專利名稱：：用血管抑制素協(xié)同加強腺伴隨病毒介導(dǎo)的b7.1免疫接種以根除擴散的肝轉(zhuǎn)移性腫瘤的制作方法本申請要求享有2003年1月7日申請的美國臨時申請60/438,449的權(quán)益，在此完全引入該申請作為參考。1.引言本發(fā)明涉及一種治療劑以及使用所述治療劑預(yù)防、治療、控制或改善所有類型的腫瘤和/或癌癥的方法，所述腫瘤和/或癌癥包括但不是限于轉(zhuǎn)移性肝癌。特別地，本發(fā)明提供一種包括被可操作地連接到編碼血管抑制素蛋白質(zhì)和/或共刺激分子B7.1的序列上的腺伴隨病毒(AAV)載體的核酸分子。特別地，本發(fā)明涉及可用于治療肝轉(zhuǎn)移性腫瘤的編碼共刺激分子B7.1的AAV載體(“AAVB7.1載體”)。AAV-B7.1還可以單獨地或者順序地或同時地與編碼血管抑制素(angiostatin)的第二個AAV載體(“AAV-血管抑制素載體”)組合地被施用給受治療者，優(yōu)選為人。本發(fā)明還涉及編碼共刺激分子B7.1和血管抑制素的AAV載體(″AAV-B7.1/血管抑制素載體″)。本發(fā)明還包括包含AAV-B7.1載體，AAV-血管抑制素載體，和/或AAV-B7.1/血管抑制素載體的藥物組合物和疫苗。還描述了制造和使用AAV載體、藥物組合物和疫苗的方法。特別地，該發(fā)明指向通過施用有效量的AAV-B7.1載體、AAV-血管抑制素載體和/或AAV-B7.1/血管抑制素載體來治療和預(yù)防癌癥的方法。在其它的實施方案中，該方法進一步提供與外科手術(shù)、標準的和試驗性的化學(xué)療法、激素治療、生物學(xué)治療、免疫療法、放射線治療、栓塞術(shù)(embolization)和/或化學(xué)栓塞治療組合的治療，用于治療或預(yù)防癌癥。2.發(fā)明背景2.1轉(zhuǎn)移性的肝癌肝臟是發(fā)生血液負責(zé)的轉(zhuǎn)移的最頻繁部位，并且與所有癌癥的大約三分之一有關(guān)，包括最常發(fā)生的癌癥類型(FidlerI.J.等人.Theimplicationsofangiogenesisforthebiologyandtherapyofcancermetastasis.Cell1994；79185-8；Weinstat-SaslowD等人.Angiogenesisandcolonizationinthetumormetastaticprocessbasicandappliedadvances.994；8401-7)。轉(zhuǎn)移性肝癌的預(yù)后很差，并且缺乏有效的治療方法。盡管對新的治療方法進行了廣泛的探索，但是還沒有治療肝臟腫瘤轉(zhuǎn)移的有效治療方法。大多數(shù)患者在診斷之后的一年內(nèi)死亡?；瘜W(xué)療法和栓塞術(shù)最多起緩和作用，而不影響存活或壽命。肝臟轉(zhuǎn)移切除構(gòu)成唯一的祛病療法，但是該方法僅僅對于10％病人來說是可行的，并且腫瘤切除后的復(fù)發(fā)率仍然很高。因此，急需探尋用于治療轉(zhuǎn)移性肝臟惡性腫瘤的可能治療策略。2.2抗血管發(fā)生的治療盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多內(nèi)源性的血管發(fā)生抑制劑，但是對這些試劑的臨床評價已經(jīng)受到高劑量需要、制造限制以及相應(yīng)的重組蛋白相對不穩(wěn)定的阻礙。當(dāng)中止用血管抑制素進行治療時，退化的腫瘤會再生。通過數(shù)輪的治療可以實現(xiàn)延長的腫瘤休眠(HolmgrenL等人，1995，同上文；O’ReillyM.S等人，1996，同上文)。迄今為止，血管抑制素的治療效果仍然是受到爭議的，部分是由于血管抑制素的循環(huán)周期非常短，并且血管抑制素的局部濃度不足以滿足治療的要求。盡管有研究表明，在施用純化的蛋白質(zhì)之后，血流中的另一種抗血管生成的藥物內(nèi)抑制素(endostatin)的濃度可以達到400μg/ml(BlezingerP.等人.Systemicinhibitionoftumorgrowthandtumormetastasesbyintramuscularadministrationoftheendostatingene.NatureBiotechnol.1999；17343-348)，還難以原位確定這種蛋白質(zhì)的局部濃度有多高。因此，在基因治療中，血管抑制素基因被呈遞給腫瘤及其附近，并且穩(wěn)定地表達一長段時間，這種基因治療方法變得越來越有吸引力。急需一種用于癌癥基因治療的理想載體，該載體產(chǎn)生比現(xiàn)行試劑更大的功效，并且毒性較低。2.3腺伴隨病毒表達載體腺伴隨病毒(AAV)是細小病毒家族的非致病性的、依賴于輔助病毒的成員，具有幾個主要優(yōu)點，例如穩(wěn)定整合、低免疫原性、長期表達以及能夠感染分化的和未分化的細胞。本發(fā)明人已經(jīng)建立了一種由腺伴隨病毒誘導(dǎo)的快速而持續(xù)的表達系統(tǒng)。先前已經(jīng)證明，采用這種系統(tǒng)，在門靜脈內(nèi)注射編碼血管生成抑制劑的AAV表達載體，會引起局限在肝細胞內(nèi)的高水平、長期(6個月)而持續(xù)地轉(zhuǎn)基因表達血管抑制素，并且顯著地抑制已經(jīng)在肝臟中建立的結(jié)節(jié)和分散的轉(zhuǎn)移EL-4淋巴瘤的生長(參見2003年2月7日申請的美國臨時申請60/438,449；和XuR.等人.Long-termexpressionofangiostatinsuppresseslivermetastaticcancerinmice.Hepatology.2003；37(6)1451-60，在此完全引入作為參考)。2.4共刺激分子B7.1實現(xiàn)腫瘤特異性免疫反應(yīng)的兩個主要障礙包括(1)克服外周T細胞對腫瘤自身抗原(Ags)的耐受和(2)誘導(dǎo)細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，其有效地消除分散的腫瘤轉(zhuǎn)移，并隨后維持持續(xù)的預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)的免疫記憶。誘導(dǎo)腫瘤特異性的CTL需要至少兩種信號(a)由抗原呈遞細胞(APC)表面上的主要組織相容性復(fù)合物(MHC)的I型和/或II型分子所加工和呈遞的腫瘤抗原；和(b)腫瘤細胞或其它APC上的足夠水平的共刺激分子(MuellerD.L.等人.ClonalexpansionversusfunctionalclonalinactivationaconstimulatorysignallingpathwaydeterminestheoutcomeofTcellantigen.AnnuRevImmunol.1989；7445-80)。膜蛋白的B7家族是最有效的共刺激分子，能夠與T細胞表面上的CD28和CTLA-4相互作用(Galea-LauriJ.等人.Novelcostimulatorsintheimmunegenetherapyofcancer.CancerGeneTher.1996；3202-14)。優(yōu)化的包括B7.1的多種T細胞共刺激細胞附著分子(CAM)的基因轉(zhuǎn)移，會引起腫瘤特異性的T細胞增殖和細胞毒性以及抵抗親本腫瘤攻擊的保護性免疫。但是，CAM介導(dǎo)的免疫治療的問題在于，其對大腫瘤無效，并且產(chǎn)生微弱的抗腫瘤的系統(tǒng)性免疫(KanwarJ.R.等人.Takinglessonsfromdendriticcellsmultiplexenogeneicligandsforleukocyteintegrinshavethepotentialtostimulateanti-tumourimmunity.GeneTherapy1999；61835-1844)。因此，急需一種更加有效的治療方法。3.發(fā)明概述本發(fā)明部分地基于本發(fā)明人的觀察結(jié)果新的腺伴隨病毒(AAV)載體在腸上皮細胞和肝細胞中都引起持久穩(wěn)定地(＞6個月)表達轉(zhuǎn)基因，導(dǎo)致在糖尿病動物模型中的長期的表型恢復(fù)(XuRA.等人，Perarollytransductionofdiffusecellsandhepatocyteinsulinleadingtoeuglycemiaindiabeticrats.MolTher.2001；3S180；DuringM.J.等人.Perarollygenetherapyoflactoseintoleranceusinganadeno-associatedvirusvector.NatureMed.1998；41131-1135；DuringM.J.等人.AnoralvaccineagainstNMDAR1withefficacyinexperimentalstrokeandepilepsy.Science2000；2871453-1460)。為了克服癌癥治療中存在的問題，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，僅當(dāng)免疫治療與以腫瘤的存活、防衛(wèi)和攻擊的武器為對象的治療策略結(jié)合時，免疫系統(tǒng)才可以被用作一種有力的武器來抗擊癌癥。如果癌癥細胞的生長被阻止，癌細胞將不能生成免疫逃逸變體。在探索更加有效地利用和加強CAM介導(dǎo)的免疫治療的抗腫瘤活性的過程中，本發(fā)明人構(gòu)建了一種編碼T細胞共刺激B7.1的新重組的AAV載體。此外，本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)出一種新的免疫-基因治療方法，通過施用B7.1與抗血管發(fā)生試劑如血管抑制素來處理癌癥(SunX.等人，CancerGeneTher.2001；8719-727，在此完全引入作為參考)。本發(fā)明人還開發(fā)出一種治療癌癥的新的免疫-基因治療方法，通過施用血管抑制素、B7.1和/或反義的組織缺氧誘導(dǎo)因子1(SunX.等人.Genetransferofantisensehypoxiainduciblefactor-1enhancesthetherapeuticefficacyofcancerimmunotherapy.GeneTher.2001；8638-645，在此完全引入作為參考)。試劑的這種特定組合在治療癌癥中起協(xié)同作用。特別地，本發(fā)明表明，組合治療克服了腫瘤的免疫抗性，引起完全而快速地消除大腫瘤，這種大腫瘤難以用血管抑制素或者反義組織缺氧誘導(dǎo)因子1或者B7.1的單一治療來消除。因此，本發(fā)明提供一種用于預(yù)防、治療、控制或改善各種腫瘤和/或癌癥的治療劑，該腫瘤和/或癌癥包括但是不限于肝癌。特別地，本發(fā)明提供用于通過基因治療來治療肝癌，特別是分散的轉(zhuǎn)移性肝癌的治療劑。在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的治療劑包括一種核酸分子，其包含腺伴隨病毒載體、β-肌動蛋白啟動子、巨細胞病毒增強子和土撥鼠乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件，被可操作地連接到編碼血管抑制素蛋白和/或共刺激分子B7.1的序列上。在一個特定的實施方案中，AAV載體編碼共刺激分子B7.1(″AAV-B7.1載體″)。在另一個特定實施方案中，AAV載體編碼血管抑制素(″AAV-血管抑制素載體″)。在還有另一個特定的實施方案中，本發(fā)明還涉及編碼共刺激分子B7.1和血管抑制素的AAV載體(″AAV-B7.1/血管抑制素載體″)。本發(fā)明涉及單獨地或者順序或同時地與AAV-血管抑制素載體和/或AAV-B7.1/血管抑制素載體組合，將AAV-B7.1載體施用給受治療者，優(yōu)選為人。AAV-B7.1載體、AAV-血管抑制素載體和AAV-B7.1/血管抑制素載體可用于治療或預(yù)防癌癥，優(yōu)選轉(zhuǎn)移性腫瘤，更加優(yōu)選肝臟轉(zhuǎn)移性腫瘤。在某些實施方案中，本發(fā)明涉及包括AAV載體的核酸分子。在一個實施方案中，核酸分子包括AAV載體和巨細胞病毒增強子以及β-肌動蛋白啟動子(CAG啟動子)，該啟動子被可操作地連接到編碼血管抑制素的核酸序列上。在特定的實施方案中，核酸分子包括AAV載體和CAG啟動子，該啟動子被可操作地連接到SEQIDNO1的核苷酸序列或者編碼SEQIDNO2的氨基酸序列的核苷酸序列上。在另一個實施方案中，該核苷酸分子包括AAV和CAG啟動子，該啟動子被可操作地連接到編碼共刺激物B7.1的核酸序列上。在特定實施方案中，核酸分子包括AAV載體和CAG啟動子，該啟動子被可操作地連接到SEQIDNO3的核苷酸序列或者編碼SEQIDNO4的氨基酸序列的核苷酸序列上。在其它特定實施方案中，核苷酸分子包括AAV載體和CAG啟動子，該啟動子被可操作地連接到SEQIDNO5的核苷酸序列或者編碼SEQIDNO6的氨基酸序列的核苷酸序列上。在特定實施方案中，可被用在本發(fā)明中的編碼B7.1的核苷酸序列包括那些存放在GenBank中，登錄號為NM005191(SEQIDNO3)和X60958(SEQIDNO5)的序列。核酸分子還可以包括土撥鼠乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)。本發(fā)明還涉及包含上述核酸分子的載體。在特定實施方案中，所述載體是含有CAG啟動子的AAV，該啟動子被可操作地連接到編碼血管抑制素的核苷酸序列上。在另一個特定的實施方案中，所述載體是含有EGR-1啟動子和靶特異性啟動子白蛋白的AAV載體。在一個優(yōu)選的實施方案中，該載體包含被可操作地連接到核苷酸序列上CAG啟動子，該核苷酸編碼具有SEQIDNO2的氨基酸序列的血管抑制素蛋白或其生物學(xué)的功能片段、類似物或其變體。在一個實施方案中，所述核苷酸序列具有SEQIDNO1的核苷酸序列。在另一個實施方案中，所述核苷酸序列具有在如在此定義的嚴緊條件下雜交到SEQIDNO1的核苷酸序列的互補物上的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼蛋白質(zhì)或多肽，其至少具有血管抑制素的一種結(jié)構(gòu)特征和/或功能特征。在還有另一個實施方案中，所述核苷酸序列具有在嚴緊條件下雜交到第二條核苷酸序列的互補物上的第一條核苷酸序列，該第二條核苷酸序列編碼SEQIDNO2的氨基酸序列或其片段，其中第一條核苷酸序列編碼蛋白質(zhì)或多肽，其至少具有血管抑制素的一種結(jié)構(gòu)特征和/或功能特征。在另一個特定實施方案中，所述載體是含有CAG啟動子的AAV，該啟動子被可操作地連接到編碼B7.1的核酸序列上。在另一個特定實施方案中，所述載體是含有EGR-1啟動子和靶特異性啟動子白蛋白的AAV載體。在一個優(yōu)選實施方案中，該載體包含被可操作地連接到核苷酸序列上CAG啟動子，該核苷酸編碼具有SEQIDNO4或6的氨基酸序列的B7.1蛋白或其生物學(xué)的功能片段、類似物或其變體。在一個實施方案中，所述核苷酸序列具有SEQIDNO3或5的核苷酸序列。在另一個實施方案中，所述核苷酸序列具有在如在此定義的嚴緊條件下雜交到SEQIDNO3或5的核苷酸序列的互補物上的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼蛋白質(zhì)或多肽，至少具有B7.1的一種結(jié)構(gòu)特征和/或功能特征。在還有另一個實施方案中，所述核苷酸序列具有在嚴緊條件下雜交到第二條核苷酸序列的互補物上的第一條核苷酸序列，該第二條核苷酸序列編碼SEQIDNO4或6的氨基酸序列或其片段，其中第一條核苷酸序列編碼蛋白質(zhì)或多肽，至少具有B7.1的一種結(jié)構(gòu)特征和/或功能特征。在某些其它實施方案中，核苷酸分子包含AAV載體和巨細胞病毒增強子和β-肌動蛋白啟動子(CAG啟動子)，該啟動子被可操作地連接到編碼血管抑制素的第一條核酸序列和編碼B7.1的第二條核酸序列上。第二個核酸分子的表達可以由CAG啟動子或不同的啟動子來驅(qū)動。在特定的實施方案中，該核苷酸分子包括AAV載體和CAG啟動子，該啟動子被可操作地連接到包含SEQIDNO1的核苷酸序列或者編碼SEQIDNO2的氨基酸序列的第一條多核苷酸以及包含SEQIDNO3的核苷酸序列或者編碼SEQIDNO4的氨基酸序列的第二條多核苷酸上。在另一個特定實施方案中，核酸分子包含AAV載體和CAG啟動子，該啟動子被可操作地連接到包含SEQIDNO1的核苷酸序列或者編碼SEQIDNO2的氨基酸序列的第一條多核苷酸以及包含SEQIDNO5的核苷酸序列或者編碼SEQIDNO6的氨基酸序列的第二條多核苷酸上。本發(fā)明還包括包含載體的宿主細胞。本發(fā)明還涉及包含核酸分子和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。在一個實施方案中，本發(fā)明提供用于分離和純化B7.1蛋白或其片段、變體或衍生物的方法。本發(fā)明還提供用于分離和純化血管抑制素蛋白或其片段、變體或衍生物的方法。本發(fā)明還涉及治療或預(yù)防受治療者中的癌癥的方法，通過給該受治療者施用治療性或預(yù)防性有效量的一種或多種核酸分子，其包含本發(fā)明的AAV-B7.1載體和/或AAV-血管抑制素載體。特別地，本發(fā)明提供用于治療轉(zhuǎn)移性腫瘤的組合治療方法，包括通過門靜脈內(nèi)或肌肉路徑給受治療者施用AAV-B7.1載體，接著通過門靜脈內(nèi)或肌肉注射施用AAV-血管抑制素載體。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于治療轉(zhuǎn)移性腫瘤的方法，包括給受治療者施用一種或多種AAV-B7.1載體、AAV-血管抑制素載體和/或AAV-B7.1/血管抑制素載體。在一個特定實施方案中，可以通過門靜脈內(nèi)或肌肉注射施用第一種AAV-B7.1載體、AAV-血管抑制素載體和/或AAV-B7.1/血管抑制素載體，接著通過門靜脈內(nèi)或肌肉注射施用第二種AAV-B7.1載體、AAV-血管抑制素載體和/或AAV-B7.1/血管抑制素載體。在特定的實施方案中，所述的癌癥為肝癌。在更特別的實施方案中，肝癌是轉(zhuǎn)移性的?？梢詫AV-B7.1載體、AAV-血管抑制素載體和/或AAV-B7.1/血管抑制素載體通過靜脈內(nèi)注射或者灌注到受治療者體內(nèi)，優(yōu)選通過門靜脈。本發(fā)明還提供一種包含本發(fā)明的治療劑和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。此外，本發(fā)明提供制備用于調(diào)節(jié)本發(fā)明的治療劑的表達或活性的藥物組合物的方法。這種方法包括將藥學(xué)上可接受的載體與一種調(diào)節(jié)本發(fā)明的治療劑的表達或活性的試劑一起配制。這種組合物還可以包括其它活性試劑。本發(fā)明的方法還包括一種或多種其它治療方法，例如外科手術(shù)、標準的和實驗性的化學(xué)治療、激素治療、生物學(xué)治療、免疫治療、放射治療、栓塞術(shù)和/或化學(xué)栓塞治療方法。此外，本發(fā)明提供預(yù)防、治療、控制或改善受治療者中的各種腫瘤和/或癌癥的方法，包括但是不限于肝癌，包括給患者施用預(yù)防性或治療性有效量的本發(fā)明的治療劑。腫瘤和/或癌癥可以是原發(fā)性的或轉(zhuǎn)移性的。一個方面，本發(fā)明的治療劑被系統(tǒng)性地施用給受治療者，例如通過靜脈內(nèi)的、肌肉內(nèi)的或皮下的注射或者口服施用。在另一個方面，治療劑被局部施用給受治療者，例如注射到受紊亂或疾病困擾的特定器官、組織或細胞供應(yīng)血液的局部血管中，或者對受疾病困擾的機體部位進行噴霧或應(yīng)用栓劑。在特定實施方案中，本發(fā)明的方法可以被用于預(yù)防、治療、控制或改善肝癌，其中通過靜脈注射、肌肉注射或口服路徑來施用治療劑。在優(yōu)選實施方案中，通過門靜脈注射來局部施用治療劑。3.1定義如在此所用，術(shù)語“類似物”，特別是“血管抑制素類似物”是指一系列具有共同的生物學(xué)活性，包括抗原性/免疫原性和抗血管生成活性和/或結(jié)構(gòu)性功能域并且具有在此定義的足夠的氨基酸或核苷酸序列同一性的肽或核酸分子的任何成員。血管抑制素類似物可以來自相同或者不同種類的動物。類似地，B7.1類似物可以來自相同或者不同種類的動物。如在此所用的，術(shù)語“血管抑制素”或“血管抑制素蛋白”是指來自任何物種的血管抑制素蛋白、片段、變體或衍生物。血管抑制素可以來自靈長類包括人或非靈長類，包括豬、牛、小鼠、大鼠和雞等。血管抑制素蛋白的一個例子包括SEQIDNO2的氨基酸序列。血管抑制素蛋白的另一個例子包括由SEQIDNO1的核苷酸序列或者在嚴緊條件下雜交到SEQIDNO1上的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。血管抑制素還指具有功能活性的血管抑制素蛋白(即具有通過下面第6節(jié)中描述的方法所評估的血管抑制素活性)及其片段、衍生物和類似物?？捎糜诒景l(fā)明的血管抑制素包括包含SEQIDNO2的氨基酸序列或者由SEQIDNO2的氨基酸序列組成的血管抑制素，或者具有相對于SEQIDNO2包含連續(xù)的或不連續(xù)的1個、2個、3個或更多個氨基酸殘基取代、缺失、置換或插入并且保留血管抑制素活性的氨基酸序列的血管抑制素；以及天然存在的小鼠血管抑制素的變體。特別有用的血管抑制素蛋白是人的血管抑制素。如在此所用，術(shù)語“B7.1”或者“B7.1蛋白”是指來自任何物種的B7.1共刺激分子或共刺激蛋白、片段、變體或衍生物。B7.1可以來自靈長類，包括人，或者非靈長類，包括豬、牛、小鼠、大鼠和雞等。B7.1蛋白的一個例子包括SEQIDNO4或6的氨基酸序列。B7.1蛋白的另一個例子包括由SEQIDNO3或5的核苷酸序列或者在嚴緊條件下雜交到SEQIDNO3或5上的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。B7.1還指具有功能活性的B7.1蛋白(即具有通過下面第6節(jié)中描述的方法所評定的B7.1活性)及其片段、衍生物和類似物?？捎糜诒景l(fā)明的血管抑制素包括包含SEQIDNO4的氨基酸序列或者由SEQIDNO4的氨基酸序列組成的血管抑制素，或者具有相對于SEQIDNO4或6包含連續(xù)的或不連續(xù)的1個、2個、3個或更多個氨基酸殘基替代、缺失、置換或插入并且保留血管抑制素活性的氨基酸序列的B7.1；以及天然存在的小鼠血管抑制素的變體。特別有用的B7.1蛋白是小鼠和人的B7.1。“保守性氨基酸替代”是其中氨基酸殘基被具有類似電荷的側(cè)鏈的氨基酸殘基替代的替代?！胺潜Ｊ匦园被崽娲笔瞧渲邪被釟埢痪哂邢喾措姾傻膫?cè)鏈的氨基酸殘基替代的替代。在本領(lǐng)域中已經(jīng)確定了具有類似電荷的側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族。遺傳編碼的氨基酸可以被分成四個家族(1)酸性的＝天冬氨酸、谷氨酸；(2)堿性的＝賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性的＝丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)無電荷的極性的＝甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。類似地，氨基酸目錄可以被分成(1)酸性的＝天冬氨酸、谷氨酸；(2)堿性的＝賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)脂族的＝甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸，而絲氨酸和蘇氨酸可任選地被單獨地分成脂族-羥基；(4)芳族＝苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；(5)酰胺＝天冬酰胺、谷氨酰胺；和(6)含硫的＝半胱氨酸和甲硫氨酸(參見例如Biochemistry，第4版，L.Stryer編輯，WHFreemanandCo.1995)。如在此所用的，術(shù)語“變體”是指給定肽的天然存在的等位基因變體或者特定肽或蛋白質(zhì)的重組制備的變體，其中一個或多個氨基酸殘基已經(jīng)通過氨基酸替代、添加或缺失而被修飾。如在此所用的，術(shù)語“衍生物”是指給定肽或蛋白質(zhì)的變體，其被另外地修飾，即通過將任何類型的分子共價連接到該肽或蛋白質(zhì)上，該分子優(yōu)選具有生物活性，包括非天然存在的氨酸。如在此所用的，術(shù)語“片段”包括一種優(yōu)選具有血管抑制素或B7.1活性的多肽的氨基酸序列的至少5個連續(xù)的氨基酸殘基，至少10個連續(xù)的氨基酸殘基，至少15個連續(xù)的氨基酸殘基，至少20個連續(xù)的氨基酸殘基，至少25個連續(xù)的氨基酸殘基，至少40個連續(xù)的氨基酸殘基，至少50個連續(xù)的氨基酸殘基，至少60個連續(xù)的氨基酸殘基，至少70個連續(xù)的氨基酸殘基，至少連續(xù)80個氨基酸殘基，至少連續(xù)90個氨基酸殘基，至少連續(xù)100個氨基酸殘基，至少連續(xù)125個氨基酸殘基，至少150個連續(xù)的氨基酸殘基，至少連續(xù)175個氨基酸殘基，至少連續(xù)200個氨基酸殘基，至少連續(xù)250個氨基酸殘基，至少300個氨基酸殘基，至少350個氨基酸殘基，至少400個氨基酸殘基，至少450個氨基酸殘基，至少500個氨基酸殘基，至少550個氨基酸殘基，至少600個氨基酸殘基，至少650個氨基酸殘基，至少700個氨基酸殘基，至少750個氨基酸殘基，至少800個氨基酸殘基，至少850個氨基酸殘基，至少900個氨基酸殘基，或者它們中的多個的氨基酸序列的一種肽或多肽。如在此所用的，“分離的”核酸分子是從存在于該核酸分子的天然來源中的其它核酸分子中分離出來的分子。而且，“分離的”核酸分子，例如cDNA分子，在通過重組技術(shù)生產(chǎn)時基本上不含有其它細胞物質(zhì)或者培養(yǎng)基，或者當(dāng)通過化學(xué)合成時基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)藥品。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，編碼本發(fā)明的多肽/蛋白質(zhì)的核酸分子是分離的或純化的。術(shù)語“分離的”核酸分子不包括作為未從含有其它核酸分子的其它文庫克隆中純化掉的文庫成員的核酸。如在此所用的，術(shù)語“組合”是指使用一種以上的預(yù)防性和/或治療性試劑。如在此所用，術(shù)語“控制”(manage)、“控制”(managing)和“控制”(management)是指受治療者從預(yù)防性或治療性試劑中獲得的有益作用，該作用不能治愈疾病或紊亂。在某些實施方案中，給受治療者施用一種或多種預(yù)防性或治療性試劑以“控制”疾病或紊亂，以防止疾病或紊亂的進展或惡化。如在此所用的，術(shù)語“預(yù)防”(prevent)、“預(yù)防”(preventing)和“預(yù)防”(prevention)是指施用預(yù)防性或治療性試劑在受治療者中產(chǎn)生的對疾病或紊亂的預(yù)防。如在此所用的，術(shù)語“預(yù)防性有效量”是指足以預(yù)防與細胞群體相關(guān)的疾病或紊亂的預(yù)防性試劑的含量，并且優(yōu)選導(dǎo)致防止細胞增殖。預(yù)防性有效量可以指足以在患者中阻止細胞增殖的預(yù)防性試劑的含量。如在此所用的，術(shù)語“副作用”包括預(yù)防性或治療性試劑的不期望的和不利的作用。不利作用通常是不期望的，但是不期望的作用不一定是不利的。由預(yù)防性的或治療性的試劑產(chǎn)生的不利作用可能是有害的或令人難受的或危險的?；瘜W(xué)治療產(chǎn)生的副作用包括但是不限于胃腸道毒性例如，但是不限于早期和晚期形成的腹瀉和腸胃氣脹；惡心；嘔吐；厭食；白血球減少癥；貧血；嗜中性白血球減少癥；虛弱；腹部痙攣；發(fā)燒；疼痛；體重下降；脫水；脫發(fā)；呼吸困難；失眠；眩暈；粘膜炎、口腔干燥和腎衰竭、便秘、神經(jīng)和肌肉影響、對腎和膀胱的暫時性的或永久性損傷、流感樣癥狀、體液潴留、暫時性的或永久性不育癥。放射治療的副作用包括但是不被限制在疲勞、口舌干燥、食欲不振和掉毛。其它的副作用包括胃腸毒性例如但是不限于，早期和晚期形成的腹瀉和腸胃氣脹；惡心；嘔吐；厭食；白血球減少癥；貧血；嗜中性白血球減少癥；虛弱；腹部痙攣；發(fā)燒；疼痛；體重下降；脫水；脫發(fā)；呼吸困難；失眠；眩暈；粘膜炎；口舌干燥和腎衰竭。由生物治療/免疫療法產(chǎn)生的副作用包括但是不限于施用部位的皮疹或腫脹，流感樣癥狀例如發(fā)燒、寒戰(zhàn)和疲勞，消化道問題和過敏性反應(yīng)。由激素治療產(chǎn)生的副作用包括但是不限于惡心、生育問題、沮喪、食欲不振、視力問題、頭痛和體重變化。患者通常所經(jīng)歷的其它不期望的作用還有許多，并且在本領(lǐng)域是已知的。許多作用被描述在Physicans’DeskReference(第56版)，2002)中。如在此所用的，術(shù)語“在嚴緊條件下”是指雜交和洗滌條件，在該條件下，相互之間具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，或至少95％同一性的核苷酸序列彼此之間保持雜交。這種雜交條件被描述在，但是不限于，CurrentProtocolsinMolecularBiologyMolecularBiology，JohnWiley&Sons，N6.3.6；BasicMethodsinMolecularBiology，ElsevierSciencePublishingCo.，Inc.，N.Y.(1986)，75-78，和84-87；以及MolecularCloning，ColdSpringHarborLaboratory，N.Y.(1982)，387-389中，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。嚴緊雜交條件的一個優(yōu)選的、非限制性的例子是在68℃下，在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)、0.5％SDS中進行雜交，接著在室溫下，在2XSSC、0.5％SDS中洗滌一次或多次。嚴緊雜交條件的另一個優(yōu)選的、非限制性的例子是在約45℃下，在6xSSC中進行雜交，接著在約50-65℃下，在0.2XSSC、0.1％SDS中洗滌一次或多次。嚴緊雜交條件的還有一個優(yōu)選的、非限制性的例子是在雜交過程中使用一種變性劑例如甲酰胺，例如在42℃下，使用50％(體積/體積)甲酰胺與0.1％牛血清清蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液，pH6.5，750mMNaCl，75mM檸檬酸鈉；或者在42℃下，采用50％甲酰胺，5XSSC(0.75MNaCl，0.075M焦磷酸鈉，5XDenhardt溶液，超聲波處理的鮭精DNA50μg/ml)，0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，在42℃下在0.2XSSC和0.1％SDS中洗滌。如在此所用的，術(shù)語“受治療者”和“患者”可互換地使用。如在此所用的，受治療者優(yōu)選為哺乳動物，例如非靈長類(例如，母牛、豬、馬、貓、狗、大鼠等)和靈長類(例如猴子和人)，最優(yōu)選為人。如在此所用的，術(shù)語“治療劑”是指可被用于預(yù)防、治療、或控制與細胞群體有關(guān)的疾病或紊亂的任何試劑。術(shù)語“治療劑”是指包含一種或多種編碼血管抑制素或B7.1蛋白質(zhì)的本發(fā)明的載體。如在此所用的，術(shù)語“治療性有效量”是指足以治療、控制或改善與細胞群體有關(guān)的疾病或紊亂的治療劑的含量。治療性有效量可以指足以降低細胞數(shù)目或者延遲或最小化細胞擴張(例如，降低或減緩原發(fā)性腫瘤的生長或降低或防止轉(zhuǎn)移)的治療劑的含量。治療性有效量還可以指在治療或控制與細胞群體有關(guān)的疾病或紊亂中產(chǎn)生治療作用的治療劑的含量。此外，對于本發(fā)明的治療劑來說，治療性有效量是指治療劑單獨地或者組合其它治療方法在處理、控制或改善與靶細胞群體有關(guān)的疾病或紊亂中產(chǎn)生治療作用的含量。如在此所用的，術(shù)語“治療方法”和“療法”是指可被用于預(yù)防、處理或控制與細胞群體有關(guān)的疾病或紊亂中的任何方案、方法和/或試劑。在某些實施方案中，術(shù)語“治療方法”和“療法”是指為本領(lǐng)域的技術(shù)熟練的內(nèi)科醫(yī)師所知的，可用于治療癌癥、傳染病、自身免疫的和炎癥性的疾病的癌癥化學(xué)療法、放射治療、激素治療、生物學(xué)治療和/或其它治療方法。如在此所用的，術(shù)語“處理”和“治療”是指由施用一種或多種預(yù)防性或治療性試劑產(chǎn)生的對與疾病或紊亂相關(guān)的細胞的殺死或抑制。附1A和1B分別顯示小鼠血管抑制素的核苷酸序列(SEQIDNO1)和氨基酸序列(SEQIDNO2)。圖2顯示重組體AAV(rAAV)-血管抑制素構(gòu)建體的示意圖，其中CAG啟動子、報導(dǎo)基因、編碼小鼠血管抑制素的1.4kbcDNA(SEQIDNO1)、土撥鼠乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)和polyA序列被插入在反向末端重復(fù)(ITR)之間。圖3A-3F顯示在通過門靜脈灌注rAAV-血管抑制素后，在肝細胞中血管抑制素的長期表達。通過免疫組織化學(xué)分析(A、B、C)和原位雜交分析(D、E、F)，在肝細胞中檢測到血管抑制素的過度表達。在用空AAV處理(A，D)后14天、用AAV-血管抑制素處理后14天(B、E)或180天(C、F)，與抗血管抑制素的單克隆抗體(mAb)反應(yīng)(染色為棕色)或者與地高辛(DIG)標記的反義cRNA雜交(100x放大；染色為綠色)，來制備代表性的肝臟切片。圖4顯示蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果，其中將來自灌注了rAAV-血管抑制素的小鼠的勻漿的肝臟細胞的提取物用抗血管抑制素抗體(Ab)或者抗β-肌動蛋白Ab(作為內(nèi)部對照)進行免疫印跡。在AAV-血管抑制素灌注后的第2天(條帶1)、14天(條帶2)、28天(條帶3)、60天(條帶4)、90天(條帶5)或者180天(條帶6)，從小鼠中切取肝臟。圖5A-5C顯示通過門靜脈基因轉(zhuǎn)移rAAV-血管抑制素對結(jié)節(jié)形式和分散形式的肝臟轉(zhuǎn)移性腫瘤的腫瘤體積；轉(zhuǎn)移性腫瘤的相對面積；以及1％存活率的影響。(A)將2×105EL-4腫瘤注射到肝被膜下的左肝葉中，建立肝臟結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移性腫瘤，接著門靜脈內(nèi)灌注3×1011rAAV-血管抑制素病毒顆粒。PBS和空AAV病毒作為對照。在操作后4周，從小鼠中切取肝臟，并測量腫瘤體積。每一個點代表一只小鼠。平均腫瘤體積用大十字指示(P＜0.01)。(B)通過脾臟內(nèi)注射2×105EL-4腫瘤來建立分散的肝臟轉(zhuǎn)移性腫瘤，接著進行門靜脈內(nèi)灌注處理。在該操作后6周，從所有小鼠中切取肝臟，低溫保存肝臟樣本，用西格瑪圖像軟件測量腫瘤面積。腫瘤占據(jù)的平均相對面積用大十字指示(P＜0.01)。(C)通過脾臟內(nèi)注射1×106EL-4腫瘤細胞來建立分散的肝臟轉(zhuǎn)移性腫瘤的模型，接著隨機門靜脈內(nèi)注射PBS、空AAV、或者rAAV-血管抑制素。每周觀察小鼠兩次。當(dāng)通過預(yù)先建立的標準判定小鼠瀕臨死亡時，處死小鼠，繪制它們的存活曲線。圖6A-6C顯示通過rAAV-血管抑制素處理來抑制腫瘤血管化，該血管化不依賴于血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。將EL-4腫瘤直接注射到肝被膜下的肝左葉中，接著通過門靜脈灌注PBS(A)、空AAV(B)或AAV-血管抑制素(C)。處理后4周，從小鼠中切取肝臟。將腫瘤切開，冷凍，并用抗CD31的抗體染色。圖7A-7C顯示AAV-血管抑制素處理對腫瘤血管化(A和B)以及VEGF表達(C)的影響。在盲選的隨機區(qū)域中計數(shù)用抗CD31mAb染色的血管，記錄平均血管密度(A)，或者用同心圓的方法記錄從排列點到最近的CD31標記的中值距離(B)。在用rAAV-血管抑制素處理的腫瘤與用PBS或空AAV病毒處理的腫瘤之間存在顯著性差異(P＜0.01；用星號表示)。如使用VEGF特異性Ab的Western印跡(C)中所示，將rAAV-血管抑制素灌注到肝臟中對腫瘤細胞表達VEGF沒有顯著影響(條帶1PBS；條帶2空AAV和條帶3rAAV-血管抑制素)。圖8A-8C顯示用TUNEL檢測rAAV-血管抑制素的細胞凋亡作用。rAAV-血管抑制素處理導(dǎo)致腫瘤細胞凋亡，但是未引起正常肝細胞的凋亡。將EL-4腫瘤直接注射到肝被膜下的肝左葉中，接著通過門靜脈灌注rAAV-血管抑制素病毒顆粒(C)、PBS(A)或者空AAV顆粒(B)。處理后4周，從小鼠中切取肝臟。水平切開肝臟腫瘤并冷凍。用TUNEL檢查切片中的凋亡，而鄰近的切片用蘇木精/曙紅染色，以比較凋亡指數(shù)(參見下文)。箭頭指向肝臟中的腫瘤位置。圖9顯示凋亡指數(shù)(AI)[(凋亡細胞的數(shù)量/有核細胞的總數(shù))×100]的比較。rAAV-血管抑制素的AI(用星號指示)顯著高于PBS(P＜0.001)或rAAV-血管抑制素和空AAV組(P＜0.01)。圖10A-10C顯示AAV-B7.1的轉(zhuǎn)染效率。將親本EL-4細胞與AAV-B7.1一起培養(yǎng)6小時。圖10A顯示EL-4細胞表面上的B7.1蛋白的表達(粗線)以及用第二抗體(Abs)染色的背景(細線)。圖10B顯示EL-4細胞表面上的B7.1蛋白的表達，該EL-4細胞已經(jīng)被轉(zhuǎn)染了AAV-B7.1載體，接著用特定的抗B7.1單克隆抗體(mAb)和FITC-標記的第二抗體進行了免疫染色，隨后通過熒光顯微鏡顯示。與空AAV載體一起培養(yǎng)的細胞EL-4被用作對照。圖10C證實在轉(zhuǎn)染AAV-B7.1后表達了B7.1蛋白，這通過Western印跡分析得到驗證。該印跡用抗β-肌動蛋白抗體染色，證明在各個泳道中加載了等量的蛋白質(zhì)。圖11A-E顯示門靜脈灌注AAV-血管抑制素會導(dǎo)致在肝細胞中長期和穩(wěn)定地表達血管抑制素。圖11A和11C顯示在用空AAV處理后14天制備的肝臟切片。圖11B和11D顯示在用AAV-血管抑制素處理后14天制備的肝臟切片。圖11A和11C分別顯示，通過原位雜交和免疫組織化學(xué)分析測定，在用空AAV處理的肝細胞中，內(nèi)源性血管抑制素含量低。圖11B和11D分別顯示，通過原位雜交和免疫組織化學(xué)分析測定，在用AAV-血管抑制素處理的肝細胞中，肝細胞中過度表達血管抑制素。用DIG-標記的反義cRNA將土撥鼠乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)RNA染色為藍色(用箭頭指示)。用抗血管抑制素特異的mAb將血管抑制素蛋白染色為棕色。圖11E證實用抗血管抑制素mAb，通過Western印跡分析體內(nèi)血管抑制素的表達。從在AAV-B7.1灌注后2天(泳道2)、14天(泳道3)、60天(泳道4)和180天(泳道5)切取肝臟的小鼠中制備肝臟勻漿。而在小鼠接受空AAV后60天制備的肝臟勻漿被用作為對照(泳道1)。圖12A-12B顯示AAV-B7.1轉(zhuǎn)染的EL-4細胞刺激抗腫瘤免疫。圖12A顯示，通過門靜脈內(nèi)灌注用AAV-B7.1或空AAV轉(zhuǎn)染的EL-4細胞攻擊的小鼠的肝臟中，腫瘤占據(jù)的相對面積(％)。腫瘤占據(jù)的平均相對面積用大十字指示。圖12B顯示體外CTL殺死試驗的結(jié)果，其中來自用AAV-B7.1轉(zhuǎn)染的EL-4細胞免疫接種的小鼠的脾細胞，不含有肝臟腫瘤，以100∶1、50∶1和10∶1的效應(yīng)子與靶點(E∶T)的比例與用AAV-B7.1或空AAV轉(zhuǎn)染的EL-4細胞混合。在存在抗-B7.1Ab時進行細胞毒性分析。*指示與用空AAV轉(zhuǎn)染的親本EL-4細胞的P＜0.01的顯著性差別。圖13A-13C顯示由通過用AAV-B7.1轉(zhuǎn)染的EL-4細胞免疫接種產(chǎn)生的抗腫瘤免疫性可以被記憶。圖13A顯示在門靜脈內(nèi)注射AAV-B7.1轉(zhuǎn)染的EL-4細胞后4周從無腫瘤小鼠中獲得的脾細胞的抗腫瘤CTL活性相對于從接受了空AAV轉(zhuǎn)染的EL-4細胞的小鼠中獲得的脾細胞的抗腫瘤CTL活性被增強了。將百分細胞毒性相對于各種效應(yīng)子與靶點(E∶T)的比例進行作圖。圖13B顯示腫瘤在來自通過門靜脈內(nèi)注射EL-4細胞進行攻擊的未被免疫接種的和被免疫接種的小鼠的肝臟中所占據(jù)的相對面積(％)。圖13C顯示腫瘤在來自通過門靜脈內(nèi)注射親本EL-4細胞而再攻擊的未被免疫接種的和被免疫接種的小鼠的肝臟中所占據(jù)的相對面積(％)。雖然被免疫接種的小鼠不能抵抗再攻擊，但是轉(zhuǎn)移到肝臟的腫瘤的生長被抑制。*和**分別指示以P＜0.01和P＜0.001顯著地和極其顯著地區(qū)別于對照組。圖14A-14C顯示，用AAV-B7.1轉(zhuǎn)染的EL-4細胞免疫接種和用AAV-血管抑制素治療產(chǎn)生協(xié)同作用，消除了分散的轉(zhuǎn)移性肝臟腫瘤并提高了小鼠的存活力。圖14A顯示腫瘤在來自用空AAV病毒(1)或AAV-血管抑制素(3)處理的未被免疫接種的小鼠和用AAV-B7.1轉(zhuǎn)染的EL-4細胞免疫接種并用空AAV病毒處理的小鼠(2)或者用AAV-B7.1轉(zhuǎn)染的EL-4細胞免疫接種并用AAV-血管抑制素處理的小鼠(4)的肝臟中占據(jù)的相對面積(％)。圖14B顯示用空AAV病毒(1)或AAV-血管抑制素(3)處理的未被免疫接種的小鼠和用AAV-B7.1轉(zhuǎn)染的EL-4細胞免疫接種并用空AAV病毒處理的小鼠(2)或者用AAV-B7.1轉(zhuǎn)染的EL-4細胞免疫接種并用AAV-血管抑制素處理的小鼠(4)的存活率。每周觀察小鼠三次，并且在通過預(yù)先建立的標準確定瀕臨死亡時，處死小鼠。圖14C顯示來自用空AAV病毒(1)或AAV-血管抑制素(3)處理的未被免疫接種的小鼠和用AAV-B7.1轉(zhuǎn)染的EL-4細胞免疫接種并用空AAV病毒處理的小鼠(2)或者用AAV-B7.1轉(zhuǎn)染的EL-4細胞免疫接種并用AAV-血管抑制素處理的小鼠(4)的具有轉(zhuǎn)移性腫瘤的肝臟的代表性照片。箭頭指向肝臟中的腫瘤。5.本發(fā)明的詳細描述5.1載體的構(gòu)建和蛋白質(zhì)的表達本發(fā)明涉及包含編碼血管抑制素或B7.1分子的序列的核酸分子。本發(fā)明涉及在合適的宿主細胞中編碼和指導(dǎo)血管抑制素和B7.1分子表達的核酸分子。由于遺傳密碼的內(nèi)在簡并性，包括編碼與血管抑制素或B7.1分子的相同的氨基酸序列的核苷酸序列的其它多核苷酸可以被用于實施本發(fā)明。這些核苷酸包括但是不限于包括血管抑制素編碼區(qū)或B7.1基因的全部或部分的核苷酸序列，這些序列通過在序列中用編碼相同氨基酸殘基的不同密碼子替代而被改變，從而產(chǎn)生沉默的改變。這種核酸分子包括在嚴緊條件下與編碼血管抑制素和/或B7.1基因的序列或其互補序列雜交的核酸序列。在一個實施方案中，雜交到SEQIDNO1、3或5的互補物上的核酸分子包括其中的至少5個、10個、15個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、100個、120個、130個、150個、170個、180個、200個、300個、400個、500個、600個、700個、800個、900個、1000個、1100個、1300個、1500個、2000個、2500個或其多倍的核苷酸。在某些實施方案中，核酸分子包括編碼血管抑制素和共刺激分子B7.1的核酸序列。在一個實施方案中，核酸分子包括AAV載體和巨細胞病毒增強子和β-肌動蛋白啟動子(CAG啟動子)，該啟動子被可操作地連接到編碼血管抑制素的核酸序列上。在特定實施方案中，核酸分子包括AAV載體和CAG啟動子，該啟動子被可操作地連接到SEQIDNO1的核苷酸序列上或者編碼SEQIDNO2的氨基酸序列的核苷酸序列上。如在此所用的，短語“嚴緊條件”是指采用低離子強度和高洗滌溫度的雜交條件，例如50℃下的0.015MNaCl/0.0015M檸檬酸鈉/0.1％SDS；或者在68℃下在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)、0.5％SDS中雜交，接著在室溫下在2XSSC，0.5％SDS中洗滌一次或多次；或者在約45℃下在6XSSC中雜交，接著在約50-65℃下在0.2XSSC，0.1％SDS中洗滌一次或多次；(2)在雜交過程中使用一種變性劑例如甲酰胺，例如在42℃下，使用50％(體積/體積)甲酰胺與0.1％牛血清清蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液，pH6.5，750mMNaCl，75mM檸檬酸鈉；或者(3)在42℃下，采用50％甲酰胺，5XSSC(0.75MNaCl，0.075M焦磷酸鈉，5XDenhardt溶液，超聲波處理的鮭精DNA50μg/ml)，0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，在42℃下在0.2XSSC和0.1％SDS中洗滌?？梢詫幋a血管抑制素或B7.1分子的序列的核酸分子工程化，包括但是不限于，改變基因產(chǎn)物的加工和表達的變化。例如，改變糖基化模式或磷酸化等。在某些實施方案中，本發(fā)明的核酸分子包括編碼血管抑制素和B7.1的核苷酸序列。在一個特定的實施方案中，核酸分子包括包含SEQIDNO1和3的核苷酸序列的核苷酸序列。在特定的實施方案中，核酸分子包括包含SEQIDNO1和5的核苷酸序列的核苷酸序列。在另一個特定的實施方案中，核酸分子包括編碼SEQIDNO2和4的氨基酸序列的核苷酸序列。在另一個特定的實施方案中，核酸分子包括編碼SEQIDNO2和6的氨基酸序列的核苷酸序列。為了表達生物活性的血管抑制素或B7.1蛋白，編碼血管抑制素或B7.1蛋白的核苷酸序列分別被插入到合適的表達載體中，即含有被插入核酸分子的轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的元件的載體。基因產(chǎn)物以及用重組的表達載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的宿主細胞或細胞系在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)?？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法來構(gòu)建含有編碼血管抑制素或B7.1分子的序列以及適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括DNA體外重組技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)重組/基因重組。參見，例如，被描述在Sambrook等人，1989，MolecularCloningALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，N.Y.和Ausubel等人，1989，CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePublishingAssociatesandWileyInterscience，N.Y.中的技術(shù)?？梢杂酶鞣N宿主表達載體系統(tǒng)來表達血管抑制素和/或B7.1分子。這些系統(tǒng)包括但是不限于微生物，例如用重組噬菌體DNA轉(zhuǎn)化的病毒、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達載體；用重組酵母表達載體轉(zhuǎn)化的酵母；用重組病毒表達載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統(tǒng)；用重組病毒表達載體(例如花椰菜花葉病毒，CaMV；煙草花葉病毒，TMV)感染或者用重組質(zhì)粒表達載體(例如，Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細胞；或者動物細胞系統(tǒng)。各種系統(tǒng)的表達元件的強度和特異性是不同的。根據(jù)所用的宿主/載體系統(tǒng)，可以在表達載體中使用大量合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件的任何一種，包括組成型和誘導(dǎo)型的啟動子。例如，當(dāng)在細菌系統(tǒng)中進行克隆時，可以使用誘導(dǎo)型啟動子例如噬菌體λ的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac雜合啟動子；巨細胞病毒啟動子；EGR-1啟動子和靶向特定啟動子的白蛋白)等；當(dāng)在昆蟲細胞系統(tǒng)中進行克隆時，可以使用啟動子如桿狀病毒多角體蛋白啟動子；當(dāng)在植物細胞系統(tǒng)中克隆時，可以使用來源于植物細胞基因組的啟動子(例如熱休克啟動子；RUBISCO的小亞基的啟動子；葉綠素α/β結(jié)合蛋白的啟動子)或者來自植物病毒的啟動子(CaMY的35SRNA啟動子；TMV的外殼蛋白啟動子)；當(dāng)在哺乳動物細胞系統(tǒng)中進行克隆時，可以使用來源于哺乳動物細胞的基因組的啟動子(例如金屬硫蛋白啟動子)、來自哺乳動物病毒的啟動子(例如腺病毒晚期啟動子；牛痘病毒7.5K啟動子)或者來自鳥類細胞的啟動子(例如，雞β-肌動蛋白啟動子)；當(dāng)生成的細胞系含有多拷貝的嵌合DNA時，可以與適當(dāng)選擇性標記一起使用SV40、BPV和EBV載體。在細菌系統(tǒng)中，可以有利地根據(jù)用于被表達的蛋白質(zhì)的用途對大量的表達載體進行選擇。例如當(dāng)要生產(chǎn)大量蛋白質(zhì)時，指導(dǎo)表達高水平的容易被純化的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的載體是期望的。這種載體包括但是不限于pHL906載體(Fishman等人，Biochem.1994；336235-6243)、大腸桿菌表達載體pUR278(Ruther等人.EMBOJ.1983；21791)，其中蛋白質(zhì)編碼序列可以與lacZ編碼區(qū)一起被連接到載體的讀框內(nèi)，以生成雜合的AS-lacZ蛋白質(zhì)；pIN載體(Inouye&Inouye.NucleicAcidsRes.1985；133101-3109；VanHeeke&；Schuster.JBiolChem.1989；2645503-5509)等。特定的起始信號也是本發(fā)明的核酸分子有效翻譯所需的。這些信號包括ATG起始密碼子和鄰近序列。在將包括自身的起始密碼子和鄰近序列的整個基因插入到適當(dāng)?shù)谋磉_載體中的情況下，不需要額外的翻譯控制信號。但是，在血管抑制素或B7.1蛋白質(zhì)編碼序列不包括自身的起始密碼子的情形下，必須提供外源的翻譯控制信號，包括ATG起始密碼子。此外，起始密碼子必須與血管抑制素或B7.1蛋白編碼序列的閱讀框協(xié)調(diào)，以確保整個插入物的翻譯。這些外源轉(zhuǎn)錄控制信號和起始密碼子可以是各種來源的，可以是天然的和合成的。可以通過插入適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄增強子元件、轉(zhuǎn)錄終止子等來提高表達效率(參見Bittner等人，MethodsinEnzymol.1987；153516-544)。此外，可以選擇調(diào)節(jié)插入序列的表達或以期望的特定方式修飾和加工基因產(chǎn)物的宿主細胞株。蛋白質(zhì)產(chǎn)物的這種修飾(例如糖基化)和加工(例如裂解)對于蛋白質(zhì)的功能來說是重要的。在血管抑制素或B7.1蛋白中存在一致的N-糖基化位點，可能需要針對最佳功能的正確修飾。不同宿主細胞具有特征性和特異性的蛋白質(zhì)翻譯后加工和修飾的機制?？梢赃x擇適當(dāng)?shù)募毎祷蛩拗飨到y(tǒng)來確保正確地修飾和加工蛋白質(zhì)。至此，可以使用具有正確加工原始轉(zhuǎn)錄物、血管抑制素或B7.1蛋白的糖基化和磷酸化的細胞機制的真核宿主細胞。這種哺乳動物宿主細胞包括但是不限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、WI38等。為了長期、高產(chǎn)量地生產(chǎn)血管抑制素和B7.1蛋白，穩(wěn)定表達是優(yōu)選的。例如，可以工程化穩(wěn)定表達血管抑制素或B7.1蛋白的細胞系。比采用含有病毒性復(fù)制起始的表達載體更好的是，可以用受適當(dāng)?shù)谋磉_控制元件控制的編碼序列來轉(zhuǎn)化宿主細胞，這些控制元件如啟動子(例如，雞β-肌動蛋白啟動子、EGR-1啟動子和靶特異性啟動子白蛋白)、增強子(例如，CMV增強子)、轉(zhuǎn)錄終止子、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(例如，WPRE)、多腺苷酸位點等，以及一種可選擇的標記。在插入外源DNA后，讓工程化的細胞在富集培養(yǎng)基中生長1-2天，然后轉(zhuǎn)換到選擇培養(yǎng)基中。重組質(zhì)粒中的可選擇標記賦予對選擇的抗性，使得細胞能夠穩(wěn)定地將質(zhì)粒整合到染色體上，生長形成轉(zhuǎn)化灶，該轉(zhuǎn)化灶隨后被克隆和擴張到細胞系中?？梢允褂迷S多選擇體系，包括但是不限于單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，1977，Cell11223)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Szybalska&Szybalski，1962，Proc.Natl.Acad.Sci.USA482026)，并且腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Lowy等人，1980，Cell22817)基因可以分別被應(yīng)用到tk-、hgprt-或aprt-細胞中。此外，抗代物抗性可以被用作選擇dhfr的基礎(chǔ)，dhfr賦予對氨甲蝶呤的抗性(Wigler等人，1980，Natl.Acad.Sci.USA773567；O′Hare等人，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA781527)；用作選擇gpt的基礎(chǔ)，gpt賦予對霉酚酸的抗性(Mulligan&Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA782072)；用作選擇neo的基礎(chǔ)，neo賦予對氨基糖苷G-418的抗性(Colberre-Garapin等人，1981，J.Mol.Biol.1501)；以及用作選擇hygro的基礎(chǔ)，hygro賦予對潮霉素基因的抗性(Santerre等人，1984，Gene30147)。其它的可選擇基因已經(jīng)被描述，即trpB，它使細胞利用吲哚替代色氨酸；hisD，它使細胞利用組氨醇替代組氨酸(Hartman&Mulligan，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA858047)；和ODC(鳥氨酸脫羧酶)，它賦予對鳥氨酸脫羧酶抑制劑2-(二氟甲基)-DL-鳥氨酸、DFMO的抗性(McConlogueL.，1987，InCurrentCommunicationsinMolecularBiology，ColdSpringHarborLaboratory編輯)。容易通過本領(lǐng)域熟知的方法來確定血管抑制素或B7.1分子的身份和功能活性。例如，可以用該蛋白質(zhì)的抗體在Western印跡分析或組織的免疫組織化學(xué)染色中鑒定該蛋白質(zhì)。5.2藥物組合物本發(fā)明的治療劑可以被摻入到適合施用的藥物組合物中。這種組合物通常包括核酸分子；以及藥學(xué)上可接受的載體。如在此所用，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”是用以包括任何和所有的溶劑、分散媒介、包被、抗菌素和抗真菌劑、等滲的和延緩吸收的試劑等，適合于藥學(xué)上施用。這些媒介和試劑用于藥學(xué)活性物質(zhì)的用途在本領(lǐng)域是已知的。除了在任何傳統(tǒng)的媒介或試劑不與活性化合物相容的范圍之外，可以期待其在組合物中的用途。輔助的活性化合物也可以被摻入到該組合物中。本發(fā)明包括用于制備包括本發(fā)明的核酸分子的藥物組合物的方法。這種方法包括將藥學(xué)上可接受的載體與本發(fā)明的治療劑一起配制。這種組合物還可以包括其它活性試劑。因此，本發(fā)明還包括通過將藥學(xué)上可接受的載體與本發(fā)明的核酸分子和一種或多種其它活性化合物一起配制來制備藥物組合物的方法。配制本發(fā)明的藥物組合物，以與其特定的施用路徑相適應(yīng)。施用路徑的例子包括胃腸外的，例如動脈內(nèi)的、門靜脈內(nèi)的、肌肉的、靜脈內(nèi)的、皮層內(nèi)的、皮下的、經(jīng)皮(局部)的、經(jīng)粘膜的、關(guān)節(jié)內(nèi)的、腹膜內(nèi)的和胸膜內(nèi)的以及口腔的、吸入的和直腸的施用。在一個優(yōu)選實施方案中，施用路徑是門靜脈內(nèi)的、例如通過門靜脈的。在另一個優(yōu)選實施方案中，施用路徑是肌肉的，例如在三角肌部位、背側(cè)臀肌部位、股外側(cè)肌部位、腹側(cè)臀肌部位。用于胃腸外的、皮層內(nèi)的或皮下的應(yīng)用的溶液或懸浮液可以包括如下成分無菌稀釋液，如注射用水、鹽溶液、不揮發(fā)的油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗菌性試劑例如苯甲醇或羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑例如乙二胺四乙酸；緩沖液例如醋酸、檸檬酸或磷酸和用于調(diào)節(jié)滲透性的試劑如氯化鈉或右旋糖?？梢杂盟峄驂A，例如鹽酸或氫氧化鈉來調(diào)節(jié)pH?？梢詫⑽改c外的制劑封裝在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶中。適合用于注射用途的藥物組合物包括無菌水溶液(其中可溶于水)或者分散體和用于臨時制備無菌水溶液或者分散體的無菌粉末。對于靜脈內(nèi)施用，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、CremophorELTM(BASF；Parsippany，NJ)或者磷酸緩沖鹽水(PBS)。在所有情況下，該組合物必須是無菌的，具有一定程度的流動性，使得容易用注射器注射。在制造和貯存條件下必須穩(wěn)定，必須抵抗微生物例如細菌和真菌的污染作用。載體可以是一種溶劑或分散介質(zhì)，含有例如水、乙醇、多羥基化合物(例如，甘油、丙二醇和聚乙二醇等)，以及合適的它們的混合物。例如在分散體的情況下，可以通過使用一種包被，例如卵磷脂來維持所需的顆粒大小，以及通過使用表面活性劑來保持恰當(dāng)?shù)牧鲃有??？梢酝ㄟ^各種抗菌劑和抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等來預(yù)防微生物的作用。在許多情況下，優(yōu)選在組合物中包括等滲試劑，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇、氯化鈉。可以在組合物中含有延緩吸收的試劑例如單硬酯酸鋁和明膠，來實現(xiàn)延緩可注射的組合物的吸收。在具有上面列舉的成分的一種或多種組合的適當(dāng)溶劑中摻入所需量的活性化合物(例如核酸分子)，如果需要，接著過濾滅菌，可以制備無菌的可注射溶液。一般地，將活性化合物摻入到含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和所需的來自上面列舉的那些的其它成分的無菌載體來制備分散體。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，從先前滅菌過濾的的溶液中得到活性成分加上任何其它期望成分的粉末。口服組合物通常包括惰性稀釋劑和可食用的載體。它們被包裹在明膠膠囊中或壓縮成片劑。為了口服治療性施用的目的，可以將活性化合物與賦形劑摻合，并以片劑、錠劑或者膠囊的形式使用。還可以用作為漱口水的液體載體來制備口服組合物，其中液體載體中的化合物被口服應(yīng)用，漱口和吐出或咽下。藥學(xué)上相容的粘合試劑和/或佐劑物質(zhì)可以作為組合物的一部分被包括在內(nèi)。片劑、藥丸、膠囊、錠劑等可以含有任何的如下成分或具有相似特性的化合物粘合劑如微晶纖維素、黃芪膠或明膠；或者玉米淀粉；滑潤劑，如硬酯酸鎂或Sterotes；滑動劑(glidant)，如膠狀二氧化硅；甜味劑，例如蔗糖或糖精；或者風(fēng)味劑，例如薄荷油、甲基水楊酸鹽或者橙調(diào)味品。對于通過吸入施用，從密閉容器中或者從含有合適的推進劑如二氧化碳的分配器或者從噴霧器中以氣霧劑的形式遞送化合物。還可以通過經(jīng)粘膜的或經(jīng)皮的方式進行系統(tǒng)性施用。對于經(jīng)粘膜的或經(jīng)皮的施用，在制劑中使用適合于將要穿透的障礙的滲透劑。這種滲透劑在本領(lǐng)域中是公知的，包括，例如，對于經(jīng)粘膜施用來說，有去垢劑、膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物?？梢酝ㄟ^使用鼻噴霧或者栓劑來實現(xiàn)經(jīng)粘膜施用。對于經(jīng)皮施用，將活性化合物配制到如本領(lǐng)域公知的油膏、藥膏、凝膠體或者面霜中。該化合物還可以以栓劑(例如采用傳統(tǒng)的栓劑基礎(chǔ)如可可油和其它的甘油酯)或者用于直腸呈遞的存留灌腸劑的形式制備。在一個實施方案中，將活性化合物與載體一起配制，該載體將防止化合物迅速從機體中消除，例如一種控制釋放的制劑，包括植入物和微膠囊呈遞系統(tǒng)?？梢允褂每缮锝到獾摹⑸锵嗳菪跃酆衔?，例如乙烯-醋酸乙烯基酯聚合物、聚酐、聚乙醇酸、膠原質(zhì)、聚正酯(polyorthoesters)和聚乳酸。用于制備這種制劑的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯然的。材料可以從AlzaCorporationandNovaPharmaceuticals，Inc購買得到。脂質(zhì)體懸浮液(包括靶向具有抗病毒抗原的單克隆抗體的被感染細胞的脂質(zhì)體)也可以被用作藥學(xué)上可接受的載體。這些載體可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如，在美國專利4,522,811中描述的方法來制備。特別有利的是，以容易施用和劑量一致的劑量形式配制口服的或胃腸外的組合物。如在此所用的，劑量單位形式是指適合作為被治療的受治療者的單一劑量的物理上分散的單位；各個單位含有預(yù)先確定含量的活性化合物，該化合物的含量被計算以與所需的藥物載體聯(lián)合產(chǎn)生期望的治療作用。本發(fā)明的劑量單位形式的規(guī)格受限于并且直接取決于活性化合物的特性和將要達到的特定治療作用，以及本領(lǐng)域中混合這種活性化合物來處理個體的內(nèi)在限制。從細胞培養(yǎng)分析和動物試驗中獲得的數(shù)據(jù)可以被用于配制用于人的劑量范圍。這種化合物的劑量優(yōu)選在包括毒性很低或無毒性的ED50的循環(huán)濃度的范圍內(nèi)。該劑量可以在該范圍內(nèi)變化，取決于所采用的劑量形式和所用的施用路徑。對于用于本發(fā)明的方法中的任何化合物來說，首先可以從細胞培養(yǎng)分析中估計治療有效劑量。在細胞培養(yǎng)和動物模型中配制一種劑量，以獲得包括在細胞培養(yǎng)中確定的IC50(獲得對癥狀的半數(shù)最大抑制的被檢測化合物的濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍。該信息可以被用于更加精確地確定人中的有用劑量?？梢詼y量血漿中的含量，如通過高效液相色譜測量。對于采用動物模型來確定最佳劑量，參見例如下文的第6.2節(jié)。熟練的操作人員將會意識到，某些因素將會影響有效治療受治療者所需的劑量，包括但是不限于疾病或紊亂的嚴重程度、先前的治療、受治療者的健康狀況和/或年齡和存在的其它疾病。而且，用治療有效量的治療劑例如核酸分子治療受治療者，包括單次治療或者，優(yōu)選包括一系列治療。還可以預(yù)期，用于治療的有效量核酸分子在特定治療過程中可能會增加或減少?？梢詮脑诖嗣枋龅脑\斷分析中得出劑量的變化并且是顯然的?？紤]到患者的癥狀，各個內(nèi)科醫(yī)生能夠選擇精確的配制方法、施用路徑和劑量(參見，例如Fingl等人，1975，InThePharmacologicalBasisofTherapeutics，第一章第1頁)。本發(fā)明的核酸分子可以被插入到載體中，被用作基因治療載體。將基因治療載體呈遞到受治療者中的方法包括靜脈內(nèi)注射、局部施用(美國專利5,328,470)或者通過定向注射(參見，例如Chen，等人，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9130543057)?；蛑委熭d體的藥物制劑可以在可接受的稀釋劑中包括基因治療載體或者可以包含包埋了基因呈遞載體的緩釋基質(zhì)?？商娲兀?dāng)從重組細胞中完整制備完整的基因呈遞載體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體時，藥物制劑可以包括一種或多種產(chǎn)生基因呈遞系統(tǒng)的細胞。至于基因治療，參見第5.3.4節(jié)中的進一步討論。5.3采用本發(fā)明的核酸分子的治療性/預(yù)防性方法本發(fā)明還指向治療或預(yù)防與特定細胞群體的異?；钚韵嚓P(guān)的疾病或紊亂的治療性或預(yù)防性的方法。這種疾病或紊亂可以通過減少細胞數(shù)量或者延緩或最小化細胞增殖來治療或預(yù)防。本發(fā)明還提供防止腫瘤或癌癥復(fù)發(fā)的方法。5.3.1癌癥可以用本發(fā)明的方法和組合物治療或預(yù)防的癌癥及相關(guān)紊亂包括但是不限于如下白血病例如但是不限于，急性白血病，急性淋巴細胞白血病，急性髓細胞白血病如成髓細胞的、原髓細胞的、骨髓單核細胞的、單核細胞的、紅白血病和髓發(fā)育異常綜合癥，慢性白血病如但是不限于，慢性髓細胞的(粒細胞的)白血病，慢性淋巴細胞白血病，多毛細胞白血?。患t血球增多癥；淋巴瘤例如但是不限于Hodgkin病，非Hodgkin?。欢喟l(fā)性骨髓瘤例如但是不限于多發(fā)性郁積骨髓瘤，非分泌性骨髓瘤，骨硬化骨髓瘤，漿細胞白血病，單漿細胞瘤和髓外漿細胞瘤；Waldenstrom巨球蛋白血癥；意義未確定的單克隆免疫球蛋白病(gammopathy)；良性的單克隆免疫球蛋白??；重鏈疾病；骨骼和結(jié)締組織肉瘤例如但是不限于骨骼肉瘤，骨肉瘤，軟骨肉瘤，Ewing肉瘤，惡性巨細胞腫瘤，骨骼纖維肉瘤，脊索瘤，骨膜肉瘤，軟組織肉瘤，血管肉瘤(angiosarcoma)(血管肉瘤(hemangiosarcoma))，纖維肉瘤，Kaposi肉瘤，平滑肌肉瘤，脂肪肉瘤，淋巴管肉瘤，神經(jīng)鞘瘤(neurilemmoma)，橫紋肌肉瘤，滑液肉瘤，腦瘤例如但是不限于，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，星形細胞瘤，腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤，室鼓膜瘤，少突膠質(zhì)細胞瘤，非神經(jīng)膠質(zhì)瘤，聽神經(jīng)瘤(acousticneurinoma)，顱咽管瘤，成神經(jīng)管細胞瘤，腦膜成纖維細胞瘤，松果體區(qū)內(nèi)腫瘤(pineocytoma)、成松果體細胞瘤，原發(fā)性腦淋巴瘤；乳腺癌包括但是不限于，腺癌，小葉(小細胞)癌，管內(nèi)癌，髓質(zhì)乳腺癌，粘膜乳腺癌，管狀乳腺癌，乳突乳腺癌，Paget疾病和炎癥性乳腺癌；腎癌例如但是不限于嗜鉻細胞瘤(pheochromocytom)和腎上腺皮質(zhì)癌；甲狀腺癌例如但是不限于乳突的或甲狀腺癌，髓質(zhì)的甲狀腺癌和整形的甲狀腺癌；胰腺癌例如但是不限于胰島細胞癌，促胃液素瘤，胰升血糖素瘤，VIP腫瘤(vipoma)，抑生長素-分泌腫瘤和良性腫瘤的或胰島細胞瘤；垂體癌例如但是不限于Cushing病，催乳激素-分泌腫瘤，肢端肥大癥和尿崩癥；眼癌例如但是不限于，眼黑素瘤例如虹膜黑素瘤，脈絡(luò)膜黑素瘤和睫狀體黑素瘤和眼癌；陰道癌例如鱗狀細胞癌，腺癌和黑素瘤；陰門癌例如鱗狀細胞癌，黑素瘤，腺癌，基細胞癌，肉瘤和Paget病；宮頸癌例如但是不限于，鱗狀細胞癌和腺癌；子宮癌例如但是不限于子宮內(nèi)膜癌和子宮肉瘤；卵巢癌例如但是不限于，卵巢上皮細胞癌，邊緣腫瘤，生殖細胞瘤和基質(zhì)瘤；食管癌例如但是不限于，鱗狀癌，腺癌，腺樣囊樣癌，粘液表皮樣癌，腺鱗狀癌，肉瘤，黑素瘤，漿細胞癌，疣狀癌和燕麥細胞(小細胞)癌；胃癌例如但是不限于，腺癌，真菌狀生長的(息肉狀的)、潰爛的、表面伸展的、廣泛伸展的惡性淋巴瘤，脂肪肉瘤纖維肉瘤和惡性肉瘤；直腸癌；肝癌例如但是不限于肝細胞癌和肝成纖維癌，膽囊癌例如腺癌；膽囊癌(cholangiocarcinomas)例如但是不限于，乳突的、結(jié)節(jié)的和擴散的；肺癌例如非小細胞肺癌，鱗狀細胞癌(鱗狀細胞癌)，腺癌，大的細胞癌和小的細胞肺癌；陰囊癌例如但是不限于，幼芽的腫瘤，睪丸精原細胞瘤，整形手術(shù)的、典型的(獨特的)、精細胞的、非精原細胞瘤，胚胎性癌，畸胎瘤，絨毛膜癌(卵黃囊瘤)，前列腺癌例如但是不限于，腺癌，平滑肌肉瘤和陰莖癌；口腔癌例如但是不限于鱗狀細胞癌；基癌(basalcancers)；唾液腺癌例如但是不限于，腺癌，粘液表皮樣癌，和腺狀囊狀癌；咽癌例如但是不限于，鱗狀上皮細胞癌，疣的；皮膚癌例如但是不限于基細胞癌，鱗狀細胞癌和黑素瘤，表面伸展的黑素瘤，結(jié)節(jié)的黑素瘤，雀斑狀痣惡性黑素瘤，acral雀斑黑素瘤；腎癌例如但是不限于腎細胞癌，腺癌，超級腎瘤，纖維肉瘤，轉(zhuǎn)移細胞癌(腎盂和/或子宮)；Wilms腫瘤；膀胱癌例如但是不限于轉(zhuǎn)移細胞癌，鱗狀細胞癌癥，腺癌，惡性肉瘤。此外，癌癥包括粘液肉瘤，成骨肉瘤，內(nèi)皮肉瘤，淋巴管內(nèi)皮細胞肉瘤，間皮瘤，滑液瘤，成血管細胞瘤，上皮瘤，囊狀腺癌，支氣管癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳突狀癌和乳突腺癌(對這些紊亂的綜述，參見Fishman等人，1985，Medicine，2dEd.，J.B.LippincottCo.，Philadelphia和Murphy等人，1997，InformedDecisionsTheCompleteBookofCancerDiagnosis，Treatment，andRecovery，VikingPenguin，PenguinBooksU.S.A.，Inc.，UnitedStatesofAmerica)。因此，本發(fā)明的方法和組合物還可以用于治療或預(yù)防各種癌癥或其它的異常的增生性疾病，包括(但是不限于)如下癌癥，包括膀胱、乳腺、大腸、腎臟、肝臟、肺部、卵巢、前列腺、胃、子宮頸、甲狀腺和皮膚的癌癥；包括鱗狀細胞癌；淋巴譜系的造血性腫瘤，包括白血病，急性淋巴細胞白血病，急性成淋巴細胞白血病，B-細胞淋巴瘤，T-細胞淋巴瘤，Berketts淋巴瘤；骨髓譜系的造血性腫瘤，包括急性和慢性的骨髓性白血病和前髓細胞白血??；間葉細胞來源的腫瘤，包括成纖維肉瘤和橫紋肌肉瘤；其它腫瘤，包括黑素瘤、精原細胞瘤、畸胎癌、成神經(jīng)細胞瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤；中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤，包括星形細胞瘤、成神經(jīng)細胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和神經(jīng)鞘瘤；間葉細胞來源的腫瘤，包括成纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤和骨肉瘤；和其它腫瘤，包括黑素瘤、外皮色素沉積(xenodermapegmentosum)、角化棘皮瘤、精原細胞瘤、甲狀腺濾泡瘤和畸胎癌。還可以預(yù)期，由凋亡中的異常引起的癌癥也可以用本發(fā)明的方法和組合物來治療。這種癌癥包括但是不限于濾泡淋巴瘤，p53突變的癌癥，乳腺、前列腺和卵巢的激素依賴腫瘤，以及癌癥前期的損害例如家族性的腺癌息肉病和髓細胞發(fā)育異常綜合癥。在特定的實施方案中，在卵巢、膀胱、乳腺、大腸、肝臟、肺部、皮膚、前列腺或子宮中，治療或預(yù)防惡性的和異常增生性的變化(例如轉(zhuǎn)化的和發(fā)育異常的)或者超增生性的紊亂。在其它特定實施方案中，肉瘤、黑素瘤或白血病被治療或預(yù)防。5.3.2治療性/預(yù)防性的施用本發(fā)明提供通過給動物(例如母牛、豬、馬、雞、貓、狗、人等)施用有效量的本發(fā)明的多核苷酸來預(yù)防和處理癌癥、腫瘤或者癌癥或腫瘤的復(fù)發(fā)的方法。本發(fā)明的多核苷酸可以以其本身或者藥物組合物的形式被施用給受治療者，來治療和預(yù)防癌癥。在特定的實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸通過門靜脈內(nèi)注射施用。在另一個特定的實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸通過肌肉注射來施用。在某些實施方案中，本發(fā)明的治療性或預(yù)防性組合物與一種或多種可以用于治療疾病或癥狀的其它治療性或預(yù)防性的組合物同時地被施用給哺乳動物，優(yōu)選為人。在一個實施方案中，AAV-B7.1載體與AAV-血管抑制素載體同時地被施用。術(shù)語“同時地”不是將預(yù)防性或治療性組合物的施用限定在嚴格的同一時間，而是指本發(fā)明的組合物和其它試劑順序地并且在一個時間間隔內(nèi)被施用給哺乳動物，使得包含多核苷酸的組合物可以與其它組合物一起作用，產(chǎn)生比它們以其它方式被施用時更強的有益效果。例如，各種預(yù)防性或治療性組合物(例如化學(xué)治療、放射治療、激素治療、生物學(xué)治療、栓塞術(shù)或者化學(xué)栓塞術(shù)治療)可在同一時間點上被施用或者以任何順序在不同時間點上順序地被施用；然而，如果不是在相同時間點上施用，則它們應(yīng)當(dāng)在足夠接近的時間點上被施用，以產(chǎn)生期望的治療性或預(yù)防性作用。各種治療性組合物可以被分開施用，以任何適當(dāng)形式和通過任何合適的路徑施用。在其它實施方案中，在手術(shù)之前、同時和之后，施用本發(fā)明的組合物。優(yōu)選地，手術(shù)完全去除了局部腫瘤或者降低了大腫瘤的尺寸。還可以實施手術(shù)來減少疼痛。在各種實施方案中，在相隔小于1小時、相隔約1小時、相隔約1-2小時、相隔約2-3小時、相隔約3-4小時、相隔約4-5小時、相隔約5-6小時、相隔約6-7小時、相隔約7-8小時、相隔約8-9小時、相隔約9-10小時、相隔約10-11小時、相隔約11-12小時、相隔不超過24小時或者不超過48小時時，施用預(yù)防性或治療性組合物。在優(yōu)選實施方案中，給同一個患者施用兩種或多種成分。在其它實施方案中，在相隔約30分鐘、相隔約1小時、相隔約1-2小時、相隔約2-3小時、相隔約3-4小時、相隔約4-5小時、相隔約5-6小時、相隔約6-7小時、相隔約7-8小時、相隔約8-9小時、相隔約9-10小時、相隔約10-11小時、相隔約11-12小時、相隔約1-2天、相隔約2-4天、相隔約4-6天、相隔約1周、相隔約1-2周、或相隔2周以上施用預(yù)防性或治療性組合物。在優(yōu)選實施方案中，在組合物仍具有活性的期限內(nèi)施用預(yù)防性或治療性組合物。在特定的實施方案中，在施用第一種AAV-B7.1載體、AAV-血管抑制素載體和/或AAV-B7.1/血管抑制素載體后4周，施用第二種AAV-B7.1載體、AAV-血管抑制素載體和/或AAV-B7.1/血管抑制素載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過被施用的組合物的半衰期來確定該時間期限。在特定的實施方案中，AAV-B7.1和AAV-血管抑制素載體都通過門靜脈內(nèi)注射來施用。在另一個特定的實施方案中，AAV-B7.1和AAV-血管抑制素載體都通過肌肉注射來施用。在另一個特定的實施方案中，AAV-B7.1載體通過門靜脈內(nèi)注射來施用，而AAV-血管抑制素載體通過肌肉注射來施用。在還有一個特定的實施方案中，AAV-B7.1載體通過肌肉注射來施用，而AAV-血管抑制素載體通過門靜脈內(nèi)注射來施用。在某些實施方案中，本發(fā)明的預(yù)防性或治療性組合物被循環(huán)施用給受治療者。循環(huán)治療包括施用第一種組合物一段時間，接著施用第二種組合物和/或第三種組合物一段時間，并重復(fù)該連續(xù)施用。循環(huán)治療能夠減少產(chǎn)生對一種或多種治療方法的抗性，避免或降低一種治療方法的副作用，和/或提高治療的功效。在某些實施方案中，在小于約3周、約每2周1次、約10天1次或約每周1次的循環(huán)中施用預(yù)防性或治療性的組合物。一個循環(huán)可以包括通過每個循環(huán)灌注90分鐘以上、每個循環(huán)灌注約1小時、每個循環(huán)灌注約45分鐘來施用治療性或預(yù)防性組合物。每個循環(huán)包括至少1周的休止期、至少2周的休止期、至少3周的休止期。施用的循環(huán)數(shù)為約1-12個循環(huán)，更加典型地為約2-10個循環(huán)，更加典型地為約2-8個循環(huán)。在還有其它實施方案中，本發(fā)明的治療性和預(yù)防性組合物以有規(guī)律的劑量方案施用，通過沒有長期休止期的持續(xù)灌注或者頻繁的施用。這種有規(guī)律的施用包括在無休止期的恒定間隔中給藥。劑量方案包括在很長一段時期內(nèi)長期每日施用相對低的劑量。在優(yōu)選實施方案中，使用較低劑量能夠最小化毒副作用，并去除休止期。在某些實施方案中，通過在約24小時到約2天、到約1周、到約2周、到約3周、到約1個月、到約2個月、到約3個月、到約4個月、到約5個月、到約6個月的范圍內(nèi)，長期低劑量或者持續(xù)灌注治療性和預(yù)防性的組合物。這種劑量方案的時間安排可以由熟練的內(nèi)科醫(yī)生來優(yōu)化。在此提供的劑量含量和施用頻率包括在術(shù)語治療有效性和預(yù)防有效性中。通常，劑量和頻率還隨特異于各個患者的因素來變化，取決于所施用的特定治療性或預(yù)防性組合物、疾病或癥狀的嚴重性和類型、施用路徑，以及患者的年齡、體重、反應(yīng)和已往病史。在考慮這些因素和如下的例如在文獻中報導(dǎo)的和在Physician′sDeskReference(56thed.，2002)中推薦的劑量后，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇合適的方案。各種呈遞系統(tǒng)是已知的，可以用于施用本發(fā)明的治療性或預(yù)防性的組合物，例如封裝在脂質(zhì)體、微粒、微囊、能夠表達抗體或抗體片段的重組細胞中、受體介導(dǎo)的細胞內(nèi)吞作用(參見例如Wu和Wu，J.Biol.Chem.2624429-4432(1987))、作為逆轉(zhuǎn)錄病毒的和其它載體的部分的核酸構(gòu)建體中等。施用本發(fā)明的預(yù)防性或治療性的組合物的方法包括，但是不限于，胃腸外施用(例如，經(jīng)皮的、肌肉內(nèi)的、腹腔內(nèi)的、靜脈內(nèi)的和皮下的)、硬腦膜上的和粘膜的(例如，鼻內(nèi)和口腔路徑)。在特定實施方案中，本發(fā)明的預(yù)防性或治療性組合物通過肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下施用。通過任何便捷的路徑，例如通過灌注或大丸劑注射，通過上皮或粘膜內(nèi)層(例如，口腔粘膜、直腸和腸道粘膜等)吸收來施用預(yù)防性或治療性的組合物，還可以與其它生物活性試劑一起施用。施用可以是系統(tǒng)性的或者局部的。在特定實施方案中，期望將本發(fā)明的預(yù)防性或治療性組合物局部施用到需要處理的部位；這可以通過例如，但是不是限制于，局部灌注，通過注射，或者借助植入物來實現(xiàn)，所述植入物是一種多孔、無孔或者凝膠狀物質(zhì)，包括膜，例如sialastic膜或纖維。在還有另一個實施方案中，可以在控制釋放或延長釋放的系統(tǒng)中呈遞預(yù)防性或治療性組合物。在一個實施方案中，可以使用泵來實現(xiàn)控制釋放或延長釋放(參見Langer，同上文；Sefton，1987，CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.1420；Buchwald等人，1980，Surgery88507；Saudek等人，1989，N.Engl.J.Med.321574)。在另一個實施方案中，使用聚合物來實現(xiàn)本發(fā)明的預(yù)防性或治療性組合物的控制釋放或延長釋放(參見，例如MedicalApplicationsofControlledRelease，LangerandWise(編輯)，CRCPres.，BocaRaton，F(xiàn)lorida(1974)；ControlledDrugBioavailability，DrugProductDesignandPerformance，SmolenandBall(編輯)，Wiley，NewYork(1984)；Ranger和Peppas，1983，J.，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.2361；還可以參見Levy等，1985，Science228190；During等人，1989，Ann.Neurol.25351；Howard等人，1989，J.Neurosurg.71105)；美國專利5,679,377；美國專利5,916,597；美國專利5,912,015；美國專利5,989,463；美國專利5,128,326；PCT公開WO99/15154；和PCT公開WO99/20253。用于延長釋放的制劑中的聚合物的例子包括，但是不限于，聚(異丁烯酸-2-羥基乙基酯)、聚(異丁烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-醋酸乙烯基酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚正酯(polyorthoester)。在優(yōu)選實施方案中，用于延長釋放的制劑中的聚合物是惰性的、不含可以瀝去的雜質(zhì)、在貯存中是穩(wěn)定的、無菌的和可生物降解的。在還有另一個實施方案中，將控制釋放或延長釋放的系統(tǒng)置于預(yù)防性或治療性靶點附近，因而僅需要系統(tǒng)性劑量的一部分(參見，例如Goodson，inMedicalApplicationsofControlledRelease，同上文，第2卷，115-138(1984))。控制釋放系統(tǒng)在Langer(1990，Science2491527-1533)的綜述中被討論。任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)可以被用于生產(chǎn)包含一種或多種本發(fā)明的治療性組合物的延長釋放制劑。參見，例如美國專利4,526,938，PCT公開WO91/05548，PCT公開WO96/20698，Ning等人，1996，″IntratumoralRadioimmunotheraphyofaHumanColonCancerXenograftUsingaSustained-ReleaseGel，″Radiotherapy&Oncology39179-189，Song等人，1995，″AntibodyMediatedLungTargetingofLong-CirculatingEmulsions，″PDAJournalofPharmaceuticalScience&Technology50372-397，Cleek等人，1997，″BiodegradablePolymericCarriersforabFGFAntibodyforCardiovascularApplication，″Pro.Int′l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24853-854，和Lam等人，1997，″MicroencapsulationofRecombinantHumanizedMonoclonalAntibodyforLocalDelivery，″Proc.Int′l.Symp.ControlRel.Bioact.Mater.24759-760，它們中的每一篇在此完全引入作為參考。5.3.3其它治療性/預(yù)防性試劑按照本發(fā)明，通過施用多核苷酸的治療可以結(jié)合施用一種或多種治療，例如但是不限于化學(xué)治療、放射治療、激素治療、生物學(xué)治療/免疫治療、栓塞術(shù)和/或化學(xué)栓塞術(shù)治療。在特定實施方案中，本發(fā)明的方法包括施用一種或多種血管生成抑制劑，例如但是不限于抗血管生成抗凝血酶III；血管酶(Angiozyme)；ABT-627；Bay12-9566；Benefin；Bevacizumab；BMS-275291；軟骨來源的抑制劑(CDI)；CAI；CD59補體片段；CEP-7055；Col3；CombretastatinA-4；內(nèi)抑制素(膠原XVIII片段)；纖連蛋白片段；Gro-beta；Halofuginone；肝素酶；肝素六糖片段；HMV833；人絨毛膜促性腺激素(hCG)；IM-862；干擾素α/β/γ；干擾素誘導(dǎo)蛋白(IP-10)；白介素-12；Kringle5(血漿酶原片段)；Marimastat；金屬蛋白酶抑制劑(TEMP)；2-甲氧雌二醇；Nu270(CGS27023A)；MoAbIMC-1C11；Neovastat；NM-3；Panzem；PI-88；胎盤核糖核酸酶抑制劑；血漿酶原活化抑制劑；血小板因子-4(PF4)；Prinomastat；泌乳刺激素16kD片段；多育曲霉素相關(guān)蛋白(PRP)；PTK787/ZK222594；類維生素A；Solimastat；Squalamine；SS3304；SU5416；SU6668；SU11248；四氫皮質(zhì)醇-S；硫酸鉬酸鹽；thalidomide；血小板反應(yīng)蛋白-1(TSP-1)；TNP-470；轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-b)；Vasculostatin；Vasostatin(caireticulin片段)；ZD6126；ZD6474；法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(FTI)和磷酸氫鹽。在包括本發(fā)明的藥物組合物和劑量形式和試劑盒的本發(fā)明的各種實施方案中，所使用的抗癌試劑的其它例子，包括但是不限于阿雪維菌素(acivicin)；阿拉克霉素(aclarubicin)；acodazolehydrochloride；acronine；阿多來星(adozelesin)；阿地白介素(aldesleukin)；六甲蜜胺(altretamine)；二霉素(ambomycin)；醋酸雙羥胺蒽酮(ametantroneacetate)；氨魯米特(aminoglutethimide)；安吖啶(amsacrine)；阿那曲唑(anastrozole)；氨茴霉素(anthramycin)；天冬酰胺酶(asparaginase)；asperlin；阿扎胞苷(azacitidine)；azetepa；含氮霉素(azotomycin)；巴馬司他(batimastat)；benzodepa；比卡魯胺(bicalutamide)；鹽酸比生群(bisantrenehydrochloride)；bisnafidedimesylate；bizelesin；硫酸博來霉素(bleomycinsulfate)；布喹那鈉(brequinarsodium)；bropirimine；白消安(busulfan)；cactinomycin；calusterone；卡拉酰胺(caracemide)；carbetimer；卡鉑(carboplatin)；卡氯芥(carmustine)；鹽酸卡柔比星(carubicinhydrochloride)；carzelesin；cedefmgol；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；cirolemycin；順鉑(cisplatin)；克拉屈濱(cladribine)；那托甲磺酸(crisnatolmesylate)；環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)；阿糖胞苷(cytarabine)；氮烯咪胺(dacarbazine)；放線菌素(dactinomycin)；鹽酸道諾霉素(daunorubicinhydrochloride)；地西他濱(decitabine)；右奧馬鉑(dexormaplatin)；dezaguanine；dezaguaninemesylate；地吖醌(diaziquone)；多西紫杉醇(docetaxel)；阿霉素(doxorubicin)；鹽酸阿霉素；屈洛昔芬(droloxifene)；檸檬酸屈洛昔芬(droloxifenecitrate)；dromostanolonepropionate；偶氮霉素(duazomycin)；依達賽特(edatrexate)；鹽酸依氟鳥氨酸(eflornithinehydrochloride)；依沙蘆星(elsamitrucin)；恩洛鉑(enloplatin)；enpromate；epipropidine；鹽酸表柔比星(epirubicinhydrochloride)；厄布洛唑(erbulozole)；鹽酸伊柔比星(esorubicinhydrochloride)；雌氮芥(estramustine)；磷酸雌氮芥鈉(estramustinephosphatesodium)；依他硝唑(etanidazole)；鬼臼乙叉甙(etoposide)；磷酸鬼臼乙叉甙(etoposidephosphate)；etoprine；鹽酸法倔唑(fadrozolehydrochloride)；法扎拉濱(fazarabine)；4-N羥基維甲胺(fenretinide)；氟尿嘧啶脫氧核苷(floxuridine)；磷酸氟達拉濱(fludarabinephosphate)；氟尿嘧啶(fluorouracil)；flurocitabine；磷喹酮(fosquidone)；磷曲星鈉(fostriecinsodium)；吉西它濱(gemcitabine)；鹽酸吉西它濱；羥基脲(hydroxyurea)；鹽酸伊達比星(idarubicinhydrochloride)；異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)；伊莫復(fù)星(ilmofosine)；白介素II(包括重組白介素II，或rIL2)，干擾素α-2a；干擾素α-2b；干擾素α-nl；干擾素α-n3；干擾素β-Ia；干擾素γ-Ib；順式-二氯-反式-二羥基-雙-異丙胺合鉑(iproplatin)鹽酸伊立替康(irinotecanhydrochloride)；醋酸蘭瑞肽(lanreotideacetate)；來曲唑(letrozole)；抑那通(leuprolideacetate)；鹽酸利阿唑(liarozolehydrochloride)；洛美曲索鈉(lometrexolsodium)；洛莫司汀(lomustine)；鹽酸洛索蒽醌(losoxantronehydrochloride)；馬索羅酚(masoprocol)；美登素(maytansine)；鹽酸二氯甲基二乙胺(mechlorethaminehydrochloride)；醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)；醋酸甲孕酮(melengestrolacetate)；美法侖(melphalan)；曼諾加利(menogaril)；巰基嘌呤(mercaptopurine)；氨甲蝶呤(methotrexate)；氨甲蝶呤鈉(methotrexatesodium)；metoprine；美妥替哌(meturedepa)；mitindomide；mitocarcin；mitocromin；mitogillin；絲裂馬菌素(mitomalcin)；絲裂菌素(mitomycin)；mitosper；臨氯苯對氯苯二乙烷(mitotane)；鹽酸米托蒽醌(mitoxantronehydrochloride)；麥考酚酸(mycophenolicacid)；諾考達唑(nocodazole)；諾加霉素(nogalamycin)；歐瑪鉑(ormaplatin)；吡酰亞砜(oxisuran)；紫杉醇(paclitaxel)；培門冬酶(pegaspargase)；佩里霉素(peliomycin)；戊莫司汀(pentamustine)；硫酸培普利歐霉素(peplomycinsulfate)；perfosfamide；pipobroman；piposulfan；鹽酸吡羅蒽醌(piroxantronehydrochloride)；plicamycin；plomestane；卟吩姆(porfimersodium)；甲基絲裂霉素(porfiromycin)；prednimustine；鹽酸甲芐肼(procarbazinehydrochloride)；嘌呤霉素(puromycin)；鹽酸嘌呤霉素(puromycinhydrochloride)；吡唑呋喃菌素(pyrazofurin)；riboprine；洛替密特(rogletimide)；safingol；safingolhydrochloride；司莫司汀(semustine)；simtrazene；sparfosatesodium；稀硫霉素(sparsomycin)；鹽酸螺鍺(spirogermaniumhydrochloride)；螺氮芥(spiromustine)；螺鉑(spiroplatin)；鏈黑霉素(streptonigrin)；鏈脲佐菌素(streptozocin)；磺氯苯脲(sulofenur)；talisomycin；tecogalansodium；替加氟(tegafur)；鹽酸替洛蒽酮(teloxantronehydrochloride)；替莫泊芬(temoporfin)；替尼泊甙(teniposide)；特洛西酮(teroxirone)；睪丸內(nèi)酯(testolactone)；thiamiprine；硫鳥嘌呤(thioguanine)；噻替派(thiotepa)；2-β-D-呋喃核糖基-4-酰胺噻唑(tiazofurin)；替拉扎明(tirapazamine)；檸檬酸托瑞米芬(toremifenecitrate)；trestoloneacetate；triciribinephosphate；三甲曲沙(trimetrexate)；葡糖醛酸三甲曲沙(trimetrexateglucuronate)；曲普瑞林(triptorelin)；鹽酸土布洛唑(tubulozolehydrochloride)；尿嘧啶芥子(uracilmustard)；uredepa；伐普肽(vapreotide)；維替泊芬(verteporfin)；硫酸長春堿(vinblastinesulfate)；硫酸長春新堿(vincristinesulfate)；長春堿酰胺(vindesine)；硫酸長春堿酰胺(vindesinesulfate)；vinepidinesulfate；vinglycinatesulfate；vinleurosinesulfate；酒石酸長春瑞賓(vinorelbinetartrate)；vinrosidinesulfate；vinzolidinesulfate；伏氯吐(vorozole)；增尼鉑(zeniplatin)；凈司他丁(zinostatin)；鹽酸索羅比星(zorubicinhydrochloride)。其它抗癌藥物包括，但是不限于20-epi-1，25二羥維生素D3；5-乙炔基尿嘧啶；abiraterone；阿拉克霉素(aclarubicin)；acylfulvene；adecypenol；阿多來星；阿地白介素；ALL-TK拮抗劑；六甲蜜胺；氨莫司汀(ambamustine)；amidox；氨磷汀(amifostine)；氨基果糖酸(aminolevulinicacid)；氨柔比星(amrubicin)；安吖啶；阿那格雷(anagrelide)；阿那曲唑；穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide)；血管發(fā)生抑制劑；抑制劑D；抑制劑G；antarelix；抗背部化形態(tài)蛋白-1(anti-dorsalizingmorphogeneticprotein-1)；抗雄激素(antiandrogen)，前列腺癌；抗雌激素(antiestrogen)；抗腫瘤物質(zhì)(antineoplaston)；反義寡核苷酸；蚜棲菌素甘氨酸鹽(aphidicolinglycinate)；凋亡基因調(diào)節(jié)物(apoptosisgenemodulators)；凋亡調(diào)控子(apoptosisregulators)；脫嘌呤酸(apurinicacid)；ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脫氨酶；asulacrine；阿他美坦(atamestane)；阿莫司??；axinastatin1；axinastatin2；axinastatin3；阿扎西隆(azasetron)；azatoxin；azatyrosine；漿果赤霉素(baccatin)III衍生物；balanol；巴馬司他(batimastat)；BCR/ABL拮抗劑；benzochlorins；benzoylstaurosporine；β內(nèi)酰胺衍生物；β-alethine；betaclamycinB；白樺脂酸(betulinicacid)；bFGF抑制劑；比卡魯胺(bicalutamide)；比生群；二吖丙啶精胺(bisaziridinylspermine)；雙萘酰亞胺(bisnafide)；比生群A；bizelesin；breflate；bropirimine；二乙氧基雙(1-苯基-1，3-丁二酮絡(luò))鈦(budotitane)；丁胱亞磺酰亞胺(buthionineSulfoximine)；鈣泊三醇(calcipotriol)；calphostinC；喜樹堿衍生物；canarypoxIL-2；卡培他濱(capecitabine)；羧胺-氨基-三唑；羧胺氨基三唑；CaRestM3；CARN700；軟骨來源的抑制劑；carzelesin；干酪素激酶抑制劑(ICOS)；栗精胺(castanospermine)；天蠶素B(cecropinB)；cetrorelix；chlorlns；磺胺氯喹喔啉(chloroquinoxalinesulfonamide)；cicaprost；順式-卟啉；克拉屈濱(cladribine)；克羅米酚(clomifene)類似物；克霉唑(clotrimazole)；克里霉素(collismycin)A；克里霉素B；風(fēng)車子抑堿(combretastatin)A4；風(fēng)車子抑堿類似物；conagenin；crambescidin816；那托；cryptophycin8；cryptophycinA衍生物；curacinA；cyclopentanthraquinones；cycloplatam；cypemycin；cytarabineocfosfate；細胞毒素因子；cytostatin；dacliximab；地西他濱(decitabine)；去氫膜海鞘素(dehydrodidemnin)B；deslorelin；地塞米松(dexamethasone)；dexifosfamide；右旋丙亞胺(dexrazoxane)；dexverapamil；diaziquone；膜海鞘素B；didox；二乙基正精胺(diethylnorspermine)；二氫-5-氮雜胞苷；dihydrotaxol，9-；dioxamycin；聯(lián)苯螺氮芥(diphenylspiromustine)；多西紫杉醇(docetaxel)；二十二烷醇(docosanol)；多拉司瓊(dolasetron)；去氧氟尿苷(doxifluridine)；屈洛昔芬(droloxifene)；dronabinol；duocarmycinSA；ebselen；ecomustine；edelfosine；edrecolomab；二氟甲基鳥氨酸(eflornithine)；欖香烯(elemene)；emitefur；表柔比星(epirubicin)；愛普列特(epristeride)；雌莫司汀(estramustine)類似物；雌激素激動劑(estrogenagonists)；雌激素拮抗劑；etanidazole；磷酸依托泊苷(etoposidephosphate)；依西美坦(exemestane)；fadrozole；fazarabine；fenretinide；非格司亭(filgrastim)；非那雄胺(finasteride)；flavopiridol；flezelastine；fluasterone；氟達拉濱(fludarabine)；fluorodaunorunicinhydrochloride；forfenimex；福美坦(formestane)；fostriecin；福莫司汀(fotemustine)；替沙林釓(gadoliniumtexaphyrin)；硝酸鎵(galliumnitrate)；galocitabine；ganirelix；明膠酶抑制劑；吉西他濱(gemcitabine)；谷胱甘肽抑制劑；hepsulfam；heregulin；六亞甲基二乙酰胺(hexamethylenebisacetamide)；金絲桃素(hypericin)；ibandronicacid；伊達比星(idarubicin)；吲哚昔酚(idoxifene)；idramantone；ilmofosine；ilomastat；咪唑吖啶酮(imidazoacridones)；咪喹莫特(imiquimod)；免疫刺激肽；胰島素樣生長因子-1受體抑制劑；干擾素激動劑；干擾素；白介素；iobenguane；吲哚阿霉素(iododoxorubicin)；依波米醇(ipomeanol)，4-；iroplact；伊索拉(irsogladine)；異孟加唑(isobengazole)；isohomohalicondrinB；itasetron；jasplakinolide；kahalalideF；lamellarin-Ntriacetate；蘭瑞肽(lanreotide)；leinamycin；雷諾格拉斯蒂姆(lenograstim)；硫酸蘑菇多糖(lentinansulfate)；leptolstatin；來曲唑(letrozole)；白血病抑制因子；白細胞α干擾素；亮丙瑞林(leuprolide)+雌激素+孕酮；抑那通(leuprorelin)；左旋咪唑(levamisole)；利阿唑(liarozole)；線性多胺類似物；親脂性二糖肽；親脂性鉑化合物；lissoclinamide7；洛鉑(lobaplatin)；蚯蚓磷脂(lombricine)；lometrexol；lonidamine；losoxantrone；洛伐他汀(lovastatin)；loxoribine；lurtotecan；lutetiumtexaphyrin；lysofylline；細胞溶解肽(lyticpeptide)；maitansine；mannostatinA；marimastat；馬丙考(masoprocol)；maspin；基質(zhì)溶素(matrilysin)抑制劑；基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑；menogaril；merbarone；meterelin；甲硫氨酸酶；滅吐靈(metoclopramide)；MIF抑制劑；米非司酮(mifepristone)；米替福新(miltefosine)；mirimostim；錯配的雙鏈RNA；異靛甲(mitoguazone)；mitolactol；絲裂菌素類似物；mitonafide；mitotoxin成纖維細胞生長因子-saporin；氟達拉濱(fludarabine)；mofarotene；莫拉司亭(molgramostim)；單克隆抗體，人絨毛膜促性腺生長激素；單磷酸類脂A+分支桿菌細胞壁sk；莫哌達醇(mopidamol)；多重藥物抗性基因抑制劑；基于多重腫瘤抑制物1的治療；芥子抗癌劑；mycaperoxideB；分枝桿菌細胞壁提取物；myriaporone；N-乙酰地那林；N-取代苯甲酰胺；那法瑞林(nafarelin)；nagrestip；納洛酮(naloxone)+戊唑辛(pentazocine)；napavin；naphterpin；nartograstim；奈達鉑(nedaplatin)；nemorubicin；奈立膦酸(neridronicacid)；中性肽鏈內(nèi)切酶(endopeptidase)；尼他胺(nilutamide)；nisamycin；氧化一氮調(diào)節(jié)物；硝基氧抗氧化劑；nitrullyn；06-苯基鳥嘌呤；奧曲肽(octreotide)；okicenone；寡核苷酸；奧那司酮(onapristone)；恩丹西酮(ondansetron)；恩丹西酮(ondansetron)；oracin；口腔細胞因子誘導(dǎo)物；歐瑪鉑(ormaplatin)；osaterone；奧沙利鉑(oxaliplatin)；oxaunomycin；紫杉醇(paclitaxel)；紫杉醇類似物；紫杉醇衍生物；palauamine；palmitoylrhizoxin；帕米膦酸(pamidronicacid)；人參炔三醇(panaxytriol)；panomifene；parabactin；pazelliptine；培門冬酰胺酶(pegaspargase)；peldesine；戊聚糖多硫酸納(pentosanpolysulfatesodium)；噴司他丁(pentostatin)；pentrozole；全氟碳(perflubron)；perfosfamide；紫蘇醇(perillylalcohol)；phenazinomycin；乙酸苯酯(phenylacetate)；磷酸酶抑制劑；溶血性結(jié)核菌素(picibanil)；鹽酸匹魯卡品(pilocarpinehydrochloride)；吡柔比星(pirarubicin)；哌利特森(piritrexim)；placetinA；placetinB；血漿酶原激活抑制劑；鉑復(fù)合物；鉑化合物；鉑-三胺復(fù)合物；光卟啉鈉(porfimersodium)；甲基絲裂霉素；強的松(prednisone)；丙基二-吖啶酮；前列腺素J2；蛋白酶體抑制劑；蛋白A免疫調(diào)節(jié)戊；蛋白激酶C抑制劑；蛋白激酶C抑制劑，microalgal；蛋白磷酸酪氨酸抑制劑；嘌呤核苷酸磷酸化酶抑制劑；羥基茜草素(purpurin)；pyrazoloacridine；吡哆氧化血色素多聚氧乙烯偶聯(lián)物(pyridoxylatedhemoglobinpolyoxyethyleneconjugate)；raf拮抗劑；raltitrexed；雷莫司瓊(ramosetron)；ras法呢基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑；ras抑制劑；ras-GAP抑制劑；去甲基化retelliptine；錸Re186依替膦酸鈉(etidronate)；rhizoxin；核糖酶(ribozymes)；RII酰胺；洛替密特(rogletimide)；rohitukine；羅莫肽(romurtide)；roquinimex；rubiginoneB1；ruboxyl；safingol；saintopin；SarCNU；肉芝軟珊瑚醇(sarcophytol)A；sargramostim；Sdi1模擬物；司莫司汀(semustine)；老化來源的抑制劑1；有義寡核苷酸；信號傳導(dǎo)抑制劑；信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)物；單鏈抗原結(jié)合蛋白；sizofiran；索布佐生(sobuzoxane)；sodiumborocaptate；苯基乙酸鈉；solverol；生長調(diào)節(jié)素(somatomedin)結(jié)合蛋白；sonermin；sparfosicacid；spicamycinD；spiromustine；splenopentin；spongistatin1；角鯊胺(squalamine)；干細胞抑制劑；干細胞分化抑制劑；stipiamide；基質(zhì)分解素(stromelysin)抑制劑；sulfinosine；超活性的血管活性的腸道肽拮抗劑；suradista；蘇拉明(suramin)；苦馬豆素(swainsonine)；合成的粘多糖；tallimustine；甲碘他莫西芬(tamoxifenmethiodide)；?；悄窘?tauromustine)；他扎羅汀(tazarotene)；tecogalansodium；替加氟(tegafur)；tellurapyrylium；端粒酶抑制劑；替莫泊芬(temoporfin)；替莫唑胺(temozolomide)；替尼泊甙(teniposide)；四氯十氧化物(tetrachlorodecaoxide)；tetrazomine；厚果唐松草堿(thaliblastine)；thiocoraline；血小板生成素(thrombopoietin)；血小板生成素模擬物；thymalfasin；促胸腺生成素(thymopoietin)受體激動劑；胸腺曲南(thymotrinan)；甲狀腺刺激素；乙基錫初紫紅素(tinethyletiopurpurin)；替拉扎明(tirapazamine)；茂鈦烯二氯化物(titanocenebichloride)；托普西汀(topsentin)；托瑞米芬(toremifene)；全能干細胞因子；翻譯抑制劑；維甲酸(tretinoin)；三乙酰尿苷(triacetyluridine)；triciribine；三甲曲沙(trimetrexate)；曲普瑞林(triptorelin)；托烷司瓊(tropisetron)；turosteride；酪氨酸激酶抑制劑；tyrphostins；UBC抑制劑；百士欣(ubenimex)；泌尿生殖腔來源的生長抑制因子；尿激酶受體拮抗劑；奧曲肽(vapreotide)；variolinB；載體系統(tǒng)，紅血球基因治療；velaresol；veramine；verdins；維替泊芬(verteporfin)；長春瑞濱(vinorelbine)；vinxaltine；vitaxin；伏氯吐(vorozole)；zanoterone；zeniplatin；zilascorb；和凈司他丁刺激物(zinostatinstimalamer)。優(yōu)選的其它抗癌藥物為5-氟尿嘧啶和甲酰四氫葉酸。這兩種試劑在使用沙利度胺(thalidomide)和拓撲異構(gòu)酶抑制劑的方法中是特別有用的?？捎糜诒景l(fā)明的方法中的其它抗癌試劑包括，用于治療、控制和預(yù)防致瘤性疾病的草藥、草藥提取物或者中藥。這些方案可以與本發(fā)明的載體組合用于癌癥治療。5.3.4基因治療本發(fā)明提供用于治療或預(yù)防癌癥和腫瘤的方法，包括施用本發(fā)明的編碼血管抑制素或B7.1的核酸分子。在特定的實施方案中，通過基因治療，施用包含編碼血管抑制素或B7.1的序列的核酸分子來治療或預(yù)防癌癥?；蛑委熓侵竿ㄟ^將被表達或可表達的核酸施用給受治療者而實施的治療。在本發(fā)明的實施方案中，核酸分子產(chǎn)生調(diào)節(jié)預(yù)防性或治療性作用的編碼蛋白。按照本發(fā)明，可以使用本領(lǐng)域可獲得的任何用于基因治療的方法。示例性的方法將在下文中被描述。對于基因治療方法的總體回顧，參見Goldspiel等人，1993，ClinicalPharmacy12488-505；Wu和Wu，1991，Biotherapy387-95；Tolstoshev，1993，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32573-596；Mulligan，1993，Science260926-932；以及Morgan和Anderson，1993，Ann.Rev.Biochem.62191-217；May，1993，TIBTECH11(5)155-215)?？梢允褂玫腄NA重組
技術(shù)領(lǐng)域：
通常所知的方法被描述在Ausubel等人(編輯)，1993，CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons，NY；和Kriegler，1990，GeneTransferandExpression，ALaboratoryManual，StocktonPress，NY中。在一個方面中，將包含本發(fā)明的核酸分子的組合物施用給合適的宿主，該核酸分子在表達載體中含有編碼血管抑制素或B7.1的核酸序列。編碼血管抑制素或B7.1的核酸序列的表達可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的任何可誘導(dǎo)的、組成型的或組織特異性的啟動子來調(diào)控。在特定實施方案中，被導(dǎo)入用于基因治療的核酸包含被可操作地連接到編碼區(qū)上的可誘導(dǎo)啟動子，使得核酸表達可以通過控制適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄誘導(dǎo)物的存在或缺失來調(diào)控。在特定的實施方案中，編碼血管抑制素或B7.1的核酸分子與在基因組的期望位點上促進同源重組的區(qū)域側(cè)面連接，從而導(dǎo)致在染色體內(nèi)表達所述編碼區(qū)(Koller和Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA868932-8935；Zijlstra等人，1989，Nature342435-438)。將核酸呈遞給患者可以是直接的，在這種情況下，患者被直接暴露于核酸分子或者攜帶核酸分子的載體，或者是間接的，在這種情況下，首先在體外用核酸分子轉(zhuǎn)化細胞，然后將細胞移植給患者。這兩種方法分別被稱作為體內(nèi)的或離體的基因治療。在特定的實施方案中，直接體內(nèi)施用核酸分子，核酸分子被表達產(chǎn)生編碼產(chǎn)物。這可以通過本領(lǐng)域知曉的大量方法中的任何一種來實現(xiàn)，例如，通過將它們構(gòu)建成為適當(dāng)?shù)暮怂岜磉_載體的一部分，施用載體使它們進入細胞內(nèi)，例如通過用缺陷型或減毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它病毒性載體進行感染(參見美國專利4,980,286)，或者通過直接注射裸DNA或者通過使用微粒轟擊(例如，基因槍Biolistic，Dupont)，或者用脂質(zhì)或者細胞表面受體或轉(zhuǎn)染試劑包被，封裝在脂質(zhì)體、微?；蛘呶⒛z囊中，或者將它們與已知會進入細胞核的肽相連來施用，或者將它們與會發(fā)生受體介導(dǎo)的細胞內(nèi)吞的配體相連來施用(參見例如Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.2624429-4432)(這可以用于靶向特異性表達受體的細胞類型)等。在另一個實施方案中，形成核酸-配體復(fù)合物，其中配體包含融合基因病毒性肽，以破壞內(nèi)涵體，使核酸分子免受溶酶體的降解。在還有另一個實施方案中，通過靶向特定受體，在體內(nèi)將核酸分子靶向特定的細胞攝取和表達(參見例如，1992年4月16日申請的PCT公開WO92/06180(Wu等人)；1992年12月23日申請的WO92/22635(Wilson等人)；1992年11月26日申請的WO92/20316(Findeis等人)；1993年7月22日申請的WO93/14188(Clarke等人)，1993年10月14日申請的WO93/20221(Young))。可替代地，將核酸分子導(dǎo)入細胞內(nèi)，通過同源重組與宿主細胞DNA結(jié)合來表達(KollerandSmithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA868932-8935；Zijlstra等人，1989，Nature342435-438)。在特定實施方案中，用病毒性載體來表達核酸序列。例如，可以使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(參見Miller等人，1993，Meth.Enzymol.217581-599)。這些逆轉(zhuǎn)錄載體刪除了不是病毒基因組的包裝所必需的逆轉(zhuǎn)錄病毒序列，并且整合到宿主細胞DNA中。用于基因治療中的編碼核酸序列的核酸分子被克隆到一個或多個載體中，以便將基因呈遞到患者中。對逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的更加詳細的描述可見Boesen等人，1994，Biotherapy6291-302，其中描述了使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體來將mdrl基因呈遞到造血干細胞中，使干細胞對化學(xué)治療有更高的抵抗性。闡述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在基因治療中的用途的其它參考文獻是Clowes等人，1994，J.Clin.Invest.93644-651；Kiem等人，1994，Blood831467-1473；Salmons和Gunzberg，1993，HumanGeneTherapy4129-141；以及Grossman和Wilson，1993，Curr.Opin.inGeneticsandDevel.3110-114。腺病毒是可用于基因治療的其它病毒性載體。對于將基因呈遞到呼吸道上皮細胞中來說，腺病毒是特別有吸引力的載體。腺病毒天然地感染呼吸道上皮細胞，引起輕微的疾病。腺病毒呈遞系統(tǒng)的其它靶點是肝臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)皮細胞和肌肉。腺病毒具有優(yōu)點，能夠感染未分化的細胞。Kozarsky和Wilson，1993，CurrentOpinioninGeneticsandDevelopment3499-503中綜述了腺病毒基因治療。Bout等人，1994，HumanGeneTherapy53-10證明了，使用腺病毒載體可將基因轉(zhuǎn)移到恒河猴的呼吸道上皮細胞中。在基因治療中使用腺病毒的其它例子可參見Rosenfeld等人，1991，Science252431-434；Rosenfeld等人，1992，Cell68143-155；Mastrangeli等人，1993，J.Clin.Invest.91225-234；PCT公開WO94/12649；以及Wang，等人，1995，GeneTherapy2775-783。在優(yōu)選實施方案中，使用腺病毒載體。腺伴隨病毒(AAV)也被建議用于基因治療(Walsh等人，1993，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204289-300；美國專利5,436,146)。用于本發(fā)明的最優(yōu)選的病毒載體為腺伴隨病毒(AAV)載體。AAV載體會引起在腸道上皮細胞和肝細胞中持續(xù)(＞6個月)表達轉(zhuǎn)基因，導(dǎo)致在糖尿病動物模型中的長期表型恢復(fù)(Xu，RA等人，2001，Perarollytransductionofdiffusecellsandhepatocyteinsulinleadingtoeuglycemiaindiabeticrats，MolTher3S180；During，MJ等人，1998，Perarollygenetherapyoflactoseintoleranceusinganadeno-associatedvirusvector，NatureMed.41131-1135；DuringMJ等人，2000，AnoralvaccineagainstNMDAR1withefficacyinexperimentalstrokeandepilepsy，Science2871453-1460)。AAV是細小病毒家族的一種非致病性的、依賴于輔助病毒的成員，具有幾個主要優(yōu)點，例如穩(wěn)定整合、低免疫原性、長期表達，并且能夠感染分化的和未分化的細胞。其能夠在大部分末期分化的組織內(nèi)引導(dǎo)長期的轉(zhuǎn)基因表達，而不會對宿主產(chǎn)生毒性，并且也不會對轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞產(chǎn)生細胞免疫反應(yīng)(PonnazhaganS等人，2001，Adeno-associatedvirusforCancerGeneTherapy，CancerRes616313-6321；LaiCC等人，2001，Suppressionofchoroidalneovascularizationbyadeno-associatedvirusvectorexpressingangiostatin，InvestOphthalmolVisSci42(10)2401-7；NguyenJT等人，1998，Adeno-associatedvirusmediateddeliveryofantiangiogenicfactorsasanantitumorstrategy，CancerResearch585673-7)。另一種基因治療方法包括通過點穿孔、脂感染、磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或者病毒感染這樣的方法將基因轉(zhuǎn)移到組織培養(yǎng)的細胞中。通常，轉(zhuǎn)移方法包括將可選擇的標記轉(zhuǎn)移到細胞中。然后將細胞置于選擇條件下來分離那些已經(jīng)攝取并且正在表達轉(zhuǎn)移基因的細胞。然后將那些細胞呈遞給患者。在一個實施方案中，在體內(nèi)施用得到的重組細胞之前，將核酸導(dǎo)入細胞中。這種導(dǎo)入可以通過本領(lǐng)域知曉的任何方法來實施，包括，但是不限于轉(zhuǎn)染、電穿孔、微注射、用含有核酸序列的病毒載體或噬菌體載體感染、細胞融合、染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、微細胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、原始質(zhì)球融合等。許多用于將外源基因?qū)爰毎募夹g(shù)在本領(lǐng)域是已知的(參見，例如Loeffler和Behr，1993，Meth.Enzymol.217599-618；Cohen等人，1993，Meth.Enzymol.217618-644；Cline，1985，Pharmac.Ther.2969-92)，并且可以被用于本發(fā)明中，只要不破壞受體細胞的必要的發(fā)育功能和生理功能。該技術(shù)應(yīng)該能夠?qū)⒑怂岱肿臃€(wěn)定地轉(zhuǎn)移到細胞中，使得包含核酸序列的核酸分子可以由細胞表達，并且優(yōu)選是可遺傳的和可以被其子代細胞表達?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的各種方法將生成的重組細胞呈遞給患者。優(yōu)選靜脈內(nèi)施用重組的血細胞(例如，造血干細胞或祖細胞)。預(yù)期所用的細胞的含量取決于期望的效果、患者狀態(tài)等，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。導(dǎo)入核酸用于基因治療目的的細胞包括任何期望的、可獲得的細胞類型，包括但是不限于上皮細胞、內(nèi)皮細胞、角質(zhì)細胞、成纖維細胞、肌肉細胞、肝細胞；血細胞如T淋巴細胞、B淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜曙紅細胞、巨核細胞、粒細胞；各種干細胞或祖細胞，特別是造血干細胞或祖細胞，例如從骨髓、臍帶血、外周血、胎兒肝臟等獲得。在優(yōu)選實施方案中，用于基因治療的細胞與患者是自體同源的。在一個實施方案中，重組細胞被用于基因治療，將編碼血管抑制素或B7.1的本發(fā)明的核酸序列導(dǎo)入細胞中，使得這些細胞或其子代可以表達這些序列，然后體內(nèi)施用重組細胞以達到治療作用。在特定實施方案中，使用干細胞或祖細胞。任何可以在體外分離和維持的干細胞和/或祖細胞都有可能被用于本發(fā)明的實施方案中(參見例如1994年4月28日申請的PCT公開WO94/08598；Stemple和Anderson，1992，Cell71973-985；Rheinwald，1980，Meth.CellBio.21A229；以及Pittelkow和Scott，1986，MayoClinicProc.61771)。5.4治療性/預(yù)防性用途的證明在人類中使用之前，優(yōu)選在體外測試本發(fā)明的組合物，然后體內(nèi)檢測期望的治療或預(yù)防活性。例如，論證組合物的治療性或預(yù)防性用途的體外分析包括，組合物對細胞系的作用，特別是對特定癌癥類型的一個探針或者患者組織樣本的作用。組合物對細胞系組織樣本的作用可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的技術(shù)來確定，包括，但是不限于玫瑰花形成分析和細胞溶解分析。特別地，肝癌細胞系、乳腺癌細胞系，例如MDA-MB-231，淋巴瘤細胞系，例如U937，和大腸癌細胞系，例如RKO，可以被用于評價編碼血管抑制素或B7.1蛋白的多核苷酸的作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的技術(shù)可以被用于測量細胞活性。例如，可以通過3H-胸苷摻入分析和臺盼蘭細胞計數(shù)來評價細胞增殖。作為檢測本發(fā)明的治療劑的治療性或預(yù)防性活性的特定例子，可以采用雞尿囊絨毛膜(CAM)分析。這是血管抑制素活性的次級的和獨立的分析。將該一日齡受精卵在水夾層培養(yǎng)箱(38℃，85％濕度)中培養(yǎng)3天。敲碎雞蛋，將具有完整卵黃的雞胚置于含有10mlRPMI-1640培養(yǎng)基的塑料培養(yǎng)皿中(38℃，85％濕度，3％CO2)。培養(yǎng)3天后，將含有抑制劑的甲基纖維素盤置于各個雞胚的CAM上。在培養(yǎng)48小時后，分析各個雞胚的CAM上的無血管條帶的形成，并拍照。以甲基纖維素盤(各個濃度為3-5個雞蛋)內(nèi)的血管區(qū)域相對于未處理的血管區(qū)域的百分比來確定血管抑制素的抑制血管作用。在另一個特定的實施方案中，可以通過計數(shù)來自用治療劑處理的受治療者的組織樣本的血管數(shù)量來評價本發(fā)明的治療劑的抑制腫瘤血管化作用，將這些組織樣本用抗內(nèi)皮細胞的特定抗體(例如抗-CD31抗體)染色，并與對照組織樣本比較。在還有另一個特定的例子中，本發(fā)明的治療劑的表達可以通過用特定探針進行原位雜交或者通過Western印跡或用特定抗體進行免疫組織化學(xué)染色來檢測。在還有另一個特定的實施方案中，本治療劑的治療性的或預(yù)防性的活性可以通過計數(shù)用TUNEL染色方法處理的組織樣本中的凋亡細胞的數(shù)量來評價(HenseyC等人，1998，ProgramcelldeathduringXenopusdevelopmentaspatio-temporalanalysis，DevBiol20336-48；Veenstra，GJ等人，1998，Non-cellautonomousinductionofapoptosisandlossofposteriorstructuresbyactivationdomain-specificinteractionsofOct-1intheXenopusembryo，CellDeathDiffer5774-84)并與對照樣本的細胞數(shù)量比較?？梢詸z測測試組合物在降低患有癌癥的患者(例如動物)的腫瘤形成的能力。還可以檢測測試組合物減輕一種或多種與癌癥伴隨的癥狀的能力。此外，可以檢測測試組合物延長患有癌癥的患者的存活期的能力。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的技術(shù)可以被用于分析檢測測試組合物在患者中的功能。在本發(fā)明的各種實施方案中，可以用于確定特定的組合物的施用是否是需要的體外分析包括體外細胞培養(yǎng)分析，其中將患者組織樣本在培養(yǎng)基中生長，并暴露于或者另外地被施用一種組合物，并觀察這種組合物對組織樣本的作用。特別地，所表達的蛋白的細胞毒性作用可以通過Promega細胞滴度96水溶性細胞增殖分析和分子探針存活/死亡細胞毒性試劑盒來評價。在人類中進行檢測之前，可以在合適的動物模型系統(tǒng)中檢測用于治療中的組合物，包括但是不限于大鼠、小鼠、雞、奶牛、猴、兔等。對于體內(nèi)分析，在施用給人之前，可以使用本領(lǐng)域知曉的任何動物模型系統(tǒng)。本發(fā)明還提供一種藥物包裹或者藥物試劑盒，包含一個或多個填裝了本發(fā)明的藥物組合物的一種或多種成分的容器。任選地與這種容器相隨的是管理生產(chǎn)商的政府部門規(guī)定的形式的告示、藥物或生物產(chǎn)品的使用或銷售，該告示反映了管理部門對制造、使用或銷售用于人施用的批準。本發(fā)明還提供可以用于上述方法中的試劑盒。在一個實施方案中，試劑盒在一個或多個容器中包含核酸分子。在特定的實施方案中，本發(fā)明的試劑盒含有用于治療、預(yù)防癌癥、病毒性感染或微生物感染的核酸分子的使用說明書。本發(fā)明通過參考詳細描述臨床試驗的如下實施例來進一步詳細說明，進行這些臨床試驗是研究本發(fā)明的三氧化砷組合物的功效和安全性。如下的實施例闡明本發(fā)明的AAV-血管抑制素載體A和AV-B7.1載體的制備和用途。這些實施例不應(yīng)被解釋為限制性的。6.實施例16.1rAAV-血管抑制素的制備在表達質(zhì)粒載體中，雞β-肌動蛋白啟動子與巨細胞病毒(CMV)增強子(CAG啟動子)(XuL.等人，CMV-beta-actinpromoterdirectshigherexpressionfromanadeno-associatedviralvectorintheliverthanthecytomegalovirusorelongationfactor1alphapromoterandresultsintherapeuticlevelsofhumanfactorXinmice.HumGeneTher.2001；12(5)563-7)、報道基因、由信號肽和第一個四個小鼠血漿酶原的kringle區(qū)的1.4-kb編碼全長小鼠血管抑制素的cDNA(SEQIDNO1)和polyA序列被使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦覆迦氲椒聪蚰┒酥貜?fù)(ITR)之間(參見附圖2)。將旱獺乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)插入到該構(gòu)建體中來增強表達水平(DonelloJ.等人，Woodchuckhepatitisviruscontainsatripartitepost-transcriptionalregulatoryelement.JVirol.1998；725085-5092；XuR.A.等人.Quantitativecomparisonofexpressionwithadeno-associatedvirus(AAV-2)brain-specificgenecassettes.GeneTher.2001；81323-1332)。用Qiagen質(zhì)粒純化試劑盒來制備質(zhì)粒。通過含有一些修飾的三個質(zhì)粒、無輔助病毒的包裝方法來制備AAV顆粒(DonelloJ.等人.1998，同上文；XiaoW.等人，RouteofadministrationdeterminesinductionofTcellindependenthumoralresponsetoadeno-associatedvirusvectors.Molaxer.2000；1(4)323-9)。采用磷酸鈣沉淀方法，用rAAV-血管抑制素和輔助病毒pFd、H22轉(zhuǎn)染293細胞。在轉(zhuǎn)染后70小時后收集細胞，并通過在存在50單位/mlBenzonase(Sigma，St.Louis，MO)時，在37℃下用0.5％脫氧膽酸酯培養(yǎng)來溶解。在以5000g離心后，用0.45-μmAcrodisc注射器濾膜過濾細胞，來去除任何顆粒的細胞物質(zhì)，用于肝素洗脫柱。通過略加改進的親合層析來分離rAAV顆粒。用100mMNaCl、1mMMgCl2和20mM磷酸氫鈉和磷酸二氫鈉緩沖液，pH7.4透析峰值的病毒餾分。用ABAppliedBiosystem對部分樣本進行定量PCR分析，以量化基因組的滴度。PCRTaqMan分析是點印跡方案，連續(xù)稀釋AAV并用DNA酶I和蛋白激酶K進行消化。用苯酚-氯仿提取病毒DNA兩次來去除蛋白質(zhì)，然后用2.5倍等體積的乙醇進行沉淀。在102到107的拷貝范圍內(nèi)建立標準擴增曲線，并獲得對應(yīng)于各個起始模板拷貝數(shù)的擴增曲線。通過商業(yè)上可獲得的分析試劑盒(Progen，Germany)來再次確認病毒顆粒。在進行動物試驗之前，將病毒載體貯存在-80℃下。6.2小鼠中的AAV-介導(dǎo)的抗血管生成的基因治療6.2.1小鼠、細胞系和抗體6-8周齡的雄性C57BL/6小鼠(H-2b)從香港大學(xué)的試驗動物單位獲得。同源的(H-2b)EL-4胸腺淋巴瘤細胞系購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，MD，USA)。將細胞培養(yǎng)在37℃下的DMEM培養(yǎng)基(GibcoBRL，GrandIsland，NY)中，該培養(yǎng)基中添加了10％胎牛血清、50U/ml青霉素/鏈霉素、2mML-谷氨酸和1mM丙酮酸?？寡獫{酶原mAb、兔多克隆抗VEGF抗體和抗CD31抗體MEC13.3分別購自Calbiochem-NovabiochemCorporation、LabVisionCorporation和Pharmingen(CA，USA)。6.2.2試驗方案所有施加給動物的手術(shù)操作和護理都遵照規(guī)定的方針。隨機地處理動物。每一組含有10只小鼠。結(jié)節(jié)和分散的腫瘤模型一致地在至少90-95％動物中形成了腫瘤。等體積的PBS和等顆粒數(shù)量的空AAV病毒或含有報道基因的AAV病毒載體作為對照。6.2.2.1肝臟結(jié)節(jié)腫瘤的誘導(dǎo)在麻醉小鼠后，通過手術(shù)暴露肝臟，用針頭或者通過門靜脈將腫瘤細胞注射到肝被膜下的肝臟的左葉中。一周后，通過門靜脈注射3×1011rAAV-血管抑制素病毒顆粒。進行止血，封閉腹腔。手術(shù)后5周，處死小鼠，切除肝臟左葉的腫瘤，用測徑器在兩個垂直直徑上進行測量(分別為a和b)。按照公式(a×b×2π)/6計算腫瘤體積，如先前所描述(AuerbachR.等人.Regionaldifferencesintheincidenceandgrowthofmousetumorsfollowingintradermalorsubcutaneousinoculation.CancerRes.1978；381739-1744)。6.2.2.2分散的肝臟轉(zhuǎn)移性腫瘤的誘導(dǎo)在麻醉小鼠后，通過手術(shù)暴露脾臟，并且在分離短胃血管和胃與脾臟的韌帶后，完整地將脾臟取出。首先，用30-G針頭將2×105EL4腫瘤細胞緩慢地注射到脾臟中。在延遲大約5分鐘以使腫瘤細胞進入門靜脈循環(huán)后，在結(jié)扎脾臟梗莖后，實施脾臟切除手術(shù)。其次，通過門靜脈注射3×1011rAAV-血管抑制素病毒顆粒。進行止血，并封閉腹腔。手術(shù)后6周，處死小鼠并切除肝臟。然后冷凍和低溫保存肝臟來制備10μm的切片，在5個不同水平面上制備切片來覆蓋整個肝臟。封固切片，并用蘇木精和伊紅進行染色。在顯微鏡下用西格瑪軟件程序測量和檢查整個肝臟和腫瘤面積。按照公式計算腫瘤所占的相對面積(總腫瘤面積/肝臟面積)×100。6.2.2.3存活力研究如分散的肝臟轉(zhuǎn)移那樣，通過脾臟內(nèi)注射1×106EL-4腫瘤細胞，接著門靜脈內(nèi)注射3×1011AAV-血管抑制素顆粒來生成腫瘤模型。每周對動物稱重3次，并進行評價。按照預(yù)先建立的標準無痛致死垂死的小鼠；即存在兩個或多個如下的premoid癥狀總腹水、可觸知的大于2cm的腫瘤負擔(dān)、脫水、萎靡、瘦弱和體重下降超過起始體重的20％。6.3.免疫組織分析在門靜脈AAV灌注后，將由肝臟或腫瘤制備的冰凍切片(10μm)與特定抗體一起培養(yǎng)過夜。隨后，用適當(dāng)?shù)牡诙贵w(VECTASTAINOUniversalQuickkit，VectorLaboratories，Burlingame，CA)培養(yǎng)切片30分鐘，并用SigmaFASTDAB(3，3′-二氨基對二氨基聯(lián)苯四鹽酸鹽)和CoCl2增強藥片(Sigma，St.Louis，MO)顯影。然后用Mayer蘇木精復(fù)染。6.4.原位雜交在4％甲醛中固定肝臟切片7分鐘，并在PBS中洗滌3分鐘，在2xSSC中洗滌10分鐘。按照原位雜交方案(Ambion，Austin)，將脫水的切片在60℃下與探針溶液雜交過夜。用4xSSC洗滌切片，并在RNA酶消化溶液中、37℃下培養(yǎng)30分鐘。然后用濃度逐漸降低的SSC，在室溫下以5分鐘的間隔緩慢攪拌來洗滌切片。然后用濃度逐漸升高的乙醇使切片脫水。通過試劑盒VECTASTAINXABC(VectorLaboratories，Burlingame，CA)和BCIP/NBT檢測雜交。6.5Western印跡處理后，切除樣本，敲碎，并在蛋白質(zhì)溶解緩沖液中進行勻漿。通過在4℃下，以10,000g離心10分鐘來去除組織或細胞碎片。匯集來自每個組小鼠的腫瘤溶解產(chǎn)物，確定蛋白質(zhì)含量。將蛋白質(zhì)樣本(100mg)溶解在10％聚丙烯酰胺SDS凝膠中，并電泳轉(zhuǎn)移到硝化纖維HybondTMC外膜上(AmershamLifeScience，England)。在用5％BSA封閉膜后，用特定的第一抗體培養(yǎng)斑點，接著與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的第二抗體一起培養(yǎng)，通過增強的化學(xué)發(fā)光來顯影(AmershamInternationalplc，England)，并暴露于X射線膜上。用SigmaScanPro軟件量化條帶濃度。6.6血管化的評價確定腫瘤血管化的方法先前已經(jīng)被描述(SunX.等人，AngiostatinenhancesB7.1-mediatedcancerimmunotherapyindependentlyofeffectsonvascularendothelialgrowthfactorexpression.CancerGeneTherapy2001；8719-727)。簡而言之，如先前描述的，將用處理后4周的肝臟結(jié)節(jié)腫瘤制備的10mm腫瘤切片用抗CD31抗體免疫染色。在放大40倍的任意選擇的5個隨機區(qū)域(0.155mm2)中計數(shù)染色的血管，計算最大的三個值的平均數(shù)。同心圓方法(HeatherE.R.等人，HIF-laisrequiredforsolidtumorformationandembryonicvascularization.EMBOJ.1998；173005-3015；Kayar等人.Evaluationoftheconcentric-circlesmethodforestimatingcapillary-tissuediffusiondistances，MicrovascularRes.1982；24342-353)也被用于評價血管化。6.7凋亡細胞的原位檢測在處理后的4周后，從腫瘤中制備6mm厚度的連續(xù)切片。用購自RocheMolecularBiochemicals，Germany的原位細胞死亡檢測試劑盒進行切片的TUNEL染色。簡而言之，將冷凍切片用4％的甲醛溶液固定，用0.1％Triton-X100和0.1％檸檬酸鈉的溶液進行透化處理，在37℃下用TUNEL試劑培養(yǎng)60min，并通過熒光顯微鏡進行檢測。相鄰的切片用蘇木精和伊紅進行反染色。計數(shù)10個隨機選擇的區(qū)域中的凋亡細胞的總數(shù)。以陽性染色細胞(即，凋亡細胞)的比例計算凋亡指數(shù)；即AI＝(凋亡細胞數(shù)量/有核細胞的總數(shù))×100。6.8統(tǒng)計分析對于腫瘤占據(jù)的腫瘤體積和相對面積，進行Kruskal-Wallis測試來檢測治療作用。對于存活力數(shù)據(jù)，進行對數(shù)排列測試來檢測治療作用。對于其它數(shù)據(jù)，結(jié)果表示為平均值±標準偏差(s.d.)，和用Student檢驗來評價統(tǒng)計顯著性。當(dāng)P小于0.05時，被認為是統(tǒng)計顯著的。6.9結(jié)果6.9.1在門靜脈灌注rAAV-血管抑制素后，血管抑制素在肝臟中長期而持續(xù)地表達rAAV的主要優(yōu)點之一是它能夠介導(dǎo)長期的轉(zhuǎn)基因表達。通過門靜脈注射重組rAAV-血管抑制素載體成功地阻止肝臟中外源基因的長期表達最高達到6個月。為了分析基因轉(zhuǎn)移的效率，在門靜脈注射rAAV-血管抑制素后的2天、14天、28天、60天、90天和180天收集肝臟樣本。通過免疫組織化學(xué)、原位雜交和western印跡來證實肝臟中的血管抑制素的表達。如附圖3所示，在基因轉(zhuǎn)移后的14天，已經(jīng)可以明顯地檢測到血管抑制素的原位過度表達(附圖3B)，并在基因轉(zhuǎn)移后持續(xù)180天(附圖3C)，相比之下，用空AAV(A)處理的對照的情況僅持續(xù)2天的表達。由于血管抑制素是血漿酶原的一個片段，是一種內(nèi)源性蛋白，并且可以被抗血管抑制素Ab檢測到，該結(jié)果還可以通過用DIGRNA標記試劑盒進行原位雜交來進一步證實(圖3D、3E和3F，分別對應(yīng)于圖3A、3B和3C的肝臟切片)。本發(fā)明人先前已經(jīng)報道了，經(jīng)過口內(nèi)施用AAV-胰島素載體會導(dǎo)致肝細胞中的轉(zhuǎn)基因胰島素在3個月內(nèi)逐漸升高，此后達到一個穩(wěn)定水平(Xu，RA，等人，2001，同上文；During等人，2000，同上文)。在通過門靜脈內(nèi)灌注AAV-血管抑制素的情況下，肝細胞中轉(zhuǎn)基因血管抑制素的表達在一個月內(nèi)達到高水平，在兩個月內(nèi)升高到峰值水平，然后穩(wěn)定6個月。樣本是來自在AAV-血管抑制素灌注后2天(條帶1)、14天(條帶2)、28天(條帶3)、60天(條帶4)、90天(條帶5)或180天(條帶6)切除肝臟的小鼠(參見圖4)。6.9.2對肝轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)腫瘤和分散性腫瘤的抑制為了分析門靜脈內(nèi)注射rAAV-血管抑制素在對結(jié)節(jié)肝臟腫瘤方面的治療潛力，將EL-4腫瘤細胞注射到30只小鼠的肝臟的左葉中，然后，讓每只小鼠隨機接受門靜脈內(nèi)注射PBS(n＝10)、空AAV(n＝10)或者rAAV-血管抑制素病毒(n＝10)。4周后，對所有小鼠實施肝臟切除手術(shù)。各個組中的肝臟腫瘤的體積被顯示在圖5A中。在接受PBS和空AAV的處理組中，左葉腫瘤的平均體積分別為149.2mm2和127.5mm2。這兩組之間的細微差別不具有統(tǒng)計顯著性(P＞0.05)。相反，在用AAV-血管抑制素處理的組中左葉腫瘤的平均體積僅為40.3mm2，其相對于用PBS和空AAV處理的組的腫瘤體積分別下降了72％和68％。該結(jié)果顯著區(qū)別于用PBS(P＜0.001)或空AAV(P＜0.01)處理的情況。為了分析門靜脈內(nèi)注射rAAV-血管抑制素對分散的肝臟轉(zhuǎn)移性腫瘤的治療潛力，將EL-4腫瘤細胞注射到小鼠的脾臟中(n＝30)，并實施脾臟切除手術(shù)。然后，隨機對小鼠門靜脈內(nèi)注射PBS(n＝10)、空AAV(n＝10)或rAAV-血管抑制素病毒(n＝10)。6周后，處死小鼠并取出肝臟。以橫切方式冷凍保存肝臟。腫瘤在肝臟中所占據(jù)的面積圖示在圖5B中。在PBS、空AAV和rAAV-血管抑制素組中，腫瘤在肝臟中所占據(jù)的平均相對面積分別為26.5％、24.0％和7.3％。在PBS和空AAV處理組之間沒有顯著性差別(P＞0.05)。但是，與PBS和AAV處理組相比，rAAV-血管抑制素處理導(dǎo)致腫瘤所占據(jù)的相對面積分別下降了72％和71％，說明在rAAV-血管抑制素處理組和任何對照組之間存在統(tǒng)計學(xué)上的顯著性差別(各個P＜0.001)。6.9.3rAAV-血管抑制素提高具有肝臟腫瘤轉(zhuǎn)移的小鼠的存活率進一步研究用AAV-血管抑制素處理的具有肝臟腫瘤轉(zhuǎn)移的小鼠的存活率，以探討這種處理是否會對小鼠產(chǎn)生存活益處。雖然肝內(nèi)模型能夠精確地測量腫瘤的大小，而脾內(nèi)模型更加接近地模擬臨床狀態(tài)，導(dǎo)致通過門靜脈系統(tǒng)的多發(fā)性肝臟腫瘤轉(zhuǎn)移，并且可更好地通過存活率來評價。給30只C57BL小鼠脾臟內(nèi)注射1×106EL-4腫瘤細胞，然后接受門靜脈內(nèi)注射3×1011rAAV-血管抑制素顆粒(n＝10)、PBS(n＝10)或空AAV(n＝10)，后兩種作為對照。用AAV-血管抑制素處理會導(dǎo)致對用腫瘤細胞進行脾臟攻擊的小鼠的存活產(chǎn)生深刻和統(tǒng)計學(xué)上的顯著性改善。在腫瘤細胞接種后，該組中的10只小鼠中的4只存活超過了80天，而PBS和空AAV處理組中所有小鼠都死亡。用PBA處理的小鼠的中值存活時間為25天，而用空AAV處理的小鼠的中值存活時間為29天。這兩個組之間沒有顯著性差別(P＞0.1)。但是，用AAV-血管抑制素處理的小鼠的中值存活時間為58天，這分別顯著地區(qū)別于PBS處理組和空AAV處理組的存活時間(各個P＜0.01)(參見圖5C)。6.9.4對不依賴于內(nèi)皮血管生長因子的腫瘤血管化的抑制通過門靜脈灌注AAV-血管抑制素會導(dǎo)致對肝臟結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移性腫瘤的血管化的抑制。在注射rAAV-血管抑制素后4周后，去除在肝臟左葉中建立的結(jié)節(jié)腫瘤，冷凍切成10μm的切片，并用抗CD31抗體染色。來自用PBS(A)、空AAV(B)和AAV-血管抑制素(C)處理的小鼠的示例性圖片顯示在圖6中。rAAV-血管抑制素治療導(dǎo)致腫瘤血管密度的顯著下降，即分別為用PBS和空AAV處理的腫瘤血管的約40％(各個P＜0.01)；而在用PBS和空AAV處理的腫瘤之間沒有顯著性差別(P＞0.05)(圖7A)。此外，在用rAAV-血管抑制素處理的腫瘤中，從一列點到最近的用抗CD31Ab標記的點之間的中值距離顯著地大于在用PBS或空AAV處理的腫瘤中觀察到的中值距離(各個P＜0.01)(圖7B)。盡管進行了深入研究，但是，血管抑制素的抗血管生成活性的機制仍然大部分是未知的。一些研究已經(jīng)表明血管抑制素能夠下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子的表達(KirschM.等人，1998，同上文；JoeY.A.等人，1999，同上文)。在本研究中，rAAV-血管抑制素對VEGF的表達沒有顯著的影響，并且該結(jié)果與先前的研究一致(Sun等人，2001，同上文)。但是，用VEGF特異性抗體通過Western印跡檢測的腫瘤VEGF表達表明，在用rAAV-血管抑制素處理后，VEGF的表達稍有增加(圖7C)。這可能是由于通過血管抑制素誘導(dǎo)的抗血管生成，使得環(huán)境中的腫瘤缺氧加強，這可能導(dǎo)致通過組織缺氧誘導(dǎo)因子路徑上調(diào)VEGF的表達，組織缺氧誘導(dǎo)因子是VEGF轉(zhuǎn)錄因子。類似地，Ding等人(IntratumoraladministrationofendostatinplasmidinhibitsvasculargrowthandperfusioninMca-4mammarycarcinomas，CancerRes.2001；61526-531)報道，在腫瘤內(nèi)施用內(nèi)抑制素引起VEGF和VEGF受體mRNA的原位轉(zhuǎn)錄的補償性增加。6.9.5rAAV-血管抑制素增加腫瘤細胞的凋亡但是不增加肝細胞的凋亡由于腫瘤能夠耐受營養(yǎng)素和氧氣的饑餓，作為rAAV-血管抑制素處理的結(jié)果，防止大量的血管網(wǎng)絡(luò)的形成，采用TUNEL方法通過片段DNA原位標記進行試驗來檢查如此處理的腫瘤是否發(fā)生程序性死亡。在用PBS或空AAV處理的腫瘤中檢測到少量的凋亡細胞(圖8A和8B)，而在rAAV-血管抑制素處理后，凋亡細胞的數(shù)量翻倍(附圖8C)。rAAV-血管抑制素處理組的凋亡指數(shù)(AI)分別顯著地高于用PBS(P＜0.001)和空AAV(P＜0.05)處理的組的凋亡指數(shù)(附圖9)。在用PBS和rAAV處理的組之間沒有顯著性差別。此外，如圖8A-8C中所示，幾乎所有的凋亡細胞都是腫瘤細胞，而極少的肝細胞凋亡，表明rAAV-血管抑制素的凋亡作用是高度的腫瘤細胞選擇性的，而不作用于正常的肝臟細胞。對正常的肝臟細胞不具有毒性顯然對于rAAV-血管抑制素在治療肝癌的臨床中應(yīng)用是有利的。6.10討論6.10.1rAAV介導(dǎo)的抗血管生成的治療比其它治療策略更有利定位的門靜脈呈遞rAAV表達載體到肝臟中，導(dǎo)致在肝臟細胞中持續(xù)過度表達外源性血管生成抑制劑-血管抑制素最多達6個月，并且抑制惡性肝臟轉(zhuǎn)移性腫瘤的生長。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于被稱作為腫瘤血管生成的過程對功能性血液供應(yīng)的補充，并且實際上，“血管生成表型”與許多人類固體腫瘤中的預(yù)后成負相關(guān)(FolkmanJ.Tumorangiogenesistherapeuticimplications.NEnglJMed.1971；171-14)。迄今設(shè)計的抗血管生成治療靶向了血管生成過程的不同步驟，范圍從通過過度表達抗血管生成因子來抑制血管生成分子的表達，到用內(nèi)源性血管生成抑制劑或者人工構(gòu)建的靶向配體直接靶向腫瘤內(nèi)皮細胞。在一個有爭議的報道中，在靜脈內(nèi)施用典型的血管生成抑制劑TNP-470，抑制了在Yoshida肉瘤的大鼠模型中的原發(fā)性腫瘤的生長，但是增加了淋巴結(jié)節(jié)中的轉(zhuǎn)移灶的生長(HoriK.等人.IncreasedgrowthandincidenceoflymphnodemetastasisesduetotheangiogenesisinhibitorAGM-1470.BrJCancer1997；751730-1734)。低劑量或短期施用抗血管抑制劑可能不適合于轉(zhuǎn)移性癌癥的治療。雖然，大部分迄今的潛伏期的和臨床的抗血管生成治療已經(jīng)用純化的抗血管生成因子來實施，但是，基因治療似乎比其它形式的抗血管生成治療更加有效。抗血管形成基因治療的潛在優(yōu)點是持續(xù)表達抗血管生成因子和高度定位的呈遞。盡管有這些優(yōu)點，這種治療形式的載體的開發(fā)仍然處于早期階段(ChenC.T.等人，Antiangiogenicgenetherapyforcancerviasystemicadministrationofadenoviralvectorsexpressingsecretableendostatin.HumanGeneTherapy2000；111983-96；FeldmanA.L.等人，Antiangiogenicgenetherapyofcancerutilizingarecombinantadenovirustoelevateendostatinlevelsinmice.CancerRes.2000；601503-1506)。但是，由基于腺病毒載體介導(dǎo)的抗血管生成因子的表達受到了有效的宿主免疫反應(yīng)的限制，并且由于載體的附加體性質(zhì)，該表達也是次要的。6.10.2局部呈遞AAV-血管抑制素在肝臟轉(zhuǎn)移治療中達到可能的治療功效施用組成型地表達抗血管生成的蛋白質(zhì)的載體，使得可以在循環(huán)中維持該蛋白質(zhì)，并且在小鼠中已經(jīng)證明它比注射抑制劑的間斷峰值更加有效(BlezingerP.等人1999，同上文)。設(shè)計來分別表達血管抑制素、內(nèi)抑制素和neuropilin的腺病毒顯著是低效率的(KuoC.J.等.Comparativeevaluationoftheantitumoractivityofantiangiogenicproteinsdeliveredbygenetransfer.ProcNatlAcadSciUSA2001；984605-4610)。但是，當(dāng)用內(nèi)抑制素轉(zhuǎn)染細胞，然后將細胞植入小鼠中時，腫瘤的生長完全地被抑制(FeldmanA.L.等人，Effectofretroviralendostatingenetransferonsubcutaneousandintraperitonealgrowthofmurinetumors.JNatlCancerInst.2001；931014-1020)。有關(guān)當(dāng)內(nèi)抑制素游離在循環(huán)中(低效的)和當(dāng)其被局部釋放到腫瘤病灶(tumorbed)(高效的)時的抗腫瘤功效的明顯差別的原因是不清楚的。一種可能性是系統(tǒng)性基因治療產(chǎn)生顯著高于系統(tǒng)性蛋白質(zhì)治療的血漿水平的內(nèi)抑制素。如果循環(huán)中的內(nèi)抑制素符合U型的功效曲線，那么循環(huán)中的非常高的蛋白質(zhì)濃度可能比較低的劑量更不具有抗血管生成作用。先前已經(jīng)報導(dǎo)，按照持續(xù)的靜脈內(nèi)方案來施用內(nèi)抑制素，當(dāng)劑量達到20mg/kg/天和血漿水平達到約250ng/ml的穩(wěn)定狀態(tài)時，在人BxPC3胰腺癌中引起97％的腫瘤退化(KiskerO.等人，Continuousadministrationofendostatinbyintraperitoneallyimplantedosmoticpumpimprovestheefficacyandpotencyoftherapyinamousexenografttumormodel.CancerRes.2001；617669-7674)。但是，當(dāng)以400mg/kg/天施用極高劑量的內(nèi)抑制素時，僅能抑制49％的腫瘤生長(KerbelR.等人，Clinicaltranslationofangiogenesisinhibitors.NatureReviews/cancer2002；2727-739)。雖然，這些劑量遠遠超出患者所接受的劑量，至少超出系統(tǒng)性治療的劑量，但是必須小心調(diào)整內(nèi)抑制素的血清水平，以獲得一定范圍的血液水平(Shi，W等人，2002，Adeno-associatedvirus-mediatedgenetransferofendostatininhibitsangiogenesisandtumorgrowthinvivo，CancerGeneTher.9513-521；CalvoA等人，Adenovirus-mediatedendostatindeliveryresultsininhibitionofmammaryglandtumorgrowthinC3(1)/SV40T-antigentransgenicmice.CancerRes.2002；623934-3938；IndraccoloS.等人Differentialeffectsofangiostatin，endostatinandinterferon-1genetransferoninvivogrowthofhumanbreastcancercells.GeneTher.2002；9867-878)。但是，被表達的蛋白質(zhì)在體循環(huán)中的含量不必與腫瘤中的局部含量相等，僅達到較窄范圍內(nèi)的水平。局部化的載體呈遞已經(jīng)被用于在不同基因治療條件下在腫瘤中實現(xiàn)或增加轉(zhuǎn)基因的表達(JuD.W.等人，IntratumoralinjectionofGM-CSFgeneencodedrecombinantvacciniaviruselicitspotentantitumorresponseinamurinemelanomamodel.CancerGeneTher.1997；4139-144；BassC.等人.Recombinantadenovirus-mediatedgenetransfertogenitourinaryepitheliuminvitroandinvivo.CancerGeneTher.1995；297-104；deRoosW.K.等人Isolated-organperfusionforlocalgenedeliveryefficientadenovirus-mediatedgenetransferintotheliver.GeneTher.1997；455-62；LeeS.S.等人.Intravesicalgenetherapyinvivogenetransferusingrecombinantvacciniavirusvectors.CancerRes.1994；543325-3328).。6.10.3除了抗血管生成功能外，AAV-血管抑制素能夠誘導(dǎo)腫瘤凋亡雖然一些試驗已經(jīng)證明，血管抑制素介導(dǎo)的對血管生成的抑制會引起腫瘤細胞凋亡的增加，而不直接影響腫瘤細胞的增殖率，但是，rAAV-血管抑制素誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的機制還不清楚(JoeY.A.等人，1999，同上文；TanakaT.等人，1998，同上文；GriscelliF.等人，1998，同上文)。血管抑制素對新血管化的抑制可能會限制腫瘤細胞存活因子的供應(yīng)，這些存活因子由內(nèi)皮細胞和/或體液循環(huán)提供。還證明血管抑制素會在內(nèi)皮細胞中誘導(dǎo)凋亡，內(nèi)皮細胞對于新血管形成是重要的(Clasesson-WelshL.等人.Angiostatininducesendothelialcellapoptosisandactivationoffocaladhesionkinaseindependentlyoftheintegrin-bindingmotifRGD.ProcNatlAcadSciUSA1998；955579-5583；LucasR.等人，Multipleformsofangiostatininduceapoptosisinendothelialcells.Blood1998；924730-4741)。rAAV-血管抑制素介導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的機制可能由切斷氧氣和營養(yǎng)的呈遞構(gòu)成。因此，血管抑制素可能誘導(dǎo)支持腫瘤細胞的微血管中的內(nèi)皮細胞凋亡，接著，腫瘤細胞發(fā)生凋亡。數(shù)個試驗表明，血管發(fā)生抑制劑能夠降低內(nèi)皮細胞來源的促進細胞存活的旁分泌因子的含量，從而誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。已經(jīng)報導(dǎo)，這些蛋白中至少有20種可由內(nèi)皮細胞生成，例如其中的血小板來源的生長因子(PDGF)、IL-6和結(jié)合肝素的上皮生長因子(HB-EGF)(RakJ.等人Consequencesofangiogenesisfortumorprogression，metastasisandcancertherapy.Anti-CancerDrugs1995；63-18)。旁分泌因子的生成降低部分地是由于內(nèi)皮細胞增殖被抑制(DixeliusJ.等人.Endostatin-inducedtyrosinekinasesignalingthroughtheShbadaptorproteinregulatesendothelialcellapoptosis.Blood2000；953403-3411)。還不清楚，血管生成抑制劑是否還直接降低內(nèi)皮細胞生成旁分泌因子。6.10.4AAV-介導(dǎo)的抗治療可用于預(yù)防和治療轉(zhuǎn)移性肝癌本發(fā)明提供有用的用于轉(zhuǎn)移性肝癌的抗血管生成治療的臨床應(yīng)用。通過手術(shù)(O′ReillyM.S.等人，1994，同上文)或者放射(CamphausenK.等人.Radiationtherapytoaprimarytumoracceleratesmetastaticgrowthinmice.CancerRes.2001；612207-2211)去除原發(fā)性腫瘤，會引起分散的微小的遠處的腫瘤發(fā)生血管化和快速生長。這種被稱作為“伴隨性抵抗”的現(xiàn)象如今被解釋為一個腫瘤抑制其它腫瘤中的血管發(fā)生的能力(O′ReillyM.S.等人，1994，同上文)。一些腫瘤產(chǎn)生能激活血管發(fā)生抑制劑的酶，這些抑制劑例如是血管抑制素(O′ReillyM.S.等人，1994，同上文；Camphausen，K.等人，2001，同上文)、內(nèi)抑制素(O′ReillyM.S.等人.Endostatinanendogenousinhibitorofangiogenesisandtumorgrowth.Cell1997；88277-285；WenW.等人.Thegenerationofendostatinismediatedbyelastase.CancerRes.1999；596052-6056；FelborU.等人.SecretedcathepsinLgeneratesendostatinfromCollagenXVIII.EMBOJ2000；191187-1194)和抗血管發(fā)生抗血栓素(O′ReillyM.S.等人.Antiangiogenicactivityofthecleavedconformationoftheserpinantithrombin.Science1999；2851926-1928；KiskerO.等人.Generationofmultipleangiogenesisinhibitorsbyhumanpancreaticcancer.CancerRes.2001；617298-7304)，接著，這些酶會阻止遠處的腫瘤的生長(O′ReillyM.S.等人，1997，同上文；WenW.等人，1999，同上文)?；瘜W(xué)治療是預(yù)防和處理這些微小的分散的轉(zhuǎn)移性腫瘤的最常用方法。但是，化學(xué)治療的毒性和免疫抑制特性使其臨床應(yīng)用價值降低?？寡苌芍委熗ǔＪ堑投拘缘?，并且更不太可能誘導(dǎo)獲得性藥物抗性。因此，對于具有高度患癌癥危險性的患者來說，抗血管生成抑制劑可以被用作一種預(yù)防性措施，或者作為完全手術(shù)切除原發(fā)性腫瘤后的癌癥復(fù)發(fā)的治療方法。在大鼠中進行的自然的致癌物質(zhì)誘導(dǎo)乳腺癌的示例性試驗已經(jīng)證明，內(nèi)抑制素防止乳腺癌的發(fā)生，而且與未處理的對照相比，還延長所處理的大鼠的存活(ChoykeP.L.等人.Specialtechniquesforimagingbloodflowtotumors.CancerJ.2002；8109-118)。但是，為了獲得預(yù)防性效果，必須長期和高濃度地呈遞抗血管生成試劑。7.實施例27.1方法7.1.1制備AAV-血管抑制素和AAV-B7.1采用適當(dāng)?shù)南拗菩悦?，將巨細胞病?CMV)增強子/雞β-肌動蛋白啟動子、報導(dǎo)基因、編碼由信號肽和小鼠血漿酶原的前四個kringle區(qū)組成的全長小鼠血管抑制素的1.4-kbcDNA片段或者編碼全長小鼠B7.1的1.2kbcDNA片段以及polyA序列插入到反向末端重復(fù)序列之間(參見，XuL.等人，CMV-beta-actinpromoterdirectshigherexpressionfromanadeno-associatedviralvectorintheliverthanthecytomegalovirusorelongationfactor1alphapromoterandresultsintherapeuticlevelsofhumanfactorXinmice.HumGeneTher.2001；12563-7)。旱獺乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)也被插入到該構(gòu)建體中，以增強表達水平(DonelloJ.等人.Woodchuckhepatitisviruscontainsatripartiteposttranscriptionalregulatoryelement.JVirol.1998；725085-5092；XuR.等人，Quantitativecomparisonofexpressionwithadeno-associatedvirus(AAV-2)brain-specificgenecassettes.GeneTher.2001；81323-32)。用Qiagen質(zhì)粒純化試劑盒來制備質(zhì)粒。采用稍微改進的三質(zhì)粒、無輔助病毒的包裝方法來制備AAV顆粒(XiaoW.等人.RouteofadministrationdeterminesinductionofTcellindependenthumoralresponsetoadeno-associatedvirusvectors.MolTher.2000；1323-9)。采用磷酸鈣沉淀方法，將AAV-血管抑制素和輔助病毒pFdH22轉(zhuǎn)染到293細胞中。在轉(zhuǎn)染后70小時收獲細胞，在存在50單位/mlBenzonaseX(Sigma)時，用0.5％脫氧膽鹽在37℃下培養(yǎng)30分鐘來溶解細胞。在以5,000xg離心后，用0.45μmAcrodisch注射器濾膜過濾，以除去顆粒物質(zhì)，接著在肝素柱上分餾。通過肝素親合柱層析來分離AAV顆粒。用100mMNaCl、1mMMgCl2和20mM磷酸鈉和磷酸二氫鈉，pH7.4來透析峰值病毒餾分。采用ABAppliedBiosystem對部分樣本進行定量PCR分析，來量化基因組滴度。PCRTaqman分析是一種改進的斑點印跡方法，其中連續(xù)稀釋AAV，接著用DNA酶I和蛋白激酶K消化。用苯酚-氯仿提取病毒DNA兩次，以去除蛋白質(zhì)，然后用2.5個當(dāng)量體積的乙醇進行沉淀。在102-107個拷貝的范圍內(nèi)建立標準擴增曲線，得到對應(yīng)于各個起始模板拷貝數(shù)的擴增曲線。用商品試劑盒(Progen，Germany)再次確認病毒顆粒。在進行動物試驗之前，將病毒載體存儲在-80℃下。7.1.2小鼠、細胞系和抗體6-8周齡的雄性C57BL/6小鼠(H-2b)從香港大學(xué)的試驗動物單位獲得。同源的(H-2b)EL-4胸腺淋巴瘤細胞系購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，MD，USA)。將細胞培養(yǎng)在37℃下的Dulbecco′sModifiedEaglesMedium(DMEM)(GibcoBRL，GrandIsland，NY，USA)中，該培養(yǎng)基中添加了10％胎牛血清、50U/ml青霉素/鏈霉素、2mML-谷氨酸和1mM丙酮酸?？寡芤种扑貑慰寺】贵w(mAb)和抗B7.1mAb分別購自Calbiochem-NovabiochemCorporation(Boston，MA，USA)和BDPharmingen(SanDiego，CA，USA)。7.1.3EL-4細胞的轉(zhuǎn)染以及對轉(zhuǎn)基因表達的分析將原代EL-4細胞(5×105/孔，培養(yǎng)在96-孔培養(yǎng)板中)培養(yǎng)在總體積50μl的添加了10％FCS的DMEM中，加入感染性AAV，產(chǎn)生1-500之間的MOL。在第0.5小時、1小時、2小時、6小時、12小時、24小時、48小時時收獲細胞。在用4％仲甲醛溶液固定后，用3％牛血清白蛋白(BSA)封閉細胞，并用抗B7.1抗體(Abs)培養(yǎng)。然后用熒光素-異硫氰酸酯(FITC)偶聯(lián)的第二抗體培養(yǎng)，并通過熒光顯微鏡觀察。將僅用空AAV載體轉(zhuǎn)染的細胞作為對照。7.1.4流式細胞計數(shù)在AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)后，收獲EL-4腫瘤細胞，并通過Ficoll密度梯度離心，并洗滌。在冰上，在磷酸緩沖鹽水(PBS)、4％FCS、0.1％疊氮化鈉、20mMHEPS(N-2-羥乙基哌嗪-N′-2乙磺酸)和5mM乙烯二氨基四乙酸(EDTA)，pH7.3中，用特定抗體培養(yǎng)細胞30分鐘，并洗滌。用同型對照大鼠IgG1mAb(BDPharmingen)培養(yǎng)來控制非特異性結(jié)合。僅用空AAV載體轉(zhuǎn)染的細胞作為對照。通過FACScan分析，評價轉(zhuǎn)基因的表達水平。然后將細胞作為如下所述的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的靶點，并用于動物試驗。7.1.5動物試驗給動物實施的所有手術(shù)操作和護理得到了香港大學(xué)道德委員會的批準，并且按照制定的指導(dǎo)方針進行。動物隨機地接受處理。各組含有10只小鼠。分散的腫瘤模型在至少90-95％動物中一致地產(chǎn)生了腫瘤。將等量的親本EL-4細胞和等量的空AAV病毒顆粒作為對照。7.1.5.1小鼠免疫用10％克他命/甲苯噻嗪溶液，通過腹膜內(nèi)注射來麻醉C57BL小鼠，并用Betadine溶液處理它們的腹部。右側(cè)肋下肌切口用于打開腹腔。在暴露肝門后，用30G針頭，將2×105AAV-B7.1轉(zhuǎn)染的EL-4腫瘤細胞緩慢注射到門靜脈中，通過無菌棉尖端施用器(cottontipapplicator)施加壓力，直到注射部位止血。進行止血，并封閉腹腔。4周后，在麻醉狀態(tài)下打開小鼠的腹腔，觀察肝臟表面的腫瘤。處死具有可見的腫瘤的小鼠，去除肝臟。然后冷凍保存肝臟，低溫保存以制備橫斷的10μm切片，這些切片是在5個不同的水平上制備的，以覆蓋整個肝臟。封閉切片，并用蘇木精和伊紅染色。用SigmaScan程序，在顯微鏡下測量和檢測整個肝臟和腫瘤的面積。按照如下公式計算腫瘤所占據(jù)的相對面積總體腫瘤面積/肝臟面積×100。在肝臟表面無可見腫瘤的小鼠被用于如下試驗中。7.1.5.2用親本腫瘤細胞攻擊免疫接種的小鼠通過門靜脈內(nèi)方式給來自上面試驗的、在肝臟表面無可見腫瘤的小鼠注射2×105或2×106親本EL-4腫瘤細胞，以確定是否已經(jīng)產(chǎn)生系統(tǒng)性的抗腫瘤免疫性。4周后，處死小鼠并取出肝臟。如上分析腫瘤在肝臟中所占據(jù)的相對面積。7.1.5.3抗擊免疫接種的小鼠中分散的肝癌的AAV-血管抑制素治療將用AAV-B7.1轉(zhuǎn)染的EL-4腫瘤細胞免疫接種并且沒有發(fā)現(xiàn)肝臟腫瘤的小鼠，用30G針頭門靜脈內(nèi)注射2×106親本EL-4腫瘤細胞，接著門靜脈內(nèi)灌注3×1011AAV-血管抑制素的顆粒。用無菌棉尖端施用器施加壓力，直到注射部位被止血。進行止血，并封閉腹腔。將未免疫接種的小鼠和空AAV病毒用作對照。手術(shù)后4周，處死小鼠，取出肝臟。如上所述，分析肝臟中被腫瘤占據(jù)的相對面積。7.1.5.4存活力研究將用AAV-B7.1轉(zhuǎn)染的EL-4腫瘤細胞免疫接種并且沒有發(fā)現(xiàn)肝臟腫瘤的小鼠，用30G針頭門靜脈內(nèi)注射2×106親本EL-4腫瘤細胞，接著門靜脈內(nèi)灌注3×1011AAV-血管抑制素的顆粒。用無菌棉尖端施用器施加壓力，直到注射部位被止血。進行止血，并封閉腹腔。將未免疫接種的小鼠和空AAV病毒用作對照。每周稱重3次，并評價。按照預(yù)先建立的標準，無痛處死瀕臨死亡的小鼠，即存在兩個或多個如下premoid癥狀(1)總腹水，(2)可觸知的大于2cm的腫瘤負擔(dān)，(3)脫水，(4)萎靡，(5)瘦弱，和(5)體重下降超過起始體重的20％。7.1.6組織切片的免疫組織化學(xué)將從門靜脈內(nèi)呈遞治療劑后的肝臟中制備的冷凍切片(10μm厚度)，用特異性的抗體培養(yǎng)過夜。接著，用適當(dāng)?shù)牡诙贵w(VECTASTAINDUniversalQuickkit，VectorLaboratories，Burlingame，CA)培養(yǎng)30分鐘，并用SigmaFASTTMDAB(3，3′-二氨基對二氨基聯(lián)苯四鹽酸鹽)和CoCl2增強片劑(Sigma)顯影。用Mayer的蘇木精對切片進行反染色。7.1.7Western印跡分析收獲體外感染的細胞，或者將來自小鼠的組織在蛋白質(zhì)溶解緩沖液中剝離、切碎和勻漿。4℃下，通過以10,000xg離心10分鐘來去除碎片。匯集來自每一組小鼠的溶解產(chǎn)物，并確定蛋白質(zhì)的濃度。將蛋白質(zhì)樣本(100μg)溶解在10％聚丙烯酰胺SDS凝膠中，并通過電泳轉(zhuǎn)移到硝化纖維HybondTM-C附加膜上(AmershamLifeScience，England)。在用5％BSA封閉膜后，用特定的第一抗體培養(yǎng)斑點，接著用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的第二抗體培養(yǎng)，并通過增強化學(xué)發(fā)光(AmershamInternationalplc，England)來顯影，曝光在X射線膠片上。用SigmaScanProgram量化條帶密度。7.1.8細胞毒性分析從用AAV-B7.1轉(zhuǎn)染的EL-4腫瘤細胞免疫接種并且無肝臟腫瘤的小鼠中收獲脾細胞，并在37℃下以分等級的E∶T比的EL-4靶向細胞在96孔圓底平板中進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)4小時后，收集50μl的上清液，用CytoTox96Assay試劑盒(Promega，Madison，WI，USA)測量溶解產(chǎn)物。包括用于非特異靶點和效應(yīng)細胞溶解產(chǎn)物的背景對照。在背景遞減后，用公式計算細胞溶解的百分比100×(實驗性自發(fā)的效應(yīng)靶向的自發(fā)靶點/最大的靶向的自發(fā)靶點)。7.1.9原位雜交在4％甲醛中固定肝臟切片7分鐘，在PBS中洗滌3分鐘，然后在2xSSC中洗滌10分鐘。按照已經(jīng)建立的原位雜交方法，在60℃下，用探針溶液雜交脫水切片過夜(Ambion，Austin，TX，USA)。用4xSSC洗滌切片，在37℃下在RNA酶消化溶液中培養(yǎng)30分鐘，接著在室溫下，用濃度逐漸降低的SSC洗滌5分鐘，并輕輕攪拌。用濃度逐漸升高的乙醇將切片脫水，并用VECTASTAINABC試劑盒和堿性磷酸酶色素原試劑盒(BCIP/NBT)進行雜交。7.2結(jié)果7.2.1用AAV-B7.1體外快速而有效地轉(zhuǎn)染EL-4腫瘤細胞通過流式細胞儀測量細胞表面上的B7.1的表達，分析AAV-B7.1病毒轉(zhuǎn)染親本EL-4腫瘤細胞的效率(附圖10A)，并且通過免疫組織化學(xué)(附圖10B)和Western印跡分析(附圖10C)證實。與未被轉(zhuǎn)染的親本EL-4細胞相比，用AAV-B7.1病毒轉(zhuǎn)染的EL-4細胞表達更高水平的B7.1。培養(yǎng)6小時后，80％以上用AAV-B7.1轉(zhuǎn)染的EL-4腫瘤細胞表達的B7.1的水平升高。然后，將轉(zhuǎn)染體用于如下試驗中。7.2.2在門靜脈灌注AAV后，在肝臟中持續(xù)表達血管抑制素本發(fā)明人先前已經(jīng)報導(dǎo)了，通過門靜脈注射重組的AAV-血管抑制素載體會導(dǎo)致在肝臟中長期表達外源基因(參見，2003年1月7日申請的美國在先申請60/438,449；以及XuR.等人，Long-termexpressionofangiostatinsuppresseslivermetastaticcancerinmice.Hepatology.2003；37(6)1451-60，在此完全引入作為參考)。在后一個試驗中，在門靜脈內(nèi)注射AAV-血管抑制素后14天，在肝細胞中過度表達血管抑制素蛋白，并且含量持續(xù)升高至少180天。在本試驗中，在門靜脈內(nèi)注射AAV-血管抑制素后第2、14、60和180天時收集肝臟樣本，也獲得了類似的結(jié)果?？誂AV被用作對照。通過免疫組織化學(xué)、原位雜交和Western印跡來證實血管抑制素在肝臟中表達。如附圖11中所示，通過用DIG-標記的反義WPRE原位雜交肝臟切片檢測，與用空載體對照處理的肝臟中的低內(nèi)源性含量相比(A)，在基因轉(zhuǎn)移后14天，肝細胞中顯然過度表達血管抑制素(B)。還通過肝臟切片的免疫組織化學(xué)進一步驗證在門靜脈內(nèi)注射AAV-血管抑制素后，過度表達血管抑制素(附圖11D，與附圖11C比較)。對肝臟勻漿的Western印跡分析表明，在肝細胞中表達的轉(zhuǎn)基因血管抑制素在2周內(nèi)迅速達到一個較高水平，在2個月內(nèi)升高到峰值水平，然后在一個恒定水平上被穩(wěn)定表達，直到在注射AAV-血管抑制素后至少6個月(圖11E)。7.2.3在門靜脈內(nèi)灌注的小鼠模型中，AAV-B7.1轉(zhuǎn)染刺激腫瘤特異性的溶解細胞的T細胞活性為了分析分散的肝轉(zhuǎn)移性腫瘤的形成和生長，將2×105已經(jīng)用AAV-B7.1轉(zhuǎn)染的EL-4細胞通過門靜脈內(nèi)注射到小鼠的肝臟中(n＝10)。將腫瘤形成和生長與通過門靜脈內(nèi)方式將類似數(shù)量的空載體所轉(zhuǎn)染的EL-4注射到對照小鼠中的進行比較。四周后，對全部小鼠實施剖腹手術(shù)，取出具有可見腫瘤的小鼠的肝臟。將肝臟切片，并且用SigmaScan程序測量腫瘤所占據(jù)的相對面積，如圖12A所示。用AAV-B7.1或者空AAV所轉(zhuǎn)染的EL-4細胞處理后，平均相對面積分別為22.9％和3.2％。用AAV-B7.1所轉(zhuǎn)染的EL-4細胞免疫接種導(dǎo)致腫瘤所占據(jù)的相對面積顯著(P＜0.001)減少(86％)。此外，60％的小鼠無肝臟腫瘤。在肝臟表面無可見腫瘤的小鼠被用于如下試驗。為了評價EL-4轉(zhuǎn)染體表達B7.1是否通過抗腫瘤的CTL促進腫瘤細胞分解，設(shè)計了一種體外的CTL殺死分析，其中將自通過用AAV-B7.1轉(zhuǎn)染體免疫接種治愈的腫瘤攻擊的小鼠的脾細胞與已經(jīng)用AAV-B7.1或者空AAV轉(zhuǎn)染的EL-4細胞混合。在效應(yīng)子與靶點的比例為50∶1時，相比于用空AAV轉(zhuǎn)染的EL-4細胞，抗腫瘤CTL極其顯著地(P＜0.01)殺死用AAV-B7.1轉(zhuǎn)染的EL-4細胞。因此，外源性B7.1促進抗腫瘤的CTL殺死腫瘤細胞；這種效果會被抗B7.1抗體消除(圖12B)。7.2.4由AAV-B7.1誘導(dǎo)的記憶性抗腫瘤免疫是腫瘤特異性的，并且防止隨后的腫瘤攻擊與來自接受了空AAV轉(zhuǎn)染的EL-4細胞的小鼠的脾細胞相比，來自無腫瘤的治愈小鼠的脾細胞所展示的抗腫瘤CTL活性得到了顯著增強(P＜0.01)，這些治愈小鼠在28天之前已經(jīng)以門靜脈內(nèi)方式注射了用AAV-B7.1轉(zhuǎn)染的EL-4細胞(圖13A)。通過門靜脈內(nèi)注射用AAV-B7.1轉(zhuǎn)染的EL-4細胞治愈了其腫瘤的小鼠，再次受到通過門靜脈內(nèi)注射2×105親本EL-4腫瘤細胞的攻擊。10只小鼠中僅1只中出現(xiàn)了腫瘤，表明已經(jīng)產(chǎn)生了系統(tǒng)性的抗腫瘤免疫記憶活性。相反，在所有未免疫接種的小鼠中出現(xiàn)了分散的肝臟腫瘤，腫瘤占據(jù)了十分大的面積(最高達38％)(圖13B)。7.2.5由AAV-B7.1誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫性不能阻止大負荷的親本EL-4腫瘤細胞的攻擊通過門靜脈內(nèi)方式，給用門靜脈內(nèi)注射AAV-B7.1所轉(zhuǎn)染的EL-4細胞治愈了腫瘤的小鼠注射更大量的(2×106)親本EL-4腫瘤細胞來再次攻擊它。雖然與未免疫接種的小鼠相比，在免疫接種小鼠中腫瘤所占據(jù)的平均相對面積顯著較小(P＜0.01)(圖13C)，但是在所有小鼠中觀察到腫瘤已經(jīng)轉(zhuǎn)移到肝臟中。7.2.6AAV-血管抑制素增強AAV-B7.1疫苗的治療功效將AAV-B7.1所轉(zhuǎn)染的EL-4腫瘤細胞(2×105)通過門靜脈內(nèi)注射到小鼠的肝臟中。四周后，對這些免疫接種的小鼠實施剖腹手術(shù)，以觀察可見的肝臟腫瘤。從試驗中排除具有可見的肝臟腫瘤的小鼠。通過門靜脈內(nèi)方式給所有無腫瘤的小鼠注射2×106EL-4親本細胞，接著門靜脈內(nèi)注射空AAV(n＝10)或者AAV-血管抑制素(n＝10)。給作為對照的未免疫接種的小鼠門靜脈內(nèi)注射2×106親本EL-4細胞，接著注射AAV(n＝10)或者AAV-血管抑制素(n＝10)。四周后處死小鼠，切除肝臟，并將肝臟橫斷切片。腫瘤在肝臟中所占據(jù)的相對面積被圖示在圖14A中。在接受空AAV或者AAV-血管抑制素的未被免疫接種的小鼠中，平均相對腫瘤面積分別為42.3％和17.7％。因此，根據(jù)本發(fā)明人的先前報導(dǎo)，AAV-血管抑制素顯著地抑制了56％的已經(jīng)轉(zhuǎn)移到肝臟的腫瘤生長(XuR.等人.Long-termexpressionofangiostatinsuppresseslivermetastaticcancerinmice.Hepatology.2003；37(6)1451-60)。用AAV-B7.1所轉(zhuǎn)染的EL-4細胞進行免疫接種也顯著地抑制了38％的腫瘤的生長，使得肝臟中26.2％被腫瘤占據(jù)，而在未被免疫接種的小鼠中，肝臟中的42.3％被腫瘤占據(jù)。在用AAV-B7.1所轉(zhuǎn)染的EL-4細胞免疫接種并用AAV-血管抑制素處理的小鼠中，肝臟腫瘤所占據(jù)的平均相對面積僅為5.6％，并且僅50％(5/10)的小鼠具有可見的肝臟腫瘤。與用空AAV處理的未免疫接種的小鼠相比，肝臟腫瘤所占據(jù)的相對面積減少了87％，與用AAV-B7.1所轉(zhuǎn)染的EL-4細胞免疫接種和用空AAV處理的小鼠相比，減少了79％，與用AAV-血管抑制素處理的未免疫接種的小鼠相比，減少了68％。7.2.7AAV-B7.1和AAV-血管抑制素在提高具有肝臟轉(zhuǎn)移性腫瘤的小鼠的存活率中起協(xié)同作用本發(fā)明人還研究了通過用AAV-B7.1所轉(zhuǎn)染的EL-4細胞免疫接種后用AAV-血管抑制素進行治療產(chǎn)生的協(xié)同作用是否會對小鼠存活有益。給C57BL/6小鼠門靜脈內(nèi)注射2×105AAV-B7.1所轉(zhuǎn)染的EL-4腫瘤細胞。四周后，對小鼠實施剖腹手術(shù)。從試驗中排除在肝臟中具有可見腫瘤的小鼠。給無腫瘤的所有小鼠門靜脈內(nèi)注射2×106EL-4親本細胞，接著門靜脈內(nèi)注射3×1011空AAV顆粒(n＝10)，或者3×1011AAV-血管抑制素顆粒(n＝10)。給作為對照的未被免疫接種的小鼠通過門靜脈內(nèi)注射2×106EL-4親本細胞，接著門靜脈內(nèi)注射3×1011空AAV顆粒(n＝10)，或者3×1011AAV-血管抑制素顆粒(n＝10)。與用空AAV處理的未被免疫接種的小鼠相比，用AAV-B7.1所轉(zhuǎn)染的EL-4細胞免疫接種和用AAV-血管抑制素進行治療都使小鼠的存活率顯著提高。此外，組合治療獲得了統(tǒng)計學(xué)上更高的存活率。組合治療組中的10只小鼠中的6只在接種腫瘤細胞后存活超過100天(圖14B)。用AAV-B7.1所轉(zhuǎn)染的EL-4相比，免疫接種并且用空AAV處理的小鼠的中值存活時間或者用AAV-血管抑制素處理的未被免疫接種的小鼠的存活時間分別為33天和42天，分別顯著地(P＜0.05或P＜0.01)區(qū)別于用空AAV處理的未免疫接種的對照小鼠的25天的中值存活時間(附圖14B)。7.3討論許多最常見的癌癥轉(zhuǎn)移到肝臟。大部分患者死于含有多種主要存在于肝臟中的轉(zhuǎn)移性酶的結(jié)腸直腸癌和乳腺癌。臨床效果需要靶向所有肝臟轉(zhuǎn)移性腫瘤的系統(tǒng)性或局部的治療(TadaH.等人，SystemicIFN-βgenetherapyresultsinlong-termsurvivalinmicewithestablishedcolorectallivermetastases.JClinInvest.2001；10883-95)。對本研究的推動力源于先前的報導(dǎo)，在該報導(dǎo)中，本發(fā)明人證明大腫瘤的免疫抗性可以通過組合B7.1介導(dǎo)的免疫治療和通過基因轉(zhuǎn)移呈遞血管抑制素對腫瘤血管的協(xié)同攻擊來克服(SunX.等人.CancerGeneEher.2001；8719-727)，而在另一個報導(dǎo)中，本發(fā)明人證明，門靜脈內(nèi)灌注編碼小鼠血管抑制素的重組AAV載體會導(dǎo)致在肝臟中長期和穩(wěn)定地表達血管抑制素，并顯著地抑制轉(zhuǎn)移性肝臟腫瘤(XuR.同上文)。但是，采用AAV-血管抑制素的抗血管發(fā)生的治療不能夠根除轉(zhuǎn)移性肝臟治療，這大概是由于雖然抗血管生成蛋白質(zhì)對于誘導(dǎo)治療退化是有效的，但是它們不是直接殺死腫瘤的，因此，一旦停止處理，常常再次發(fā)生腫瘤再生。為了擴大與免疫治療和抗血管發(fā)生治療結(jié)合的癌癥基因治療的范圍，本發(fā)明人采用AAV技術(shù)來呈遞血管抑制素和共刺激分子B7.1。本研究首次證明，局部門靜脈內(nèi)呈遞AAV-B7.1所轉(zhuǎn)染的EL-4細胞會誘導(dǎo)記憶性抗腫瘤免疫性，這使被免疫接種的小鼠具有抵抗被親本EL-4細胞攻擊的能力。組合門靜脈內(nèi)灌注AAV-B7.1所轉(zhuǎn)染的EL-4細胞和AAV血管抑制素能夠根除所建立的肝臟轉(zhuǎn)移性腫瘤。由于依賴于B7的共刺激信號在T細胞激活中起重要作用，已經(jīng)提出許多腫瘤類型的免疫原性的缺乏是由于缺乏B7表達(ChenL.等人，CostimulationofantitumorimmunitybytheB7counterreceptorfortheTlymphocytemoleculesCD28andCTLA-4.Cell.1992；711093-102；BaskarS.等人，ConstitutiveexpressionofB7restoresimmunogenicityoftumorcellsexpressingtruncatedmajorhistocompatibilitycomplexclassIImolecules.ProcNatlAcadSciUSA.1993；90(12)5687-90)。實際上，已經(jīng)證明，B7.1基因轉(zhuǎn)染到不同的實驗性小鼠腫瘤中，極大地提高了它們的免疫原性(ChenL.等人，同上文；BaskarS.等人，同上文)。B7-1和B7-2轉(zhuǎn)染到免疫原性的腫瘤細胞中，使得這種細胞具有呈遞其腫瘤抗原和生成抗腫瘤CTL的能力，當(dāng)轉(zhuǎn)染體被注射到動物中時，防止了腫瘤的發(fā)生。相反，免疫系統(tǒng)仍然完全不識別親本的未被轉(zhuǎn)染的腫瘤細胞，這些細胞無限制地生長(ChenL.等人，CostimulationofantitumorimmunitybytheB7counterreceptorfortheTlymphocytemoleculesCD28andCTLA-4.Cell.1992；711093-102；TownsendS.E.等人，TumorrejectionafterdirectcostimulationofCD8+TcellsbyB7-transfectedmelanomacells.Science1993；259368-370；BaskarS.等人，ConstitutiveexpressionofB7restoresimmunogenicityoftumorcellsexpressingtruncatedmajorhistocompatibilitycomplexclassIImolecules.ProcNatlAcadSciUSA.1993；90(12)5687-90)。已經(jīng)證明，小鼠B7-1和B7-2的腫瘤內(nèi)基因轉(zhuǎn)移能夠根除已經(jīng)建立的腫瘤，已經(jīng)顯示這種轉(zhuǎn)移共同刺激由CD8+T細胞和NK細胞介導(dǎo)的抗腫瘤活性，伴隨著與穿孔素和Fas-配體路徑相關(guān)的增強的腫瘤特異性的溶解細胞的T細胞活性(SunX.CancerGeneTher.2001；8719-727；KanwarJ.R.等人，GeneTherapy1999；61835-1844；SunX.等人，GeneTher2001；8638-645；KanwarJ.R.等人，EffectofsurvivingantagonistsonthegrowthofestablishedtumorsandB7.1immunogenetherapy.JNatlCancerInst.2001；931541-1552)。用于本研究的AAV介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)是有利的，其能夠快速在體外轉(zhuǎn)染EL-4腫瘤細胞，因此將EL-4細胞轉(zhuǎn)化為一種疫苗，該疫苗被用于免疫接種小鼠。被免疫接種的小鼠抵抗親本EL-4細胞的攻擊，表明產(chǎn)生了抗腫瘤的免疫性。本研究的關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)是，血管抑制素和B7.1-免疫治療在根除轉(zhuǎn)移到肝臟中的腫瘤中起協(xié)同作用。相比之下，用AAV-B7.1所轉(zhuǎn)染的EL-4細胞進行免疫接種或者使用AAV-血管抑制素單一治療都不能有效地清除轉(zhuǎn)移到肝臟中的腫瘤。通過組合治療治愈的并且用活的親本EL-4細胞再次攻擊的小鼠保持無腫瘤至少2個月，表明已經(jīng)產(chǎn)生了有效的系統(tǒng)性的抗腫瘤的免疫性。局部載體呈遞已經(jīng)被用于在腫瘤中特異性地靶向轉(zhuǎn)基因表達(BassC.等人，Rcombinantadenovirus-mediatedgenetransfertogenitourinaryepitheliuminvitroandinvivo.CancerGeneTher.1995；297-104；deRoosW.K.等人，Isolated-organperfusionforlocalgenedeliveryefficientadenovirus-mediatedgenetransferintotheliver.GeneTher.1997；455-62；LeeS.S.等人，Intravesicalgenetherapyinvivogenetransferusingrenconbinantvacciniavirusvectors.CancerRes.1994；543325-3328)。雖然，在許多臨床條件下，系統(tǒng)性的載體呈遞可能是最優(yōu)選的，但肝臟的獨特解剖學(xué)特征使得基因治療方法對于不可切除的肝臟轉(zhuǎn)移性腫瘤來說是便捷的(deRoos等人，同上文)。局部載體呈遞的優(yōu)點是顯然的，其能夠原位誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)的高水平表達，以產(chǎn)生有效的抗腫瘤活性，并且相對于系統(tǒng)性呈遞來說，降低了副作用發(fā)生的可能性。在此描述的組合基因治療方法，采用共刺激分子B7.1和血管發(fā)生抑制劑血管抑制素，導(dǎo)致在肝細胞中持續(xù)過度表達外源的血管抑制素最長達6個月，并且抑制已經(jīng)轉(zhuǎn)移到肝臟中的淋巴瘤的生長。對于通常難以治療的肝臟癌癥治療來說，該結(jié)果具有重要的意義。8.等同物僅采用常規(guī)試驗，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會認識到或者能夠確定，在此描述的本發(fā)明的特定實施方案的許多等同物。這些等同物被包括在如下的權(quán)利要求書中。在本說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請在此引入作為參考，其程度與每個獨立的出版物或?qū)＠暾埍幻鞔_而分別地指明引入作為參考一樣。在此對參考文獻的引用或者討論不應(yīng)被解釋為認同它們?yōu)楸景l(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。序列表<110>Xu，RuianSun，XueyingFan，Sheung-TatKung，Hsiang-FuKrissensan，GeoffreyFung，Peter<120>用血管抑制素協(xié)同加強腺伴隨病毒介導(dǎo)的B7.1免疫接種以根除擴散的肝轉(zhuǎn)移性腫瘤<130>9661-048-999<140>將要被指定<141><150>60/438,449<151>2003-01-07<160>6<170>FastSEQforWindowsVersion4.0<210>1<211>1401<212>DNA<213>小鼠<220><221>CDS<222>(1)...(1401)<223>小鼠血管抑制素<400>1atggaccataaggaagtaatccttctgtttctcttgcttctgaaacca48MetAspHisLysGluValIleLeuLeuPheLeuLeuLeuLeuLysPro151015ggacaaggggactcgctggatggctacataagcacacaaggggcttca96GlyGlnGlyAspSerLeuAspGlyTyrIleSerThrGlnGlyAlaSer202530ctgttcag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動子的核酸分子，該CAG啟動子被可操作地連接到編碼血管抑制素的核酸序列上，其中該CAG啟動子包含巨細胞病毒增強子和β-肌動蛋白啟動子。18.一種治療或預(yù)防需要治療或預(yù)防癌癥的受治療者中癌癥的方法，所述方法包括給所述受治療者施用治療有效量的包含腺伴隨病毒載體和CAG啟動子的核酸分子，CAG啟動子被可操作地連接到編碼B7.1的核酸序列上，其中CAG啟動子包含巨細胞病毒增強子和β-肌動蛋白啟動子。19.一種治療或預(yù)防需要治療或預(yù)防癌癥的受治療者中的癌癥的方法，所述方法包括給所述受治療者施用治療有效量的包含腺伴隨病毒載體和CAG啟動子的核酸分子，該CAG啟動子被可操作地連接到(a)SEQIDNO1的核苷酸序列；或者(b)編碼SEQIDNO2的氨基酸序列的核苷酸序列上，其中CAG啟動子包含巨細胞病毒增強子和β-肌動蛋白啟動子。20.一種治療或預(yù)防需要治療或預(yù)防癌癥的受治療者中的癌癥的方法，所述方法包括給所述受治療者施用治療有效量的包含腺伴隨病毒載體和CAG啟動子的核酸分子，該CAG啟動子被可操作地連接到(a)SEQIDNO3的核苷酸序列；或者(b)編碼SEQIDNO4的氨基酸序列的核苷酸序列上，其中該CAG啟動子包含巨細胞病毒增強子和β-肌動蛋白啟動子。21.權(quán)利要求17或18的方法，其中所述的核酸分子還包括旱獺乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件。22.權(quán)利要求17或18的方法，其中所述的癌癥是肝癌。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述的肝癌是轉(zhuǎn)移性的。24.權(quán)利要求17或18的方法，其中通過門靜脈施用所述的核酸分子。25.權(quán)利要求17或18的方法，其中通過肌肉注射施用所述的核酸分子。26.一種治療或預(yù)防需要治療或預(yù)防癌癥的受治療者中的癌癥的方法，所述方法包括給所述受治療者施用治療有效量的(a)包含腺伴隨病毒載體和CAG啟動子的第一種核酸分子，該CAG啟動子被可操作地連接到編碼血管抑制素的核酸序列上，其中該CAG啟動子包含巨細胞病毒增強子和β-肌動蛋白啟動子；和(b)包含腺伴隨病毒載體和CAG啟動子的第二種核酸分子，該CAG啟動子被可操作地連接到編碼B7.1的核酸序列上，其中該CAG啟動子包含巨細胞病毒增強子和β-肌動蛋白啟動子。27.一種在需要的受治療者中治療或預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括給所述受治療者施用治療有效量的(a)包含腺伴隨病毒載體和CAG啟動子的第一種核酸分子，該CAG啟動子被可操作地連接到(a)SEQIDNO1的核酸序列；或者(b)編碼SEQIDNO2的氨基酸序列的核苷酸序列上，其中該CAG啟動子包含巨細胞病毒增強子和β-肌動蛋白啟動子；和(b)包含腺伴隨病毒載體和CAG啟動子的第二種核酸分子，該CAG啟動子被可操作地連接到(a)SEQIDNO3的核酸序列；或者(b)編碼SEQIDNO4的氨基酸序列的核苷酸序列上，其中該CAG啟動子包含巨細胞病毒增強子和β-肌動蛋白啟動子。28.權(quán)利要求26的方法，其中第一種核酸分子還包括旱獺乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件。29.權(quán)利要求26的方法，其中第二種核酸分子還包括旱獺乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件。30.權(quán)利要求26的方法，其中所述癌癥是肝癌。31.權(quán)利要求30的方法，其中所述肝癌是轉(zhuǎn)移性的。32.權(quán)利要求26的方法，其中第一種核酸分子和第二種核酸分子是通過門靜脈施用的。33.權(quán)利要求26的方法，其中第一種核酸分子和第二種核酸分子是通過肌肉注射施用的。34.權(quán)利要求26的方法，其中第一種核酸分子和第二種核酸分子被順序施用。35.權(quán)利要求26的方法，其中第一種核酸分子和第二種核酸分子被同時施用。36.一種核酸分子，包含腺伴隨病毒載體和CAG啟動子，該CAG啟動子被可操作地連接到包含編碼血管抑制素的第一條核酸序列的第一條多核苷酸，和包含編碼B7.1的第二條核酸序列的第二條多核酸上，其中CAG啟動子包含巨細胞病毒增強子和β-肌動蛋白啟動子。37.權(quán)利要求36的核酸分子，還包括旱獺乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件。38.一種核酸分子，包含腺伴隨病毒載體和CAG啟動子，該CAG啟動子被可操作地連接到(a)包含(i)SEQIDNO1的核苷酸序列或者(ii)編碼SEQIDNO2的氨基酸序列的核苷酸序列的第一條多核苷酸；和(b)包含(i)SEQIDNO3的核苷酸序列或者(ii)編碼SEQIDNO4的氨基酸序列的核苷酸序列的第二條多核苷酸，其中該CAG啟動子包含巨細胞病毒增強子和β-肌動蛋白啟動子。39.權(quán)利要求38的核酸分子，還包括旱獺乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件。40.包含權(quán)利要求36的核酸分子的載體。41.包含權(quán)利要求40的載體的宿主細胞。42.一種藥物組合物，包含權(quán)利要求36的核酸分子和藥學(xué)上可接受的載體。43.一種生產(chǎn)分離的或者純化的B7.1蛋白和血管抑制素或其片段、變體或者衍生物的方法，所述方法包括(i)培育權(quán)利要求41的細胞，使得B7.1蛋白和血管抑制素被表達；和(ii)分離或者純化所述的B7.1蛋白和血管抑制素。44.一種治療或預(yù)防需要治療或預(yù)防癌癥的受治療者中的癌癥的方法，所述方法包括給所述受治療者施用治療有效量的包含腺伴隨病毒載體和CAG啟動子的核酸分子，該CAG啟動子被可操作地連接到包含編碼血管抑制素的第一條核酸序列的第一條多核苷酸和包含編碼B7.1的第二條核酸序列的第二條多核苷酸上，其中該CAG啟動子包含巨細胞病毒增強子和β-肌動蛋白啟動子。45.一種治療或預(yù)防需要治療或預(yù)防癌癥的受治療者中的癌癥的方法，所述方法包括給所述受治療者施用治療有效量的包含腺伴隨病毒載體和CAG啟動子的核酸分子，該CAG啟動子被可操作地連接到(a)包含(i)SEQIDNO1的核苷酸序列或者(ii)編碼SEQIDNO2的氨基酸序列的核苷酸序列的第一條多核苷酸；和(b)包含(i)SEQIDNO3的核苷酸序列或者(ii)編碼SEQIDNO4的氨基酸序列的核苷酸序列的第二條多核苷酸上，其中該CAG啟動子包含巨細胞病毒增強子和β-肌動蛋白啟動子。46.權(quán)利要求44的方法，其中第一條多核苷酸還包括旱獺乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件。47.權(quán)利要求44的方法，其中第二條多核苷酸還包括旱獺乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件。48.權(quán)利要求44的方法，其中所述的癌癥是肝癌。49.權(quán)利要求48的方法，其中所述的肝癌是轉(zhuǎn)移性的。50.權(quán)利要求44的方法，其中通過門靜脈施用核酸分子。51.權(quán)利要求26的方法，其中通過肌肉注射施用核酸分子。全文摘要本發(fā)明提供編碼血管抑制素蛋白的腺伴隨病毒(AAV)載體和/或編碼共刺激分子B7.1的腺伴隨病毒(AAV)載體(“AAV－B7.1載體”)?？梢詥为毜貙AV－血管抑制素載體施用給受驗者，或者將其與AAV－B7.1載體順序地或同時地施用組合，來治療、控制或者預(yù)防轉(zhuǎn)移性腫瘤。還描述了包含AAV－血管抑制素載體和/或AAV－B7.1載體的藥物組合物和疫苗及其制造方法。還提供了通過門靜脈內(nèi)注射和肌肉注射來施用AAV－血管抑制素和AAV－B7.1載體。文檔編號C12N15/864GK1761757SQ200480005187公開日2006年4月19日申請日期2004年1月7日優(yōu)先權(quán)日2003年1月7日發(fā)明者許瑞安,孫學(xué)英,范上達,孔祥復(fù),馮戩云,G·克里斯桑森申請人:香港大學(xué),奧克蘭單一服務(wù)有限公司