專利名稱：利用水稻轉(zhuǎn)錄因子基因OsNACx提高植物抗旱耐鹽能力的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種水稻DNA片段(基因)的分離克隆、功能驗(yàn)證和應(yīng)用。所述的基因與植物抗旱和耐鹽有關(guān)。將該基因的完整翻譯區(qū)(Coding sequence)與花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子(CaMV35S)結(jié)合后直接轉(zhuǎn)入一般植物體，轉(zhuǎn)基因植株的抗旱和耐鹽能力顯著提高。
背景技術(shù)：
植物在生長的過程中會(huì)受到諸多環(huán)境因素的影響，干旱和鹽害往往導(dǎo)致農(nóng)作物的大規(guī)模減產(chǎn)，在許多地區(qū)是農(nóng)業(yè)發(fā)展的瓶頸。培育抗逆性作物品種一直是農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究的主要目標(biāo)之一。為了抵抗或適應(yīng)環(huán)境不利因素，植物體感受細(xì)胞外環(huán)境條件的變化并通過多種途徑將其傳遞到細(xì)胞內(nèi)，會(huì)誘導(dǎo)表達(dá)一些應(yīng)答基因，產(chǎn)生一些使細(xì)胞免受干旱、高鹽、低溫等脅迫傷害的功能蛋白、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以及傳遞信號(hào)和調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，從而對外界的變化做出相應(yīng)的反應(yīng)(Xiong等，Cell signaling during cold，drought and salt stress.Plant Cell.14(suppl)，S165-S183，2002)。而那些功能基因?qū)Νh(huán)境做出反應(yīng)的過程中能否正確表達(dá)受到調(diào)控因子的精1 細(xì)調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)錄因子作為一種調(diào)控基因，當(dāng)生物體感受逆境脅迫時(shí)，能調(diào)控一系列下游基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)植物體對逆境的耐受能力，達(dá)到抵抗不良環(huán)境條件脅迫的效果。Kawasaki等(2001)利用表達(dá)芯片分析了水稻在高鹽脅迫下的早期表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)有大量的基因能被誘導(dǎo)或抑制，這些基因的誘導(dǎo)表達(dá)受到了轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)參與(Kawasaki S，Borchert C，Deyholos M，Wang H，Brazille S，Kawai K，Galbraith D and Bohnert H J.Gene expression profiles during theinitial phase of salt stress in rice.Plant Cell.2001，13889-905.)。而在擬南芥中發(fā)現(xiàn)AP2/EREBP，Zinc finger，Myb，bZIP類轉(zhuǎn)錄因子家族在不同的逆境脅迫下，可誘導(dǎo)表達(dá)或被抑制(Shinozaki K等.Monitoring the Expression Pattern of 1300 Arabidopsis Genes underDrought and Cold Stresses by Using a Full-Length cDNA Microarray.Plant Cell.2001，1361-72.)。因而認(rèn)為這些轉(zhuǎn)錄因子家族在植物對逆境的應(yīng)答過程中起著非常重要的調(diào)控作用。因此分離和鑒定對逆境起核心調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，并用于作物抗逆境的遺傳改良，對育種有著重要的意義。根據(jù)已有的擬南芥轉(zhuǎn)錄因子的信息，人們已在植物抗性改良方面作了嘗試，利用DREB1A和DREB2A培育的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，其低溫耐性和干旱，高鹽耐性都比野生型強(qiáng)(Liu Q等Two transcription factors，DREB1 and DREB2，with an EREBP/AP2DNA domains separatetwo cellular signal thansduction pathways in drought-and low-temperature-responsivegene expression，respectively，in Arabidopsis.Plant Cell.1998，101391-1406.)。美國Michigan州立大學(xué)的Thomashow MF研究小組利用擬南芥CBF1基因，進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，也培育出耐寒性增強(qiáng)的植株。
水稻是最重要的糧食作物之一，抗旱或耐鹽的水稻對我們來說具有重要的意義。但目前在水稻中還沒培育出耐旱或耐鹽的轉(zhuǎn)基因植株，因而找出與抗旱或耐鹽的轉(zhuǎn)錄因子，培育耐旱和耐寒的品種對提高水稻產(chǎn)量具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是從水稻中分離克隆一個(gè)包含有抗旱相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因完整編碼區(qū)段的DNA片段，利用這個(gè)基因改良水稻或其它植物抗旱的能力。對這個(gè)基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析其屬于植物特異的轉(zhuǎn)錄因子NAC家族，因此被命名為OsNACx。
本發(fā)明涉及分離和應(yīng)用一種包含OsNACx基因的DNA片段，該片段賦予植物在于早等逆境條件下，增強(qiáng)耐受能力。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO1所示，或者基本上相當(dāng)于SEQ IDNO1所示的高度同源DNA序列，或者其功能相當(dāng)于SEQ ID NO1所示序列的亞片段。
可以采用已經(jīng)克隆的OsNACx基因作探針，從cDNA和基因組文庫中篩選得到本發(fā)明的基因或同源基因。同樣，也可以采用PCR(polymerase chain reaction)技術(shù)，從基因組、mRNA和cDNA中擴(kuò)增得到本發(fā)明的OsNACx基因以及任何感興趣的一段DNA或與其同源的一段DNA。采用以上技術(shù)，可以分離得到包含OsNACx基因的序列，將這一序列與任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植株，可獲得對干旱，高鹽脅迫耐受力得到增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的基因在構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前加上任何一種強(qiáng)啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。本發(fā)明的基因在構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時(shí)，也可使用增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子和鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的翻譯。
攜帶有本發(fā)明OsNACx基因的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒，植物病毒載體，直接DNA轉(zhuǎn)化，微注射，電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞(Weissbach，1998，Method for PlantMolecular Biology VIII，Academy Press，New York，pp.411-463；Geiserson and Corey，1998，Plant Molecular Biology(2ndEdition)。
可使用包括本發(fā)明的OsNACx基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主是包括水稻在內(nèi)多種植物，培育抗旱，抗鹽或抗寒的植物品種。
本發(fā)明基因是受逆境誘導(dǎo)表達(dá)的，因此其啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，將本發(fā)明的啟動(dòng)子區(qū)段與任何感興趣的基因同時(shí)連入合適的表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化植物宿主，在逆境條件下可誘導(dǎo)表達(dá)基因，提高植物對逆境的耐受能力。
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。


序列表SEQ ID No1顯示的是本發(fā)明分離克隆的包含有OsNACx基因編碼區(qū)和啟動(dòng)子區(qū)的DNA片段序列。
圖1OsNACx基因分離和鑒定流程圖。
圖2采用ClustalW軟件(公開使用軟件)將OsNACx基因與NAC類轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行同源性比較結(jié)果。
圖3采用GENSCAN(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)基因結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件對OsNACx基因完整序列分析的結(jié)果。圖中Gn代表基因編號(hào)；Ex代表外顯子；Init代表基因起始端外顯子；Term代表基因終止端外顯子；Prom代表基本啟動(dòng)子；PlyA代表PolyA；S代表DNA鏈，其中“+”表示分析過程中輸入的DNA序列鏈；Begin代表外顯子、啟動(dòng)子或PolyA在輸入DNA序列中的起始位置；End代表外顯子、啟動(dòng)子或PolyA在輸入DNA序列中的終止位置；Len代表外顯子、啟動(dòng)子或PolyA的序列長度(bp)；Fr代表翻譯閱讀框(每條DNA序列有3個(gè)翻譯閱讀框)；I/Ac代表3’剪切位點(diǎn)分值；Do/T代表5’剪切位點(diǎn)分值；CodRg代表翻譯區(qū)分值；P代表外顯子概率；Tscr代表外顯子分值。
圖4用Northern雜交檢測OsNACx基因在干旱，高鹽，低溫和ABA等逆境脅迫不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平。
圖5OsNACx基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)情況，第一道為對照，其余為轉(zhuǎn)基因獨(dú)立轉(zhuǎn)基因植株。
圖6成株期OsNACx超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因家系在田間干旱脅迫22天后的生長情況。
圖7幼苗期OsNACx超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因家系在高鹽(200mM)脅迫12天后，轉(zhuǎn)基因各家系的生長情況。圖中A為對照，B為轉(zhuǎn)基因家系T40S19，C為轉(zhuǎn)基因家系T40S24，D為轉(zhuǎn)基因家系T40S26，E為轉(zhuǎn)基因家系T40S8，F(xiàn)為轉(zhuǎn)基因家系T40S25。
圖8OsNACx基因轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞后，根據(jù)LacZ報(bào)告基因的表達(dá)情況來檢測OsNACx基因的反式激活活性。
圖9OsNACx基因在植物細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位及自身啟動(dòng)子表達(dá)。圖8A為在熒光顯微鏡下檢測抗性愈傷中OsNACx-GFP的表達(dá)情況；圖8B為OsNACx-GFP在愈傷細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位，其中(a)為愈傷切片在熒光染料碘化丙啶染色后觀察的結(jié)果，(b)為綠色熒光下GFP表達(dá)的圖像，(c)為紅綠熒光合成的結(jié)果。
圖10是本發(fā)明的超量表達(dá)載體PCAMBIA1301結(jié)構(gòu)示意圖。
圖11是本發(fā)明的亞細(xì)胞定位載體PCAMBIA1381-EGFP結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的前期工作獲得了來源于水稻品種明恢63(一種中國普遍推廣應(yīng)用的一個(gè)水稻品種)的cDNA克隆04I24。該cDNA是OsNACx基因的cDNA片斷，是一個(gè)抗旱相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子。主要依據(jù)有以下幾個(gè)方面(1)采用cDNA芯片技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)cDNA克隆04I24在水稻品種“中旱5號(hào)”(由中國上海農(nóng)科院提供的一個(gè)公開使用的一個(gè)水稻品種)干旱脅迫處理15天表達(dá)量增加3.5倍。對其進(jìn)行測序，分析發(fā)現(xiàn)其編碼產(chǎn)物與OsNAC4同源性高達(dá)64％(圖2)。鑒于該克隆表達(dá)量在干旱處理后的明顯差異和其功能特征，認(rèn)為04I24克隆所代表的基因在干旱下參與調(diào)控基因的表達(dá)。(2)對其進(jìn)行逆境條件下的表達(dá)譜分析(圖4)，發(fā)現(xiàn)在脅迫處理的過程中，表達(dá)量有明顯的提高。(3)，將其全長基因在植株中超量表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性和抗高鹽能力大大增強(qiáng)(圖6和圖7)。這些結(jié)果都表明OsNACx基因是一個(gè)逆境相關(guān)調(diào)控基因，不僅參與調(diào)控抗旱，也參與調(diào)控抗高鹽和寒冷。
以下實(shí)施例進(jìn)一步定義本發(fā)明，并描述了本發(fā)明在上述前期工作基礎(chǔ)上分離克隆包含有OsNACx基因完整編碼區(qū)段的DNA片段以及驗(yàn)證OsNACx基因功能的方法(發(fā)明流程如圖1所示)。根據(jù)以下的描述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。
實(shí)施例1分離克隆包含有OsNACx基因區(qū)段的DNA片段和OsNACx基因通過水稻品種“中旱5號(hào)”(由中國上海農(nóng)科院提供的一個(gè)公開使用的一個(gè)水稻品種)的干旱誘導(dǎo)基因表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)受干旱強(qiáng)烈誘導(dǎo)(干旱脅迫后期表達(dá)量提高3.5倍以上)的EST(表達(dá)序列簽)，經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因?yàn)檗D(zhuǎn)錄因子家族NAC的一個(gè)成員，并且是5’端部分序列。通過查找日本水稻全長數(shù)據(jù)庫(http//cdna01.dna.affrc.go.jp)，找到其所對應(yīng)的CDNA克隆J012130D02，并將其定位于第三染色體BAC克隆AC135594上。根據(jù)BAC克隆AC135594序列，并預(yù)測其啟動(dòng)子區(qū)域，設(shè)計(jì)引物PF(5-CAGAATTCAAAGCAACAGTGGAGAGAAAAC，序列特異引物外加接頭EcoRI位點(diǎn))和FR(5-TAGGATCCCCGAGCCATCTCTTGAC，序列特異引物外外加接頭BamHI)，將BAC克隆AC135594的9781-12321bp序列從“中旱5號(hào)”品種的總DNA中擴(kuò)增出來。擴(kuò)增產(chǎn)物就是本發(fā)明的序列1-2540bp(圖3)。具體步驟為提取水稻品種“中早5號(hào)”葉片中的總DNA(CTAB法抽提，Zhang等，genetic diversity and differentiation of indica an japonica ricedetected by RFLP analysis，1992，Theor Appl Genet，83，495-499)作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃3min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。將擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物連入pGEM-T載體(購自Promega公司)，篩選陽性克隆并測序(ABI3730測序儀)，獲得所需的包含有OsNACx基因區(qū)段和預(yù)測的自身啟動(dòng)子的DNA片段。該克隆命名為PGEM-NAC-PRO。
采用TRIZOL試劑(購自Invitrogen公司)從干旱脅迫處理的水稻品種“中旱5號(hào)”中提取葉片總RNA(提取方法根據(jù)上述TRIZOL試劑說明書)，利用反轉(zhuǎn)錄酶(購自Invitrogen公司)將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，反應(yīng)條件為65℃5min，42℃50min，70℃10min。根據(jù)cDNA克隆04I24的序列設(shè)計(jì)的巢式引物FF(5-TAGGTACCAGAAGCAAGCAAGAAGCGAT，加接頭KpnI)和FR(5-TAGGATCCCCGAGCCATCTCTTGAC，外加接頭BamHI)將其從反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中擴(kuò)增出來，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2min；94℃30sec，55℃30sec，72℃2min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。將擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物連入pGEM-T載體(購自Promega公司)，篩選陽性克隆并測序，獲得所需的全長基因。該克隆命名為PGEM-OsNACx。
實(shí)施例2檢測水稻內(nèi)源基因OsNACx的誘導(dǎo)表達(dá)以水稻品種“中旱5號(hào)”為材料，在3葉期分別進(jìn)行干旱、冷害和高鹽脅迫以及ABA處理。干旱處理是用20％的聚乙二醇(商品名為PEG6000，一種)浸泡幼苗根部，0h，0.5h，1h，2h，4h，6h后取樣。冷害處理是將幼苗置于4℃生長箱，0h，1h，8h，12h后取樣。高鹽脅迫是將幼苗根部浸泡在200mM/L NaCl溶液中并在0h，4h，8h，16h后取樣。ABA處理是將幼苗根部浸泡在100μM/L ABA溶液中并在0h，0.5h，3h，6h，12h和24h后取樣。提取葉片的總RNA(Trizol試劑，Invitrogen)后按《分子克隆》(科學(xué)出版社，北京，1999年版)有關(guān)實(shí)驗(yàn)操作方法進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)膜，并以O(shè)sNACx為探針做Northern雜交。結(jié)果表明，本發(fā)明克隆的基因OsNACx能被干旱、冷害、高鹽和ABA誘導(dǎo)表達(dá)(如圖4所示)，是一個(gè)與逆境相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。
實(shí)施例3，OsNACx基因超量表達(dá)載體的構(gòu)建，轉(zhuǎn)化根據(jù)實(shí)施例2的結(jié)果，知道本發(fā)明基因OsNACx是能被干旱、冷害、高鹽和ABA誘導(dǎo)表達(dá)的，為了能更好地闡明此基因的功能，申請人將其在水稻中超量表達(dá)，從轉(zhuǎn)基因植株的表型來驗(yàn)證。方法是首先將實(shí)施例1中得到的陽性克隆pGEM-OsNACx質(zhì)粒用BamHI和KpnI雙酶切，回收外源片段；同時(shí)，用同樣的方法酶切攜帶雙煙草花葉病毒啟動(dòng)子35S的的遺傳轉(zhuǎn)化載體pD35S1301(pD35S1301是在國際上常用的植物遺傳轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1301(來自澳大利亞CAMBIA實(shí)驗(yàn)室(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture)基礎(chǔ)上改建的，攜帶具有組成型和超量表達(dá)特征的雙煙草花葉病毒啟動(dòng)子35S的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化載體)，酶切完畢，用氯仿異戊醇(24∶1)抽提，純化酶切產(chǎn)物。用包含OsNACx基因的酶切片段和酶切的pD35S1301載體(如附圖10所示)做連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10β(菌株購自Invitrogen公司)。通過酶切篩選陽性克隆，獲得轉(zhuǎn)化載體。
通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系將其導(dǎo)入到水稻品種中花11(中國水稻研究所提供的一個(gè)公開使用的一個(gè)水稻品種)中，經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、篩選具有潮霉素抗性的愈傷、分化、生根、練苗移栽，得到轉(zhuǎn)基因植株。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻(粳稻亞種)遺傳轉(zhuǎn)化體系應(yīng)用Hiei等人報(bào)道的方法(參見Efficient transformation of rice，Oryza sativa L.，mediated byAgrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，1994，Plant Journal6271-282)基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化。主要步驟和試劑如下(1)試劑和溶液縮寫本發(fā)明中培養(yǎng)基所用到的植物激素的縮寫表示如下6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-芐基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧芐青霉素)；KT(Kinetin，激動(dòng)素)；NAA(Napthaleneacetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亞砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix(N6微量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmix(MS微量成分溶液)(2)主要溶液配方1)N6培養(yǎng)基大量元素母液[以10倍濃縮液(10X)計(jì)]的配制硝酸鉀(KNO3) 28.3g磷酸二氫鉀(KH2PO4) 4.0g硫酸銨((NH4)2SO4) 4.63g硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 1.85g氯化鈣(CaCl2·2H2O) 1.66g逐一溶解，然后室溫下用蒸餾水定容至1000ml。
2)N6培養(yǎng)基微量元素母液[以100倍濃縮液(100X)計(jì)]的配制碘化鉀(KI) 0.08g硼酸(H3BO3) 0.16g硫酸錳(MnSO4·4H2O) 0.44g硫酸鋅(ZnSO4·7H2O) 0.15g室溫下溶解并用蒸餾水定容至1000ml。
3)鐵鹽(Fe2EDTA)貯存液(以100X)計(jì)的配制準(zhǔn)備800ml雙蒸水并加熱至70℃，加入乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA·2H2O)3.73克，充分溶解后在70℃水浴中保持2小時(shí)，用蒸餾水定容至1000ml，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 4)維生素貯存液(以100X計(jì))配制煙酸(Nicotinic acid) 0.1g維生素B1(Thiamine HCl) 0.1g維生素B6(Pyridoxine HCl) 0.1g甘氨酸(Glycine)0.2g肌醇(Inositol) 10g加蒸餾水定容至1000ml，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 5)MS培養(yǎng)基大量元素母液(以10X計(jì))的配制硝酸銨(NH4NO3) 16.5g硝酸鉀 19.0g磷酸二氫鉀 1.7g硫酸鎂 3.7g
氯化鈣 4.4g室溫下溶解并用蒸餾水定容至1000ml。
6)MS培養(yǎng)基微量元素母液(以100X計(jì))的配制碘化鉀0.083g硼酸 0.62g硫酸錳 0.86g鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O) 0.025g硫酸銅(CuSO4·5H2O) 0.0025g室溫下溶解并用蒸餾水定容至1000ml。
7)2，4-D貯存液(以1mg/ml計(jì))的配制秤取2，4-D 100mg，用1ml 1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后用蒸餾水定容至100ml，于室溫下保存。
8)6-BA貯存液(以1mg/ml計(jì))的配制秤取6-BA 100mg，用1ml 1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后用蒸餾水定容至100ml，室溫保存。
9)萘乙酸(NAA)貯存液(以1mg/ml計(jì))的配制秤取NAA 100mg，用1ml 1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后用蒸餾水定容至100ml，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 10)吲哚乙酸(IAA)貯存液(以1mg/ml計(jì))的配制秤取IAA 100mg，用1ml 1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，4℃保存?zhèn)湓谝粋€(gè)大三角瓶中加入300ml蒸餾水和硫酸鐵(FeSO4·7H2O)2.78g。在另一個(gè)大三角瓶中加入300ml蒸餾水備用。
11)葡萄糖貯存液(以0.5g/ml計(jì))的配制秤取葡萄糖125g，然后用蒸餾水溶解定容至250ml，滅菌后4℃保存?zhèn)溆谩?2)AS貯存液的配制秤取AS 0.392g，DMSO 10ml，分裝至1.5ml離心管內(nèi)，4℃保存?zhèn)溆谩?3)1N氫氧化鉀貯存液秤取氫氧化鉀5.6g，并用蒸餾水溶解定容至100ml，室溫保存?zhèn)溆谩?br> (3)用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基配方1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6max母液(10X)100mlN6mix母液(100X)10mlFe2+EDTA貯存液(100X) 10ml
維生素貯存液(100X)10ml2，4-D貯存液 2.5ml脯氨酸(Proline) 0.3gCH0.6g蔗糖(Sucrose) 30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。
pH＝5.82)繼代培養(yǎng)基N6max母液(10X) 100mlN6mix母液(100X) 10mlFe2+EDTA貯存液(100X) 10ml維生素貯存液(100X)10ml2，4-D貯存液 2.0ml脯氨酸0.5gCH0.6g蔗糖 30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。
3)預(yù)培養(yǎng)基N6max母液(10X) 12.5mlN6mix母液(100X) 1.25mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X) 2.5ml2，4-D貯存液0.75mlCH 0.15g蔗糖5g瓊脂粉(Agarose) 1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6，封口滅菌。
使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250μl AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。
pH值＝5.64)共培養(yǎng)基N6max母液(10X) 12.5mlN6mix母液(100X) 1.25mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X) 2.5ml2，4-D貯存液0.75mlCH0.2g蔗糖5g瓊脂粉 1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6，封口滅菌。
使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250μl AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/每皿)。
5)懸浮培養(yǎng)基N6max母液(10X) 5mlN6mix母液(100X) 0.5mlFe2+EDTA貯存液(100X) 0.5ml維生素貯存液(100X) 1ml2，4-D貯存液 0.2mlCH0.08g蔗糖 2g加蒸餾水至100ml，調(diào)節(jié)pH值到5.4，分裝到兩個(gè)100ml的三角瓶中，封口滅菌。
使用前加入1ml葡萄糖貯存液和100μl AS貯存液。
6)選擇培養(yǎng)基的通用培養(yǎng)基N6max母液(10X) 25mlN6mix母液(100X) 2.5mlFe2+EDTA貯存液(100X) 2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml2，4-D貯存液0.625mlCH0.15g
蔗糖7.5g瓊脂粉 1.75g加蒸餾水至250ml，調(diào)節(jié)pH值到6.0，封口滅菌。
使用前溶解培養(yǎng)基，加入250μl潮酶素(50mg/ml)和400ppm羧芐青霉素(CN)，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。
7)預(yù)分化培養(yǎng)基N6max母液(10X) 25mlN6mix母液(100X)2.5mlFe2+EDTA貯存液(100X) 2.5ml維生素貯存液(100X) 2.5ml6-BA貯存液 0.5mlKT貯存液 0.5mlNAA貯存液 50μlIAA貯存液 50μlCH 0.15g蔗糖7.5g瓊脂粉 1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，封口滅菌。
使用前溶解培養(yǎng)基，加入250μl潮酶素(50mg/ml)和200ppm羧芐青霉素(CN)，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。
8)分化培養(yǎng)基N6max母液(10X) 100mlN6mix母液(100X) 10mlFe2+EDTA貯存液(100X) 10ml維生素貯存液(100X) 10ml6-BA貯存液 2mlKT貯存液 2mlNAA貯存液 0.2mlIAA貯存液 0.2mlCH1g蔗糖 30gPhytagel 3g
加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到6.0。
煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口滅菌。
9)生根培養(yǎng)基MSmax母液(10X) 50mlMSmix母液(100X) 5mlFe2+EDTA貯存液(100X) 5ml維生素貯存液(100X)5ml蔗糖 30gPhytagel 3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.8。
煮沸并定容至1000ml，分裝到生根管中(25ml/管)，封口滅菌。
(4)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化步驟(對上述培養(yǎng)基的具體應(yīng)用舉例)3.1愈傷誘導(dǎo)(1)將成熟的“中花11”水稻種子去殼，然后依次用70％的乙醇處理1分鐘，0.15％氯化汞(HgCl2)種子表面消毒15分鐘；(2)用滅菌水洗種子4-5次；(3)將種子放在以上所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；(4)將接種后的培養(yǎng)基置于黑暗處培養(yǎng)4周，溫度25±1℃，得到水稻愈傷組織。
3.2愈傷繼代挑選亮黃色、緊實(shí)且相對干燥的胚性愈傷，放于如上所述的繼代培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25±1℃，得到水稻繼代的愈傷組織。
3.3預(yù)培養(yǎng)挑選緊實(shí)且相對干燥的水稻胚性愈傷組織，放于如上所述的預(yù)培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25±1℃。
3.4農(nóng)桿菌培養(yǎng)(1)在帶有對應(yīng)抗性選擇的LA培養(yǎng)基(一種公開使用的培養(yǎng)基)上預(yù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌EHA105(購自Invitrogen公司)48小時(shí)(兩天)，培養(yǎng)溫度28℃；(2)將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至如上所述的懸浮培養(yǎng)基里，28℃搖床上培養(yǎng)2-3小時(shí)。
3.5農(nóng)桿菌侵染(1)將預(yù)培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)移至滅菌好的瓶子內(nèi)；(2)調(diào)節(jié)所述的農(nóng)桿菌的懸浮液至OD6000.8-1.0；
(3)將水稻愈傷組織在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；(4)將步驟(3)的愈傷組織轉(zhuǎn)移至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在如上所述的共培養(yǎng)基上培養(yǎng)72小時(shí)(3天)，培養(yǎng)溫度19-20℃。
3.6愈傷組織洗滌和選擇培養(yǎng)(1)用滅菌水洗滌水稻愈傷組織至看不見農(nóng)桿菌；(2)將步驟(1)的水稻愈傷組織浸泡在含400ppm羧芐青霉素(CN)的滅菌水中30分鐘；(3)將步驟(2)的水稻愈傷組織轉(zhuǎn)移至滅菌好的濾紙上吸干；(4)將步驟(3)的水稻愈傷組織轉(zhuǎn)移至如上所述的選擇培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)2-3次，每次培養(yǎng)2周。(將上述所配制的選擇培養(yǎng)基加熱融化后，冷卻至60℃左右加入適當(dāng)?shù)某泵顾睾汪绕S青霉素，第一次選擇培養(yǎng)基潮霉素篩選濃度為400mg/l，羧芐青霉素濃度為400ppm；第二次及以后選擇培養(yǎng)基潮霉素篩選濃度為250mg/l，羧芐青霉素濃度為250ppm)3.7分化(1)將上述在選擇培養(yǎng)基得到的水稻抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基上黑暗處培養(yǎng)5-7周；(2)將步驟(1)得到的預(yù)分化培養(yǎng)的水稻愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上，光照下培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度26℃，得到轉(zhuǎn)基因水稻植株。
3.8生根(1)剪掉轉(zhuǎn)基因水稻植株分化時(shí)產(chǎn)生的根；(2)然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中光照下培養(yǎng)2-3周，培養(yǎng)溫度26℃。
3.9移栽洗掉轉(zhuǎn)基因水稻植株根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入溫室，同時(shí)在最初的幾天保持水分濕潤。
將獲得的轉(zhuǎn)基因水稻植株被命名為T40SN(其中T40S為載體編號(hào)，N表示轉(zhuǎn)化品種為中花11)。本發(fā)明總共獲得獨(dú)立轉(zhuǎn)基因水稻植株36株。
實(shí)施例4OsNACx基因轉(zhuǎn)基因T1家系在田間的干旱篩選為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因水稻植株的抗旱性是否增強(qiáng)以及是否與轉(zhuǎn)入的OsNACx基因有關(guān)，本發(fā)明采用Northern雜交技術(shù)對部分轉(zhuǎn)基因水稻植株中OsNACx基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(圖5為Northern雜交(方法同實(shí)施例2)的結(jié)果，并對本發(fā)明T1代植株進(jìn)行了田間抗旱篩選。具體步驟如下T1代各家系的種子在含有潮霉素的水溶液(50mg/ml)浸種，去除不發(fā)芽種子，秧田播種，5葉期插秧苗于抗旱大棚沙田中，每家系種植20單株，分兩行。到成株期抽穗前3周斷水，圖6是斷水22天后，轉(zhuǎn)基因家系和對照在田間的干旱篩選情況。實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性明顯高于對照植株，對該兩家系進(jìn)行了相對含水量的檢測，實(shí)測相對含水量的數(shù)據(jù)分別為83.9％和85.2％，可見相對含水量差異并不大。該結(jié)果說明OsNACx基因的確與干旱相關(guān)，其超量表達(dá)能提高轉(zhuǎn)基因植物的抗旱性。為了更充分說明本發(fā)明基因能提高植物抗旱性，申請人還分析了干旱脅迫后轉(zhuǎn)基因家系的結(jié)實(shí)率。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，超量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株的結(jié)實(shí)率遠(yuǎn)高于對照，其結(jié)實(shí)率從1.8％提高到25％(如表1所示)，而分蘗數(shù)和千粒重并沒有明顯差異，從另一面說明轉(zhuǎn)基因水稻植株的抗性增強(qiáng)確實(shí)與轉(zhuǎn)入的OsNACx基因有關(guān)。
表1 干旱脅迫后轉(zhuǎn)基因家系和對照的結(jié)實(shí)率比較

實(shí)施例5OsNACx基因轉(zhuǎn)基因T1家系苗期抗鹽篩選在實(shí)施例4中已證明本發(fā)明基因OsNACx轉(zhuǎn)基因植株成株期的抗旱性極顯著高于對照，為了驗(yàn)1證OsNACx轉(zhuǎn)基因植株是否還具有其他的抗逆效果，本實(shí)施例中對其進(jìn)行了苗期的高鹽脅迫處理。具體方法如下T1代轉(zhuǎn)基因超表達(dá)植株選用5個(gè)家系，在加潮霉素選擇下(50mg/ml)浸泡T1代種子，去除不發(fā)芽種子，催芽后直播到小圓桶中(試驗(yàn)用的土壤為南方水稻土與粗沙按2∶3混合而成，每圓桶等量均勻沙土加等體積水，水自行滲漏確保土壤的緊實(shí)度一致)，試驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)。對健康生長的5葉期的植株進(jìn)行高鹽脅迫(200mMNaCl溶液)直至對照植株全部萎焉死亡，調(diào)查植株的成活率(單株綠葉面積在20％以下的植株通常難以繼續(xù)存活，視為枯死)。圖7顯示脅迫處理12天后對照植株已全部死亡情況下的各超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因家系的生長狀況，表2是對照植株已全部死亡時(shí)調(diào)查的各超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因家系的存活率，各轉(zhuǎn)基因家系的存活率普遍高于80％，表明本發(fā)明基因OsNACx轉(zhuǎn)基因植株能顯著提高植物的抗高鹽性。
表2 高鹽脅迫12天后各轉(zhuǎn)基因家系植株的存活率(％)

實(shí)施例6OsNACx基因3’端具有轉(zhuǎn)錄活性驗(yàn)證由于本發(fā)明基因?yàn)檎T導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄因子，本應(yīng)具有轉(zhuǎn)錄激活功能，在逆境下激活下游基因表達(dá)，從而產(chǎn)生抗性。為了驗(yàn)證本發(fā)明基因OsNACx是否具有轉(zhuǎn)錄激活功能，或具體哪一區(qū)域具有這激活功能，本實(shí)例利用酵母體系進(jìn)行了反式激活實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。首先構(gòu)建了一系列的OsNACx基因和部分缺失突變子到酵母GAL4-DB融合表達(dá)載體pDEST32(購自Invitrogen公司)，將其轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞Y187(購自CLONTHCH公司)，經(jīng)β-Galactosidase酶活性實(shí)驗(yàn)，酵母是否顯藍(lán)色確定報(bào)告基因LacZ的表達(dá)，從而確定基因是否具有激活功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明OsNACx基因確實(shí)具有轉(zhuǎn)錄激活功能，其激活功能域位于基因3’端，并且從243到273的氨基酸序列對本基因具有轉(zhuǎn)錄激活功能是必不可少的。圖8顯示了本發(fā)明基因OsNACx及其缺失突變體轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞后報(bào)告基因LacZ的表達(dá)情況，其中CK表示空載體pDEST32轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞Y187；Full表示OsNACx基因全長融合到pDEST32轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞Y187；Mut1表示OsNACx基因1-166AA片斷(NAM結(jié)構(gòu)域)融合到pDEST32轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞Y187；Mut2表示OsNACx基因182-316AA片斷融合到pDEST32轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞Y187；Mut3表示OsNACx基因182-273AA片斷融合到pDEST32轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞Y187；Mut4表示OsNACx基因182-243AA片斷融合到pDEST32轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞Y187。
具體實(shí)施步驟為1.將OsNACx基因全長及部分缺失突變子融合到酵母表達(dá)載體pDEST32(購自Invitrogen公司)。
根據(jù)全長CDNA克隆xx序列按照pDEST32載體的讀碼框設(shè)計(jì)基因引物(利用軟件primer5.0)，分別為DBF5-AGAAGCAAGCAAGAAGCGATDBR5-CCGAGCCATCTCTTGACDBM1R5-TCCGACACAGCACCCAATCATCDBM3R5-T ATCGTCGTAGCTCAGGTCCADBM4R5-C TTTCTTGGGCACCATCATDBM5R5-A CGGGAAGGGGTCGTTGTCCADBMF5-CTGTACAACAAGAAGAACG然后在引物DBF和DBMF的前端加上接頭attB1(5-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggct)，在引物DBR，DBM1R，DBM3R，DBM4R和DBM5R前加上接頭attB2(5-ggggaccacttt gtacaagaaagctgggt)。這樣在反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃2min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min的情況下，引物組合DBF和DBR的產(chǎn)物為DBNACF(1-316AA)，DBF和DBM1R的產(chǎn)物為Mut1(1-182AA)，DBMF和DBR的產(chǎn)物為Mut2(182-316AA)，DBMF和DBM3R的產(chǎn)物為Mut3(182-273AA)，DBMF和DBM4R的的產(chǎn)物為Mut4(182-243AA)。將得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)過PEG8000純化后與中間載體pDONR221(購自Invitrogen公司)進(jìn)行BP重組反應(yīng)，反應(yīng)體系為5ul，PCR產(chǎn)物200ng，pDONR22150ng，5X BP Clonase Reaction Buffer 2ul，BP Clonase Mix 2ul，置于25℃5個(gè)小時(shí)左右，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH1Oβ(購自Invitrogen公司)，篩選陽性克隆，然后將所需陽性克隆質(zhì)粒通過LR重組反應(yīng)將其攜帶的基因片段融合到酵母表達(dá)載體pDEST32，步驟為BP反應(yīng)陽性質(zhì)粒100ng，pDEST3250ng，5X LR Clonase Buffer 2ul，LR Clonase Mix 2ul，25℃5個(gè)小時(shí)左右，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10β(購自Invitrogen公司)，篩選陽性克隆。
2.醋酸鋰(LiAc)法酵母感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化(CLONTECH，Yeast Protocols Handbook)1)試劑及其配方A，YPD medium20g Difco peptone10g Yeast extract20g glucose用蒸餾水定容至1L，滅菌15分鐘B，SD/Leu medium6.7g Yeast nitrogen base without amino acids20gAgar powder20gglucose0.69g -Leu DO Supplement(購于CLONTECH公司)用蒸餾水定容至1L，滅菌15分鐘C，10 TE buffer0.1M Tris-HCl，10mM EDTA PH 7.5，滅菌D，10 LiAc1M lithium acetate，PH 7.5，滅菌E，PEG/LiAc solution

2)步驟A，先用1ml YPD溶液將直徑大小為2-3mm的酵母單菌落打散，轉(zhuǎn)移到含有10ml YPD培養(yǎng)基的三角瓶中，B，在轉(zhuǎn)速為250rpm下，30℃培養(yǎng)16-18小時(shí)，使得OD600＞1.5C，取5ml左右上述菌液到另一含有50mlYPD培養(yǎng)基的三角瓶，檢測濃度使OD600＝0.2-0.3D，30℃培養(yǎng)3小時(shí)(230rpm)，此時(shí)，OD600＝0.4-0.6，如果OD600＜0.4，可能培養(yǎng)有問題
E，將菌液至于50ml離心管，室溫1000xg離心5分鐘，F(xiàn)，去掉上清，用滅菌的雙蒸水重懸細(xì)胞，室溫1000xg離心5分鐘，G，去上清，用1ml現(xiàn)配的1x TE/1x LiAc將酵母細(xì)胞混勻H，將200ng融合質(zhì)粒DNA至于1.5-ml離心管，加入100ul酵母感受態(tài)細(xì)胞混勻，加入600ul PEG/LiAc，高速離心混勻，30℃培養(yǎng)30min(200rpm)I，加入70ul DMSO(100％)，輕柔上下顛倒數(shù)次，42℃水浴15min后置于冰上2minJ，室溫14000rpm離心5秒，去上清，用500ul 1x TE buffer打散細(xì)胞。
K，取l00ul轉(zhuǎn)化細(xì)胞均勻涂于-Leu/SD平皿，在30℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)2-4天直至克隆出現(xiàn)。
3，用β-Galactosidase實(shí)驗(yàn)中報(bào)告基因LacZ表達(dá)情況驗(yàn)證OsNACx基因及其缺失突變體的轉(zhuǎn)錄活性。
1)試劑及配方A.Z bufferNa2HPO4·7H2O 16.1g/LNaH2PO4·H2O 5.5g/LKCl0.75g/LMgSO4·7H2O 0.246g/L調(diào)節(jié)PH到7.0，滅菌B，X-gal stock solution (20mg/ml)C，Z buffer/X-gal solution100ml Z buffer0.27ml β-mercaptoethanol1.67ml X-gal stock solution2)步驟A，將轉(zhuǎn)化的克隆長到1-3mm(30℃，2-4天)B，將合適大小的圓形無菌Watman濾紙放置于10cm無菌平皿，加入2.5-5ml左右Zbuffer/X-gal solution，將其潤濕，忌氣泡。
C，用鑷子將另一張干凈無菌濾紙置于長有克隆的平皿上，輕壓濾紙，使克隆粘附到濾紙上D，當(dāng)濾紙已濕潤，用鑷子揭開濾紙，將粘附有克隆的面朝上，放置于液氮10秒后，將其置于室溫解凍，這樣凍融的目的是使酵母細(xì)胞破碎F，小心將這濾紙克隆面朝上置于先前潤濕的濾紙上，忌氣泡G，將濾紙?jiān)?0℃放置(30min-8hr)，根據(jù)藍(lán)色斑出現(xiàn)的情況來判斷基因是否具有激活功能。
實(shí)施例7，OsNACx基因的啟動(dòng)子功能驗(yàn)證及其亞細(xì)胞定位為了確定OsNACx基因在細(xì)胞的表達(dá)部位及自身啟動(dòng)子(1-1374bp)的活性，進(jìn)一步進(jìn)行了GFP-NLS(核定位信號(hào))融合蛋白構(gòu)建，即根據(jù)GFP的表達(dá)情況來確定基因的表達(dá)模式。首先參照前人發(fā)表的關(guān)于擬南芥NAC基因(Miki Fujita，Kazuo Shinozaki et al，A Dehydration-inducedNAC protein，RD26，is involved in a novel ABA-dependent stress-signaling pathway.Plant J(2004)39，863-876)分析該基因的核定位信號(hào)(NLS)可能位于79-90AA或116-182AA，根據(jù)此序列與GFP融合后在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)部位可確定該基因的亞細(xì)胞定位。將本發(fā)明序列的1-1641bp片段(包括ATG前1374bp和基因1-90AA，即包含啟動(dòng)子區(qū)和核定位信號(hào))融合到pCAMBIA1381-GFP載體上，目的在于，一是希望該片段的1-1374bp已包含完整的啟動(dòng)子，可啟動(dòng)基因的表達(dá)；二是包含該基因的1-90AA序列(其中已包含核定位信號(hào))，即可根據(jù)GFP的表達(dá)部位來確定該基因在細(xì)胞的表達(dá)情況。pCAMBIA1381-EGFP載體是在國際上通用的植物遺傳轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1381基礎(chǔ)上改建的(如附圖11所示)，將其攜帶的GUS基因換成GFP基因，GFP前不帶有任何啟動(dòng)子，pCAMBIA1381載體來自澳大利亞CAMBIA實(shí)驗(yàn)室公開使用(Center forthe Application of Molecular Biology to International Agriculture)。
融合基因載體構(gòu)建的具體方法如下設(shè)計(jì)引物PF(5-cagaattcaaagcaacagtggagagaaaac，加接頭EcoRI位點(diǎn))和PR(5-caaagcttgcgtgacccattaggatactt，加入接頭HindIII)，以“中旱5號(hào)”總DNA或上述實(shí)施例1中構(gòu)建的載體pGEM-NAC-PRO為模板，通過擴(kuò)增程序(94℃預(yù)變性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃2min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min)將其擴(kuò)增出來，擴(kuò)增產(chǎn)物通過EcoRI和HindIII雙酶切，連入已進(jìn)行同樣雙酶切的pCAMBIA1381-EGFP載體。
將融合載體p1381-GFP-promoter-NLS用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化水稻愈傷(其具體方法同實(shí)施例3所述)，在潮霉素(其具體方法同實(shí)施例3所述)的選擇壓力下得到抗性愈傷，在熒光顯微鏡下觀察到GFP表達(dá)(如圖9A所示)，表明該序列的1-1374bp已包含完整的啟動(dòng)子可啟動(dòng)基因的表達(dá)。為了將其在細(xì)胞內(nèi)定位，將表達(dá)的抗性愈傷制成切片，并在共聚焦顯微鏡下觀察GFP在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。圖9B顯示在共聚焦顯微鏡下GFP只在細(xì)胞核中表達(dá)，說明1-90AA的序列已包含NLS，可將GFP定位在細(xì)胞核，即OsNACx蛋白定位在細(xì)胞核。本實(shí)例證明本發(fā)明序列的1-1374bp片段包含完整的啟動(dòng)子，可誘導(dǎo)基因的表達(dá)；而且OsNACx的79-90AA推測就是NLS，可將OsNACx蛋白定位在細(xì)胞核內(nèi)。
EQUENCE LISTING<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>利用水稻轉(zhuǎn)錄因子基因OsNACx提高植物抗旱耐鹽能力<130>
<141>2004-12-20<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2540<212>DNA<213>水稻(Oryza sativa)<220>
<221>gene<222>(1)..(2540)<223>
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<221>Intron<222>(1848)..(1976)<223>
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<221>exon<222>(1374)..(1847)<223>
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權(quán)利要求
1.OsNACx基因介導(dǎo)的賦予植物對干旱和鹽脅迫耐受能力的DNA序列，它是(a)SEQ ID NO1中第1374-2453位所示的DNA序列，或(b)編碼與(a)編碼的蛋白質(zhì)相同的蛋白質(zhì)的DNA序列。
2.合適啟動(dòng)子連接的權(quán)利要求1所述的DNA序列。
3.權(quán)利要求2所述的DNA序列，它是SEQ ID NO1所示的DNA序列。
4.賦予植物對干旱和鹽脅迫耐受能力的啟動(dòng)子序列，它是(a)SEQ ID NO1中第1-1373位所示的DNA序列。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的DNA序列在增加水稻對干旱和鹽脅迫耐受能力中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種水稻DNA片斷的分離克隆、功能驗(yàn)證及其應(yīng)用。所述的DNA片斷包含水稻抗逆相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因OsNACx，它賦予植物對干旱和鹽脅迫的耐受能力。將該DNA片段與其外源調(diào)節(jié)序列直接轉(zhuǎn)入植物體，轉(zhuǎn)基因植物對干旱和鹽脅迫的耐受能力顯著增強(qiáng)。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1796559SQ200410061408
公開日2006年7月5日 申請日期2004年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月21日
發(fā)明者胡紅紅, 熊立仲 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)