專(zhuān)利名稱(chēng)：α-淀粉酶突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及親本類(lèi)透阿米爾(Termamyl-like)α-淀粉酶的變體(突變體)，其在中溫和/或高pH下的活性更高。
背景技術(shù)：
α-淀粉酶(α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC3.2.1.1)構(gòu)成這樣一組酶，它們催化淀粉和其他線(xiàn)性及分枝1，4-葡萄糖苷寡-糖和多糖的水解。
有大量專(zhuān)利和科學(xué)文獻(xiàn)涉及這類(lèi)工業(yè)上非常重要的酶。從例如WO90/11352，WO95/10603，WO95/26397，WO96/23873和WO96/23874可以知道許多α-淀粉酶，比如類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶變體。
在更近期的涉及α-淀粉酶的公開(kāi)文獻(xiàn)中，WO96/23874提供了一種類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶的三維，X-射線(xiàn)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，該酶含有解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶(BANTM)的300個(gè)氨基端氨基酸殘基以及含有所述氨基酸序列的地衣形芽孢桿菌α-淀粉酶的羧基端301-483位氨基酸(后者以透阿米爾TM的商品名出售)，因此該酶與工業(yè)上很重要的芽孢桿菌α-淀粉酶(其在本文中包含在術(shù)語(yǔ)“類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶”中，該術(shù)語(yǔ)特別包括地衣形芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌(BANTM)和嗜熱脂肪芽孢桿菌(BSGTM)α-淀粉酶)有密切的關(guān)系。WO96/23874還描述了在分析親本類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶之結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)相對(duì)親本改變了性質(zhì)的親本類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶之變體的方法。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明涉及新的類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶的α-淀粉分解酶變體(突變體)，該變體在高pH和中溫的洗滌能力(相對(duì)親本α-淀粉酶)提高。
在本發(fā)明文中術(shù)語(yǔ)“中溫”意指10℃到60℃，優(yōu)選20℃到50℃，特別是30℃到40℃。
術(shù)語(yǔ)“高pH”意指目前用于洗滌的堿性pH，更具體說(shuō)是大約pH8到10.5。
在本發(fā)明文中，“低溫α-淀粉酶”意指一種在0-30℃的溫度范圍內(nèi)具有相對(duì)最佳活性的α-淀粉酶。
在本發(fā)明文中，“中溫α-淀粉酶”意指一種在30℃-60℃的溫度范圍內(nèi)具有最佳活性的α-淀粉酶。比如，SP690和SP722α-淀粉酶分別是“中溫α-淀粉酶”。
在本發(fā)明文中，“高溫α-淀粉酶”意指一種在60℃-110℃的溫度范圍內(nèi)具有最佳活性的α-淀粉酶。比如，透阿米爾是一種“高溫α-淀粉酶”。
本發(fā)明的變體可以實(shí)現(xiàn)這些特性的改變類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶在pH8到10.5的穩(wěn)定性；和/或在pH8到10.5對(duì)Ca2+的穩(wěn)定性；和/或在10℃-60℃，優(yōu)選20℃-50℃，特別是30℃-40℃的特異活性。
應(yīng)當(dāng)注意的是，相對(duì)最適溫度通常取決于所用的特定pH。換句話(huà)說(shuō)，在例如pH8確定的相對(duì)最適溫度可能與例如pH10確定的相對(duì)最適溫度非常不同。
溫度對(duì)酶活性的影響活性部位及其周?chē)膭?dòng)力學(xué)取決于溫度和氨基酸組成，并且對(duì)一種酶的相對(duì)最適溫度有重要意義。通過(guò)比較中溫和高溫α-淀粉酶的動(dòng)力學(xué)，可以確定出高溫α-淀粉酶在中等溫度下的功能關(guān)鍵區(qū)域。圖2顯示了SP722α-淀粉酶(SEQ ID NO2)和地衣形芽孢桿菌α-淀粉酶(以Termanyl購(gòu)自Novo Nodisk)(SEQ ID NO4)。
圖中顯示，在中溫范圍(30-60℃)，SP722絕對(duì)活性的相對(duì)最適溫度比同源的地衣形芽孢桿菌α-淀粉酶高，后者在60-100℃左右具有最佳活性。這些分布圖主要取決于活性部位殘基及其周?chē)臏囟确€(wěn)定性和動(dòng)力學(xué)。另外，活性分布圖取決于所用pH和活性部位殘基的pKa。
本發(fā)明更具體地涉及1.一種親本類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶的變體，該變體具有α-淀粉酶活性，所述變體包含1或多個(gè)突變，其對(duì)應(yīng)于下列SEQ ID NO2所示氨基酸序列中的突變T141，K142，F(xiàn)143，D144，F(xiàn)145，P146，G147，R148，G149，Q174，R181，G182，D183，G184，K185，A186，W189，S193，N195，H107，K108，G109，D166，W167，D168，Q169，S170，R171，Q172，F(xiàn)173，F(xiàn)267，W268，K269，N270，D271，L272，G273，A274，L275，K311，E346，K385，G456，N457，K458，P459，G460，T461，V462，T463。
2.項(xiàng)1的變體，所述變體有1或多個(gè)下列取代或缺失
T141A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，W，Y，V；K142A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；F143A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，P，S，T，W，Y，V；D144A， R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；F145A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，P，S，T，W，Y，V；P146A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，S，T，W，Y，V；G147A， D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；R148A， D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；G149A， D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；R181*，A，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；G182*，A，D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；D183*，A，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；G184*，A，R，D，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；K185A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；A186D， R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；W189A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，Y，V；S193A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，T，W，Y，V；N195A， D，R，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；H107A， D，R，N，C，E，Q，G，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；K108A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；G109A， D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；D166A， R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；W167A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，Y，V；D168A， R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；Q169A， D，R，N，C，E，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；S170A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，T，W，Y，V；R171A， D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；Q172A， D，R，N，C，E，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；F173A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，P，S，T，W，Y，V；Q174*，A，D，R，N，C，E，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；F267A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，P，S，T，W，Y，V；W268A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，Y，V；K269A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；N270A， D，R，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；D271A， R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；L272A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；G273A， D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；A274D， R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；
L275A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；K311A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；E346A，D，R，N，C，Q，G，H，I，K，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；K385A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；G456A，D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；N457A，D，R，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；K458A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；P459A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，S，T，W，Y，V；G460A，D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；T461A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，W，Y，V；V462A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y；T463A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，W，Y，V.
3.項(xiàng)2的變體，其中所述變體有1或多個(gè)下列取代或缺失K142R；S193P；N195F；K269R，Q；N270Y，R，D；K311R；E346Q；K385R；K458R；P459T；T461P；Q174*；R181Q，N，S；G182T，S，N；D183*；G184*；K185A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，M，N，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；A186T，S，N，I，V，R；W189T，S，N，Q.
4.項(xiàng)1-3的變體，其中所述變體在D183+G184位點(diǎn)缺失，還有1或多個(gè)下列取代或缺失K142R；S193P；N195F；K269R，Q；N270Y，R，D；K311R；E346Q；K385R；K458R；P459T；T461P；Q174*；R181Q，N，S；G182T，S，N；D183*；G184*；K185A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，M，N，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；A186T，S，N，I，V，R；W189T，S，N，Q。
5.項(xiàng)1-4任何一項(xiàng)的變體，其中相對(duì)親本α-淀粉酶所述變體至少下列性能之一發(fā)生改變i)在pH8到10.5的pH穩(wěn)定性提高；和/或ii)在pH8到10.5的Ca2+穩(wěn)定性提高，和/或iii)在溫度為10到60℃，優(yōu)選20-50℃，特別是30-40℃特異活性增強(qiáng)。
6.項(xiàng)1-5任何一項(xiàng)的變體，在pH8到10.5穩(wěn)定性提高，具有1或多個(gè)對(duì)應(yīng)下列位點(diǎn)(使用SEQ ID NO2的編號(hào))的位點(diǎn)的突變T141，K142，F(xiàn)143，D144，F(xiàn)145，P146，G147，R148，G149，R181，A186，S193，N195，K269，N270，K311，K458，P459，T461。
7.項(xiàng)6的變體，該變體具有1或多個(gè)下列取代T141A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，W，Y，V；K142A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；F143A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，P，S，T，W，Y，V；D144A，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；
F145A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，P，S，T，W，Y，V；P146A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，S，T，W，Y，V；G147A，D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；R148A，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；G149A，D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；K181A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；A186D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，P，K，M，F(xiàn)，S，T，W，Y，V；S193A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，T，W，Y，V；N195A，D，R，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；K269A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；N270A，D，R，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；K311A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；K458A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；P459A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，S，T，W，Y，V；T461A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，W，Y，V.
8.項(xiàng)7的變體，該變體具有1或多個(gè)下列取代K142R，R181S，A186T，S193P，N195F，K269R，N270Y，K311R，K458R，P459T和T461P。
9.項(xiàng)1-5的變體，在pH8到10.5對(duì)Ca2+的穩(wěn)定性提高，具有1或多個(gè)對(duì)應(yīng)下列位點(diǎn)(使用SEQ ID NO2的編號(hào))的突變R181，G182，D183，G184，K185，A186，W189，N195，N270，E346，K385，K458，P459。
10.項(xiàng)9的變體，該變體具有1或多個(gè)下列取代或缺失R181*，A，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；G182*，A，D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；D183*，A，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；G184*，A，R，D，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；K185A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；A186D， R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；W189A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，Y，V；N195A， D，R，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；N270A， R，D，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；E346A， R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；K385A， R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；K458A， R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；P459A， R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，S，T，W，Y，V.
11.項(xiàng)10的變體，其中所述變體具有1或多個(gè)下列取代或缺失R181Q，N；G182T，S，N；D183*；G184*；K185A，R，D，C，E，Q，G H，I，L，M，N，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；A186T，S，N，I，V；W189T，S，N，Q；N195F；N270R，D；E346Q；K385R；K458R；P459T。
12.項(xiàng)1-11的變體，其中所述親本類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶選自具有SEQ ID NO1所示序列的芽孢桿菌菌株NCIB12512α-淀粉酶；具有SEQ ID NO5所示序列的解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶；具有SEQ ID NO4所示序列的地衣形芽孢桿菌α-淀粉酶。
13.項(xiàng)1-5的變體，在10-60℃，優(yōu)選20-50℃，特別是30-40℃的溫度范圍內(nèi)特異活性提高，在1或多個(gè)下列位點(diǎn)(使用SEQ ID NO2的編號(hào))具有突變H107，K108，G109，D166，W167，D168，Q169，S170，R171，Q172，F(xiàn)173，Q174，D183，G184，N195，F(xiàn)267，W268，K269，N270，D271，L272，G273，A274，L275，G456，N457，K458，P459，G460，T461，V462，T463。
14.項(xiàng)13的變體，該變體含有1或多個(gè)下列取代H107A， D，R，N，C，E，Q，G，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；K108A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；G109A， D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；D166A， R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；W167A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，Y，V；D168A， R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；Q169A， D，R，N，C，E，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；S170A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，T，W，Y，V；R171A， D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；Q172A， D，R，N，C，E，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；F173A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，P，S，T，W，Y，V；Q174*，A，D，R，N，C，E，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；D183*，A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，W，Y，V；G184*，A，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；N195A， D，R，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；F267A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，P，S，T，W，Y，V；W268A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，Y，V；K269A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；N270A， D，R，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；D271A， R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；L272A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；G273A， D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；A274D， R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；L275A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；G456A， D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；N457A， D，R，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；K458A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；P459A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，S，T，W，Y，V；
G460A，D，R，N，C，E，Q，H，L，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；T461A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，W，Y，V；V462A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y；T463A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，W，Y，V.
15.項(xiàng)14的變體，其中所述變體含有1或多個(gè)下列取代或缺失Q174*，D183*，G184*，N195F，K269S。
16.項(xiàng)13-15的變體，其中所述親本類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶是具有SEQID NO4所示序列的地衣形芽孢桿菌α-淀粉酶。
17.一種DNA構(gòu)建體，它含有編碼項(xiàng)1-16任何一項(xiàng)所述α-淀粉酶變體的DNA序列。
18.一種攜帶項(xiàng)17所述DNA構(gòu)建體的重組表達(dá)載體。
19.一種用項(xiàng)17所述DNA構(gòu)建體或項(xiàng)18所述載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
20.項(xiàng)19的細(xì)胞，它是一種微生物細(xì)胞。
21.項(xiàng)20的細(xì)胞，它是細(xì)菌或真菌。
22.項(xiàng)21的細(xì)胞，它是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，比如枯草芽孢桿菌，地衣形芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌，短芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，嗜堿芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，凝結(jié)芽孢桿菌，環(huán)狀芽孢桿菌，燦爛芽孢桿菌，或蘇云金芽孢桿菌。
23.項(xiàng)1-16任何一項(xiàng)所述α-淀粉酶變體用于洗滌和/或清洗餐具的用途。
24.含有項(xiàng)1-16任何一項(xiàng)所述α-淀粉酶變體的洗滌劑添加劑，任選該添加劑是非dusting顆粒，穩(wěn)定化的液體或被保護(hù)的酶。
25.項(xiàng)24的洗滌劑添加劑，它含有0.02-200mg酶蛋白/g添加劑。
26.項(xiàng)24或25的洗滌劑添加劑，它還含有另一種酶，比如蛋白酶，脂酶，過(guò)氧化物酶，另一種淀粉水解酶和/或纖維素酶。
27.一種包含項(xiàng)1-16任何一項(xiàng)所述α-淀粉酶變體的洗滌劑組合物。
28.項(xiàng)27的洗滌劑組合物，它另外包含另一種酶，比如蛋白酶，脂酶，過(guò)氧化物酶，另一種淀粉水解酶和/或纖維素酶。
29.一種手洗或自動(dòng)餐具洗滌劑組合物，該組合物包含項(xiàng)1-16任何一項(xiàng)所述的α-淀粉酶變體。
30.項(xiàng)29的清洗餐具的洗滌劑組合物，該組合物另外包含另一種酶，比如蛋白酶，脂酶，過(guò)氧化物酶，另一種淀粉水解酶和/或纖維素酶。
31.一種手洗或自動(dòng)的衣物洗滌組合物，該組合物包含項(xiàng)1-16任何一項(xiàng)所述的α-淀粉酶變體。
32.項(xiàng)31的衣物洗滌組合物，該組合物另外包含另一種酶，比如蛋白酶，脂酶，過(guò)氧化物酶，淀粉水解酶和/或纖維素酶。
33.制備α-淀粉酶的方法，該α-淀粉酶具有1)改變了的pH最佳值，和/或2)改變了的溫度最佳值，和/或3)穩(wěn)定性提高，所述方法包括以下步驟i)將兩個(gè)或多個(gè)pH，溫度和/或穩(wěn)定性曲線(xiàn)迥異的α-淀粉酶的3D結(jié)構(gòu)之分子動(dòng)力學(xué)進(jìn)行比較，從而確定(a)α-淀粉酶突變的目標(biāo)位點(diǎn)和/或區(qū)域；ii)在所確定的位點(diǎn)和/或區(qū)域進(jìn)行1或多個(gè)氨基酸的取代，添加和/或缺失。
34.項(xiàng)33的方法，其中將一種中溫α-淀粉酶與一種高溫α-淀粉酶進(jìn)行比較。
35.項(xiàng)33的方法，其中將一種低溫α-淀粉酶與一種中溫或高溫α-淀粉酶進(jìn)行比較。
36.項(xiàng)33-35的方法，其中所述α-淀粉酶至少70％，優(yōu)選80％，達(dá)到90％，比如達(dá)到95％，尤其是95％同源。
37.項(xiàng)36的方法，其中所比較的α-淀粉酶是類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶。
38.項(xiàng)28的方法，其中所比較的α-淀粉酶是SEQ ID NO1到SEQ IDNO8所示的任何一個(gè)α-淀粉酶。
本發(fā)明更進(jìn)一步涉及編碼本發(fā)明所述變體的DNA構(gòu)建體；制備本發(fā)明所述變體的方法；以及本發(fā)明所述變體單獨(dú)地或與其他酶結(jié)合，在各種工業(yè)產(chǎn)品或方法中的用途，例如，用在洗滌劑中或用于淀粉液化。
本發(fā)明最后一個(gè)方面涉及生產(chǎn)α-淀粉酶的方法，該酶的最適pH，和/或最適溫度發(fā)生改變，和/或穩(wěn)定性提高。
命名法則在本說(shuō)明書(shū)和項(xiàng)書(shū)中，使用了氨基酸殘基的常規(guī)單字母和三字母編碼。為了便于參考，采用以下命名法則來(lái)描述本發(fā)明的α-淀粉酶變體原氨基酸位點(diǎn)取代氨基酸根據(jù)這一命名原則，例如在第30位丙氨酸到天冬酰胺的取代應(yīng)表示為Ala30Asn或A30N
在同一位點(diǎn)的丙氨酸缺失表示為Ala30*或A30*添加的氨基酸殘基，比如賴(lài)氨酸插入表示為Ala30 AlaLys或A30AK連續(xù)的氨基酸殘基片段，比如30-33位氨基酸殘基缺失表示為(30-33)*或Δ(A30-N33)。
當(dāng)特定α-淀粉酶與其他α-淀粉酶相比含有一個(gè)“缺失”，并且在該位點(diǎn)做了一個(gè)插入，這種情況表示為(對(duì)于36位插入了一個(gè)天冬氨酸)36Asp或36D多重突變用加號(hào)隔開(kāi)，即Ala30Asp+Glu34Ser或A30N+E34S代表在30和34位分別將丙氨酸和谷氨酸取代為天冬氨酸和絲氨酸。
當(dāng)在一個(gè)給定位點(diǎn)可以插入1或多個(gè)可選擇的氨基酸殘基時(shí)，將其表示為A30N，E或A30N或A30E另外，當(dāng)本文中確定了一個(gè)適合進(jìn)行修飾的位置而沒(méi)有建議具體的修飾方式，應(yīng)當(dāng)理解為可以用任何氨基酸殘基來(lái)取代該位點(diǎn)的氨基酸殘基。因此，例如，如果提及30位的丙氨酸修飾，但沒(méi)有具體化，應(yīng)當(dāng)理解可以將該丙氨酸缺失或用任何其他氨基酸來(lái)取代它，即下列之一的氨基酸R，N，D，A，C，Q，E，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V。


圖1是6個(gè)親本類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶的氨基酸序列對(duì)比。最左端的數(shù)字代表下列各氨基酸序列1SEQ ID NO22Kaoamyl3SEQ ID NO14SEQ ID NO55SEQ ID NO46SEQ ID NO3圖2顯示SP722(SEQ ID NO2)(pH9)和地衣形芽孢桿菌α-淀粉酶(SEQID NO4)(pH7.3)的溫度活性關(guān)系圖。
圖3顯示SP690(SEQ ID NO1)，SP722(SEQ ID NO2)，地衣形芽孢桿菌α-淀粉酶(SEQ ID NO4)在pH10的溫度分布圖。
圖4是5個(gè)α-淀粉酶的氨基酸序列對(duì)比。最左端的數(shù)字代表下列各氨基酸序列1amyp-小鼠2amyp-大鼠3amyp-豬 豬胰腺α-淀粉酶(PPA)4amyp-人5amy-altha A.haloplanctis α-淀粉酶(AHA)發(fā)明詳述類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶眾所周知，芽孢桿菌亞種所產(chǎn)生的許多α-淀粉酶在氨基酸水平上同源性極高。例如，發(fā)現(xiàn)包含SEQ ID NO4所示氨基酸序列的地衣形芽孢桿菌α-淀粉酶(商品名為透阿米爾TM)與包含SEQ ID NO5所示氨基酸序列的解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶大約89％同源，與包含SEQ ID NO3所示氨基酸序列的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶大約79％同源。其他的同源α-淀粉酶包括來(lái)源于芽孢桿菌菌株NCIB12289，NCIB12512，NCIB12513或DSM9375的α-淀粉酶(這些在WO95/26397中都有詳細(xì)的描述)以及Tsukamoto等描述過(guò)的α-淀粉酶(生物化學(xué)和生物物理研究通訊，151(1988)，25-31頁(yè)，參見(jiàn)SEQID NO6)。
其他同源α-淀粉酶包括EP0252666中描述的地衣形芽孢桿菌(ATCC27811)產(chǎn)生的α-淀粉酶，以及WO91/00353和WO94/18314中鑒定到的α-淀粉酶。在產(chǎn)品OptithermTM和TakathermTM(Solvay有售)，MaxamylTM(Gist-brocades/Genencor有售)，Spezym AATM和Spezym Delta AATM(Genencor有售)以及KeistaseTM(Daiwa有售)中含有其他一些商品類(lèi)透阿米爾地衣形芽孢桿菌α-淀粉酶。
由于發(fā)現(xiàn)這些α-淀粉酶之間有極大的同源性，可以認(rèn)為它們屬于同類(lèi)α-淀粉酶，即“類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶”類(lèi)。
因此，在本文中，術(shù)語(yǔ)“類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶”意指這類(lèi)α-淀粉酶，它在氨基酸水平上與透阿米爾TM(即具有文中SEQ ID NO4所示氨基酸序列的地衣形芽孢桿菌α-淀粉酶)有極大的同源性。換句話(huà)說(shuō)，以下所有具有SEQ ID NO1，2，3，4，5，6，7或8所示氨基酸序列，或者WO95/26397中的SEQ ID NO1所示氨基酸序列(與此處SEQ ID NO7所示氨基酸序列相同)之α-淀粉酶或者WO95/26397中的SEQ ID NO2所示氨基酸序列(與此處SEQ ID NO8所示氨基酸序列相同)或者Tsukamoto等文中(1988，該氨基酸序列在文中見(jiàn)SEQ ID NO6)之α-淀粉酶都被認(rèn)為是“類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶”。其他的類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶是這樣一些α-淀粉酶i)與SEQ ID NO1-8所示氨基酸序列中的至少一個(gè)有至少60％，比如至少70％(例如至少75％)，或至少80％(例如至少85％)，至少90％或至少95％同源，和/或ii)與至少一個(gè)所述α-淀粉酶的抗體有免疫交叉反應(yīng)，和/或iii)由這樣一種DNA序列編碼，這些序列能與編碼以上特定α-淀粉酶的DNA序列進(jìn)行雜交，根據(jù)本申請(qǐng)的SEQ ID NO9，10，11或12(這些編碼序列分別編碼此處SEQID NO1，2，3，4和5所示的氨基酸序列)，WO95/26397中的SEQ ID NO4(文中SEQ ID NO13顯示了該DNA序列和終止密碼子TAA，并編碼文中SEQ ID NO8所示的氨基酸序列)以及WO95/26397中的SEQ ID NO5(文中SEQ ID NO14所示)很容易得到這些序列。
對(duì)于特性i)，可以借助任何常規(guī)算法來(lái)確定“同源性”，優(yōu)選利用GCG程序包7.3版本(1993年6月)中的GAP程序，該程序中GAP罰分采用缺省值，即GAP生成罰分為3.0，GAP延伸罰分為0.1(Genetic computergroup(1991)GCG程序包程序手冊(cè)，版本7，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA53711)。
可以利用透阿米爾(SEQ ID NO4)和類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶之間的結(jié)構(gòu)對(duì)比來(lái)鑒定其他類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶中的等同/相應(yīng)位點(diǎn)。獲得所述結(jié)構(gòu)對(duì)比的一個(gè)方法是利用GCG程序包中的Pile Up程序，該程序中GAP罰分采用缺省值，即GAP生成罰分為3.0，GAP延伸罰分為0.1。其他結(jié)構(gòu)對(duì)比方法包括疏水簇分析(Gaboriaud等，(1987)，F(xiàn)EBS快報(bào)224，149-155頁(yè))和反相成絲技術(shù)(reverse threading)(Huber T，Torda，AE，蛋白質(zhì)科學(xué)，7卷，1期142-149(1998))。
可以利用抗相關(guān)類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶的至少一個(gè)表位，或者與之反應(yīng)的抗體來(lái)檢測(cè)α-淀粉酶的特性ii)，即免疫交叉反應(yīng)性?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域的已知方法，例如Hudson等(實(shí)用免疫學(xué)，第3版(1989)，Blackwell ScientificPublications)描述的方法來(lái)制備單克隆或多克隆抗體?？梢岳帽绢I(lǐng)域已知的檢測(cè)方法(這類(lèi)例子有Western印跡或者Hudson等(1989)描述的徑向免疫擴(kuò)散法)來(lái)確定免疫交叉反應(yīng)性。就這方面而言，發(fā)現(xiàn)具有SEQ ID NO1，2，3，4，5，6，7或8所示氨基酸序列的α-淀粉酶之間分別有免疫交叉反應(yīng)。
可以在所研究的α-淀粉酶的全長(zhǎng)或部分核苷酸或氨基酸序列的基礎(chǔ)上適當(dāng)?shù)刂苽涞接糜诟鶕?jù)特性iii)來(lái)鑒定類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶的寡核苷酸探針。
檢測(cè)雜交的適宜條件包括在5×SSC中預(yù)浸泡，于～40℃在含有20％甲酰胺，5×Denhardt′s溶液，50mM磷酸鈉(pH6.8)以及50mg超聲變性小牛胸腺DNA的溶液中預(yù)雜交1小時(shí)，然后于～40℃在補(bǔ)充有100mMATP的同一溶液中雜交18小時(shí)，隨之將濾膜洗3次，每次在2×SSC，0.2％SDS中于40℃(低嚴(yán)格性)，優(yōu)選50℃(中等嚴(yán)格性)，更優(yōu)選65℃(高嚴(yán)格性)，還要優(yōu)選的是～75℃(極高嚴(yán)格性)洗30分鐘。有關(guān)雜交方法的其他細(xì)節(jié)可見(jiàn)Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第2版，Cold Spring Harbor，1989.
在本文中，“來(lái)源于”不僅是指由所研究的微生物菌株產(chǎn)生或能產(chǎn)生的α-淀粉酶，也指分離自該菌株的DNA序列所編碼的，并在用所述DNA序列轉(zhuǎn)化的宿主微生物中產(chǎn)生的α-淀粉酶。最后，該術(shù)語(yǔ)意指這樣的α-淀粉酶，它由合成的和/或cDNA來(lái)源的DNA序列編碼并且具備所述α-淀粉酶的鑒定特征。該術(shù)語(yǔ)還用來(lái)表示親本α-淀粉酶可以是天然存在的α-淀粉酶的變異體，即由天然存在的α-淀粉酶的1或多個(gè)氨基酸殘基經(jīng)過(guò)修飾(插入，取代，缺失)所產(chǎn)生的變體。
親本雜交α-淀粉酶親本α-淀粉酶(即主鏈α-淀粉酶)可以是一種雜交α-淀粉酶，即包含組合在一起的來(lái)源于至少兩個(gè)α-淀粉酶的部分氨基酸序列。
親本雜交α-淀粉酶可以是這樣的酶，在氨基酸同源性和/或免疫雜交反應(yīng)性和/或DNA雜交(如上所述)的基礎(chǔ)上可以確定它屬于類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶家族。在這種情況中，雜交α-淀粉酶通常包含類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶的至少一部分和1或多個(gè)其他α-淀粉酶的1個(gè)或多個(gè)部分，后者選自微生物(細(xì)菌或真菌)和/或哺乳動(dòng)物來(lái)源的類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶或非類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶。
因此，親本雜交α-淀粉酶可以包括來(lái)源于至少兩個(gè)類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶，或者來(lái)源于至少一個(gè)類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶和至少一個(gè)非類(lèi)透阿米爾細(xì)菌α-淀粉酶，或者來(lái)源于至少一個(gè)類(lèi)透阿米爾和至少一個(gè)真菌α-淀粉酶的部分氨基酸序列的組合。來(lái)源于部分氨基酸序列的類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶可以是，例如文中提到的那些特定類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶中的任何一個(gè)。
例如，親本α-淀粉酶可以包括來(lái)源于地衣形芽孢桿菌菌株的α-淀粉酶的羧基端部分和來(lái)源于解淀粉芽孢桿菌菌株或嗜熱脂肪芽孢桿菌菌株的α-淀粉酶的氨基端部分。例如，親本α-淀粉酶可以包括地衣形芽孢桿菌α-淀粉酶的羧基端部分的至少430個(gè)氨基酸殘基，還可以，例如，包括a)與具有SEQ ID NO5所示氨基酸序列的解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶的37個(gè)氨基端氨基酸殘基相對(duì)應(yīng)的氨基酸片段和與具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的地衣形芽孢桿菌α-淀粉酶的445個(gè)羧基端氨基酸殘基相對(duì)應(yīng)的氨基酸片段，或者雜交類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶與透阿米爾序列(即SEQ ID NO4所示的地衣形芽孢桿菌α-淀粉酶)相同，除了氨基端的35個(gè)氨基酸殘基被BAN(成熟蛋白質(zhì))(即SEQ ID NO5所示的解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶)的氨基端33個(gè)殘基(成熟蛋白質(zhì))取代；或者包括b)與具有SEQ ID NO3所示氨基酸序列的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶的68個(gè)氨基端氨基酸殘基相對(duì)應(yīng)的氨基酸片段和與具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的地衣形芽孢桿菌α-淀粉酶的415個(gè)羧基端氨基酸殘基相對(duì)應(yīng)的氨基酸片段。
另一合適的親本雜交α-淀粉酶是先前在WO96/23874(Novo Nordisk申請(qǐng))中描述的酶，該酶由BAN(解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶)的氨基端(成熟蛋白質(zhì)的1-300位氨基酸)和透阿米爾的羧基端(成熟蛋白質(zhì)的301-483位氨基酸)構(gòu)成。通過(guò)將上述雜交α-淀粉酶(BAN1-300/透阿米爾301-483)的1或多個(gè)以下位點(diǎn)取代使其活性提高Q360，F(xiàn)290和N102。尤其有意義的取代是1或多個(gè)以下取代Q360E，D；F290A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T；N102D，E。
SEQ ID NO2所示SP722α-淀粉酶中的相應(yīng)位點(diǎn)是S365，Y295，N106中的1或多個(gè)。在SEQ ID NO2所示α-淀粉酶中尤其有意義的相應(yīng)取代是S365D，E；Y295A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T；以及N106D，E中的1或多個(gè)。
SEQ ID NO1所示SP690α-淀粉酶中的相應(yīng)位點(diǎn)是S365，Y295，N106中的1或多個(gè)。尤其有意義的相應(yīng)取代是S365D，E；Y295A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T；以及N106D，E中的1或多個(gè)。
上面提到的非類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶可以，例如，是(與類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶不同的)真菌α-淀粉酶，哺乳動(dòng)物或植物α-淀粉酶或者細(xì)菌α-淀粉酶。這類(lèi)α-淀粉酶的具體例子包括米曲霉TAKAα-淀粉酶，黑曲霉酸α-淀粉酶，枯草芽孢桿菌α-淀粉酶，豬胰腺α-淀粉酶和大麥α-淀粉酶。所有這些α-淀粉酶的結(jié)構(gòu)與文中所述的典型類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶的結(jié)構(gòu)顯著不同。
上面提到的真菌α-淀粉酶，即來(lái)源于黑曲霉和米曲霉，在氨基酸水平上同源性極高，通常認(rèn)為屬于同族α-淀粉酶。來(lái)源于米曲霉的真菌α-淀粉酶以商品名FungamylTM銷(xiāo)售。
另外，如果類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶的特定變體(本發(fā)明的變體)是指-以常規(guī)方式-特定類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶的氨基酸序列中的特異氨基酸殘基發(fā)生的修飾(例如缺失或取代)，那么應(yīng)將其理解為涵蓋了在等同位點(diǎn)(由各氨基酸序列之間的最可能氨基酸對(duì)比所確定的)進(jìn)行修飾的另一個(gè)類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶的變體。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，α-淀粉酶主鏈來(lái)源于地衣形芽孢桿菌(與親本類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶一樣)，例如前面提到過(guò)的，比如具有SEQ IDNO4所示氨基酸序列的地衣形芽孢桿菌α-淀粉酶。
本發(fā)明變體的改變特性以下討論存在于本發(fā)明的變體中的突變與可能由該突變導(dǎo)致的預(yù)期性狀變化(相對(duì)親本類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶的這些性狀)之間的關(guān)系。
在pH8-10.5的穩(wěn)定性提高在本發(fā)明文中，對(duì)于實(shí)現(xiàn)在高pH下穩(wěn)定性提高有重要意義的突變(包括氨基酸取代)包括與SP722α-淀粉酶(具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列)中的1或多個(gè)下列位點(diǎn)所發(fā)生的突變相對(duì)應(yīng)的突變T141，K142，F(xiàn)143，D144，F(xiàn)145，P146，G147，R148，G149，R181，A186，S193，N195，K269，N270，K311，K458，P459，T461。
本發(fā)明的變體具有1或多個(gè)下列取代(使用SEQ ID NO2的編號(hào))T141A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，W，Y，V；K142A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；F143A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，P，S，T，W，Y，V；D144A，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；F145A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，P，S，T，W，Y，V；P146A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，S，T，W，Y，V；G147A，D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；R148A，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；G149A，D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；
K181A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；A186D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，P，K，M，F(xiàn)，S，T，W，Y，V；S193A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，T，W，Y，V；N195A，D，R，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；K269A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；N270A，D，R，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；K311A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；K458A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；P459A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，S，T，W，Y，V；T461A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，W，Y，V.
優(yōu)選的高pH穩(wěn)定性變體包括SP722α-淀粉酶(具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列)中的1或多個(gè)下列取代K142R，R181S，A186T，S193P，N195F，K269R，N270Y，K311R，K458R，P459T和T461P。
在具體實(shí)施方案中，用具有SEQ ID NO1所示序列的芽孢桿菌菌株NCIB12512α-淀粉酶，或者具有SEQ ID NO3所示序列的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶，或者具有SEQ ID NO4所示序列的地衣形芽孢桿菌α-淀粉酶，或者具有SEQ ID NO5所示序列的解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶作為主鏈，即親本類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶來(lái)進(jìn)行這些突變。
從圖1的對(duì)比結(jié)果可以看到，嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶在與SP722中的N270對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)已有一個(gè)酪氨酸。另外，芽孢桿菌菌株NCIB12512α-淀粉酶，嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶，地衣形芽孢桿菌α-淀粉酶和解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶在與SP722中的K458對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)早已有精氨酸。另外，地衣形芽孢桿菌α-淀粉酶在與SP722中的T461對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)已有一個(gè)脯氨酸。因此，所述取代與這些α-淀粉酶無(wú)關(guān)。
可以利用實(shí)施例2中提及的分子動(dòng)力學(xué)模擬，通過(guò)在所發(fā)現(xiàn)的區(qū)域進(jìn)行取代來(lái)構(gòu)建在高pH下穩(wěn)定性提高的α-淀粉酶變體。模擬描述了那些在高pH(即pH8-10.5)比在中等pH有更高柔性或可變性的區(qū)域。
利用任何與類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶(BA2，在Novo Nodisk提出的WO96/23874的附錄1中公開(kāi)了該酶的3D結(jié)構(gòu))同源(定義如下)的細(xì)菌α-淀粉酶的結(jié)構(gòu)，即有可能建立這些α-淀粉酶結(jié)構(gòu)的模型并可以對(duì)它進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬。用GCG程序包7.3版(1993年6月)中的UWGCG GAP程序測(cè)量到所述細(xì)菌α-淀粉酶的同源性可以為至少60％，優(yōu)選70％以上，更優(yōu)選80％以上，最優(yōu)選90％以上同源于前面提及的類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶(BA2)，測(cè)量采用缺省值作為GAP罰分(Genetic computer group(1991)GCG程序包程序手冊(cè)，版本7，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA53711)。將不利的殘基取代為其他殘基是可行的。
在pH8-10.5的Ca2+穩(wěn)定性提高Ca2+穩(wěn)定性提高意味著酶在Ca2+耗盡的情況下，穩(wěn)定性已有提高。在本發(fā)明文中，對(duì)于獲得在高pH下Ca2+穩(wěn)定性提高有重要意義的突變(包括氨基酸取代)包括與SP722α-淀粉酶(具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列)中的下列位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的1或多個(gè)位點(diǎn)突變或缺失R181，G182，D183，G184，K185，A186，W189，N195，N270，E346，K385，K458，P459。
本發(fā)明的變體具有1或多個(gè)下列取代或缺失R181*，A，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；G182*，A，D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；D183*，A，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；G184*，A，R，D，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；K185A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；A186D， R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；W189A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，Y，V；N195A， D，R，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；N270A， R，D，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；E346A， R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；K385A， R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；K458A， R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；P459A， R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，S，T，W，Y，V.
優(yōu)選的是具有1或多個(gè)下列取代或缺失的變體R181Q，N；G182T，S，N；D183*；G184*；K185A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，M，N，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；A186T，S，N，I，V；W189T，S，N，Q；N195F，N270R，D；E346Q；K385R；K458R；P459T.
在具體實(shí)施方案中，用具有SEQ ID NO1所示序列的芽孢桿菌菌株NCIB12512α-淀粉酶，或者具有SEQ ID NO5所示序列的解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶，或者具有SEQ ID NO4所示序列的地衣形芽孢桿菌α-淀粉酶作為進(jìn)行這些突變的主鏈。
從圖1的對(duì)比結(jié)果可看到，地衣形芽孢桿菌α-淀粉酶沒(méi)有與SP722中的D183和G184對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)。因此，所述缺失與該α-淀粉酶無(wú)關(guān)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，變體是這樣的芽孢桿菌菌株NCIB12512α-淀粉酶，它在D183和G184缺失，并有下列取代之一R181Q，N和/或G182T，S，N和/或D183*；G184*和/或K185A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，M，N，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V和/或A186T，S，N，I，V和/或W189T，S，N，Q和/或N195F和/或N270R，D和/或E346Q和/或K385R和/或K458R和/或P459T。
在中溫的特異活性增強(qiáng)本發(fā)明另外一個(gè)方面，對(duì)于獲得在10-60℃，優(yōu)選20-50℃，尤其是30-40℃特異活性增強(qiáng)的變體來(lái)說(shuō)，重要的突變包括與SP722α-淀粉酶(具有SEQID NO2所示氨基酸序列)中的1或多個(gè)下列位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的突變H107，K108，G109，D166，W167，D168，Q169，S170，R171，Q172，F(xiàn)173，Q174，D183，G184，N195，F(xiàn)267，W268，K269，N270，D271，L272，G273，A274，L275，G456，N457，K458，P459，G460，T461，V462，T463.
本發(fā)明的變體具有1或多個(gè)下列取代H107A， D，R，N，C，E，Q，G，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；K108A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；G109A， D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；D166A， R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；W167A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，Y，V；D168A， R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；Q169A， D，R，N，C，E，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；S170A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，T，W，Y，V；R171A， D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；Q172A， D，R，N，C，E，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；F173A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，P，S，T，W，Y，V；Q174*，A，D，R，N，C，E，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；D183*，A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，W，Y，V；G184*，A，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；N195A， D，R，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；F267A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，P，S，T，W，Y，V；W268A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，Y，V；K269A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；N270A， D，R，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；D271A， R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；L272A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；G273A， D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；A274D， R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；L275A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；G456A， D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；N457A， D，R，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；K458A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；
P459A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，S，T，W，Y，V；G460A，D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；T461A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，W，Y，V；V462A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y；T463A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，W，Y，V.
優(yōu)選的變體具有1或多個(gè)下列取代或缺失Q174*，D183*，G184*，K269S。
在具體實(shí)施方案中，用具有SEQ ID NO4所示序列的地衣形芽孢桿菌α-淀粉酶作為進(jìn)行這些突變的主鏈。
本發(fā)明變體的通用突變?cè)谥袦靥禺惢钚栽鰪?qiáng)特別有意義的氨基酸取代是那些能提高酶活性部位周?chē)目勺冃缘娜〈?。這可以通過(guò)那些能破壞活性部位附近(即優(yōu)選與構(gòu)成活性部位的任何殘基在10A或8A或6A或4A之內(nèi))的穩(wěn)定性相互作用的改變來(lái)實(shí)現(xiàn)。
這類(lèi)例子是那些能降低側(cè)鏈尺寸的突變，比如Ala到GlyVal到Ala或GlyIle或Leu到Val，Ala或GlyThr到Ser我們希望，通過(guò)導(dǎo)入空腔或者通過(guò)能填塞突變?cè)斐傻目臻g的結(jié)構(gòu)重排，這些突變導(dǎo)致活性部位區(qū)域的柔性提高。
可以?xún)?yōu)選本發(fā)明的變體還包含1或多個(gè)除上面概括過(guò)的以外的修飾。因此，將被修飾的α-淀粉酶變體某部分存在的1或多個(gè)脯氨酸取代為非脯氨酸殘基可能是有益的，所述非脯氨酸可以是任何可能的，天然非脯氨酸殘基，優(yōu)選是Ala，Gly，Ser，Thr，Val或Leu。
類(lèi)似地，可以?xún)?yōu)選將親本α-淀粉酶被修飾的那些氨基酸殘基中存在的1或多個(gè)Cys殘基取代為非半胱氨酸殘基，比如Ser，Ala，Thr，Gly，Val或Leu。
另外，可以將本發(fā)明的變體進(jìn)行修飾一作為唯一的修飾或者結(jié)合上面概括的任何修飾-以便將與SEQ ID NO4中的185-209位氨基酸片段所對(duì)應(yīng)的氨基酸片段中存在的1或多個(gè)Asp和/或Glu分別取代為Asn或Gln。同樣有意義的是在類(lèi)透阿米爾α-淀粉酶中，將與SEQ ID NO4中的185-209位氨基酸片段所對(duì)應(yīng)的氨基酸片段中存在的1或多個(gè)Lys殘基取代為Arg。
應(yīng)當(dāng)明白，本發(fā)明涵蓋了含有兩個(gè)或多個(gè)上述修飾的變體。
另外，向此處描述的任何變體導(dǎo)入點(diǎn)突變可能是有益的。
活性部位周?chē)勺冃蕴岣叩摩?淀粉酶變體可以通過(guò)替換靠近底物部位的1或多個(gè)位點(diǎn)的1或多個(gè)氨基酸殘基來(lái)提高本發(fā)明α-淀粉酶變體的可變性。這些位點(diǎn)是(使用SP722α-淀粉酶(SEQID NO2)的編號(hào))V56，K108，D168，Q169，Q172，L201，K269，L272，L275，K446，P459。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及在1或多個(gè)上述位點(diǎn)發(fā)生突變的變體。
優(yōu)選的取代是下列中的1或多個(gè)V56A，G，S，T；K108A，D，E，Q，G，H，I，L，M，N，S，T，V；D168A，G，I，V，N，S，T；Q169A，D，G，H，I，L，M，N，S，T，V；Q172A，D，G，H，I，L，M，N，S，T，V；L201A，G，I，V，S，T；K269A，D，E，Q，G，H，I，L，M，N，S，T，V；L272A，G，I，V，S，T；L275A，G，I，V，S，T；Y295A，D，E，Q，G，H，I，L，M，N，F(xiàn)，S，T，V；K446A，D，E，Q，G，H，I，L，M，N，S，T，V；P459A，G，I，L，S，T，V.
在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，用具有SEQ ID NO1所示序列的芽孢桿菌菌株NCIB12512α-淀粉酶，或者具有SEQ ID NO3所示序列的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶，或者具有SEQ ID NO4所示序列的地衣形芽孢桿菌α-淀粉酶，或者具有SEQ ID NO5所示序列的解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶作為進(jìn)行這些突變的主鏈。
從圖1的對(duì)比可以看到，地衣形芽孢桿菌α-淀粉酶和解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶在與SP722中的K269相對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)有一個(gè)Glu。另外，嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶在與SP722中的K269相對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)有一個(gè)Ser。因此，所述取代與這些α-淀粉酶無(wú)關(guān)。
另外，從圖1的對(duì)比可以看到，解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶在與SP722中的L272相對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)有一個(gè)Ala，嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶在與SP722中的L272相對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)有一個(gè)Ile。因此，所述取代與這些α-淀粉酶無(wú)關(guān)。
從圖1的對(duì)比可以看到，芽孢桿菌菌株12512α-淀粉酶在與SP722中的L275相對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)有一個(gè)Ile。因此所述取代與該α-淀粉酶無(wú)關(guān)。
從圖1的對(duì)比可以看到，解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶在與SP722中的Y295相對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)有一個(gè)Phe。另外，嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶在與SP722中的Y295相對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)有一個(gè)Asn。因此，所述取代與這些α-淀粉酶無(wú)關(guān)。
從圖1的對(duì)比可以看到，地衣形芽孢桿菌α-淀粉酶和解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶在與SP722中的K446相對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)有一個(gè)Asn。另外，嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶在與SP722中的K446相對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)有一個(gè)His。因此，所述取代與這些α-淀粉酶無(wú)關(guān)。
從圖1的對(duì)比可以看到，地衣形芽孢桿菌α-淀粉酶，解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶以及嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶在與SP722中的P459相對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)有一個(gè)Ser。另外，芽孢桿菌菌株12512α-淀粉酶在與SP722中的P459相對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)有一個(gè)Thr。因此，所述取代與這些α-淀粉酶無(wú)關(guān)。
在中溫有較高活性的酶的穩(wěn)定化本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案涉及提高低溫α-淀粉酶(例如河豚毒素交替單胞菌(Feller等，(1994)，歐洲生物化學(xué)雜志222441-447))和中溫α-淀粉酶(例如SP722和SP690)的穩(wěn)定性，這些酶具有中溫活性，即通常稱(chēng)為嗜冷酶和嗜溫酶。對(duì)于這一特定酶類(lèi)，穩(wěn)定性應(yīng)理解為熱穩(wěn)定性或在鈣耗竭條件下的穩(wěn)定性。
通常，在中溫顯示高活性的酶在那些對(duì)酶有抑制作用的條件(比如溫度或鈣耗竭)下也會(huì)有嚴(yán)重問(wèn)題。
從而，本發(fā)明的目的是提供在中溫顯示所需高活性，同時(shí)在輕微抑制條件下不喪失活性的酶。
應(yīng)當(dāng)優(yōu)選穩(wěn)定化變體于中溫測(cè)定的活性是初始活性的100％或以上與50％之間，更優(yōu)選在100％或以上與70％之間，最優(yōu)選在100％或以上與85％之間，所述初始活性是酶在穩(wěn)定化前在該特定溫度的活性，并且得到的酶應(yīng)能在抑制條件下比野生型的酶忍受更長(zhǎng)時(shí)間的溫育。
可以考慮的酶包括例如細(xì)菌或真菌來(lái)源的α-淀粉酶。
一例這類(lèi)低溫α-淀粉酶是分離自河豚毒素交替單胞菌(Feller等，(1994)，歐洲生物化學(xué)雜志222441-447)的酶。已得到了該α-淀粉酶的晶體結(jié)構(gòu)(Aghajari等，(1998)，蛋白質(zhì)科學(xué)7564-572)。
河豚毒素交替單胞菌α-淀粉酶(圖4所示對(duì)比結(jié)果的5)與豬胰腺α-淀粉酶(PPA)(圖4所示對(duì)比結(jié)果的3)大約66％同源。PPA 3D結(jié)構(gòu)是已知的，并且可從Brookhaven數(shù)據(jù)庫(kù)中以1OSE或1DHK的名字獲得。根據(jù)與其他更穩(wěn)定的α-淀粉酶的同源性，可以使得來(lái)自河豚毒素交替單胞菌α-淀粉酶實(shí)現(xiàn)“低溫高活性酶”的穩(wěn)定化，并同時(shí)維持所需的中溫高活性。
圖4顯示5個(gè)α-淀粉酶，包括AHA和PPAα-淀粉酶的多重序列對(duì)比。使河豚毒素交替單胞菌α-淀粉酶的穩(wěn)定性提高的特異突變是T66P，Q69P，R155P，Q177R，A205P，A232P，L243R，V295P，S315R。
制備α-淀粉酶變體的方法幾種將突變導(dǎo)入基因的方法是本領(lǐng)域已知的。簡(jiǎn)要討論α-淀粉酶-編碼DNA序列之后，將討論在α-淀粉酶-編碼序列中的特定位點(diǎn)產(chǎn)生突變的方法。
克隆編碼α-淀粉酶的DNA序列可以利用多種本領(lǐng)域的公知方法，從任何能產(chǎn)生目的α-淀粉酶的細(xì)胞或微生物中分離編碼親本α-淀粉酶的DNA序列。首先，應(yīng)當(dāng)利用得自能產(chǎn)生目的α-淀粉酶的有機(jī)體的染色體DNA或信使RNA來(lái)構(gòu)建基因組DNA和/或cDNA文庫(kù)。然后，如果α-淀粉酶的氨基酸序列是已知的，可以合成并合成并用同源的，標(biāo)記的寡核苷酸來(lái)由從目的有機(jī)體制備的基因組文庫(kù)鑒定α-淀粉酶-編碼克隆。另外，可以使用標(biāo)記的寡核苷酸探針(該探針含有與已知α-淀粉酶基因同源的序列)作為探針，采用低嚴(yán)謹(jǐn)性雜交和洗滌條件來(lái)鑒定α-淀粉酶-編碼克隆。
另一種鑒定α-淀粉酶-編碼克隆的方法包括將基因組DNA片段插入表達(dá)載體(比如質(zhì)粒)，用所得基因組DNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化α-淀粉酶陰性的細(xì)菌，以及隨后將轉(zhuǎn)化細(xì)菌鋪到含有α-淀粉酶底物的瓊脂上，從而能鑒定表達(dá)α-淀粉酶的克隆。
可選擇地，可以通過(guò)已確立的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)合成制備編碼酶的DNA序列，例如S.L.Beaucage和M.H.Caruthers(1981)描述的磷酸脒方法或Matthes等(1984)描述的方法。在磷酸脒方法中，在例如自動(dòng)DNA合成儀中合成寡核苷酸，將其純化，退火，連接和克隆到合適的載體中。
最后，DNA序列可以是基因組和合成來(lái)源混合的，合成和cDNA來(lái)源混合的，或者基因組和cDNA來(lái)源混合的，其是依照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，將合成的，基因組或cDNA來(lái)源的片段連接在一起而制備的(在合適時(shí)，對(duì)應(yīng)完整DNA序列各部分的片段)。還可以如US4683202或R.K.Saiki等(1988)描述的，使用特異引物通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來(lái)制備DNA序列。
表達(dá)α-淀粉酶變體根據(jù)本發(fā)明，可以利用表達(dá)載體將通過(guò)上述方法，或者通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何替代方法制備的編碼變體的DNA序列表達(dá)為酶的形式，載體通常包括調(diào)控序列，該序列編碼啟動(dòng)子，操縱子，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，翻譯起始信號(hào)以及任選地，阻遏子基因或各種激活子基因。
攜帶編碼本發(fā)明所述α-淀粉酶變體之DNA序列的重組表達(dá)載體可以是任何能方便地進(jìn)行重組DNA操作的載體，且載體的選擇通常取決于它將要導(dǎo)入的宿主細(xì)胞。因此，載體可以是自主復(fù)制的載體，即以染色體外個(gè)體存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體的復(fù)制，例如質(zhì)粒，噬菌體或染色體外元件，微小染色體或人工染色體?？蛇x擇地，載體可以是這樣的，當(dāng)被導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)，它會(huì)整合到宿主基因組中，并與所整合到其中的染色體一起復(fù)制。
在所述載體中，DNA序列應(yīng)當(dāng)可操縱地連接到合適的啟動(dòng)子序列。該啟動(dòng)子可以是任何在所選宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的DNA序列，并可以來(lái)源于編碼宿主細(xì)胞的同源或異源蛋白質(zhì)的基因。適于引導(dǎo)編碼本發(fā)明所述α-淀粉酶變體的DNA序列的轉(zhuǎn)錄的合適的啟動(dòng)子序列是在所選宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的序列，并可以來(lái)源于編碼宿主細(xì)胞的同源或異源蛋白質(zhì)的基因。適于引導(dǎo)編碼本發(fā)明所述α-淀粉酶變體的DNA序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄(特別是在細(xì)菌宿主中)的啟動(dòng)子的例子是大腸桿菌lac操縱子的啟動(dòng)子，天藍(lán)色鏈霉菌瓊脂糖酶基因dagA的啟動(dòng)子，地衣形芽孢桿菌α-淀粉酶(amyL)的啟動(dòng)子，嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽淀粉酶基因(amyM)的啟動(dòng)子，解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶(amyQ)的啟動(dòng)子，枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因等的啟動(dòng)子。在真菌宿主中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時(shí)，有用的啟動(dòng)子的例子是來(lái)源于這樣一些基因的啟動(dòng)子，所述基因編碼米曲霉TAKA淀粉酶，米赫氏根霉天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸穩(wěn)定α-淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，米赫氏根霉脂酶，米曲霉堿性蛋白酶，米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶或構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶。
本發(fā)明的表達(dá)載體還可以包含合適的轉(zhuǎn)錄終止子以及，在真核細(xì)胞中時(shí)的多腺苷酸化序列，它們與編碼發(fā)明所述α-淀粉酶變體的DNA序列可操縱地連接在一起。終止和多腺苷酸化序列可以適當(dāng)?shù)貋?lái)自與啟動(dòng)子相同的來(lái)源。
載體還可以包含能使載體在目的宿主細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制的DNA序列。這類(lèi)序列的例子是質(zhì)粒pUC19，pACYC177，pUB110，pE194，pAMB1和pIJ702的復(fù)制原點(diǎn)。
載體還可以包含選擇標(biāo)記，例如一個(gè)其產(chǎn)物能補(bǔ)償宿主細(xì)胞缺陷的基因，比如來(lái)自枯草芽孢桿菌或地衣形芽孢桿菌的dal基因；或者賦予抗生素抗性(比如氨芐青霉素，卡那霉素，氯霉素或四環(huán)素抗性)的基因。另外，載體可以包含曲霉選擇標(biāo)記，比如amdS，argB，niaD和sC，產(chǎn)生潮霉素抗性的標(biāo)記，或者可以通過(guò)共轉(zhuǎn)化(例如WO91/17243中描述的)來(lái)實(shí)現(xiàn)選擇。
胞內(nèi)表達(dá)在某些方面可能是有益的，例如用某種細(xì)菌作為宿主細(xì)胞時(shí)，但通常優(yōu)選表達(dá)是胞外的?？傊颂幪峒暗难挎邨U菌α-淀粉酶包含一個(gè)允許被表達(dá)的蛋白酶分泌到培養(yǎng)基中的前導(dǎo)區(qū)。如果需要，可以方便地通過(guò)取代編碼該前區(qū)的DNA序列來(lái)將該前區(qū)替換為不同的前導(dǎo)區(qū)或信號(hào)序列。
用于分別將編碼α-淀粉酶變體，啟動(dòng)子，終止子和其他元件的本發(fā)明所述DNA構(gòu)建體連接在一起，并將其插入合適的包含復(fù)制所用的必要信息之載體的步驟是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的(參考，例如，Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第2版，Cold Spring Harbor，1989)。
本發(fā)明的細(xì)胞，它包含如上所述的本發(fā)明DNA構(gòu)建體或表達(dá)載體，可以有效地作為重組制備本發(fā)明α-淀粉酶變體的宿主細(xì)胞?？梢杂帽景l(fā)明編碼變體的DNA構(gòu)建體，方便地通過(guò)將該構(gòu)建體(以1或多拷貝)整合到宿主染色體中來(lái)轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞。通常認(rèn)為整合是有益的，因?yàn)檫@樣DNA序列更可能穩(wěn)定地保持在細(xì)胞中?？梢砸勒粘Ｒ?guī)方法，例如通過(guò)同源或異源重組將DNA構(gòu)建體整合到宿主染色體中。可選擇地，可以根據(jù)宿主細(xì)胞的不同類(lèi)型用上面描述過(guò)的表達(dá)載體來(lái)轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
本發(fā)明的細(xì)胞可以是更高等的生物，比如哺乳動(dòng)物或昆蟲(chóng)的細(xì)胞，但優(yōu)選是微生物細(xì)胞，比如細(xì)菌或真菌(包括酵母)細(xì)胞。
合適的細(xì)菌的例子是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，比如枯草芽孢桿菌，地衣形芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌，短芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，嗜堿芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，凝結(jié)芽孢桿菌，環(huán)狀芽孢桿菌，燦爛芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌，或者淺青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌，或者是革蘭氏陰性細(xì)菌，比如大腸桿菌。可以通過(guò)例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化或利用競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞以已知方式來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的轉(zhuǎn)化。
可以有利地從酵母屬或裂殖酵母屬中選擇酵母微生物，例如釀酒酵母。絲狀真菌最好是屬于曲霉屬的種，例如米曲霉或黑曲霉?？梢酝ㄟ^(guò)一個(gè)包括原生質(zhì)體形成和轉(zhuǎn)化，以及隨后以已知方式再生細(xì)胞壁的方法來(lái)轉(zhuǎn)化真菌細(xì)胞。在EP238023中描述了轉(zhuǎn)化曲霉宿主細(xì)胞的適用步驟。
再一方面，本發(fā)明涉及制備發(fā)明所述α-淀粉酶變體的方法，該方法包括在有助于變體生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)以上描述的宿主細(xì)胞，以及從細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中回收變體。
用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是任何適合目的宿主細(xì)胞生長(zhǎng)以及本發(fā)明所述α-淀粉酶變體進(jìn)行表達(dá)的常規(guī)培養(yǎng)基?？梢詮墓?yīng)商那里獲得合適的培養(yǎng)基或者可以根據(jù)公開(kāi)的配方(例如，美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中所描述的)來(lái)制備。
可以通過(guò)公知方法從培養(yǎng)基中方便地回收宿主細(xì)胞所分泌的α-淀粉酶變體，這些方法包括通過(guò)離心或過(guò)濾從培養(yǎng)基中分離細(xì)胞，以及借助鹽(比如硫酸銨)來(lái)沉淀培養(yǎng)基中的蛋白類(lèi)成分，然后利用層析操作，比如離子交換層析，親合層析等。
工業(yè)應(yīng)用本發(fā)明的α-淀粉酶變體具備適合多種工業(yè)應(yīng)用的有價(jià)值的特性。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的酶變體可以作為洗滌，餐具清洗和硬金屬表面清潔的洗滌劑組合物的成分。
許多變體在由淀粉生產(chǎn)甜味劑和乙醇，和/或紡織品退漿時(shí)尤其有用。在例如US3912590和歐洲專(zhuān)利
發(fā)明者托賓·V·博徹特, 阿倫·斯文森, 卡斯滕·安德森, 比賈尼·R·尼爾森, 托賓·L·尼森, 索倫·克賈魯爾夫, R 尼爾森, 安德森, L 尼森, 克賈魯爾夫, 托賓 V 博徹特, 斯文森 申請(qǐng)人:諾維信公司