專利名稱：短梗霉多糖薄膜及用于菌種保藏的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的微生物保藏方法。
背景技術(shù)：
微生物菌種保藏方法常用的有斜面法，砂管法、礦油保藏法、冷凍干燥法和液氮保藏法等。斜面法、礦油保藏法，砂管法等保藏時間過長菌種會逐漸衰亡，冷凍干燥法和液氮法菌種保藏效果好，但需相應(yīng)設(shè)備條件，成本較高，液氮還易引起爆炸，不安全。上述各種方法保藏菌種所占用空間大，郵寄，使用都不方便?，F(xiàn)行各種微生物保藏方法比較(周德慶，微生物學(xué)教程，高等教育出版社2002，5)見下表


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對上述存在的問題，提出一種短梗霉多糖薄膜及用于菌種保藏的方法，這種保藏方法占用空間小，保藏成本低，郵寄、使用方便、安全。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的短梗霉多糖薄膜，其膜的厚度為0.02mm～0.04mm，拉伸強(qiáng)度27Mpa～32Mpa，直角撕裂強(qiáng)度31KN/m～38KN/m，透光率95％～98％，氧氣透過量2.7cm3/m2.bar.d～1.6cm3/m2.bar.d所述的短梗霉多糖薄膜的制備方法，以流涎法制備，其方法為首先由發(fā)酵得到短梗霉多糖，發(fā)酵原料采用淀粉，淀粉經(jīng)水解得到葡萄糖和寡聚糖混合物，該混合物配制培養(yǎng)基，由短梗霉發(fā)酵轉(zhuǎn)化成為短梗霉多糖；該多糖經(jīng)菌體分離、脫色、過濾、濃縮成濃度為15g/100ml～20g/100ml的短梗霉多糖溶液；將濃縮的短梗霉多糖溶液裝入密封容器內(nèi)，然后給密封容器內(nèi)施加0.08Mpa～0.15Mpa的氣壓，噴嘴開度調(diào)至0.1mm～0.2mm，熱風(fēng)溫度調(diào)至60～80℃，控制干燥后的薄膜厚度為0.02mm～0.04mm。
所述的短梗霉多糖薄膜用于保藏菌種的方法，首先將其薄膜裁剪成面積大小為8mm×8mm～20mm×20mm單元膜片，并進(jìn)行無菌處理；然后在兩層經(jīng)無菌處理的短梗霉多糖薄膜中間涂上甘油和海藻糖保護(hù)劑及微生物菌種，將二膜貼緊后，外層以另二層經(jīng)無菌處理的塑料膜套封，構(gòu)成一個多糖薄膜菌種保藏單元；再將該菌種保藏單元匯編成保藏冊，在-24℃以下保存，時間可達(dá)12個月，使用時取出保藏單元，剪開塑料外封，將含有菌種的多糖膜投入培養(yǎng)基中，多糖膜溶化，菌種即可生長。
所采用的外層塑料薄膜為耐高溫和可熱封的尼龍復(fù)合膜，或是聚酯復(fù)合膜，耐受溫度為121℃～125℃。
所述的短梗霉多糖薄膜的無菌處理，其處理方法為短梗霉多糖膜用15W紫外燈20cm距離照射20分鐘。
所述的外封的塑料膜的無菌處理，其處理方法為其塑料膜在滅菌鍋內(nèi)121℃滅菌30分鐘。
本發(fā)明中待保藏的微生物菌種從斜面上和平皿菌落上挑取，涂布于一層短梗霉多糖膜之上，另一層短梗霉多糖膜涂布保護(hù)劑甘油和海藻糖、然后將二膜貼緊、外層套二張塑料膜，并將四邊封口，形成保藏單元，其操作過程全部在無菌室內(nèi)完成。
其保藏單元片匯編成類似于集郵冊的細(xì)菌分冊，酵母分冊，霉菌分冊，放線菌分冊，冊的材料可以是塑料聚酯膜等，冊內(nèi)的每一頁可插入多張保藏單元片，每一冊由若干頁組成。
本發(fā)明具體是這樣來實(shí)現(xiàn)的第一、無菌短梗霉多糖膜片制備首先由發(fā)酵得到短梗霉多糖，發(fā)酵原料采用淀粉，淀粉經(jīng)水解得到葡萄糖和寡聚糖混合物，該混合物配制培養(yǎng)基，由短梗霉發(fā)酵轉(zhuǎn)化成為短梗霉多糖。該多糖經(jīng)菌體分離、脫色、過濾、濃縮成濃度為15g/100ml～20g/100ml，以流涎法制得短梗霉多糖薄膜，流涎法制膜由三個單元組成，第一個單元為一密封容器內(nèi)裝濃縮的多糖；第二個單元為流涎噴頭；第三個單元是配有不銹鋼循環(huán)帶的干燥箱(見圖1)，箱內(nèi)可通熱風(fēng)加熱。密封容器與流涎噴頭以管道相連，制膜時，密封容器內(nèi)施加0.08Mpa～0.15Mpa的氣壓，多糖被壓入流涎噴頭經(jīng)噴嘴均勻分布到不銹鋼循環(huán)帶上，噴嘴開度調(diào)至0.1mm～0.2mm，熱風(fēng)溫度調(diào)至60～80℃，控制干燥后的薄膜厚度為0.02mm～0.04mm。制得的膜裁剪為8mm×8mm～20mm×20mm的面積大小，該多糖膜是無色透明的，其拉伸強(qiáng)度27Mpa～32Mpa，直角撕裂強(qiáng)度31KN/m～38KN/m，透光率95％～98％，氧氣透過量2.7cm3/m2.bar.d～1.6cm3/m2.bar.d以上薄膜置于無菌室內(nèi)，在15W紫外燈下照射殺菌，照射距離為20cm，照射時間為20分鐘，經(jīng)照射處理后成為無菌的多糖膜備用。
第二、外封的塑料膜的選取和滅菌短梗霉多糖膜作載體保藏微生物，必須要外封一層塑料膜，這樣保藏膜片才不會污染空氣中的微生物，外封的塑料膜也必須是無菌的，這樣就可保證封藏的多糖膜上保存的菌種是無雜菌的，外封的塑料膜選取耐高溫的尼龍膜、聚酯或類似的復(fù)合材料，將這種塑料膜包扎后在滅菌鍋內(nèi)121℃滅菌30分鐘，取出置無菌室內(nèi)，備用。
第三、待保藏微生物菌種的培養(yǎng)本發(fā)明保藏的微生物菌種主要指細(xì)菌、酵母、霉菌和放線菌，所保藏的微生物可以是菌種保藏中心收藏的菌種，也可是其它任何途徑得來的菌種，待培養(yǎng)的微生物菌種以其相應(yīng)的培養(yǎng)基分別在平皿和試管斜面上進(jìn)行培養(yǎng)，得到單菌落和純的斜面菌種。
第四、制作菌種保藏單元在無菌室內(nèi)，挑取生長好的純菌種，涂布于準(zhǔn)備好的短梗霉多糖膜片上，在另一多糖膜片上涂布滅過菌的甘油，然后將二膜片緊貼，甘油和菌種擠壓混勻被封存在二膜之間，取已滅過菌的二層塑料膜，面積略大于上述多糖膜片，以便于熱封機(jī)四邊封口。將二層塑料膜上下套封載有菌種的多糖膜片，以手提式熱封機(jī)沿邊緣四邊封口，形成密封的菌種保藏單元。
第五、制作菌種保藏冊以一般塑料材料如聚酯等制備成集郵冊形式的菌種保藏冊，冊的封面可標(biāo)上細(xì)菌分冊，霉菌分冊，酵母分冊，放線菌分冊。冊內(nèi)頁具有類似于集郵冊的很多柵格，柵格內(nèi)分門別類的插入上述已制備的菌種保藏單元片。上述保藏冊置于冰箱內(nèi)-24℃以下長期保存。
第六、測保藏單元活菌數(shù)將上述保藏冊的菌種保藏單元，每3-6個月各取一菌測其活菌數(shù)。
以短梗霉多糖膜為載體進(jìn)行菌種保藏，由于短梗霉多糖成膜性好，所成的膜不透氧，具有與塑料膜類似的可熱封性，可以滿足菌種保藏低溫、無氧、干燥、缺營養(yǎng)和添加保護(hù)劑等環(huán)境要素，由于短梗霉多糖的基本結(jié)構(gòu)是葡萄糖、對微生物沒有毒害作用。
本發(fā)明用短梗霉多糖膜作載體保藏菌種，占用空間小，保藏成本低，郵寄、使用方便、安全。


圖1 短梗霉多糖流涎成膜和鼓風(fēng)干燥示意2 菌種保藏冊封面示意中序號1流液嘴，2多糖膜料液，3控制板，4不銹鋼循環(huán)帶，5干燥箱，6鼓風(fēng)機(jī)，7電熱絲，8主動機(jī)，9卷膜盤具體實(shí)施方式
實(shí)施例1大米淀粉經(jīng)水解得到葡萄糖和寡聚糖混合物，該混合物配制培養(yǎng)基，由短梗霉發(fā)酵轉(zhuǎn)化成為短梗霉多糖。該多糖經(jīng)菌體分離、脫色、過濾、、精制、濃縮至濃度為20g/100ml，打入噴膜頭內(nèi)，噴嘴開度0.1mm，以恒定壓力0.09MPa噴膜，循環(huán)不銹鋼帶均勻接膜，80℃熱風(fēng)干燥得到0.03mm厚透明干燥的多糖薄膜一卷，測得其性能指標(biāo)如下拉伸強(qiáng)度32Mpa直角撕裂強(qiáng)度38KN/m透光率96％ 氧氣透過量1.6cm3/m2.bar.d實(shí)施例2將實(shí)施例1制得的多糖膜裁剪成10mm×10mm的單元片，置于無菌室內(nèi)，以15W紫外燈，20cm距離分別照射5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、30分鐘對膜片殺菌，殺菌結(jié)束后，以少量生理鹽水溶解膜片，然后分別涂布在完全培養(yǎng)基和肉湯培養(yǎng)基的平皿上30℃培養(yǎng)6天，觀察結(jié)果如下照射時間(分鐘)5 10152030完全培養(yǎng)基上菌落數(shù)173 0 0 0肉湯培養(yǎng)基上菌落數(shù)131 0 0 0多糖膜片經(jīng)紫外照射15分鐘可達(dá)到完全無菌。安全起見，照射時間可延至20分鐘實(shí)施例3分別將實(shí)施例1制得的若干多糖膜片紫外照射20分鐘備用，市售尼龍復(fù)合膜片裁剪成15mm×15mm大小，121℃，30分鐘滅菌備用。
分別取大腸桿菌(AS1.751)、北京棒桿菌(AS1.299)、枯草芽孢桿菌(AS1.339)和黃色短桿菌(AB91058)斜面菌株，在平皿肉湯培養(yǎng)基上涂布，32℃培養(yǎng)，生長成單菌落；取酵母菌(AY91014)在平皿麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上涂布，30℃培養(yǎng)生成單菌落；取出芽短梗霉AS3.3693在平皿完全培養(yǎng)基上涂布，30℃培養(yǎng)生長成單菌落。無菌室內(nèi)，從培養(yǎng)皿中分別挑取上述6株菌單菌落(每一株菌各菌落大小基本相等)，涂布在上述紫外線照射過的無菌多糖膜片上，以另一抹有薄層甘油和微量海藻糖的無菌多糖膜片將其貼緊，然后以上述二片滅過菌的尼龍復(fù)合膜將該多糖膜上下復(fù)蓋，以塑料封口機(jī)將其四邊熱封，形成一個外封塑料膜，內(nèi)有夾層多糖膜的菌種保藏單元，以上操作全部在無菌室內(nèi)進(jìn)行。上述6種菌的保藏單元膜片在-24℃下保藏6個月、9個月、12個月、18個月，每一菌每次各取出三片，分別以生理鹽水溶化稀釋法涂到相應(yīng)的平皿培養(yǎng)基上培養(yǎng)，測其活菌數(shù)如下(每次三片，取平均值)保藏時間(月) 6 9 12 18大腸桿菌AS1.751(106個) 87 83 81 83北京棒桿菌AS1.299(106個) 134 135 134 133枯草芽孢桿菌AS1.339(106個) 119 117 116 116黃色短桿菌AB91058(106個) 97 93 93 92酵母AY91014(106個) 106 104 103 105出芽短梗霉AS3.3693(106個)168 166 169 166以上各菌平皿培養(yǎng)物均未發(fā)現(xiàn)雜菌。
權(quán)利要求
1.一種短梗霉多糖薄膜，其特征在于膜的厚度為0.02mm～0.04mm，拉伸強(qiáng)度27Mpa～32Mpa，直角撕裂強(qiáng)度31KN/m～38KN/m，透光率95％～98％，氧氣透過量2.7cm3/m2.bar.d～1.6cm3/m2.bar.d。
2.權(quán)利要求1所述的短梗霉多糖薄膜的制備方法，其特征在于，以流涎法制備，其方法為首先由發(fā)酵得到的短梗霉多糖、經(jīng)脫色、過濾、濃縮成濃度為15g/100ml～20g/100ml的短梗霉多糖溶液，將濃縮的短梗霉多糖溶液裝入密封容器內(nèi)，然后給密封容器內(nèi)施加0.08Mpa～0.15Mpa的氣壓，噴嘴開度調(diào)至0.1mm～0.2mm，熱風(fēng)溫度調(diào)至60～80℃，控制干燥后的薄膜厚度為0.02mm～0.04mm。
3.權(quán)利要求1所述的短梗霉多糖薄膜用于保藏菌種的方法，其特征在于，首先將其薄膜裁剪成面積大小為8mm×8mm～20mm×20mm單元膜片，并進(jìn)行無菌處理；然后在兩層經(jīng)無菌處理的短梗霉多糖薄膜中間涂上甘油和海藻糖保護(hù)劑及微生物菌種，將二膜貼緊后，外層以另二層經(jīng)無菌處理的塑料膜套封，構(gòu)成一個多糖薄膜菌種保藏單元；再將該菌種保藏單元匯編成保藏冊，在-24℃以下保存，時間可達(dá)12個月，使用時取出保藏單元，剪開塑料外封，將含有菌種的多糖膜投入培養(yǎng)基中，多糖膜溶化，菌種即可生長。
4.如權(quán)利要求3所述的用于保藏菌種的方法，其特征在于，所采用的外層塑料薄膜為耐高溫和可熱封的尼龍復(fù)合膜，或是聚酯復(fù)合膜，耐受溫度為121℃～125℃。
5.如權(quán)利要求3所述的用于保藏菌種的方法，其特征在于，所述的短梗霉多糖薄膜的無菌處理，其處理方法為短梗霉多糖膜用15W紫外燈20cm距離照射20分鐘。
6.如權(quán)利要求3所述的用于保藏菌種的方法，其特征在于，所述的外封的塑料膜的無菌處理，其處理方法為其塑料膜在滅菌鍋內(nèi)121℃滅菌30分鐘。
7.如權(quán)利要求3所述的用于保藏菌種的方法，其特征在于，待保藏的微生物菌種從斜面上和平皿菌落上挑取，涂布于一層短梗霉多糖膜之上，另一層短梗霉多糖膜涂布保護(hù)劑甘油和海藻糖、然后將二膜貼緊、外層套二張塑料膜，并將四邊封口，形成保藏單元，其操作過程全部在無菌室內(nèi)完成。
8.如權(quán)利要求3所述的用于保藏菌種的方法，其特征在于保藏單元片匯編成類似于集郵冊的細(xì)菌分冊，酵母分冊，霉菌分冊，放線菌分冊，冊的材料可以是塑料聚酯膜，冊內(nèi)的每一頁可插入多張保藏單元片，每一冊由若干頁組成。
全文摘要
本發(fā)明提供一種短梗霉多糖(pullulan)薄膜及用于菌種保藏的方法，該薄膜流涎法制備，膜的厚度為0.02mm～0.04mm，拉伸強(qiáng)度27MPa～32MPa，直角撕裂強(qiáng)度31KN/m～38KN/m，透光率95％～98％，氧氣透過量2.7cm
文檔編號C12N1/04GK1644675SQ200410061418
公開日2005年7月27日 申請日期2004年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月23日
發(fā)明者李世杰 申請人:李世杰