)生調(diào)節(jié)的方式突變天然調(diào)節(jié)序列，并且基因的表達(dá)增加了。核酸構(gòu)件體可額外有利地包含一個或多個與啟動子功能性連接的增強子序列，其使核酸序列增加表達(dá)成為可能。也可以在DNA序列的3’端插入有利的其他序列，如其他調(diào)節(jié)元件或終止子。根據(jù)本發(fā)明的核酸在構(gòu)建體中可以一個或多個拷貝存在。構(gòu)建體也可包含其他標(biāo)記，如適于選擇構(gòu)建體的抗生素抗性或營養(yǎng)缺陷型互補基因。
在優(yōu)選的實施方案中，編碼本發(fā)明腈水解酶的核酸序列與確保其在生物體(例如微生物或植物)中表達(dá)的至少一個啟動子有效連接。
有效連接應(yīng)理解為指例如啟動子與待表達(dá)的核酸序列(例如腈水解酶)和(如果適當(dāng)?shù)脑?其他調(diào)節(jié)序列(如終止子)以當(dāng)核酸序列重組表達(dá)時每一調(diào)節(jié)序列能實現(xiàn)其功能的方式連續(xù)排列。化學(xué)意義上的直接連接并不總是必需的。遺傳控制序列(如增強子序列)也可從遠(yuǎn)離的位置，或?qū)嶋H上從其他DNA分子上執(zhí)行對靶序列的功能。優(yōu)選的排列為重組表達(dá)的核酸序列位于作為啟動子的序列之后，以使兩個序列互相共價連接。啟動子序列和重組表達(dá)的核酸序列之間的距離優(yōu)選少于500堿基對，尤其優(yōu)選少于200堿基對，極其優(yōu)選少于100堿基對。
有效連接和表達(dá)盒可通過常規(guī)的重組和克隆技術(shù)產(chǎn)生，如例如Maniatis T，F(xiàn)ritsch EF和Sambrook J(1989)《Molecular CloningALaboratory Manual》，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor(NY)中，Silhavy TJ，Berman ML和Enquist LW(1984)《Experiments with Gene Fusions》，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor(NY)中，Ausubel FM等(1987)《Current Protocols inMolecular Biology》，Greene Publishing Assoc.和Wiley Interscience和Gelvin等(1990)《Plant Molecular Biology Manua1》中所述。然而作為帶有特定限制性內(nèi)切酶切割位點的接頭或作為信號肽的其他序列也可位于兩序列之間。序列的插入也可引起融合蛋白質(zhì)的表達(dá)。
根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒包含在各自宿主生物中發(fā)揮功能的、位于重組表達(dá)的核酸序列5’-上游的啟動子和3’-下游的終止子序列作為額外遺傳控制序列，以(如果適當(dāng)?shù)脑?還含有在每一種情況下與重組表達(dá)的核酸序列有效連接的其他常規(guī)調(diào)節(jié)序列。
依賴于用本發(fā)明表達(dá)盒或載體轉(zhuǎn)化的宿主生物，優(yōu)選不同的遺傳控制序列。
在微生物中實施本發(fā)明的有利調(diào)節(jié)序列為例如存在于啟動子中的序列，這些啟動子如有利于用于革蘭氏陰性細(xì)菌中的cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、rhaP(rhaPBAD)、ara、SP6、λ-PR或λ-PL啟動子。其他有利的調(diào)節(jié)序列為例如革蘭氏陽性啟動子amy和SPO2，真菌或酵母啟動子ADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中的序列。就此而論，有利的啟動子還有丙酮酸脫羧酶啟動子和例如漢遜酵母屬pr Pichia甲醇氧化酶的啟動子(例如AOX啟動子)。也可以使用人工啟動子進行調(diào)節(jié)。
適于在植物生物體中表達(dá)腈水解酶的植物特異的啟動子可包括組成型啟動子(例如CaMV 35S啟動子(Franck等(1980)Cell 2l285-294)，OCS啟動子，泛素啟動子(Holtorf S等(1995)Plant Mol Biol 29637-649)，擬南芥腈水解酶-1基因啟動子(GenBank Acc.No.U38846，核苷酸3862-5325或到5342)，組織特異性啟動子(例如菜豆異類黃酮靈啟動子；US 5,504,200)或化學(xué)誘導(dǎo)啟動子(綜述文章Gatz等(1997)Annu Rev Plant Physiol PlantMol Biol 4889-108)。
原則上，所有其調(diào)節(jié)序列如同以上所述的天然啟動子都可用于根據(jù)本發(fā)明的方法。此外也可有利地使用合成啟動子。
本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體或載體也可包含其他功能元件。術(shù)語功能元件應(yīng)廣義理解，并指對根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒、載體或重組生物體的產(chǎn)生、擴增或功能具有影響的所有元件。下列以例子形式提到，但不限于此a).選擇標(biāo)記選擇標(biāo)記對于成功選擇和分離轉(zhuǎn)化或同源的重組細(xì)胞并對防止染色體外DNA構(gòu)建體隨時間丟失是有用的。選擇標(biāo)記賦予對殺生物化合物，如代謝阻遏物(例如2-脫氧葡萄糖-6-磷酸，WO 98/45456)、抗生素(例如氨芐青霉素、四環(huán)素、卡那霉素、G 418、博來霉素或潮霉素)或除草劑(例如膦絲菌素或草甘膦)的抗性。
適于原核生物的選擇標(biāo)記可包括但不限于Amp(氨芐青霉素抗性；β-內(nèi)酰胺酶)、Cab(羧芐青霉素抗性)、Cam(氯霉素抗性)、Kan(卡那霉素抗性)、Rif(利福平抗性)、Tet(四環(huán)素抗性)、Zeo(Zeocin抗性)或Spec(壯觀霉素抗性)。選擇壓力通過培養(yǎng)基中一定水平的抗生素保持(例如氨芐青霉素100mg/l、羧芐青霉素100mg/l、氯霉素35mg/l、卡那霉素30mg/l、利福平200mg/l、四環(huán)素12.5mg/l、壯觀霉素50mg/l)。
對于在植物中使用，尤其優(yōu)選的選擇標(biāo)記為那些給予除草劑抗性的選擇標(biāo)記。例子為膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT；de Block等(1987)EMBO J62513-2518)、5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)、磺酰脲-和咪唑啉酮-鈍化乙酰乳酸合酶、Bromoxyni_降解腈水解酶(bxn)。其他真核生物中可使用卡那霉素-或G418-抗性基因(NPTII；NPTI)。
選擇標(biāo)記還包含適于與主生物中的遺傳缺陷互補的序列，例如與氨基酸合成缺陷互補?；パa允許宿主細(xì)胞在缺乏該氨基酸的培養(yǎng)基上生長。適當(dāng)?shù)睦佑猩彼?例如trpC)、亮氨酸(例如leuB)或組氨酸(例如hisB)合成缺陷。相應(yīng)的微生物菌株可商業(yè)購買(例如從Clontech Inc.購買)并可分別被選擇標(biāo)記(例如TRP1、Leu2或HIS3)互補。
b)轉(zhuǎn)錄終止序列轉(zhuǎn)錄終止序列阻止非預(yù)期的轉(zhuǎn)錄(例如連讀)，并提高質(zhì)粒和/或mRNA的穩(wěn)定性和/或數(shù)量。
c)Shine-Dalgarno序列(SD)對翻譯的起始有用。用于大腸桿菌(E.coli)表達(dá)的適當(dāng)共有序列為例如5’-TAAGGAGG-3’。該序列可位于ATG起始密碼子上游4-14核苷酸處，其中最合適的為上游8個核苷酸。為防止可能降低翻譯效率的二級RNA結(jié)構(gòu)，相應(yīng)的區(qū)域應(yīng)優(yōu)選為富含A/T。
d)起始密碼子起始密碼子為翻譯起始的點。在大腸桿菌和高等真核生物中ATG為最常用的起始密碼子。在大腸桿菌中GTG可備選地使用。
e)標(biāo)簽和融合蛋白可將重組蛋白質(zhì)與短肽(“標(biāo)簽”)或其他蛋白質(zhì)(“融合蛋白”)在N-或C-端的融合，以能夠提高的表達(dá)、可溶性、檢測或純化。優(yōu)選融合部分包含允許表達(dá)和純化之后去掉融合部分的蛋白酶(例如thrombine或因子X)切割位點。
f)多克隆位點(MCS)允許和輔助一個或多個核酸序列的插入。
g)終止密碼子/翻譯終止子三個可能的終止密碼子中TAA為優(yōu)選的(因為TAG和TGA在一些條件下允許連續(xù)翻譯)?？墒褂枚鄠€終止密碼子以確保翻譯終止。
h)報告基因報告基因編碼通過其顏色和酶活性而易于定量的蛋白質(zhì)，以便能夠評估使轉(zhuǎn)化效率、表達(dá)位點和表達(dá)時間。本文中極其優(yōu)選的為編碼報告蛋白質(zhì)的基因(Schenborn E & Groskreutz D(1999)MolBiotechnol 13(1)29-44)，如綠色熒光蛋白(GFP)、氯霉素轉(zhuǎn)移酶、螢光素酶(Ow等(1986)Science 234856-859)或β-半乳糖苷酶。
i)復(fù)制起點，其確保根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒或載體在例如大腸桿菌中的擴增?？商峒暗膶嵗秊镺RI(DNA復(fù)制起點)，pBR322ori或P15A ori(Sambrook等《Molecular Cloning.A Laboratory Manual》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。
j)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化所必需的元件，如T-DNA的左或右邊界或病毒區(qū)域(Vir region)。
k)表達(dá)盒介導(dǎo)的分子伴侶蛋白質(zhì)(例如GroELS、dnaKJ、grpE或clpB)的表達(dá)，已知其特別是在重組表達(dá)系統(tǒng)中，能增加正確折疊蛋白質(zhì)的水平(US 5,635,391)。
l)宿主擴增過程中促進質(zhì)粒分離和分布的元件(例如cer-位點；Wilms B等(2001)Biotechnol Bioeng 73(2)95-103)。
可有利地使用包含表達(dá)盒的載體實現(xiàn)向生物體或其細(xì)胞、組織、器官、部分或種子中引入根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒。表達(dá)盒可通過適當(dāng)?shù)南拗菩郧懈钗稽c引入載體(例如質(zhì)粒)。形成的質(zhì)粒首先引入大腸桿菌。選擇、培養(yǎng)正確轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，并通過技術(shù)人員熟悉的方法獲得重組質(zhì)粒。限制性分析和測序可用來驗證克隆步驟。載體的實例可為質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒或農(nóng)桿菌。在有利的實施方案中，表達(dá)盒通過質(zhì)粒載體引入。
適當(dāng)質(zhì)粒的實例在大腸桿菌中為pUC18、PUC19、pBlueScript系列、pKK223-3、pJOE2702、pBAD、pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11或pBdCI，在鏈霉菌中為pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361，在桿菌中為pUB110、pC194或pBD214，在棒桿菌中為pSA77或pAJ667，在真菌中為pALS1、pIL2或pBB116，在酵母中為2μM、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23，或在植物中為pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004或pDH51。在高等真核生物(例如哺乳動物)細(xì)胞中表達(dá)的載體含有基于SV40、乳頭瘤病毒、腺病毒或多瘤病毒的病毒序列(Rodriquez RL & Denhardt DT編；《載體分子克隆載體及其用途的調(diào)查》，Butterworths(1988)，Lenstra等(1990)Arch Virol 1101-24)。所述質(zhì)粒代表一小部分可以選擇的質(zhì)粒。其他質(zhì)粒為技術(shù)人員所熟知并可見于例如《Cloning Vectors》(Pouwels PH等編Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN 0444904018)。包含調(diào)節(jié)序列控制下能夠表達(dá)使本發(fā)明腈水解酶的所有核酸序列被認(rèn)為是本發(fā)明的一部分。
本發(fā)明還涉及重組生物或組織、器官、部分、細(xì)胞或其繁殖材料，其包含本發(fā)明的腈水解酶、編碼所述腈水解酶的核酸序列、包含該核酸序列的重組表達(dá)盒或包括該表達(dá)盒的重組載體。
此類重組生物可例如通過用相應(yīng)蛋白質(zhì)或核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染產(chǎn)生。轉(zhuǎn)化生物(或轉(zhuǎn)化細(xì)胞或組織)的產(chǎn)生需要在相關(guān)宿主細(xì)胞中引入相關(guān)DNA(例如表達(dá)載體)、RNA或蛋白質(zhì)?？墒褂枚喾N方法實施這一稱為轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染)的操作(Keown等(1990)Methods in Enzymology 185527-537)。例如可通過顯微注射或通過用DNA-包被的微粒的轟擊直接引入DNA或RNA。細(xì)胞也可化學(xué)透化例如使用使用聚乙二醇透化，以便DNA可通過擴散進入細(xì)胞。DNA也可通過磷酸鈣介導(dǎo)或與含DNA單位(如微細(xì)胞、溶酶體或脂質(zhì)體)融合引入。另一個引入DNA的適當(dāng)方法為電穿孔，其中細(xì)胞用電脈沖可逆地透化。優(yōu)選的常用方法包括(但不限于)磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)和感染。這些方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(Davis等(1986)BasicMethods In Molecular Biology；Sambrook J等(1989)Molecular cloningA laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel FM等(1994)Current protocols in molecular biology，John Wiley和Sons；Glover DM等(1995)DNA Cloning Vol.1，IRL Press ISBN 019-963476-9)。
在植物中，除了這些“直接”轉(zhuǎn)化技術(shù)之外，轉(zhuǎn)化也可通過使用根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)或發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)的細(xì)菌感染實現(xiàn)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化最適于雙子葉植物細(xì)胞。此方法為本領(lǐng)域熟知并描述(Horsch RB等(1985)Science 2251229f.；EP 120516；Hoekema，The Binary Plant Vector System，OffsetdrukkeriiKanters B.V.，Alblasserdam，Chapter V；An等(1985)EMBO J 4277-287)。當(dāng)使用農(nóng)桿菌時，表達(dá)盒整合到特定質(zhì)粒中，或整合到穿梭或中間載體，或整合到二元(binary)載體中。優(yōu)選使用二元載體(Holsters等(1978)Mol Gen Genet 163181-187)。已知多種二元載體，其中一些可商業(yè)購買，例如pBI101.2或pBIN19(Clontech Laboratories，Inc.USA)。
當(dāng)選擇標(biāo)記為引入的DNA的一部分時，可從未轉(zhuǎn)化細(xì)胞中選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞?？勺鳛闃?biāo)記的基因的實例為上文提供的所有能賦予抗生素或除草劑抗性的基因。對植物而言，技術(shù)人員熟悉從植物細(xì)胞或植物部分再生完整植物的方法。再生方法例如由Fennell等(1992)Plant Cell ReD.11567-570；Stoeger等(1995)Plant Cell Rep.14273-278；Jahne等(1994)Theor Appl Genet 89525-533所描述的。
本發(fā)明還涉及用至少根據(jù)本發(fā)明的核酸序列、根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒或根據(jù)本發(fā)明的載體之一轉(zhuǎn)化的重組生物，細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、組織、部分(如在為植物生物情況下的葉、根等)或來源于此類生物的繁殖材料。術(shù)語生物應(yīng)廣義理解，并指原核和真核生物，優(yōu)選指細(xì)菌、酵母(例如酵母、克孢酵母式畢赤(Pichia)酵母)、真菌(如曲霉式青霉)、非人類動物生物或植物。優(yōu)選的植物生物在上文指出。
術(shù)語“微生物”或“細(xì)菌”包括革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌。優(yōu)選的為所有腸桿菌屬(Enterobacteriaceae)和種和所有放線菌目(Actinomycetales)和種。尤其優(yōu)選的為腸桿菌科埃希氏菌屬(Escherichia)、沙雷氏菌屬(Serratia)、變形菌(Proteus)、腸道細(xì)菌屬(Enterobacter)、克雷博氏桿菌屬(Klebsiella)、沙門氏菌(Salmonella)、志賀氏桿菌屬(Shigella)、愛德華菌(Edwardsielle)、檸檬酸細(xì)菌屬(Citrobacter)、摩根氏菌屬(Morganella)、普羅威登斯菌屬(Providencia)和耶爾森氏菌屬(Yersinia)的菌種。其他優(yōu)選的為土壤農(nóng)桿菌屬、假單胞菌屬、伯克氏菌屬(Burkholderia)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、醋酸桿菌屬(Acetobacter)、葡萄糖桿菌屬(Gluconobacter)、棒狀桿菌屬、短桿菌屬(Brevibacterium)、桿菌屬、梭菌屬(Clostridium)、藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacter)、葡萄菌(Staphylococcus)、產(chǎn)氣桿菌屬(Aerobacter)、產(chǎn)堿桿菌屬、玫瑰色紅球菌屬和鏈霉菌屬(Streptomyces)的所有種。對于表達(dá)重組腈水解酶，埃希氏菌菌種為最優(yōu)選，尤其是大腸桿菌。
此處使用的術(shù)語“植物”或“植物生物”指能光合作用的任何生物。優(yōu)選生物為分化的多細(xì)胞有機體。術(shù)語包括植物界高等和低等植物的所有屬和種。還包括成熟植物、種子、枝條和幼苗、和部分、繁殖材料和來源于它的培養(yǎng)物，例如細(xì)胞培養(yǎng)物。尤其優(yōu)選的為單子葉和雙子葉植物，特別是為動物或人飼料或食物目的或為工業(yè)利用種植的植物，像玉米、小麥、大麥、蕓苔(Canola)、大豆、水稻、甘蔗、甜菜、馬鈴薯、蘿卜(beet)、煙草棉花等。
重組生物可用上述轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染生物體的方法產(chǎn)生。
本發(fā)明的微生物可在允許所述微生物生長的培養(yǎng)基中生長和繁殖。所述培養(yǎng)基可為合成的或天然來源。使用不同的培養(yǎng)基取決于微生物，并為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。為了微生物的生長，培養(yǎng)基包含碳源、氮源、無機鹽并任選地包含少量的維生素和/或痕量元素。
優(yōu)選的碳源為例如多元醇(如丙三醇)、糖類像例，如單糖、二糖或多糖(例如葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、棉籽糖、淀粉或纖維素)、復(fù)合糖源(例如糖蜜)、糖磷酸(例如果糖-1，6-二磷酸)、糖醇(例如甘露醇)、醇(例如甲醇或乙醇)、羧酸(例如檸檬酸、乳酸或乙酸)、油和脂肪(例如大豆油或菜籽油)、氨基酸或氨基酸混合物(例如酪蛋白氨基酸；Difco)或不同的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺)或氨基糖，其中后者也可用作氮源。更優(yōu)選的為葡萄糖和多元醇，尤其是丙三醇。
優(yōu)選的氮源為包含所述化合物的有機或無機氮化合物或材料。實例為銨鹽(例如NH4Cl或(NH4)2SO4)、硝酸鹽、尿素和復(fù)合氮源，如釀酒酵母自溶物、豆粉、麥麩、酵母提取物、蛋白胨、肉膏、酪蛋白水解物、酵母或馬鈴薯蛋白，其也經(jīng)常用作碳源。
無機鹽的實例包括鈣、鎂、鈉、鈷、鉬、錳、鉀、鋅、銅和金屬鹽。特別優(yōu)選對應(yīng)的陰離子為氯、硫酸根、硫和磷酸根離子。提高產(chǎn)量的一個重要問題為控制培養(yǎng)基中Fe2+或Fe3+離子濃度。
培養(yǎng)基任選地包含其他生長因子，例如維生素或生長促進因子，所述生長促進因子如生物素、2-酮基-L-古洛糖酸、抗壞血酸、硫胺素、葉酸、煙酸、泛酸或吡多辛、氨基酸(例如丙氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、苯丙氨酸、鳥氨酸或纈氨酸)、羧酸(例如檸檬酸、甲酸、乳酸)或像二硫蘇糖醇之類的物質(zhì)。
單個營養(yǎng)成分的平衡依賴于發(fā)酵方式并根據(jù)個別需要采用。培養(yǎng)基成分可在發(fā)酵的開始時，在需要它之前進行滅菌后提供或在發(fā)酵過程中根據(jù)培養(yǎng)需要連續(xù)或間斷加入。
以確保產(chǎn)物的最佳產(chǎn)量(例如最佳腈水解酶活性產(chǎn)量)方式選擇發(fā)酵和生長條件。優(yōu)選的發(fā)酵條件為溫度15-40℃，優(yōu)選為溫度25-37℃。pH優(yōu)選地保持在pH 3-9的范圍，優(yōu)選為pH 5-8。發(fā)酵時間一般地可從數(shù)小時到數(shù)天，優(yōu)選為8小時到21天，更優(yōu)選地為4小時到14天。優(yōu)化培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的方法為本領(lǐng)域所熟知(Applied Microbiol Physiology，“APractical Approach(PM Rhodes、PF Stanbury編，IRL-Press，1997，S.53-73，ISBN 0199635773)。
本發(fā)明還涉及制備光學(xué)活性、手性或非手性羧酸的方法，其包含在根據(jù)本發(fā)明的核酸序列編碼的氨基酸序列或生長的、休眠的或破壞的上述微生物(＝宿主生物)在存的條件下將腈轉(zhuǎn)變成光學(xué)活性、手性或非手性羧酸，所述微生物或含有根據(jù)本發(fā)明的核酸序列，或含有包含與一個或多個調(diào)節(jié)信號的連接的本發(fā)明核酸序列的本發(fā)明核酸構(gòu)建體，或含有根據(jù)本發(fā)明的載體的。
本方法有利的實施方案為將光學(xué)活性手性或非手性脂肪族腈轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的羧酸。
如此處使用的術(shù)語“腈”優(yōu)選指含有至少一個腈基的任何有機化合物。術(shù)語“腈”也包括醛或酮和氰化物的混合物，其引起至少一個腈形成。此處使用的術(shù)語“氰化物”應(yīng)指包含或引起氰離子(CN-)釋放的化合物。術(shù)語“氰離子”優(yōu)選應(yīng)包括氰酸和/或氰酸鹽，更優(yōu)選氰化鈉或氰化鉀。本文使用的術(shù)語“混合物”應(yīng)指所有醛/酮和氰化物的定量組合，其引起腈的形成?；旌衔飪?yōu)選地由等摩爾或幾乎等摩爾量的醛/酮和氰化物組成。
本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案為制備光學(xué)活性、手性或非手性羧酸的方法，其中通式I的腈在本發(fā)明的腈水解酶，或生長的、休眠的或破壞的上述微生物存在的條件下被轉(zhuǎn)變成通式II的羧酸，所述微生物含有編碼本發(fā)明腈水解酶的核酸序列，或含有根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒或根據(jù)本發(fā)明的載體。
其中式I和II中的取代基和變量具有下列意義-R1、R2、R3可互相獨立地選自氫，取代或非取代的、分枝或不分枝的C1-C10烷基或C1-C10烷氧基，取代或非取代的芳基或雜芳基、羥基、鹵素(如氟、氯或溴)、C1-C10烷基氨基和氨基，并且其中至少兩個，優(yōu)選地全部取代基R1、R2和R3為不同的。
式I和II中的R1、R2或R3取代基之一為芳基(如苯基)是有利的。還優(yōu)選式I和II中的R1、R2或R3取代基之一為羥基，且另一個為氫或甲基。
適合作為所述R1、R2、R3基團的取代基為例如一個或多個如鹵素(如氟、氯或溴)、巰基、硝基、氨基、羥基、烷基、烷氧基、鏈烯基、鏈烯氧基、炔基或其他芳香族或其他飽和或非飽和的非芳香環(huán)或環(huán)系統(tǒng)之類的取代基。優(yōu)選如C1-C6-烷基(如甲基、乙基、丙基或丁基)之類的為烷基基團、芳基(如苯基、硫代苯基)、鹵素(如氟、氯、溴)、羥基或氨基。
在優(yōu)選的實施方案中，制備光學(xué)活性、手性或非手性羧酸的方法包括將通式III的腈轉(zhuǎn)變成通式IV的羧酸。
其中式I和II中的取代基和變量具有下列意義n＝0或1m＝0、1、2或3，其中m＞2時兩個相鄰的碳原子間有一個或沒有雙鍵p＝0或1A、B、D和E互相獨立地為CH、N或CR7當(dāng)n＝0時，H＝O、S、NR4、CH或CR7，或當(dāng)n＝1時，H＝CH、N或CR7。
其中兩個相鄰的變量A、B、D、E或H可能一起形成另一個取代或非取代的芳香族、飽和或部分飽和的5-8個碳原子的環(huán)，環(huán)中可含有一個或多個雜原子(如O、N或S)，并且變量A、B、D、E或H中不超過三個為雜原子，并且其中R4選自氫、取代或非取代的、分枝或不分枝的C1-C10-烷基，并且其中R5、R6、R7可獨立地選自氫、取代或非取代，分枝或不分枝的C1-C10烷基或C1-C10烷氧基、取代或非取代的芳基或雜芳基、羥基、鹵素(如氟、氯或溴)、C1-C10烷基氨基和氨基。
適合作為所述R4、R5或R6基團的取代基為例如一個或多個如鹵素(如氟、氯或溴)、巰基、硝基、氨基、羥基、烷基、烷氧基、鏈烯基、鏈烯氧基、炔基或其他芳香族或其他飽和或非飽和非芳香環(huán)或環(huán)系統(tǒng)之類的取代基。優(yōu)選如C1-C6-烷基(如甲基、乙基、丙基或丁基)之類的烷基基團、芳基(如苯基、硫代苯基)、鹵素(如氯、氟或溴)、羥基或氨基。
上述烷基基團可包含取代或非取代的、分枝或不分枝的C1-C10-烷基鏈如甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基、正丁基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、1，1-二甲基乙基、正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2，2-二甲基丙基、1-乙基丙基、正己基、1，1-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1，1，2-三甲基丙基、1，2，2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基、1-乙基-2-甲基丙基、正庚基、正辛基、正壬基或正癸基。優(yōu)選的為甲基、乙基、正丙基、正丁基、異丙基或異丁基。
上述鏈烯基基團可包含分枝或不分枝的C2-C10鏈烯基鏈，如乙烯基、丙稀基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、2-甲基丙稀基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-甲基-1-丁烯基、2-甲基-1-丁烯基、，3-甲基-1-丁烯基、1-甲基-2-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、3-甲基-2-丁烯基、1-甲基-3-丁烯基、2-甲基-3-丁烯基、3-甲基-3-丁烯基、1，1-二甲基-2-丙稀基、1，2-二甲基-1-丙稀基、1，2-二甲基-2-丙稀基、1-乙基-1-丙稀基、1-乙基-2-丙稀基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基、1-甲基-1-戊烯基、2-甲基-1-戊烯基、3-甲基-1-戊烯基、4-甲基-1-戊烯基、1-甲基-2-戊烯基、2-甲基-2-戊烯基、3-甲基-2-戊烯基、4-甲基-2-戊烯基、1-甲基-3-戊烯基、2-甲基-3-戊烯基、3-甲基-3-戊烯基、4-甲基-3-戊烯基、1-甲基-4-戊烯基、2-甲基-4-戊烯基、3-甲基-4-戊烯基、4-甲基-4-戊烯基、1，1-二甲基-2-丁烯基、1，1-二甲基-3-丁烯基、1，2-二甲基-1-丁烯基、1，2-二甲基-2-丁烯基、1，2-二甲基-3-丁烯基、1，3-二甲基-1-丁烯基、1，3-二甲基-2-丁烯基、1，3-二甲基-3-丁烯基、2，2-二甲基-3-丁烯基、2，3-二甲基-1-丁烯基、2，3-二甲基-2-丁烯基、2，3-二甲基-3-丁烯基、3，3-二甲基-1-丁烯基、3，3-二甲基-2-丁烯基、1-乙基-1-丁烯基、1-乙基-2-丁烯基、1-乙基-3-丁烯基、2-乙基-1-丁烯基、2-乙基-2-丁烯基、2-乙基-3-丁烯基、1，1，2-三甲基-2-丙稀基、1-乙基-1-甲基-2-丙稀基、1-乙基-2-甲基-1-丙稀基、1-乙基-2-甲基-2-丙稀基、1-庚烯基、2-庚烯基、3-庚烯基、4-庚烯基、5-庚烯基、6-庚烯基、1-辛烯基、2-辛烯基、3-辛烯基、4-辛烯基、5-辛烯基、6-辛烯基、7-辛烯基、壬烯基或癸烯基。優(yōu)選的為乙烯基、丙稀基、丁烯基或戊烯基。
上述烷氧基基團可為取代或非取代的、分枝或不分枝的C1-C10-烷氧基鏈如甲氧基、乙氧基、丙氧基、1-甲基乙氧基、丁氧基、1-甲基丙氧基、2-甲基丙氧基、1，1-二甲基乙氧基、戊氧基、1-甲基丁氧基、2-甲基丁氧基、3-甲基丁氧基、1，1-二甲基丙氧基、1，2-二甲基丙氧基、2，2-二甲基丙氧基、1-乙基丙氧基、己氧基、1-甲基戊氧基、2-甲基戊氧基、3-甲基戊氧基、4-甲基戊氧基、1，1-二甲基丁氧基、1，2-二甲基丁氧基、1，3-二甲基丁氧基、2，2-二甲基丁氧基、2，3-二甲基丁氧基、3，3-二甲基丁氧基、1-乙基丁氧基、2-乙基丁氧基、1，1，2-三甲基丙氧基、1，2，2-三甲基丙氧基、1-乙基-1-甲基丙氧基、1-乙基-2-甲基丙氧基、己烯氧基、庚烯氧基、辛烯氧基、壬烯氧基或癸烯氧基和其分枝同源物。
上述烷基羰基基團為取代或非取代的、分枝或不分枝的C1-C10-烷基羰基鏈如甲基羰基、乙基羰基、正丙基羰基、1-甲基乙基羰基、正丁基羰基、1-甲基丙基羰基、2-甲基丙基羰基、1，1-二甲基乙基羰基、正戊基羰基、1-甲基丁基羰基、2-甲基丁基羰基、3-甲基丁基羰基、2，2-二甲基丙基羰基、1-乙基丙基羰基、正己基羰基、1，1-二甲基丙基羰基、1，2-二甲基丙基羰基、1-甲基戊基羰基、2-甲基戊基羰基、3-甲基戊基羰基、4-甲基戊基羰基、1，1-二甲基丁基羰基、1，2-二甲基丁基羰基、1，3-二甲基丁基羰基、2，2-二甲基丁基羰基、2，3-二甲基丁基羰基、3，3-二甲基丁基羰基、1-乙基丁基羰基、2-乙基丁基羰基、1，1，2-三甲基丙基羰基、1，2，2-三甲基丙基羰基、1-乙基-1-甲基丙基羰基、1-乙基-2-甲基丙基羰基、正庚基羰基、正辛基羰基、正壬基羰基或正癸基羰基。優(yōu)選的為甲基羰基、乙基羰基、正丙基羰基、正丁基羰基、異丙基羰基或異丁基羰基。
上述鏈烯基羰基基團可為分枝或不分枝的C2-C10-鏈烯基羰基鏈如乙烯基羰基、丙稀基羰基、1-丁烯基羰基、2-丁烯基羰基、3-丁烯基羰基、2-甲基丙稀基羰基、1-戊烯基羰基、2-戊烯基羰基、3-戊烯基羰基、4-戊烯基羰基、1-甲基-1-丁烯基羰基、2-甲基-1-丁烯基羰基、3-甲基-1-丁烯基羰基、1-甲基-2-丁烯基羰基、2-甲基-2-丁烯基羰基、3-甲基-2-丁烯基羰基、1-甲基-3-丁烯基羰基、2-甲基-3-丁烯基羰基、3-甲基-3-丁烯基羰基、1，1-二甲基-2-丙稀基羰基、1，2-二甲基-1-丙稀基羰基、1，2-二甲基-2-丙稀基羰基、1-乙基-1-丙稀基羰基、1-乙基-2-丙稀基羰基、1-己烯基羰基、2-己烯基羰基、3-己烯基羰基、4-己烯基羰基、5-己烯基羰基、1-甲基-1-戊烯基羰基、2-甲基-1-戊烯基羰基、3-甲基-1-戊烯基羰基、4-甲基-1-戊烯基羰基、1-甲基-2-戊烯基羰基、2-甲基-2-戊烯基羰基、3-甲基-2-戊烯基羰基，4-甲基-2-戊烯基羰基，1-甲基-3-戊烯基羰基，2-甲基-3-戊烯基羰基，3-甲基-3-戊烯基羰基、4-甲基-3-戊烯基羰基、1-甲基-4-戊烯基羰基、2-甲基-4-戊烯基羰基、3-甲基-4-戊烯基羰基、4-甲基-4-戊烯基羰基、1，1-二甲基-2-丁烯基羰基、1，1-二甲基-3-丁烯基羰基、1，2-二甲基-1-丁烯基羰基、1，2-二甲基-2-丁烯基羰基、1，2-二甲基-3-丁烯基羰基、1，3-二甲基-1-丁烯基羰基、1，3-二甲基-2-丁烯基羰基、1，3-二甲基-3-丁烯基羰基、2，2-二甲基-3-丁烯基羰基、2，3-二甲基-1-丁烯基羰基、2，3-二甲基-2-丁烯基羰基、2，3-二甲基-3-丁烯基羰基、3，3-二甲基-1-丁烯基羰基、3，3-二甲基-2-丁烯基羰基、1-乙基-1-丁烯基羰基、1-乙基-2-丁烯基羰基、1-乙基-3-丁烯基羰基、2-乙基-1-丁烯基羰基、2-乙基-2-丁烯基羰基、2-乙基-3-丁烯基羰基、1，1，2-三甲基-2-丙稀基羰基、1-乙基-1-甲基-2-丙稀基羰基、1-乙基-2-甲基-1-丙稀基羰基、1-乙基-2-甲基-2-丙稀基羰基、1-庚烯基羰基、2-庚烯基羰基、3-庚烯基羰基、4-庚烯基羰基、5-庚烯基羰基、6-庚烯基羰基、1-辛烯基羰基、2-辛烯基羰基、3-辛烯基羰基、4-辛烯基羰基、5-辛烯基羰基、6-辛烯基羰基、7-辛烯基羰基、壬烯基羰基或癸烯基羰基。優(yōu)選的為乙烯基羰基、丙稀基羰基、丁烯基羰基或戊烯基羰基。
上述芳基基團可為環(huán)或環(huán)系統(tǒng)中含有6-20個碳原子的取代或非取代的芳基基團。這可包含融合到-起的芳環(huán)或烷基、烷基羰基、鏈烯基或鏈烯基羰基鏈、羰基、氧或氮連接的芳環(huán)。芳基基團也可適當(dāng)?shù)慕?jīng)由C1-C10-烷基、C3-C8-鏈烯基、C3-C6-炔基或C3-C8-環(huán)烷基鏈與基礎(chǔ)框架。優(yōu)選的為苯基或萘基。
上述芳基羰基基團可為環(huán)或環(huán)系統(tǒng)中含有6-20個碳原子的取代或非取代的芳基羰基基團。環(huán)系統(tǒng)可包含融合到-起的芳環(huán)或由烷基、烷基羰基、鏈烯基或鏈烯基羰基鏈、羰基、氧或氮連接的芳環(huán)。優(yōu)選的為苯基羰基或萘基羰基。
上述雜芳基系統(tǒng)可為取代或非取代的、簡單或融合的芳環(huán)系統(tǒng)，可帶有一個或多個芳香雜環(huán)(3-7個成員環(huán))，環(huán)中可含有一個或多個雜原子(如N、O或S)，并可適當(dāng)?shù)赜蒀1-C10-烷基、C3-C8-鏈烯基或C3-C8-環(huán)烷基鏈與基礎(chǔ)框架連接。此類雜芳基基團的實例為吡唑、咪唑、噁唑、異噁唑、噻唑、三唑、吡啶、喹啉、異喹啉、吖啶、嘧啶、噠嗪、吡嗪酰胺、吩嗪、嘌呤或喋啶。雜芳基基團可由雜原子或由環(huán)或環(huán)系統(tǒng)中的各碳原子或由取代基與基礎(chǔ)框架連接。雜芳基羰基基團指由羰基基團與基礎(chǔ)框架連接的芳香雜環(huán)基團。優(yōu)選的為吡啶、咪唑、嘧啶、嘌呤、吡嗪酰胺或喹啉。
上述烷基氨基基團可為取代或非取代的、分枝或不分枝的C1-C10-烷基氨基鏈，如甲氨基、乙氨基、正丙氨基、1-甲基乙氨基、正丁氨基、1-甲基丙氨基、2-甲基丙氨基、1，1-二甲基乙氨基、正戊氨基、1-甲基丁氨基、2-甲基丁氨基、3-甲基丁氨基、2，2-二甲基丙氨基、1-乙基丙氨基、正己氨基、1，1-二甲基丙氨基、1，2-二甲基丙氨基、1-甲基戊氨基、2-甲基戊氨基、3-甲基戊氨基、4-甲基戊氨基、1，1-二甲基丁氨基、1，2-二甲基丁氨基、1，3-二甲基丁氨基、2，2-二甲基丁氨基、2，3-二甲基丁氨基、3，3-二甲基丁氨基、1-乙基丁氨基、2-乙基丁氨基、1，1，2-三甲基丙氨基1，2，2-三甲基丙氨基、1-乙基-1-甲基丙氨基、1-乙基-2-甲基丙氨基、正庚氨基、正辛氨基、正壬氨基或正癸氨基。優(yōu)選的為甲氨基、乙氨基、正丙氨基、正丁氨基、異丙氨基或異丁氨基。
優(yōu)選的腈包括芳香族或芳香雜環(huán)腈，如2-苯基丙腈、2-羥基-2-苯基乙酰腈、2-氨基-2-苯基乙酰腈、2-氯苯基丙腈、2-羥基苯基丙腈、苯并腈、苯基乙酰腈、反式-苯乙烯腈、2-羥基-4-苯基-丁酸腈、3-氰基噻吩或3-氰基甲基噻吩。優(yōu)選的為芳基-乙酰腈，更優(yōu)選的為取代扁桃腈。扁桃腈芳基可帶有一個或多個取代。優(yōu)選的取代可為烷基(優(yōu)選的為甲基)、烷氧基(優(yōu)選的為甲氧基)、鹵素或硝基。取代扁桃腈可選自但不限于鄰氟扁桃腈、對氟扁桃腈、間氟扁桃腈、鄰氯扁桃腈、對氯扁桃腈、間氯扁桃腈、鄰溴扁桃腈、對溴扁桃腈、間溴扁桃腈、鄰硝基-扁桃腈、對硝基扁桃腈、間硝基扁桃腈、鄰甲基扁桃腈、對甲基扁桃腈、間甲基扁桃腈、鄰甲氧基扁桃腈、對甲氧基扁桃腈或間甲氧基扁桃腈。更優(yōu)選的為鄰氯扁桃腈。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中，外消旋腈指由兩個對映異構(gòu)體的50∶50混合物組成的腈，或由富含混合物中兩個對映異構(gòu)體之一的任何其他混合物組成的腈，或由乙醛/甲酮化合物和氰化物混合組成的腈。
根據(jù)本發(fā)明的方法中，“光學(xué)活性”羧酸指顯示富含一種對映異構(gòu)體的羧酸。該方法優(yōu)選地引起至少70％ee，優(yōu)選至少90％ee，尤其優(yōu)選至少98％ee，極其優(yōu)選至少99％ee的對映異構(gòu)體純度。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中與SEQ ID NO2所述的野生型糞產(chǎn)堿菌腈水解酶296位相應(yīng)的氨基酸殘基與非酪氨酸的氨基酸殘基交換不引起得到的產(chǎn)物對映異構(gòu)體純度的實質(zhì)降低，交換更優(yōu)選地引起未改變的或提高的對映異構(gòu)體純度。
根據(jù)本發(fā)明的方法可在溫度0-80℃實施是有利的，優(yōu)選在溫度10-60℃實施，尤其優(yōu)選地在溫度15-55℃實施。
根據(jù)本發(fā)明的方法在pH 4-11實施是有利的，優(yōu)選在pH 4-9實施。
在本發(fā)明方法中使用按重量計算0.01-30％的腈或0.01-30％的相應(yīng)醛或酮和0.01-30％氰化物(例如氰氫酸)是有利的。可以使用過量的氰化物實施方法。在一些情況下，這引起高于所述的氰化物含量。取決于腈，反應(yīng)中可使用不同數(shù)量的腈。對于與相應(yīng)的醛和氰化物平衡的腈(羥腈)，使用腈的最小量(介于0.01-5％重量百分比的量)是有利的，因為醛通常對微生物或酶有毒性。同樣以按重量計算0.01-10％數(shù)量使用揮發(fā)性腈是有利的。更大量的羥腈或腈會阻滯反應(yīng)。在具有低的或基本上無溶解性的腈或僅非常小量地溶于水介質(zhì)的腈的情況下，可能使用比所述更大的量，并且是有利。為提高轉(zhuǎn)變和得率，以控制外消旋腈的加入有利地實施反應(yīng)。產(chǎn)物可在反應(yīng)終結(jié)束之后分離或在旁路中連續(xù)地取出。本發(fā)明的方法可以分批式方法進行，其中離析物在過程的開始以一定濃度提供，并隨后轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的產(chǎn)物。備選地，離析物可連續(xù)地加入反應(yīng)混合物中，例如以保持離析物濃度恒定或幾乎恒定的方式加入反應(yīng)混合物中。
上述適當(dāng)?shù)娜┗蛲高m當(dāng)?shù)匾詨A催化的反應(yīng)后，在醛或酮和氰化物(例如氰氫酸)之間形成腈的化合物。醛和氰化物之間的反應(yīng)引起化醛和氰化物平衡中具有優(yōu)勢的羥腈的產(chǎn)生。與羥腈平衡的建立指可能用僅能轉(zhuǎn)變腈的一個異構(gòu)體的酶如此獲得理論的100％產(chǎn)量，因為外消旋腈連續(xù)地再充。對所有其他腈來說，不為酶轉(zhuǎn)變的腈(＝“錯誤的”或其他對映異構(gòu)體)有利地通過化學(xué)反應(yīng)外消旋并返回加工過程以能達(dá)到理論的100％產(chǎn)量，或者丟棄或純化和具保留的立構(gòu)中心的化學(xué)水解。
酶促腈水解的方法優(yōu)選地在水溶液中實施。
根據(jù)本發(fā)明的方法使可以將大量的外消旋腈轉(zhuǎn)變成光學(xué)活性的羧酸。本發(fā)明方法可以轉(zhuǎn)變至少25mmol腈/hxmg蛋白質(zhì)或至少25mmol腈/hxg微克干重微生物，優(yōu)選至少30mmol腈/hxmg蛋白質(zhì)或至少30mmol腈/hxg干重，尤其優(yōu)選地至少40mmol腈/hxmg蛋白質(zhì)或至少40mmol腈/hxg干重，極其優(yōu)選地至少50mmol腈/hxmg蛋白質(zhì)或至少50mmol腈/hxg干重。
可以將包含本發(fā)明核酸、核酸構(gòu)建體或載體的生長的細(xì)胞用于本發(fā)明的方法。也可使用休眠的、固定的、透化的或破壞的細(xì)胞。破壞的細(xì)胞指例如通過用如溶劑之類的處理造成可通透的細(xì)胞或通過酶處理、機械處理(例如氟氏細(xì)胞壓碎器或超聲)或其他方法分解的細(xì)胞。以這種方式獲得的粗提物適于并對本發(fā)明的方法有利。純化或部分純化的酶也可用于此方法。固定的微生物或酶同樣適于并可有利地用于反應(yīng)中。
可有利地通過萃取或結(jié)晶或者通過萃取和結(jié)晶從水反應(yīng)溶液中分離根據(jù)本發(fā)明的方法中制備的光學(xué)活性羧酸。為此目的，可濃縮水反應(yīng)溶液(例如通過蒸發(fā)或低壓升華干燥法)，并用如無機酸(例如HCl或H2SO4)或有機酸有利地酸化到pH 3或低于3的pH值，然后用有機溶劑萃取。萃取可重復(fù)多次以增加產(chǎn)量?？墒褂玫挠袡C溶劑原則上適當(dāng)?shù)募尤臌}之后與水呈現(xiàn)相界的所有溶劑。有利的溶劑如甲苯、苯、己烷、甲基叔丁醚或乙酸乙酯。
濃縮有機相之后，通?？梢暂^好的化學(xué)純度分離產(chǎn)物，即高于90％的化學(xué)純度。然而，萃取之后含產(chǎn)物的有機相也僅可部分濃縮，可結(jié)晶產(chǎn)物。為此目的，有利地將溶液冷卻到溫度0-25℃(室溫)。也可直接從有機溶液中結(jié)晶。結(jié)晶產(chǎn)物可重吸收于相同或不同的溶劑中，以重新結(jié)晶并再次結(jié)晶。隨后至少一次的結(jié)晶(依賴于共晶組合物的情況)進一步增加產(chǎn)物的對映異構(gòu)體純度。
然而，光學(xué)活性的羧酸也可在用酸有利地酸化到pH低于3之后從水反應(yīng)溶液中立即結(jié)晶出。這有利地需要通過加熱減少水溶液體積10-90％，優(yōu)選20-80％，尤其優(yōu)選30-70％以使其濃縮。優(yōu)選用冷卻進行結(jié)晶。結(jié)晶優(yōu)選的溫度為0-15℃。同樣優(yōu)選由萃取或適當(dāng)?shù)碾S后結(jié)晶產(chǎn)生光學(xué)活性羧酸。
用這些優(yōu)選的實施類型，可依賴于反應(yīng)使用的腈以60-100％，優(yōu)選以80-100％，尤其優(yōu)選以90-100％的得率分離本發(fā)明方法的產(chǎn)物。分離的產(chǎn)物具有＞90％，優(yōu)選＞95％，尤其優(yōu)選＞98％的高化學(xué)純度。此外，產(chǎn)物具有還可通過結(jié)晶進一步增加的高對映異構(gòu)體純度。以這種方式獲得的產(chǎn)物適于用作有機合成制備藥物或農(nóng)用化學(xué)品的起始材料或者用作外消旋物分解(racemate resolution)的起始材料。
而本發(fā)明另一個實施方案涉及在植物生物中實現(xiàn)除草劑抗性的方法，其中該植物生物用包含編碼腈水解酶的核酸序列的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化，其中所述的腈水解酶在與如SEQ ID NO2所述的野生型糞產(chǎn)堿菌腈水解酶296位相應(yīng)的位置含有非酪氨酸的氨基酸，其中所述的核酸序列受在該植物生物中發(fā)揮功能的啟動子的控制。優(yōu)選的除草劑為腈除草劑，更優(yōu)選為3，5-二溴-4-羥基苯并腈(Bromoxynil_)。
在此描述的實施例和實施方案應(yīng)理解為僅為描述目的，其多種修飾和改變可建議于本領(lǐng)域的技術(shù)人員，并包括在此應(yīng)用的宗旨和權(quán)限之內(nèi)和附加權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。所有的出版物、專利和引用的專利申請書為所有目的在此引用作為參考。
序列SEQ ID NO1編碼糞產(chǎn)堿菌種腈水解酶的核酸序列(DE19848129-A1)。
SEQ ID NO2編碼糞產(chǎn)堿菌種腈水解酶的氨基酸序列(DE19848129-A1)。
SEQ ID NO3編碼糞產(chǎn)堿菌種腈水解酶的核酸序列(WO 99/64607)。
SEQ ID NO4編碼糞產(chǎn)堿菌種腈水解酶的氨基酸序列(WO 99/6460)。
SEQ ID NO5編碼假單胞菌屬菌種腈水解酶的核酸序列。
SEQ ID NO6編碼假單胞菌屬菌種腈水解酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO7編碼玫瑰色紅球菌腈水解酶的核酸序列(DE10010149)。
SEQ ID NO8編碼玫瑰色紅球菌腈水解酶的氨基酸序列(DE10010149)。
實施例實施例1通過用其他氨基酸置換Y296產(chǎn)生經(jīng)修飾的腈水解酶使用重疊序列延伸PCR通過定點誘變實現(xiàn)如SEQ ID NO2所述的野生型糞產(chǎn)堿菌腈水解酶296位酪氨酸的取代。建立下列方法
使用下列引物
上面指出的引物中，NNN可代表任何堿基(A；T；C；G；擺動引物(wobbleprimer))。
PCR反應(yīng)使用Pfu-聚合酶(Stratagene)，使用下列溫度方案進行95℃3分鐘；95℃45秒，55℃45秒和72℃2分50秒，25個循環(huán)；72℃10分鐘；保存于4℃?zhèn)溆?。所有PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳(E-Gel，Invitrogen)和柱層析(GFX-Kit，Pharmacia)純化。3號PCR的產(chǎn)物隨后用NdeI和HindIII消化，并克隆到相應(yīng)消化的pDHE載體(DE19848129-A1)中。
實施例2用2-氯扁桃腈測定酶促活性用如實施例1所述產(chǎn)生的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1并鋪于含100μg/ml氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上。獲得的克隆轉(zhuǎn)到0.2ml液體LB-氨芐青霉素培養(yǎng)基中，并于37℃生長過夜。部分此培養(yǎng)物用于接種含2g/l用于誘導(dǎo)表達(dá)的L-鼠李糖的0.2ml液體LB-氨芐青霉素培養(yǎng)基。培養(yǎng)物生長過夜，收獲并分析其催化2-氯扁桃腈的活性。為此目的在85μl 10mM PipespH7.2和25μl 2-氯扁桃腈(2-CMN)(48mM于甲醇中)加入90μl細(xì)胞懸浮液(于10mM Pipes pH7.2中)。50℃孵育40分鐘后，通過加入HCl終止反應(yīng)。通過HPLC分析上清液的2-氯扁桃酸。分離具有最高活性的克隆，從中制備質(zhì)粒DNA，測序并轉(zhuǎn)化進含pAgro pHSG575的TG10。(大腸桿菌TG10為包含鼠李糖異構(gòu)酶rhaA缺陷的大腸桿菌TG1衍生物；pAgro(pBB541；Tashifumi Tomoyasu等(2001)Mol Microbiol 40(2)397-413)，且pHSG575(Takeshita S等(1987)Gene 6163-74)共表達(dá)伴侶分子GroELS的質(zhì)粒)。
在還含有壯觀霉素(50μg/ml)、氯霉素(chloramphenicole)(10μg/ml)和(如果對于酶誘導(dǎo)需要的話)L-鼠李糖(0.5g/L)和IPTG(0.1mM)的4ml規(guī)模的液體LB-氨芐青霉素中培養(yǎng)之后，以上選擇克隆的活性得到驗證。圖1描述了與未修飾的對照TG10 pDHE1650 pAgro pHSG575比較，一些克隆的活性及其序列。
活性通過確定羧酸產(chǎn)量[μmol/(l*min)]計算。通過相對于測定法中使用的以600nm(OD600)下測量的光密度[mmol/(l*min*OD600)]表示的微生物生物量進行標(biāo)準(zhǔn)化而獲得比活性。“相對比活性”通過將獲得于特定標(biāo)準(zhǔn)底物(例如野生型腈水解酶)的比活性設(shè)為1.0并通過比例法(rule ofthree)轉(zhuǎn)化其他腈水解酶的比活性計算。
實施例3腈水解酶(SEQ ID NO2)和其Y296C突變體底物接納性的比較用包含SEQ ID NO2所述腈水解酶表達(dá)盒(pDHE1650)和其Y296C突變體(如上所述產(chǎn)生)的pDHE載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌TG10預(yù)培養(yǎng)物在包含氨芐青霉素(100μg/ml)、壯觀霉素(50μg/ml)、氯霉素(chloramphenicole)(10μg/ml)的25mL液體LB培養(yǎng)基中37℃連續(xù)振蕩(200轉(zhuǎn)/分)23小時。10ml得到的培養(yǎng)物用于接種包含氨芐青霉素(100μg/ml)、壯觀霉素(50μg/ml)、氯霉素(chloramphenicole)(10μg/ml)、0.1mM IPTG和0.5g/L鼠李糖的400mL LB培養(yǎng)基并37℃連續(xù)振蕩(200轉(zhuǎn)/分)培養(yǎng)18小時。收獲產(chǎn)生的生物質(zhì)并用10mM Tris/HCl pH 7.0洗滌。
底物接納性檢測通過使用25μl細(xì)胞懸浮液/ml 10mM PIPES pH7.0/包含6mM所指示腈的10％MeOH，于40℃分別進行0.5小時和2小時而實施。反應(yīng)通過加入1M HCl終止，上清通過HPLC分析。結(jié)果在圖2中描述。顯然，Y296位的突變造成對取代的芳基乙酰腈更廣泛的底物接納性。而未修飾的酶僅以低活性轉(zhuǎn)變?nèi)〈碾?，修飾造成對每一檢測的取代底物的活性增加，而對未取代的底物活性保持不變。
通過測定羧酸產(chǎn)量[μmol(l*min)]計算活性。通過相對于測定法中使用的以600nm(OD600)下測量的光密度[mmol(l*min*OD600)]表示的微生物生物量相行標(biāo)準(zhǔn)化而獲得比活性?！跋鄬Ρ然钚浴蓖ㄟ^將獲得于特定標(biāo)準(zhǔn)底物(例如未取代的扁桃腈)的比活性設(shè)為100％并通過比例法轉(zhuǎn)化對其他底物的比活性計算。
實施例4通過用其他氨基酸置換Y296產(chǎn)生經(jīng)修飾的腈水解酶4.1使用重疊序列延伸PCR通過定點誘變實現(xiàn)用丙氨酸取代糞產(chǎn)堿菌ATCC8750腈水解酶(SEQ.ID NO.4，稱為“Nit8750ALCFA”)的酪氨酸Y296。建立下列方法
引物
如實施例1中所述進行PCR反應(yīng)和克隆。所獲克隆的質(zhì)粒-DNA經(jīng)測序證明攜帶編碼經(jīng)修飾的腈水解酶Nit8750_ALCFA-Y296A的所需突變。
4.2使用重疊序列延伸PCR通過定點誘變實現(xiàn)用丙氨酸取代假單胞菌屬菌種腈水解酶(SEQ.ID NO.6，稱為“Nit338_PSESP”；殘基Y297與腈水解酶Nit1650_ALCFA和Nit8750_ALCFA中的Y296對應(yīng))的酪氨酸Y297。建立下列方法
引物
如實施例1中所述進行PCR反應(yīng)和克隆。所獲克隆的質(zhì)粒-DNA經(jīng)測序證明的攜帶編碼經(jīng)修飾的腈水解酶Nit338_PSESP-Y296A的所需突變。實施例5腈水解酶Nit8750_ALCFA和其Y296A突變體、Nit338_PSESP和其Y297A突變體底物接納性的比較將分別包含SEQ ID NO4所述腈水解酶及其Y296A突變體，SEQ IDNO6所述腈水解酶及其Y297A突變體的表達(dá)盒的pDHE載體(如上所述產(chǎn)生)轉(zhuǎn)化的單獨的的大腸桿菌TG10預(yù)培養(yǎng)物在包含氨芐青霉素(100μg/ml)、壯觀霉素(50μg/ml)、氯霉素(chloramphenicole)(10μg/ml)的25mL液體LB培養(yǎng)基中于37℃連續(xù)振蕩(200轉(zhuǎn)/分)下生長23小時。10ml所得的各培養(yǎng)物用于接種包含氨芐青霉素(100μg/ml)、壯觀霉素(50μg/ml)、氯霉素(chloramphenicole)(10μg/ml)、0.1mM IPTG和0.5g/L鼠李糖的單批400mL LB培養(yǎng)基并在37℃連續(xù)振蕩(200轉(zhuǎn)/分)下生長18小時。分開收獲產(chǎn)生的生物質(zhì)，并用10mM Tris/HCl pH 7.0洗滌。
底物接納性檢測通過使用25μl單一細(xì)胞懸浮液/ml 10mM PIPESpH7.0/分別包含10mM扁桃腈和2-氯扁桃腈的10％MeOH，于40℃分別進行0.5小時和2小時而實施。反應(yīng)通過加入1M HCl終止，上清通過HPLC分析。結(jié)果在圖3中以2-氯扁桃腈對扁桃腈的比活性比率描述。通過將各野生型腈水解酶對扁桃腈的比活性設(shè)為100％，并通過比例法轉(zhuǎn)化其它腈水解酶的比活性和2-氯扁桃腈的比活性進行計算。
Y296/Y297位的突變(每一個與SEQ ID NO2所述的糞產(chǎn)堿菌腈水解酶中Y296對應(yīng))造成對取代的芳基乙酰腈獨立于野生型腈水解酶的更廣泛的底物接納性。而未修飾的酶僅以低活性轉(zhuǎn)變?nèi)〈碾?，修飾造成對每一個測試的取代底物活性的增加。
序列表<110>巴斯福股份公司<120>經(jīng)修飾的腈水解酶及它們在產(chǎn)生羧酸的方法中的用途<130>AE20020055<140>
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<221>CDS<222>(1)..(1068)<223>編碼腈水解酶<220>
<221>變異<222>(886)..(888)<223>用于非酪氨酸修飾變異的密碼子<400>1atg cag aca aga aaa atc gtc cgg gca gcc gcc gta cag gcc gcc tct 48Met Gln Thr Arg Lys Ile Val Arg Ala Ala Ala Val Gln Ala Ala Ser1 5 10 15ccc aac tac gat ctg gca acg ggt gtt gat aaa acc att gag ctg gct 96Pro Asn Tyr Asp Leu Ala Thr Gly Val Asp Lys Thr Ile Glu Leu Ala20 25 30cgt cag gcc cgc gat gag ggc tgt gac ctg atc gtg ttt ggt gaa acc 144Arg Gln Ala Arg Asp Glu Gly Cys Asp Leu Ile Val Phe Gly Glu Thr35 40 45tgg ctg ccc gga tat ccc ttc cac gtc tgg ctg ggc gca ccg gcc tgg 192Trp Leu Pro Gly Tyr Pro Phe His Val Trp Leu Gly Ala Pro Ala Trp50 55 60tcg ctg aaa tac agt gcc cgc tac tat gcc aac tcg ctc tcg ctg gac 240Ser Leu Lys Tyr Ser Ala Arg Tyr Tyr Ala Asn Ser Leu Ser Leu Asp65 70 75 80agt gca gag ttt caa cgc att gcc cag gcc gca cgg acc ttg ggt att 288Ser Ala Glu Phe Gln Arg Ile Ala Gln Ala Ala Arg Thr Leu Gly Ile85 90 95
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atg gtc gaa tac aca aac aca ttc aaa gtt gct gcg gtg cag gca cag48Met Val Glu Tyr Thr Asn Thr Phe Lys Val Ala Ala Val Gln Ala Gln1 5 10 15cct gtg tgg ttc gac gcg gcc aaa acg gtc gac aag acc gtg tcc atc96Pro Val Trp Phe Asp Ala Ala Lys Thr Val Asp Lys Thr Val Ser Ile20 25 30atc gcg gaa gca gcc cgg aac ggg tgc gag ctc gtt gcg ttt ccc gag 144Ile Ala Glu Ala Ala Arg Asn Gly Cys Glu Leu Val Ala Phe Pro Glu35 40 45gta ttc atc ccg ggg tac ccg tac cac atc tgg gtc gac agc ccg ctc 192Val Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Tyr His Ile Trp Val Asp Ser Pro Leu50 55 60gcc gga atg gcg aag ttc gcc gtg cgc tac cac gag aat tcc ctg acg 240Ala Gly Met Ala Lys Phe Ala Val Arg Tyr His Glu Asn Ser Leu Thr65 70 75 80atg gac agc ccg cac gta cag cgg ttg ctc gat gcc gcc cgc gac cac 288Met Asp Ser Pro His Val Gln Arg Leu Leu Asp Ala Ala Arg Asp His85 90 95aac atc gcc gta gtg gtg gga atc agc gag cgg gat ggc ggc agc ttg 336Asn Ile Ala Val Val Val Gly Ile Ser Glu Arg Asp Gly Gly Ser Leu100 105 110tac atg acc cag ctc atc atc gac gcc gat ggg caa ctg gtc gcc cga 384Tyr Met Thr Gln Leu Ile Ile Asp Ala Asp Gly Gln Leu Val Ala Arg115 120 125cgc cgc aag ctc aag ccc acc cac gtc gag cgt tcg gta tac gga gaa 432Arg Arg Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Ser Val Tyr Gly Glu130 135 140gga aac ggc tcg gat atc tcc gtg tac gac atg cct ttc gca cgg ctt 480Gly Asn Gly Ser Asp Ile Ser Val Tyr Asp Met Pro Phe Ala Arg Leu145 150 155 160ggc gcg ctc aac tgc tgg gag cat ttc cag acg ctc acc aag tac gca 528Gly Ala Leu Asn Cys Trp Glu His Phe Gln Thr Leu Thr Lys Tyr Ala165 170 175atg tac tcg atg cac gag cag gtg cac gtc gcg agc tgg cct ggc atg 576Met Tyr Ser Met His Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Gly Met180 185 190tcg ctg tac cag ccg gag gtc ccc gca ttc ggt gtc gat gcc cag ctc 624Ser Leu Tyr Gln Pro Glu Val Pro Ala Phe Gly Val Asp Ala Gln Leu195 200 205acg gcc acg cgt atg tac gca ctc gag gga caa acc ttc gtg gtc tgc 672Thr Ala Thr Arg Met Tyr Ala Leu Glu Gly Gln Thr Phe Val Val Cys210 215 220acc acc cag gtg gtc aca ccg gag gcc cac gag ttc ttc tgc gag aac 720Thr Thr Gln Val Val Thr Pro Glu Ala His Glu Phe Phe Cys Glu Asn225 230 235 240
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1.分離的編碼腈水解酶的多肽，其中所述多肽包含至少一個這樣選自以下序列a)(K/R/H)XXDXXGX(X*)，b)與腈水解酶共有序列具有至少50％同源性的序列，其中所述的腈水解酶共有序列選自i)KAINDPVGH(X*)ii)GH(X*)SRPDV，和c)與腈水解酶共有序列具有至少35％同源性的序列，其中所述的腈水解酶共有序列選自i)DP(A/V)GH(X*)SRPDV(L/T)(S/R)L，和ii)DPAGH(X*)SRPDVLSLLV，條件是包含于所述分離的多肽的該序列中，X*代表非酪氨酸的氨基酸殘基，并且其中X*位于如SEQ ID NO2所述的野生型糞產(chǎn)堿菌腈水解酶中296位相應(yīng)的位置。
2.權(quán)利要求1的分離的多肽，其中所述多肽包含至少一個選自以下的序列a)(K/R)XXXDXXG(H/Y/S)(X*)，b)KXXXDXXGX(X*)，c)KAINDPVGH(X*)，d)GH(X*)SRPDV，e)DP(A/V)GH(X*)SRPDV(L/T)(S/R)L，和f)DPAGH(X*)SRPDVLSLLV，其中X*代表任何氨基酸，條件是包含于所述分離的多肽的該序列中X*代表非酪氨酸的氨基酸殘基，并且其中X*位于如SEQ ID NO2所述的野生型糞產(chǎn)堿菌腈水解酶中296位相應(yīng)的位置。
3.權(quán)利要求1或2的分離的多肽，其中X*選自半胱氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸和蘇氨酸。
4.權(quán)利要求1-3所述的分離的多肽，其中所述多肽編碼的腈水解酶與同該腈水解酶除了SEQ ID NO2所述野生型糞產(chǎn)堿菌腈水解酶中296位相應(yīng)位置的氨基酸殘基外相同的腈水解酶比較表現(xiàn)出經(jīng)調(diào)節(jié)的接納性。
5.權(quán)利要求1-4中任何一項的分離的多肽，其中所述多肽還由以下多肽序列描述a)包含與SEQ ID NO2、4、6或8的氨基酸序列至少60％，優(yōu)選80％，更優(yōu)選90％，最優(yōu)選地95％相同的氨基酸序列的多肽分子；和b)包含至少一個SEQ ID NO2、4、6或8所述序列的至少20個連續(xù)氨基酸，優(yōu)選50個連續(xù)氨基酸的片段的多肽分子。
6.分離的核酸分子，其包含編碼權(quán)利要求1-5中任何一項的多肽的序列。
7.重組表達(dá)構(gòu)建體，其包含至少一個權(quán)利要求6的核酸。
8.重組表達(dá)載體，其包含至少一個權(quán)利要求5的重組表達(dá)構(gòu)建體和/或至少一個權(quán)利要求6的核酸。
9.重組生物，其包含至少一個權(quán)利要求8的重組表達(dá)載體，至少一個權(quán)利要求7的重組表達(dá)構(gòu)建體和/或至少一個權(quán)利要求6所述的核酸。
10.權(quán)利要求9的重組生物，其中該生物選自細(xì)菌、真菌、藻類或植物生物。
11.權(quán)利要求9或10的重組生物，其中微生物為埃希氏菌屬、紅球菌屬、諾卡氏菌屬、鏈霉菌屬或分歧桿菌屬的細(xì)菌。
12.生產(chǎn)具有經(jīng)調(diào)節(jié)的底物接納性的腈水解酶的方法，其至少包含在該腈水解酶中用另一個氨基酸置換SEQ ID NO2所述野生型糞產(chǎn)堿菌腈水解酶中296位相應(yīng)位置的至少一個酪氨酸的步驟。
13.調(diào)節(jié)腈水解酶底物接納性的方法，其至少包含在該腈水解酶中用另一個氨基酸置換SEQ ID NO2所述野生型糞產(chǎn)堿菌腈水解酶中296位相應(yīng)位置的至少一個酪氨酸的步驟。
14.生產(chǎn)羧酸的方法，其中腈或醛或酮與氰化物的混合物通過權(quán)利要求1-5中任何一項的一個或多個多肽之一，或權(quán)利要求9-11任何一項的一個或多個生長的、休眠的或破壞的重組生物的作用轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的羧酸。
15.權(quán)利要求14的方法，其中至少一個通式I的腈被轉(zhuǎn)變成通式II的羧酸 其中取代基R1、R2、R3可互相獨立地選自氫、取代或未取代、分枝或不分枝的C1-C10-烷基或C1-C10-烷氧基、取代或未取代的芳基或雜芳基、羥基、鹵素、C1-C10-烷基氨基和氨基，并且基團R1、R2和R3中至少有兩個不同。
16.權(quán)利要求14或15的方法，其中腈選自外消旋鄰氯扁桃腈、對氯扁桃腈、間氯扁桃腈、鄰溴扁桃腈、對溴扁桃腈、間溴扁桃腈、鄰甲基扁桃腈、對甲基扁桃腈和間甲基扁桃腈和與此項權(quán)利要求的腈對應(yīng)的醛和氰化物的混合物。
17.權(quán)利要求14-16中任何一項的方法，其中產(chǎn)生的光學(xué)活性羧酸選自R-扁桃酸、S-扁桃酸、R-對氯扁桃酸、S-對氯扁桃酸、R-間氯扁桃酸、S-間氯扁桃酸、R-鄰氯扁桃酸、S-鄰氯扁桃酸、S-鄰溴扁桃酸、S-對溴扁桃酸、S-間溴扁桃酸、S-鄰甲基扁桃酸、S-對甲基扁桃酸、S-間甲基扁桃酸、R-鄰溴扁桃酸、R-對溴扁桃酸、R-間溴扁桃酸、R-鄰甲基扁桃酸、R-對甲基扁桃酸和R-間甲基扁桃酸。
18.在植物生物中實現(xiàn)除草劑抗性的方法，其中用包含編碼腈水解酶的核酸序列的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化所述植物生物，其中所述腈水解酶在SEQ ID NO2所述野生型糞產(chǎn)堿菌腈水解酶296位相應(yīng)的位置包含非酪氨酸的氨基酸，其中所述該核酸序列受在該植物生物中發(fā)揮作用的啟動子的控制。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有經(jīng)修飾的底物接納性的新的腈水解酶、獲得它們的方法和上述腈水解酶的用途。所述腈水解酶由多肽序列編碼，其中所述多肽序列在與野生型糞產(chǎn)堿菌296位相應(yīng)的位置包含非酪氨酸的氨基酸。本發(fā)明還涉及編碼該腈水解酶的核酸序列和氨基酸序列，涉及包含所述核酸序列的表達(dá)構(gòu)建體，包含核酸序列或表達(dá)構(gòu)建體的載體，涉及包含核酸序列、表達(dá)構(gòu)建體或載體的生物體，優(yōu)選微生物。本發(fā)明額外涉及制備羧酸的方法，優(yōu)選從外消旋腈制備取代的手性羧酸。
文檔編號C12N15/55GK1753990SQ200480005397
公開日2006年3月29日 申請日期2004年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月27日
發(fā)明者T·澤林斯基, M·凱塞勒, B·豪爾, T·弗里德里希 申請人:巴斯福股份公司