專利名稱：一種芽孢桿菌高效分泌表達載體及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及采用基因工程手段構(gòu)建芽孢桿菌高效分泌表達載體，屬于微生物、基 因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
芽孢桿菌是一類格蘭仕陽性細菌，其很多菌株如枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、 地衣芽孢桿菌等被用作淀粉酶、蛋白酶等酶制劑的生產(chǎn)，許多產(chǎn)品如中溫α-淀粉酶、1398 蛋白酶等被長期用于食品加工。芽孢桿菌還具有嚴格好氧生長的特點，因此一般不具有致 病性，是一類比較安全的微生物。除具有較高的安全性外，芽孢桿菌還具有向細胞外大量分 泌蛋白質(zhì)的能力，因此也是一類表達外源蛋白的理想宿主菌。中溫α _淀粉酶的工業(yè)生產(chǎn)菌株主要為解淀粉芽孢桿菌 (Bacillusamyloliquefaciens),目前我國酶制劑工業(yè)所采用的生產(chǎn)菌株是60年代中溫 α -淀粉酶生產(chǎn)菌株BF7658基礎(chǔ)上獲得的，為我國酶制劑工業(yè)所特有，這一菌株是在野 生型解淀粉芽孢桿菌基礎(chǔ)上經(jīng)反復(fù)物理化學(xué)誘變產(chǎn)生的淀粉酶高產(chǎn)菌株[無錫酶制劑 廠.枯草桿菌BF-7658CI-淀粉酶高產(chǎn)菌株209的選育和投產(chǎn).遺傳學(xué)報，1976，9 (3) 216-223.]。在這一淀粉酶高產(chǎn)菌株中，其控制淀粉酶表達的啟動子是用于構(gòu)建芽孢桿菌 表達載體的理想材料。本發(fā)明所使用的中溫α-淀粉酶生產(chǎn)菌株由江南大學(xué)中國高校工 業(yè)微生物資源與信息中心(http://WWW. cicim-cu. Jiangnan. edu. cn)提供，其收藏編號為 B. amyloliquefaciens CICIM B4311。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是通過基因重組的方法，利用中溫α-淀粉酶生產(chǎn)菌 株細胞內(nèi)α-淀粉酶基因的強啟動子和信號肽編碼區(qū)構(gòu)建一種能控制外源蛋白在芽孢桿 菌宿主中高效分泌表達的載體，為酶制劑、多肽類藥物等蛋白質(zhì)的生產(chǎn)提供一種高效分泌 表達載體。本發(fā)明的技術(shù)方案一種芽孢桿菌分泌表達載體，分類命名為PCHA03，其核苷酸 序列為SEQ ID Ν0:2，該芽孢桿菌分泌型表達載體的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子JM109/pCHA03已保藏 在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC Μ2010199。所述表達載體pCHA03的構(gòu)建方法(1)制備中溫α -淀粉酶表達控制元件Pamy 以生產(chǎn)菌CICIM Β4311中溫α -淀 粉酶基因啟動子和信號肽編碼區(qū)組成表達調(diào)控元件Pamy，利用PCR方法獲得生產(chǎn)菌 CICIM B4311中溫α _淀粉酶基因的啟動子和信號肽編碼區(qū)的基因片段，其核苷酸序列 為SEQ ID NO. 1，與文獻報道的解淀粉芽孢桿菌標準株α-淀粉酶基因核苷酸序列[Palva I. Molecular cloning of alpha-amylase gene fromBacillus amyloliquefaciens and its expression in B. subtilis (J). Gene, 1982，19 (1) :81_87.]相比，序列 SEQ ID NO 1 在基因的啟動子區(qū)有1個堿基序列發(fā)生變化，位于-49位的堿基發(fā)生改變C轉(zhuǎn)變?yōu)門 ；
(2)構(gòu)建大腸桿菌-芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒PCH02 它含有芽孢桿菌復(fù)制元件 ori-pama，大腸桿菌復(fù)制元件pMBl ori和能在芽孢桿菌和大腸桿菌中使用的四環(huán)素抗性基 因 tet ；該大腸桿菌-芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒PCH02的構(gòu)建步驟如下第一步以大腸桿菌質(zhì)粒pBR322為模板，用PCR方法獲得大腸桿菌復(fù)制原件pMBl ori ；第二步以大腸桿菌-芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒PHY300PLK [Ishiwa H andShibahara—Sone H. New shuttle vectors for Escherichia coli and Bacillus subtilis. IV. The nucleotide sequence of pHY300PLK and some properties in relation totransformation (J). Jpn J Genet，61 :515_528 (1986).]為模板，利用 PCR 方 法獲得該質(zhì)粒中芽孢桿菌復(fù)制元件ori-pama和四環(huán)素抗性基因tet ；將上述兩步獲得的DNA片段進行連接，獲得大腸桿菌_芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒PCH02 ；(3)步驟⑴中獲得的中溫α _淀粉酶表達控制元件Pamy與步驟⑵中獲得的大 腸桿菌_芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒PCH02進行重組，獲得芽孢桿菌分泌表達載體PCHA03。所述的芽孢桿菌分泌表達載體pCHA03的應(yīng)用，芽孢桿菌分泌表達載體PCHA03用 于轉(zhuǎn)化不同類型的芽孢桿菌枯草芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，及地衣芽孢桿菌，利用中溫 α-淀粉酶基因的啟動子和信號肽編碼區(qū)控制外源蛋白的表達。材料和方法普通分子生物學(xué)方法除非提及，DNA操作和轉(zhuǎn)化按照標準的分子生物學(xué)方法進行(Sambrook等1989 分子克隆實驗手冊)，芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化按照芽孢桿菌分子生物學(xué)操作的經(jīng)典方法進行 (Harwood, C，R.和Cutting, S. Μ. (eds)芽孢桿菌的分子生物方法)。除非另外提及，PCR操作使用標準方法和PCR反應(yīng)數(shù)據(jù)進行，可參見(Sambrook等 1989分子克隆實驗手冊)。DNA操作所使用的酶根據(jù)供應(yīng)商的說明等使用。引物均為本專利發(fā)明人設(shè)計并由上海生工生物工程有限公司合成。大腸桿菌JM109，枯草芽孢桿菌標準株168，地衣芽孢桿菌標準株14580均由中國 高校工業(yè)微生物資源與信息中心(http://www. cicim-cu. jiangnan. edu. cn)提供。DNA操作使用的酶除非另外提及，所有的酶，例如限制性內(nèi)切酶，連接酶等均來自上海生工生物工程 有限公司。培養(yǎng)基LB在“Sambrook等1989分子克隆實驗手冊”中描述。發(fā)酵培養(yǎng)基豆餅粉32g/ L，魚粉llg/L，淀粉10g/L，(NH4)2SO4 10g/L，用自來水配制。液體搖瓶培養(yǎng)均采用500mL三 角瓶，在37°C條件下按220r/min條件在恒溫搖瓶柜中進行。α -淀粉酶活力測定參考中國輕工業(yè)部標準GB1805. 1-93生物材料樣品保藏芽孢桿菌分泌型表達載體的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子JM109/pCHA03， 已保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱CCTCC，保藏日期2010年8月11日，保藏編號CCTCC M 2010199。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明實施后獲得的分泌表達載體可以實現(xiàn)多種蛋白在芽孢 桿菌宿主中的高效分泌表達，在酶制劑生產(chǎn)、多肽類藥物生產(chǎn)等領(lǐng)域具有應(yīng)用前景。


圖1大腸桿菌-芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒PCH02的限制性酶切圖譜結(jié)構(gòu)。圖中符號意義如下T7 termi 來源于T7噬菌體的轉(zhuǎn)錄終止子；pMBl ori 來源于 大腸桿菌質(zhì)粒PBR322的大腸桿菌復(fù)制原件；ori-pama 來源于芽孢桿菌載體pHY300PLK的 芽孢桿菌復(fù)制元件；tet 四環(huán)素抗性基因，可以使含有質(zhì)粒的大腸桿菌和芽孢桿菌轉(zhuǎn)化子 表現(xiàn)出四環(huán)素抗性。圖2芽孢桿菌分泌表達載體PCHA03的限制性酶切圖譜。圖中符號意義如下Pamy 中溫α -淀粉酶表達控制元件，包括中溫α -淀粉酶基 因強啟動子和信號肽編碼區(qū)；Τ7 termi 來源于T7噬菌體的轉(zhuǎn)錄終止子；pMBl ori 來源于 大腸桿菌質(zhì)粒PBR322的大腸桿菌復(fù)制原件；ori-pama 來源于芽孢桿菌載體pHY300PLK的 芽孢桿菌復(fù)制元件；tet 四環(huán)素抗性基因，可以使含有質(zhì)粒的大腸桿菌和芽孢桿菌轉(zhuǎn)化子 表現(xiàn)出四環(huán)素抗性。
具體實施例方式通過實施例對本發(fā)明作進一步說明，實施例將不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實施例1 中溫α -淀粉酶基因表達調(diào)控元件Pamy的克隆以解淀粉芽孢桿菌CICIM Β4311染色體DNA為模板擴增α -淀粉酶基因的表達控 制元件(Pamy)，采用引物5' -AATTACCGGGTACCCTGGCTGAAAACATTGAGCC-3'，(SEQ ID NO 3)5 ‘ -AATCCGCGGCTCGAGAACTAGTGTCGACGAGCTCCTGCAGAAGCTTTACGTAGGATCCAATGAAT TCGAATTCGGGCCCATTTACGGCTGATG-3‘，(SEQ ID NO 4)擴增片段全長約0. 3kb，用限制性內(nèi)切酶Kpn I、和Sac II消化，與經(jīng)相同酶切的 分子克隆通用載體pBluescript sk(-)連接，連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109的感受態(tài) 細胞，37°C下在含氨芐青霉素(100yg/mL)的LB平板上選擇轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒命名為 pSK-amy，該質(zhì)粒含有中溫α _淀粉酶基因的啟動子和信號肽編碼區(qū)，為便于使用在信號肽 編碼區(qū)下游增加了多個限制性內(nèi)切酶識別位點。實施例2 大腸桿菌_芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒PCH02的構(gòu)建第一步獲得含大腸桿菌復(fù)制元件pMBl ori的DNA片段以質(zhì)粒pBR322為模板，用PCR方法擴增大腸桿菌復(fù)制元件，利用引物如下5' -ATCTCGAGCAGCTGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTG GGGCCTCTMACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAMGGAGGMT CATGACCAAAATCCCTTMC-3 ‘, (SEQ ID NO 5)5'-ATAGGCCTTACCGCACAG ATGCGTAAGG AGAAAATACC GCATCAGGCG CTCTTCCGCT TCC-3，，(SEQ ID NO 6)PCR擴增獲得一約0. 9kb大小的DNA片段，該片段包含大腸桿菌復(fù)制原件pMBlori，該片段用Xho I和Stu I酶切后備用。在引物SEQ ID NO :5中，下劃線部分序列與T7 噬菌體轉(zhuǎn)錄終止序列一致，在所構(gòu)建的載體中起轉(zhuǎn)錄終止的作用。第二步獲得含芽孢桿菌復(fù)制元件ori-pama和四環(huán)素抗性基因tet的片段以芽孢桿菌質(zhì)粒pHY300PLK為模板，擴增含芽孢桿菌復(fù)制元件ori-pama和四環(huán)素 抗性基因tet的片段，利用引物如下5，-ATAGGCCTGCTAGAAATTCCTTAAGG-3，，(SEQ ID NO 7)5，-ATCTCGAGAATGCATGGTACCGCTAGAAATTCCTGTTATAAAAAAAGGATC-3，，(SEQ ID NO 8)PCR擴增獲得一約3kb大小的DNA片段，該片段含有芽孢桿菌復(fù)制元件ori-pama 和四環(huán)素抗性基因tet，片段用Xho I和Stu I酶切后與在本實施例第一步中獲得的片段進 行連接，連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，在含四環(huán)素的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒命名 為PCH02，該質(zhì)粒的限制性酶切圖譜如圖1所示。 實施例3 芽孢桿菌分泌表達載體PCHA03的構(gòu)建將實施例1中獲得的重組質(zhì)粒pSK-amy用限制性內(nèi)切酶Kpn I和Sac II酶切，分 離其中約0. 3kb大小的片段，該片段含有中溫α -淀粉酶基因的啟動子和信號肽編碼區(qū)組 成的表達調(diào)控元件Pamy，分離后備用。將實施例2中獲得的大腸桿菌_芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒PCH02用限制性內(nèi)切酶Kpn I 和Xho I酶切，與上一步驟中用同樣酶切并分離獲得的0. 3kb片段進行連接，連接物轉(zhuǎn)化大 腸桿菌JM109，在含四環(huán)素的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒命名為pCHA03，該質(zhì)粒的限 制性酶切圖譜結(jié)構(gòu)如圖2所示。實施例4 利用芽孢桿菌分泌表達載體PCHA03實現(xiàn)高嗜熱α -淀粉酶基因在芽孢 桿菌中的分泌表達以含有古細菌Pyrococcus furisus來源的高嗜熱α -淀粉酶基因的質(zhì)粒 pEtac-amy [沈微王正祥唐雪明等.古細菌Pyrococcus furiosus高嗜熱α -淀粉酶基因在 大腸桿菌中的分泌表達.中國釀造，2003，1 :12-14.]為模板，利用引物如下5，-AATGAATTCATGGCAAAATACTTGGAGC-3，，(SEQ ID NO 9)5，-AATAAGCTTTTACCCAACACCACAATAAC-3，，(SEQ ID Ν0:10)PCR擴增獲得一約1. 4kb大小的DNA片段，該DNA片段為P. furiosus α -淀粉酶基 因的成熟肽編碼基因(Pfa)，編碼的α-淀粉酶具有極高的耐熱性，在121°C條件下處理1 小時酶活仍能保留一半以上M。上述DNA片段用EcoR I和Hind III酶切后與實施例3中 獲得的經(jīng)同樣酶切處理的載體PCHA03進行連接，連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，在含四環(huán)素 的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒命名為pCHA-pf a。大量提取質(zhì)粒pCHA-pf a分別轉(zhuǎn)化枯 草芽孢桿菌標準株168、解淀粉芽孢桿菌CICIM B2125和地衣芽孢桿菌標準株14580等，在 含15μ g/mL四環(huán)素的LB固體培養(yǎng)基中篩選轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子分離純化后分別接種含15 μ g/ mL四環(huán)素的LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)24小時后分別取IOmL培養(yǎng)液接種IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基中。 作為對照，用空質(zhì)粒PCHA03轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌標準株168、解淀粉芽孢桿菌CICIM B2125和 地衣芽孢桿菌標準株14580等獲得的轉(zhuǎn)化子也同樣接種。上述菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中搖瓶培 養(yǎng)48小時后各取培養(yǎng)液30mL，以8，000r/min離心20min，取上清液在高壓滅菌鍋中121 °C 保溫1小時，保溫后分別取少量培養(yǎng)液檢測酶活，結(jié)果如表1
表1不同轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)液的酶活
權(quán)利要求
1.一種芽孢桿菌分泌表達載體，分類命名為PCHA03，其核苷酸序列為SEQID N0:2，該 芽孢桿菌分泌型表達載體的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子JM109/pCHA03已保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏 中心，保藏編號CCTCC M 2010199。
2.權(quán)利要求1所述表達載體PCHA03的構(gòu)建方法，其特征在于(1)制備中溫α_淀粉酶表達控制元件Pamy 以生產(chǎn)菌CICIM Β4311中溫α -淀粉酶基 因啟動子和信號肽編碼區(qū)組成表達調(diào)控元件Pamy，利用PCR方法獲得生產(chǎn)菌CICIM B4311 中溫α-淀粉酶基因的啟動子和信號肽編碼區(qū)的基因片段，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 1， 與文獻報道的解淀粉芽孢桿菌標準株α-淀粉酶基因核苷酸序列相比，序列SEQ ID NO 1 在基因的啟動子區(qū)有1個堿基序列發(fā)生變化，位于-49位的堿基發(fā)生改變C轉(zhuǎn)變?yōu)門 ；(2)構(gòu)建大腸桿菌-芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒PCH02它含有芽孢桿菌復(fù)制元件ori-pama，大 腸桿菌復(fù)制元件PMBl ori和能在芽孢桿菌和大腸桿菌中使用的四環(huán)素抗性基因tet ；該大腸桿菌_芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒PCH02的構(gòu)建步驟如下第一步以大腸桿菌質(zhì)粒PBR322為模板，用PCR方法獲得大腸桿菌復(fù)制原件pMBlori ；第二步以大腸桿菌_芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒PHY300PLK為模板，利用PCR方法獲得該質(zhì)粒 中芽孢桿菌復(fù)制元件ori-pama和四環(huán)素抗性基因tet ；將上述兩步獲得的DNA片段進行連接，獲得大腸桿菌_芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒PCH02 ；(3)步驟(1)中獲得的中溫α-淀粉酶表達控制元件Pamy與步驟(2)中獲得的大腸桿 菌_芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒PCH02進行重組，獲得芽孢桿菌分泌表達載體PCHA03。
3.權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌分泌表達載體PCHA03的應(yīng)用，其特征在于芽孢桿菌分 泌表達載體PCHA03用于轉(zhuǎn)化不同類型的芽孢桿菌枯草芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，及地 衣芽孢桿菌，利用中溫α-淀粉酶基因的啟動子和信號肽編碼區(qū)控制外源蛋白的表達。
全文摘要
一種芽孢桿菌高效分泌表達載體及其構(gòu)建方法，屬于微生物、基因工程技術(shù)領(lǐng)域。芽孢桿菌分泌表達載體pCHA03，其核苷酸序列為SEQ ID NO2，該芽孢桿菌分泌型表達載體的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子JM109/pCHA03已保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC M 2010199。本發(fā)明主要利用我國中溫α-淀粉酶生產(chǎn)菌株(B.myloliquefaciens)CICIM B4311α-淀粉酶基因的啟動子和信號肽編碼區(qū)構(gòu)建適合在芽孢桿菌中分泌表達外源蛋白的載體pCHA03。本發(fā)明實施后獲得的分泌表達載體可以實現(xiàn)多種外源蛋白在芽孢桿菌宿主中的高效分泌表達，在酶制劑生產(chǎn)、多肽類藥物生產(chǎn)等領(lǐng)域具有應(yīng)用前景。
文檔編號C12R1/19GK101993887SQ20101025274
公開日2011年3月30日 申請日期2010年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月13日
發(fā)明者沈微, 王正祥 申請人:江南大學(xué)