專利名稱：產(chǎn)黃青霉的一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及產(chǎn)黃青霉的一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其編碼基因與在β-內(nèi)酰胺類抗生素生產(chǎn)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
β-內(nèi)酰胺類抗生素是目前已知的抗生素中毒性最低、品種最多、臨床應(yīng)用最廣的一類。其中最重要的為青霉素和頭孢菌素C，以它們?yōu)樵辖?jīng)過化學(xué)或酶反應(yīng)得到中間體，可得到一系列半合成青霉素和半合成頭孢菌素，這些中間體主要包括6-氨基青霉烷酸(6-APA)、7-氨基去乙酰頭孢烷酸(7-ADCA)和氯甲基頭孢芐酯(GCLE)、7-氨基頭孢烯酸(7-ACA)。6-APA、7-ADCA、GCLE都由青霉素制得，7-ACA由頭孢菌素C制得。這些中間體的獲得使得半合成抗生素，特別是半合成頭孢菌素的品種不斷增加。目前，全世界臨床應(yīng)用的半合成青霉素和半合成頭孢菌素品種已經(jīng)超過了120種，占世界抗感染藥物市場(chǎng)65％以上。
在工業(yè)生產(chǎn)中，青霉素和頭孢菌素C分別由產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)和產(chǎn)黃頂頭孢霉(Acremonium chrysogenum)產(chǎn)生。目前，它們的生物合成途徑已經(jīng)清楚由三個(gè)前體氨基酸(α-氨基己二酸、半胱氨酸、纈氨酸)開始，經(jīng)過縮合、環(huán)化反應(yīng)后形成異青霉素N，這一過程在兩種微生物中是一致，然后由此分叉，再經(jīng)一系列反應(yīng)，最終分別得到青霉素和頭孢菌素C。與青霉素和頭孢菌素C生物合成相關(guān)的關(guān)鍵基因都已被克隆(Ingolia&Queener，Med.Res.Rev.9245-264，1989；Aharonowitz，et al.，Ann.Rev.Microbiol.46461-495，1992；Ullán，et al.，J.Biol.Chem.27746216-46225，2002)。
發(fā)酵過程中，青霉素和頭孢菌素C都分泌到培養(yǎng)基中。在對(duì)發(fā)酵菌種進(jìn)行改良中發(fā)現(xiàn)，β-內(nèi)酰胺類抗生素的分泌是一個(gè)主動(dòng)過程，需要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的參與，但目前對(duì)其機(jī)制還知之甚少。WO01/32904提供了通過增強(qiáng)“ATP結(jié)合性盒型”轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette transporter，ABC transporter)的活性來提高β-內(nèi)酰胺抗生素分泌的方法，同時(shí)提供了相應(yīng)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的編碼序列。在構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)中，Andrade等(Mol.Gen.Genet.，263966-977，2000)報(bào)道了atrD基因編碼的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在青霉素分泌中的作用。Ullán等(Mol.Gen.Genet.，267673-683，2002)利用轉(zhuǎn)錄分析的方法，在產(chǎn)黃頂頭孢霉(Acremoniumchrysogenum)頭孢菌素“早期”生物合成基因簇中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)編碼多藥外排泵(multidrug efflux pump)蛋白的基因cefT，通過增加產(chǎn)黃頂頭孢霉C10菌株中該基因的拷貝數(shù)，提高了宿主頭孢菌素C的產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)的一種與β-內(nèi)酰胺類抗生素相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因，來源于產(chǎn)黃青霉菌，名稱為pctA，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №12)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的cDNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的cDNA序列；4)序列表中的SEQ ID №3。
序列表中的SEQ ID №1的cDNA序列長(zhǎng)度為1842bp，讀碼框是自5’端第67位核苷酸到第1761位核苷酸。
序列表中的SEQ ID №3的DNA序列長(zhǎng)度為3655bp，讀碼框是自5’端第1459位核苷酸到第3153位核苷酸，該序列中還包含有pctA基因的啟動(dòng)子、終止子等調(diào)控序列。
產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)的一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，名稱為PctA，是具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)或?qū)EQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQ ID №2是由564個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。
含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體及細(xì)胞系均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，利用現(xiàn)有分子生物學(xué)的方法可以得到不同的表達(dá)載體，如pPEPCT(物理圖譜如圖1)，pPCT(物理圖譜如圖2)等。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供pctA基因在β-內(nèi)酰胺抗生素生產(chǎn)上的應(yīng)用。
實(shí)驗(yàn)證明，利用含有序列表中序列1的核苷酸序列以及相應(yīng)的調(diào)控元件，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體，并用其轉(zhuǎn)化β-內(nèi)酰胺抗生素生產(chǎn)菌，可以提高β-內(nèi)酰胺抗生素的分泌，從而最終提高其產(chǎn)量。調(diào)控元件包括啟動(dòng)子與終止子，這些元件可以是該基因自身的，也可以是已經(jīng)證實(shí)在絲狀真菌有效的其他序列，比如，構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)色氨酸合成酶基因trpC啟動(dòng)子與終止子，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)基因gpdA的啟動(dòng)子，粗糙脈孢霉(Neurospora crassa)交叉途徑控制基因cpc-1啟動(dòng)子，酵母cycl基因的終止序列(cyclTT)，以及產(chǎn)黃青霉青霉素生物合成關(guān)鍵酶ACVS、IPNS、AT基因的啟動(dòng)子與終止子等。
本發(fā)明提供了產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)中與β-內(nèi)酰胺抗生素相關(guān)的一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其編碼基因，并構(gòu)建了增加該基因拷貝數(shù)的工程菌，可以提高β-內(nèi)酰胺抗生素的產(chǎn)量，降低β-內(nèi)酰胺抗生素的生產(chǎn)成本。


圖1為pPEPCT載體的物理圖譜圖2為pPCT載體的物理圖譜圖3為PCR產(chǎn)物的電泳4為TMHMM服務(wù)器對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的跨膜區(qū)分析結(jié)果圖5為pPEPCT和pPCE9載體轉(zhuǎn)基因菌株細(xì)胞內(nèi)外7-ADCA含量比較圖具體實(shí)施方式
除有特別說明外，本發(fā)明中所用的試劑均為市售分析純?cè)噭?，?gòu)自天津試劑公司。
實(shí)施例1、pctA基因的克隆將產(chǎn)黃青霉菌ATCC10003(X-1612)在YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，過濾收菌絲，取0.1g濕菌絲液N2研磨，加1ml Trizol試劑(Invitrogen公司，15596-026)抽提產(chǎn)黃青霉總RNA，將所得產(chǎn)黃青霉總RNA溶解于DEPC水中，-70℃下保存?zhèn)溆谩?br> 為去除可能的DNA污染，取產(chǎn)黃青霉總RNA 5μg，在100μl反應(yīng)體系內(nèi)，加入5μlRQ1 RNase-Free DNase(Promega公司，M6101)，10μl RQ1 RNase-Free DNase反應(yīng)緩沖液(10×)，37℃保溫30分，用酚氯仿抽提，乙醇沉淀，溶于10μl DEPC水。取5μl去除DNA的RNA樣品，用隨機(jī)引物(Random Hexamers，Promega公司，C1181)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，所用反轉(zhuǎn)錄酶為SuperScriptTMII RNase H-(Invitrogen公司，18064-022)。
以5’-ATCTGGCAGACCATTCTAATACTC-3’和5’-ATCAACCGATCTTATGCTC-3’為引物，分別以cDNA和經(jīng)RQ1 RNase-Free DNase處理的RNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件為94℃，5分；94℃1分，60℃1分，72℃1.5分-40循環(huán)；72℃7分；4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳，結(jié)果如圖3所示，只有cDNA擴(kuò)增出了相應(yīng)長(zhǎng)度的片段，RNA模板則沒有擴(kuò)增條帶。M道為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1道為RT-PCR產(chǎn)物，2道為RNA-PCR產(chǎn)物。將RT-PCR產(chǎn)物按常規(guī)方法克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明該RT-PCR產(chǎn)物具有序列表中序列1的核苷酸序列，長(zhǎng)度為1842bp。通過序列分析和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，表明該序列的開放閱讀框架(Open Reading Frame，ORF)為自5’端的第67到第1761位堿基，長(zhǎng)度為1695bp，沒有內(nèi)含子，將其命名為pctA。在序列分析時(shí)還發(fā)現(xiàn)在ORF起始密碼子ATG前21bp處，同相位有終止密碼子TAG，由此說明我們得到了該基因的全長(zhǎng)序列。
該基因ORF片段的讀碼框編碼564個(gè)氨基酸，如序列表中序列2所示。該氨基酸序列與主要易化超家族(major facilitator superfamily，MFS)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白氨基酸序列有很高的相似性與啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)多胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Tpo3p、Tpo2p(NP_015482、NP_011654)氨基酸序列的一致性最高，皆為55％；與產(chǎn)黃頂頭孢霉(Acremonium chrysogenum)多藥抗性蛋白(CefT，CAD32176)氨基酸序列的一致性為44％；與煙曲霉(Aspergillus fumigatus)多藥抗性蛋白(CAD29613)氨基酸序列的一致性為39％。
用TMHMM服務(wù)器(http//genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對(duì)該蛋白質(zhì)序列進(jìn)行了跨膜區(qū)分析，結(jié)果如圖4所示，顯示該蛋白存在12個(gè)跨膜區(qū)，分別位于130-152位、167-189位、201-223位、227-249位、256-278位、293-315位、364-386位、396-418位、438-460位、464-486位、499-521位、531-553位氨基酸殘基處，具有典型的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白特征。(圖4中標(biāo)注1為跨膜區(qū)，2為膜外區(qū)，3為膜內(nèi)區(qū))實(shí)施例2、產(chǎn)黃青霉基因轉(zhuǎn)化載體(pPIPKA和pPCE9)的構(gòu)建酵母表達(dá)載體pPICZA和克隆載體pCR4Blunt-TOPO均購(gòu)自Invitrogen公司。
將產(chǎn)黃青霉菌ATCC10003(X-1612)培養(yǎng)在YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)培養(yǎng)基中24h，菌絲過濾后，加液N2磨碎，用Easy-DNA kit(Invitrogen公司，K1800-01)提取得到產(chǎn)黃青霉基因組DNA。
本發(fā)明選用腐草霉素抗性的編碼基因作為篩選標(biāo)記，腐草霉素抗性的編碼基因Shble來自于酵母表達(dá)載體pPICZA。在該載體中，Sh ble基因受酵母的TEF1(Transcriptionelongation factor 1)啟動(dòng)子和原核啟動(dòng)子EM7的雙重調(diào)控，3’端則為酵母CYC1基因的終止序列(cyclTT)。為了在產(chǎn)黃青霉中應(yīng)用該抗性，需引入能被絲狀真菌產(chǎn)黃青霉RNA聚合酶識(shí)別的啟動(dòng)子，本發(fā)明選用產(chǎn)黃青霉中異青霉素N合成酶(IPNS)基因pcbC的啟動(dòng)子Pipns。
根據(jù)文獻(xiàn)(Carr et al.，Gene 48257～266，1986)，設(shè)計(jì)引物pip15’-TCGCGGATCCTGTCCCTAGTGCTGGGCTTGAAGTATG-3’和pip25’-TGGAAGCCATGGTGTCTAGAAAAATAATGGTGAAAACT-3’，以產(chǎn)黃青霉ATCC10003(x-1612)菌株基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件為94℃，5分；94℃1分，62℃1分，72℃1分-30循環(huán)；72℃7分；4℃保存，得到1.16kb的Pipns序列。對(duì)PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序，結(jié)果表明該P(yáng)CR產(chǎn)物長(zhǎng)度為1168bp，和文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，只在589位由G變?yōu)锳。在所得PCR產(chǎn)物的5’和3’端分別引入BamH I和Nco I酶切位點(diǎn)，用T4DNA連接酶(Promega公司，M1801)與pGEM-T載體(Promega公司，A1360)在16℃連接12小時(shí)，得到質(zhì)粒pGEM-T/Pipns。
利用引物pk1 5’-TGAAGCTTGTCAGCTACTGGGCTATCAGGAC-3’、pk25’-ACA GATCTAAAGTGCCACCTGTATGCGGTGTG-3’，以pCR4Blunt-TOPO質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增得到卡那霉素的抗性基因(kanr)，并在其5’端和3’端分別引入Hind III、Bgl II酶切位點(diǎn)。
pPICZA質(zhì)粒用Hind III/Bgl II雙酶切后回收2.46kb片段，與經(jīng)過同樣酶切的kanr片段在16℃連接12小時(shí)，得到pPICZA/kan質(zhì)粒，然后采用CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選同時(shí)具有卡那霉素和腐草霉素抗性的陽性克隆，從中提取pPICZA/kan質(zhì)粒。
pPICZA/kan質(zhì)粒經(jīng)BamH I/NcoI部分消化，回收3.1kb片段。pGEM-T/Pipns同樣用BamH I/NcoI酶切，回收1.16kb片段。將兩片段在16℃連接12小時(shí)，得到產(chǎn)黃青霉的轉(zhuǎn)化載體，定名為pPIPKA。
根據(jù)文獻(xiàn)中公開的棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus)的青霉素N擴(kuò)環(huán)酶基因(cefE)(Kovacevic et al.J Bacteriol.171754-760，1989)序列，設(shè)計(jì)引物CEF15’-GTGAGAGTCCATGGACACGACGGTGCCCACCTTCAGCCTG-3’CEF25’-TTAGATAAGCTTCGCCTTGACCGCGGTGAGGTCGACTC-3’用棒狀鏈霉菌染色體DNA為模板，以CEF1、CEF2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到0.9kb的PCR產(chǎn)物，該P(yáng)CR產(chǎn)物為cefE開放閱讀框，其5’端引入了Nco I內(nèi)切酶位點(diǎn)，3’端引入了Hind III內(nèi)切酶位點(diǎn)。
將克隆的棒狀鏈霉菌的擴(kuò)環(huán)酶基因cefE(包括ORF及其本身的終止序列)與IPNS基因的啟動(dòng)子Pipns連接，得到表達(dá)盒pcef。將此表達(dá)盒pcef克隆于pPIPKA的BamHI/Hind III位點(diǎn)，所得質(zhì)粒定名為pPCE9。該質(zhì)粒含有IPNS基因啟動(dòng)子Pipns啟動(dòng)的棒狀鏈霉菌的擴(kuò)環(huán)酶基因，用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化產(chǎn)黃青霉，其陽性克隆菌株可直接發(fā)酵得到半合抗中間體7-ADCA。
實(shí)施例3、利用pctA基因提高7-ADCA產(chǎn)量1、構(gòu)建載體pPEPCT以5’-TTTATCACAGTTTGCAGCCTATTT-3’和5’-TGATTTACACCGTCTCCCAGTT-3’為引物，以產(chǎn)黃青霉ATCC10003基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后按常規(guī)方法進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果為序列表中序列3的核苷酸序列，長(zhǎng)度為3655bp。該序列除含有pctA基因的編碼區(qū)(自5’端第1459bp到3153bp)外，還包含有啟動(dòng)子、終止子等調(diào)控序列。將pPCE9載體用Hind III酶切、Klenow酶(Promega公司，M220A)補(bǔ)平，然后用T4DNA連接酶與PCR產(chǎn)物在16℃連接12小時(shí)，得到載體pPEPCT，其物理圖譜如圖1所示。
2、產(chǎn)黃青霉轉(zhuǎn)化與陽性克隆篩選采用Ca-PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法來轉(zhuǎn)化細(xì)胞。具體操作按Cantoral的方法(Bio/Technol.5494-497，1987)進(jìn)行，分別用pPEPCT載體和pPCE9載體轉(zhuǎn)化產(chǎn)黃青霉ATCC10003。陽性克隆在含有腐草霉素的YPD選擇性培養(yǎng)基篩選，各得到陽性克隆330個(gè)、282個(gè)。
3、轉(zhuǎn)基因菌株分泌7-ADCA檢測(cè)將所得陽性菌株按2×106分生孢子/ml接種到種子培養(yǎng)基，在26℃下培養(yǎng)48小時(shí)，種子培養(yǎng)基配方為(g/l)葡萄糖，30；乳糖，10；棉籽餅粉，10；酵母粉，10；玉米漿，10；(NH4)2SO4，2；KH2PO4，1；CaCO3，5；pH5.8。然后將種子培養(yǎng)物以5％接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，26℃下培養(yǎng)144小時(shí)。發(fā)酵培養(yǎng)基為(g/l)乳糖，120；棉籽餅粉，30；玉米漿，20；(NH4)2SO4，5；KH2PO4，1；K2SO4，5；CaCO3，10；pH6.5。
發(fā)酵結(jié)束后，以8000g離心力離心發(fā)酵液15分鐘除去菌絲體，得到發(fā)酵上清液。上清液進(jìn)行HPLC分析，分析條件見表1。
表1目的產(chǎn)物HPLC分析條件

按照峰面積計(jì)算7-ADCA的產(chǎn)量，以pPCE9載體282個(gè)轉(zhuǎn)基因菌株的平均產(chǎn)量為100％，pPEPCT轉(zhuǎn)基因菌株7-ADCA的平均產(chǎn)量提高了26.5％。兩種載體的轉(zhuǎn)基因菌株7-ADCA產(chǎn)量的比較如表2所示。
表2兩種載體的轉(zhuǎn)基因菌株7-ADCA產(chǎn)量的比較

4、轉(zhuǎn)基因菌株細(xì)胞內(nèi)外7-ADCA含量比較各取60株兩種載體的陽性克隆株，按照步驟3的培養(yǎng)方法進(jìn)行接種和發(fā)酵培養(yǎng)。10ml 144小時(shí)的發(fā)酵液8000g離心力離心15分鐘，上清液用HPLC測(cè)定7-ADCA含量。沉淀菌絲加入10m175％乙醇重懸，靜置60分鐘，萃取出細(xì)胞中的7-ADCA。離心上清用于HPLC分析。按峰面積計(jì)算產(chǎn)量，換算成每毫升菌液的7-ADCA含量。結(jié)果表明，pPCE9轉(zhuǎn)基因菌株中，胞內(nèi)7-ADCA的含量占63％，胞外占37％，而pPEPCT轉(zhuǎn)基因菌株細(xì)胞內(nèi)外的含量分別為43％、 57％。這種差異體現(xiàn)了pPEPCT載體中所含編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因序列轉(zhuǎn)化進(jìn)細(xì)胞后，促進(jìn)了7-ADCA的分泌，從而導(dǎo)致產(chǎn)量的增加。
實(shí)施例4、利用pctA基因提高青霉素的產(chǎn)量將載體pPIPKA用Hind III和BamH I酶切后，用Klenow酶補(bǔ)平，回收大片段，與實(shí)施例3中得到的PCR產(chǎn)物在16℃溫度下連接12小時(shí)，得到載體pPCT，其功能圖譜如圖2所示。
按實(shí)施例3所述方法用載體pPCT轉(zhuǎn)化產(chǎn)黃青霉菌株ATCC10003，篩選得到157株陽性菌株。按照標(biāo)準(zhǔn)方法(Brownlee et al，J Gen Microbio1，3347-352，1949)檢測(cè)青霉素產(chǎn)量，并參照Lein的方法(Overproduction of microbial metabolites，Z.Vanek and ZHostalek eds，pp105-139，1986)對(duì)篩選到的高單位菌株利用搖瓶發(fā)酵進(jìn)行復(fù)試。結(jié)果表明，工程菌與出發(fā)菌株相比，其青霉素產(chǎn)量明顯提高，最高提高幅度超過了20％。
序列表<160>3<210>1<211>1842<212>cDNA<213>產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)<400>1atctggcaga ccattctaat actcccaaaa atccttccac tgccataggc tctcatattt 60attattatgt cttcgacgat accagaagaa ggctcggaga ccccggagcc cttgcatgcc120cagcacctat ctatggccga aacgcaagag agcctccgca accggggcat cgcagaaact180cctcaagcat tggattacaa ctacccggct attggacatg acaaagaccc tgtatttccc240gaggagtaca ccgttgagac gagtactggt cttgttcccc aaagaaccct ggagcagatc300cgatctcatg gttctatctc atcgacgaag atcggaacac caacaaacga ggtcaacgcc360gacatcgaaa aaggaggaaa gggccctacg gagttcgtga cattcaccat cggcgatcct420gaacacccct acaattggtc ccgtgcttat cgctggtata tcactcttgt cgcctcggca480cttgtggtat gtgtcgcatt cgggtcctcc attgtcaccg gaggattggg tttgattgaa540gaacaataca acgtctctct cgaagttgca atcctaacat gttcaatcat ggtctgcgga600ttcgcagttg gccctctact ctggtctccc ctctctgaga tcatcggtcg aaggcctgta660tacatcatct ctctcgtttt atatgtgatt ttcaacatcc catgcgctct atccccaaac720atcggtggct tgctcgtctg ccgattccta tgcggtgtct tctctagttc aggcctttcc780ctcgctggtg gcaccattgc cgatatttgg agcattgagg agcgcgggat ggccattgca840tactttgctg ctgcaccata ctgcggccct gtactcggcc ctatcgtgac aggttggatc900aatgttggaa cgggccgcct cgacctcttc ttctgggtga acctagcttt cgccggtgcc960atcatggtca tgatcggcct tgtcccggag acatatgctc cagtgatcct gaagcggcgt 1020gccgcaaaac tccgcaaaga aaccggaaaa aacatcatca ccgagcaaga aaaaacgaag 1080ctcacattcc gagaaatcgc tcgcacaagc ctgatcagac ccatcactat gattatgaca 1140gagcccgtcc tcgaccttat gtgcatgtat attgttctga tctatgcaat gctctacgcc 1200ttcttcttcg catacccggt catcttcacc aagctctatg gctacaacga cggccagatc 1260gggctcatgt ttattcccat tctgatcggc gccggtttcg cccttgttgt cacacccgcc 1320atcgagggca agttccggaa aatctgtagc acgaggtctc caacaccaga ggaccgactc 1380cacgctgcac tgattggtgc accttttatc ccaatcgcct tcttcatcct gggcgctacc 1440tcctacaagc atattatctg ggttggacct gcttcgtcgg ggattgcctt tggcttcggc 1500atggtgttgt gctactatgc agtgaataac tatatcatcg actcgtacca gaagtacgct 1560gcgtcggctt tggcggccaa ggtcttcctc cgctctggtg gtggcgcggc tttcccgctg 1620ttcactacgc agatgtatga tcgtcttggg ttgcagtggg cttcttggct gcttgctttc 1680attggcgttg ccatggtctt cattccatat atcttctact tctttggggc gggcctgcgc 1740gcaagactta cccgggatta ggagaattgc tgctcctgct gtttctttct tttttcttca 1800tggaaaaagg ttagaacgtt cgggagcata agatcggttg at 1842
<210>2<211>564<212>PRT<213>產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)<400>2Met Ser Ser Thr Ile Pro Glu Glu Gly Ser Glu Thr Pro Glu Pro Leu1 5 10 15His Ala Gln His Leu Ser Met Ala Glu Thr Gln Glu Ser Leu Arg Asn20 25 30Arg Gly Ile Ala Glu Thr Pro Gln Ala Leu Asp Tyr Asn Tyr Pro Ala35 40 45Ile Gly His Asp Lys Asp Pro Val Phe Pro Glu Glu Tyr Thr Val Glu50 55 60Thr Ser Thr Gly Leu Val Pro Gln Arg Thr Leu Glu Gln Ile Arg Ser65 70 75 80His Gly Ser Ile Ser Ser Thr Lys Ile Gly Thr Pro Thr Asn Glu Val85 90 95Asn Ala Asp Ile Glu Lys Gly Gly Lys Gly Pro Thr Glu Phe Val Thr100 105 110Phe Thr Ile Gly Asp Pro Glu His Pro Tyr Asn Trp Ser Arg Ala Tyr115 120 125Arg Trp Tyr Ile Thr Leu Val Ala Ser Ala Leu Val Val Cys Val Ala130 135 140Phe Gly Ser Ser Ile Val Thr Gly Gly Leu Gly Leu Ile Glu Glu Gln145 150 155 160Tyr Asn Val Ser Leu Glu Val Ala Ile Leu Thr Cys Ser Ile Met Val165 170 175Cys Gly Phe Ala Val Gly Pro Leu Leu Trp Ser Pro Leu Ser Glu Ile180 185 190Ile Gly Arg Arg Pro Val Tyr Ile Ile Ser Leu Val Leu Tyr Val Ile195 200 205Phe Asn Ile Pro Cys Ala Leu Ser Pro Asn Ile Gly Gly Leu Leu Val210 215 220Cys Arg Phe Leu Cys Gly Val Phe Ser Ser Ser Gly Leu Ser Leu Ala225 230 235 240Gly Gly Thr Ile Ala Asp Ile Trp Ser Ile Glu Glu Arg Gly Met Ala245 250 255Ile Ala Tyr Phe Ala Ala Ala Pro Tyr Cys Gly Pro Val Leu Gly Pro260 265 270Ile Val Thr Gly Trp Ile Asn Val Gly Thr Gly Arg Leu Asp Leu Phe275 280 285
Phe Trp Val Asn Leu Ala Phe Ala Gly Ala Ile Met Val Met Ile Gly290 295 300Leu Val Pro Glu Thr Tyr Ala Pro Val Ile Leu Lys Arg Arg Ala Ala305 310 315 320Lys Leu Arg Lys Glu Thr Gly Lys Asn Ile Ile Thr Glu Gln Glu Lys325 330 335Thr Lys Leu Thr Phe Arg Glu Ile Ala Arg Thr Set Leu Ile Arg Pro340 345 350Ile Thr Met Ile Met Thr Glu Pro Val Leu Asp Leu Met Cys Met Tyr355 360 365Ile Val Leu Ile Tyr Ala Met Leu Tyr Ala Phe Phe Phe Ala Tyr Pro370 375 380Val Ile Phe Thr Lys Leu Tyr Gly Tyr Asn Asp Gly Gln Ile Gly Leu385 390 395 400Met Phe Ile Pro Ile Leu Ile Gly Ala Gly Phe Ala Leu Val Val Thr405 410 415Pro Ala Ile Glu Gly Lys Phe Arg Lys Ile Cys Ser Thr Arg Ser Pro420 425 430Thr Pro Glu Asp Arg Leu His Ala Ala Leu Ile Gly Ala Pro Phe Ile435 440 445Pro Ile Ala Phe Phe Ile Leu Gly Ala Thr Ser Tyr Lys His Ile Ile450 455 460Trp Val Gly Pro Ala Ser Ser Gly Ile Ala Phe Gly Phe Gly Met Val465 470 475 480Leu Cys Tyr Tyr Ala Val Asn Asn Tyr Ile Ile Asp Ser Tyr Gln Lys485 490 495Tyr Ala Ala Ser Ala Leu Ala Ala Lys Val Phe Leu Arg Ser Gly Gly500 505 510Gly Ala Ala Phe Pro Leu Phe Thr Thr Gln Met Tyr Asp Arg Leu Gly515 520 525Leu Gln Trp Ala Ser Trp Leu Leu Ala Phe Ile Gly Val Ala Met Val530 535 540Phe Ile Pro Tyr Ile Phe Tyr Phe Phe Gly Ala Gly Leu Arg Ala Arg545 550 555 560Leu Thr Arg Asp<210>3<211>3655<212>DNA<213>產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)
<400>3tttatcacag tttgcagcct atttaggccg ggagggaaag tgtcgagttg aggacaccga 60aaagggcttg gtcatagcgt ggattgataa cagtccagac acacttcgcc gccgggaggc 120catcttaaag aaagaacgcc aggagaaggg agacgaagag cgagagcaac gcttgattca 180agaccagatt aagcgcgccc agcaaacggc gctggctggc agcactacga cagaaccgga 240acccgaggca agattgttgc agaggaagga aggagaaaag atgaagttga atcttggact 300tggctcgaag aaggcagatg caaagcctgc atcgcctcct acggcaacaa cgacagcgga 360gtcgccggaa gaaaaagatg cacaaaagga tgcaccgaca ggaaacagcg actctcccgc 420tccgtctgcg cctaccgcac ccgtcaaaat atcgatgtca atgggtacac agaagccgaa 480aaatgtgttt gcagcagcag ctaagaagaa ccccttggct gggaaaaagg gttctatatt 540cacggctcct aagaaaatga ctgagcagga aaggattatg agagctgaaa tggaggcaat 600ggagcgcaaa cgggcccgtc cggactcggg attcacgaac aaacgaccga agatcacttg 660aattgacatg atttacatag agaaaacaca tacccagcta cccggcccat gcggttgagc 720ctatcgccct gcacaaacct tatgggagga tttgggccgg gtaagtcgtt tcttcaaatt 780ccttccgttt gtatcatgca cagtatgtgg gacttcaaga ggtactcgat catattgtat 840tcaaacagtt gtcttagcat tgtccatagg tgatcgtata taaaaccgtg ggtggaatcc 900aacctccgaa atatatctac aactattccc attaaccttt cctagcgaag tcgagttttg 960tgatctattt ggaaagtggg atcgaaacgt acctgggcat cgcatatata gcaattactt1020gctagcattc acgcgagctt ttggtgttga atggaagact gacgtgtctg agacctccac1080gggccgaaaa agaaccgggc cgttggaaac ctgatcggat cacactaagc gcagtctggc1140ctatcgggcg tgatgctaca aatctaaact tgggttggat tcgacgtctt atagtagatg1200cgcacacggc gatcgctcgg accgagcttt taccgctcac attgcgactg gtttagtgag1260ccattttctg cgatgccgac tttccggtga tcgtccggta tatctcggag atgggtcggc1320gttgcaagta tatacctgac acctttgcaa gcctccttgg gagtataagt atctgcaata1380tcgcctttaa gtatctggca gaccattcta atactcccaa aaatccttcc actgccatag1440gctctcatat ttattattat gtcttcgacg ataccagaag aaggctcgga gaccccggag1500cccttgcatg cccagcacct atctatggcc gaaacgcaag agagcctccg caaccggggc1560atcgcagaaa ctcctcaagc attggattac aactacccgg ctattggaca tgacaaagac1620cctgtatttc ccgaggagta caccgttgag acgagtactg gtcttgttcc ccaaagaacc1680ctggagcaga tccgatctca tggttctatc tcatcgacga agatcggaac accaacaaac1740gaggtcaacg ccgacatcga aaaaggagga aagggcccta cggagttcgt gacattcacc1800atcggcgatc ctgaacaccc ctacaattgg tcccgtgctt atcgctggta tatcactctt1860gtcgcctcgg cacttgtggt atgtgtcgca ttcgggtcct ccattgtcac cggaggattg1920ggtttgattg aagaacaata caacgtctct ctcgaagttg caatcctaac atgttcaatc1980atggtctgcg gattcgcagt tggccctcta ctctggtctc ccctctctga gatcatcggt2040cgaaggcctg tatacatcat ctctctcgtt ttatatgtga ttttcaacat cccatgcgct2100ctatccccaa acatcggtgg cttgctcgtc tgccgattcc tatgcggtgt cttctctagt2160tcaggccttt ccctcgctgg tggcaccatt gccgatattt ggagcattga ggagcgcggg2220atggccattg catactttgc tgctgcacca tactgcggcc ctgtactcgg ccctatcgtg2280acaggttgga tcaatgttgg aacgggccgc ctcgacctct tcttctgggt gaacctagct2340ttcgccggtg ccatcatggt catgatcggc cttgtcccgg agacatatgc tccagtgatc2400
ctgaagcggc gtgccgcaaa actccgcaaa gaaaccggaa aaaacatcat caccgagcaa2460gaaaaaacga agctcacatt ccgagaaatc gctcgcacaa gcctgatcag acccatcact2520atgattatga cagagcccgt cctcgacctt atgtgcatgt atattgttct gatctatgca2580atgctctacg ccttcttctt cgcatacccg gtcatcttca ccaagctcta tggctacaac2640gacggccaga tcgggctcat gtttattccc attctgatcg gcgccggttt cgcccttgtt2700gtcacacccg ccatcgaggg caagttccgg aaaatctgta gcacgaggtc tccaacacca2760gaggaccgac tccacgctgc actgattggt gcacctttta tcccaatcgc cttcttcatc2820ctgggcgcta cctcctacaa gcatattatc tgggttggac ctgcttcgtc ggggattgcc2880tttggcttcg gcatggtgtt gtgctactat gcagtgaata actatatcat cgactcgtac2940cagaagtacg ctgcgtcggc tttggcggcc aaggtcttcc tccgctctgg tggtggcgcg3000gctttcccgc tgttcactac gcagatgtat gatcgtcttg ggttgcagtg ggcttcttgg3060ctgcttgctt tcattggcgt tgccatggtc ttcattccat atatcttcta cttctttggg3120gcgggcctgc gcgcaagact tacccgggat taggagaatt gctgctcctg ctgtttcttt3180cttttttctt catggaaaaa ggttagaacg ttcgggagca taagatcggt tgatggagag3240acgaaagtct tgatttgaca ttaatggatg ttgggggtaa tgacatacat aataatacta3300atgaaggata gaacacaaca cggagagcat cggtgctcct tcaccggggc gacacatggc3360gaatcaatat tttccctggc ctcgattcca agtgccgggg aatacacaga gatatattgc3420ctcagccttg gagcgtcatt gagaacgatt atcttatgca taccgtcggt ctcatagagt3480ctagcgccgt ctgtattgtg agggcagtct ctgacgtttc ctgggttttt tccacctagg3540aggtgtgaaa ctcaatataa ggcatgatct gctggagatg cgaagtgaga agaaagatgt3600ggcatcaggc gaaaacttgc ccaaaggaat cccaactggg agacggtgta aatca 365權(quán)利要求
1.產(chǎn)黃青霉的一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的cDNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的cDNA序列；4)序列表中的SEQ ID №3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于所述產(chǎn)黃青霉轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因是序列表中的SEQ ID №1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述SEQ ID №1的讀碼框是自5’端第67位核苷酸到第1761位核苷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于所述產(chǎn)黃青霉轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因是序列表中的SEQ ID №3。
5.產(chǎn)黃青霉的一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)或?qū)EQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的產(chǎn)黃青霉轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其特征在于它具有序列表中SEQID №2的氨基酸殘基序列。
7.含有權(quán)利要求1所述基因的表達(dá)載體和細(xì)胞系。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的表達(dá)載體和細(xì)胞系，其特征在于所述載體為pPEPCT或pPCT。
9.權(quán)利要求1所述基因在β-內(nèi)酰胺類抗生素生產(chǎn)中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述β-內(nèi)酰胺類抗生素為7-氨基去乙酰頭孢烷酸、青霉素。
全文摘要
本發(fā)明公開了產(chǎn)黃青霉的一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供產(chǎn)黃青霉的一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1cDNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的cDNA序列；4)序列表中的SEQID №3。產(chǎn)黃青霉的一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)或?qū)EQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。構(gòu)建增加該基因拷貝的工程菌可以有效提高β－內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)量。
文檔編號(hào)C12N15/31GK1696290SQ20041003783
公開日2005年11月16日 申請(qǐng)日期2004年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月11日
發(fā)明者王富強(qiáng), 徐平, 任志紅, 鄭桂珍, 蘇彩云, 張春珍, 賈茜, 賀建功, 張建國(guó), 汪建, 于軍 申請(qǐng)人:華北制藥集團(tuán)有限責(zé)任公司