專利名稱：產(chǎn)黃青霉工程菌及其在生產(chǎn)7－氨基－3－脫乙酰氧基頭孢烷酸的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及β-內(nèi)酰胺類抗生素的生產(chǎn)領(lǐng)域，特別是涉及產(chǎn)黃青霉工程菌及其在生產(chǎn)7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸(7-ADCA)的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
β-內(nèi)酰胺類抗生素構(gòu)成最重要的一類抗生素，具有悠久的臨床應(yīng)用歷史。這類抗生素中，突出的有青霉素類半合成抗生素和頭孢菌素類半合成抗生素。合成這些抗生素的主要起始原料為6-氨基青霉烷酸(6-APA)、7-氨基頭孢烯酸(7-ACA)和7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸(7-ADCA)。產(chǎn)黃青霉菌發(fā)酵生產(chǎn)得到青霉素，從而可制得6-APA；7-ACA由頭孢菌素C制得，頭孢菌素C則通過(guò)產(chǎn)黃頂頭孢菌發(fā)酵產(chǎn)生，頭孢菌素C在任何pH下都非常易溶于水，所用的柱層析分離技術(shù)操作繁瑣、成本昂貴，而且工藝周期長(zhǎng)，從而增加了成本。
7-ADCA是制造頭孢氨芐、頭孢羥氨芐、頭孢拉定等半合成頭孢菌素的重要中間體，與7-ACA相比，在3位消除了不穩(wěn)定的乙酰氧基。它可由價(jià)廉易得的青霉素G(或V)經(jīng)酯化、擴(kuò)環(huán)重排、酶解去側(cè)鏈而得。其反應(yīng)過(guò)程包括青霉素G在低溫下經(jīng)過(guò)氧乙酸氧化后用雙-三甲基硅脲進(jìn)行酯化保護(hù)；吡啶和溴乙酰作用下加熱進(jìn)行開環(huán)、脫水、分子重排產(chǎn)生6-元的頭孢菌素環(huán)結(jié)構(gòu)；水解去三甲基硅后酰化酶水解脫側(cè)鏈得到7-ADCA。
產(chǎn)黃青霉菌(Penicillium chrysogenum)不能直接發(fā)酵得到頭孢菌素環(huán)結(jié)構(gòu)，但來(lái)自帶小棒鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus)的青霉素N擴(kuò)環(huán)酶可以進(jìn)行這種環(huán)擴(kuò)張，當(dāng)被引入產(chǎn)黃青霉菌后，它能將青霉素環(huán)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)轭^孢菌素環(huán)結(jié)構(gòu)，如Cantwell等在Proc.R.Soc.Lond.B.248(1992)，283-289；及EP-A-05 32341和EP-A-0540210中所述。在EP-A-05 32341中描述了擴(kuò)環(huán)酶結(jié)合己二酸作為原料在產(chǎn)黃青霉中的應(yīng)用，5-羧基戊酰側(cè)鏈作為產(chǎn)黃青霉中酰基轉(zhuǎn)移酶的底物，這導(dǎo)致形成5-羧基戊酰-6-APA，后者通過(guò)引入產(chǎn)黃青霉菌中的擴(kuò)環(huán)酶產(chǎn)生5-羧基戊酰-7-ADCA，最后去除5-羧基戊酰側(cè)鏈生成終產(chǎn)物7-ADCA；EP-A-05 40210描述了制備7-ACA的相似方法，但上述專利由于沒(méi)有認(rèn)識(shí)到擴(kuò)環(huán)酶在細(xì)胞中與?；D(zhuǎn)移酶同時(shí)表達(dá)的問(wèn)題，所提供的方法不夠經(jīng)濟(jì)有效。
ZL94192932.9和ZL94192933.7描述了補(bǔ)加兩種不同的前體3，3’-硫代二丙酸和3’-羧甲硫基丙酸，并結(jié)合擴(kuò)環(huán)酶和酰基轉(zhuǎn)移酶的同時(shí)表達(dá)，來(lái)生產(chǎn)7-ADCA的方法，在實(shí)用化上前進(jìn)了一步，但由于需要補(bǔ)加特殊而且昂貴的前體，使生產(chǎn)成本高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株能用于生產(chǎn)7-ADCA的產(chǎn)黃青霉工程菌。
本發(fā)明所提供的產(chǎn)黃青霉工程菌是產(chǎn)黃青霉菌(Penicillium chrysogenum)，該菌株已于2003年09月27日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC № 1018。
本發(fā)明所提供的產(chǎn)黃青霉工程菌在YPD培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。菌落直徑為1.1-1.3厘米。菌落周圍有一圈白邊、圓形，周邊飽滿；中間隆起、灰綠色，孢子豐富。菌落隆起部位的中央有凹陷。
在選育工程菌的過(guò)程中，本發(fā)明發(fā)明人構(gòu)建了兩個(gè)新的載體產(chǎn)黃青霉菌的重組載體pPIPKA，是利用載體pGEM-T與啟動(dòng)子Pipns序列酶切、連接，得到載體pGEM-T/Pipns；然后將載體pGEM-T/Pipns與載體pCR4Blunt-TOPO、pPICZA酶切、連接，構(gòu)建得到的；和產(chǎn)黃青霉菌的表達(dá)青霉素N擴(kuò)環(huán)酶基因的重組表達(dá)載體pPCE9，是將青霉素N擴(kuò)環(huán)酶基因cefE與啟動(dòng)子Pipns序列連接，然后與重組載體pPIPKA酶切、連接，構(gòu)建得到重組表達(dá)載體pPCE9，這兩個(gè)載體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸(7-ADCA)的方法。
本發(fā)明所提供的生產(chǎn)7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸的方法，包括1)發(fā)酵產(chǎn)黃青霉菌(Penicillium chrysogenum)CGMCC № 1018，從發(fā)酵液中提取5’-羥基-N-己二?；?7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸；2)將5’-羥基-N-己二?；?7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸制備成7-ADCA。
其中，步驟1)所述的提取步驟可以采用兩種方法第一種，采用有機(jī)溶劑萃取法在發(fā)酵液中加入萃取劑，調(diào)節(jié)pH值至1-2，分離有機(jī)相；然后在有機(jī)相中加水，調(diào)節(jié)pH值至6-7，分離水相，得5’-羥基-N-己二?；?7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸；所述萃取劑為正丁醇、異丙醇或乙酸乙酯。
第二種，采用大孔吸附樹脂提取法將發(fā)酵液調(diào)節(jié)pH2-3，酸化、過(guò)濾除蛋白，清液用大孔吸附樹脂吸附，洗脫得到5’-羥基-N-己二?；?7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸。
常用的大孔吸附樹脂有XAD-16、XAD-1600、SP-207等，一般以pH7-8乙酸鈉溶液作為洗脫劑，即可得到5’-羥基-N-己二?；?7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸。
步驟2)所述的5’-羥基-N-己二?；?7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸制備成7-ADCA，也有兩種方式第一種，化學(xué)法將5’-羥基-N-己二?；?7-氨基脫乙酰氧基頭孢烷酸在五氯化磷、吡啶的甲醇溶液中反應(yīng)1-2h，得到7-ADCA。制備過(guò)程的反應(yīng)溫度可以選擇-40--20℃。
第二種，酶法a)將所得5’-羥基-N-己二酰基-7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸溶解于含有偏亞硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液中，在25-30℃、pH6.5條件下通入氧氣用固定化D．氨基酸氧化酶催化氧化，過(guò)濾得到戊二酰-7-ADCA溶液；b)向所得戊二酰-7-ADCA溶液中加入固定化GL-7-ACA?；福?5-30℃、pH8條件下催化?；?，得到7-ADCA。
酶法中步驟a)所述氧氣的通氣流量通?？刂圃?.1-0.5L/min之間。在酶法制備過(guò)程中一般采用濃度為5％的氨水控制反應(yīng)pH，使反應(yīng)pH在酶催化反應(yīng)過(guò)程中能比較穩(wěn)定。
本發(fā)明的產(chǎn)黃青霉工程菌選擇青霉素N合成酶基因的調(diào)控元件進(jìn)行驅(qū)動(dòng)，從而使該基因能在最佳時(shí)間范圍內(nèi)表達(dá)，提高了青霉素分子擴(kuò)環(huán)反應(yīng)的效率，使得在發(fā)酵培養(yǎng)基中不需要補(bǔ)加前體，直接發(fā)酵得到5’-羥基-N-己二酰基-7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸，所得到的發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)過(guò)化學(xué)法或酶法脫去其側(cè)鏈，即可制備得到7-ADCA，簡(jiǎn)化了7-ADCA的制備工藝，降低了其生產(chǎn)成本。本發(fā)明工程菌培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，表達(dá)量高，一般可得到2.2g7-ADCA/L發(fā)酵液，可廣泛用于抗生素生產(chǎn)工業(yè)。


圖1為質(zhì)粒pPIPKA的物理圖譜；圖2為質(zhì)粒pPCE9的物理圖譜；圖3為工程菌發(fā)酵產(chǎn)物的紅外光譜圖；圖4為工程菌發(fā)酵產(chǎn)物的紫外光譜圖；圖5為工程菌發(fā)酵產(chǎn)物的1H核磁共振譜；圖6為工程菌發(fā)酵產(chǎn)物的13C核磁共振譜；圖7為工程菌發(fā)酵產(chǎn)物的13C核磁共振譜通過(guò)DEPT譜；圖8為工程菌發(fā)酵產(chǎn)物的13C核磁共振譜通過(guò)HMQC譜；圖9為工程菌發(fā)酵產(chǎn)物的低分辨質(zhì)譜；圖10為工程菌發(fā)酵產(chǎn)物的高分辨質(zhì)譜；圖11為工程菌發(fā)酵產(chǎn)物的1H-1H COSY譜；圖12為工程菌發(fā)酵產(chǎn)物的HMBC圖譜；圖13為工程菌發(fā)酵產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式；圖14A為產(chǎn)黃青霉基因工程菌CGMCC № 1018發(fā)酵產(chǎn)物HPLC圖譜；圖14B為產(chǎn)黃青霉菌ATCC10003(X-1612)發(fā)酵產(chǎn)物HPLC圖譜；圖15A為產(chǎn)黃青霉基因工程菌CGMCC № 1018發(fā)酵產(chǎn)物青霉素酶消化后的HPLC圖譜；圖15B為產(chǎn)黃青霉基因工程菌CGMCC № 1018發(fā)酵產(chǎn)物頭孢菌素酶消化后的HPLC圖譜。
具體實(shí)施例方式
除有特別說(shuō)明外，本發(fā)明中所用的試劑均為市售分析純?cè)噭?，?gòu)自天津試劑公司。
實(shí)施例1、產(chǎn)黃青霉工程菌(Penicillium chrysogenum)CGMCC № 1018的選育酵母表達(dá)載體pPICZA和原核生物基因克隆載體pCR4Blunt-TOPO均購(gòu)自Invitrogen公司。產(chǎn)黃青霉細(xì)胞壁裂解酶Novozyme234購(gòu)自Sigma公司。
同源性選擇性標(biāo)記，如amdS基因、氨基酸或核苷酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因等，和異源性選擇標(biāo)記基因，如腐草霉素抗性的編碼基因或寡霉素抗性的編碼基因等，都可用于轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性克隆的選擇。本發(fā)明選用腐草霉素抗性的編碼基因作為篩選標(biāo)記，腐草霉素抗性的編碼基因Shble來(lái)自于酵母表達(dá)載體pPICZA。在該載體中，Sh ble基因受酵母的TEF1(Transcription elongation factor 1)啟動(dòng)子和原核啟動(dòng)子EM7的雙重調(diào)控，3’端則為酵母CYC1基因的終止序列(cyc1TT)，抗性基因既可以在大腸桿菌也可以在酵母細(xì)胞中表達(dá)，可分別用于原核及真核篩選。為了在產(chǎn)黃青霉中應(yīng)用該抗性，需引入能被絲狀真菌產(chǎn)黃青霉RNA聚合酶識(shí)別的啟動(dòng)子。
異青霉素N合成酶(IPNS)基因pcbC的啟動(dòng)子Pipns、?；D(zhuǎn)移酶(AT)基因penDE啟動(dòng)子Pat、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)磷酸甘油激酶基因gpdA的啟動(dòng)子PgpdA、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)色氨酸合成酶基因trpC的啟動(dòng)子PtrpC、粗糙脈胞霉(Neurospora crassa)交叉途徑控制基因(cpc-1)的啟動(dòng)子Pcpc-1等都可用于啟動(dòng)選擇性標(biāo)記基因的表達(dá)。本發(fā)明選用產(chǎn)黃青霉中異青霉素N合成酶(IPNS)基因pcbC的啟動(dòng)子Pipns。
1、基因克隆和基因轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建將產(chǎn)黃青霉菌ATCCl0003(X-1612)培養(yǎng)在YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，菌絲過(guò)濾后，加液N2磨碎，用Easy-DNA kit(Invitrogen公司，K1800-01)提取得到產(chǎn)黃青霉基因組DNA。
帶小棒鏈霉菌ATCC 27064在YD(1％酵母萃取液，1％葡萄糖)培養(yǎng)液中生長(zhǎng)24h，提取該菌株的染色體DNA。
根據(jù)文獻(xiàn)(Carr et al.，1986，Gene 48257～266)，以pip1(SEQ ID NO.6)5’-TCGCGGATCCTGTCCCTAGTGCTGGGCTTGAAGTATG-3’和pip2(SEQ IDNO.7)5’-TGGAAGCCATGGTGTCTAGAAAAATAATGGTGAAAACT-3’為引物，以產(chǎn)黃青霉ATCC10003(x-1612)菌株基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件為94℃，5分；94℃1分，62℃1分，72℃1.5分-30循環(huán)；72℃7分；4℃保存。將PCR產(chǎn)物采用常規(guī)方法克隆測(cè)序，結(jié)果表明克隆產(chǎn)物具有序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列，長(zhǎng)度為1168bp，和文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，只在589位由G變?yōu)锳，證明得到了Pipns序列。在克隆得到的1.16kb Pipns序列5’和3’端分別引入BamH I和NcoI酶切位點(diǎn)，然后用DNA連接酶與pGEM-T載體(Promega公司，A1360)在16℃溫度下連接12小時(shí)，得到質(zhì)粒pGEM-T/Pipns。
以pCR4Blunt-TOPO質(zhì)粒為模板，利用引物pk1(SEQ ID NO.2)5’-TGA AGCTTG TCA GCT ACT GGG CTA TCA GGA C-3’、pk2(SEQ ID NO.3)5’-ACA GATCTA AAG TGC CAC CTG TAT GCG GTG TG-3’，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到卡那霉素的抗性基因(kanr)，并在其5’端和3’端分別引入Hind III、BglII酶切位點(diǎn)。
pPICZA質(zhì)粒用Hind III/Bgl II雙酶切后回收2.46kb片段，與經(jīng)過(guò)同樣酶切的kanr片段在16℃連接12小時(shí)，得到pPICZA/kan質(zhì)粒，然后采用CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選同時(shí)具有卡那霉素和腐草霉素抗性的陽(yáng)性克隆，從中提取pPICZA/kan質(zhì)粒。
pPICZA/kan質(zhì)粒經(jīng)BamH I/Nco I部分消化，回收3.1kb片段。pGEM-T/Pipns同樣用BamH I/Nco I酶切，回收1.16kb片段。將兩片段在16℃連接12小時(shí)，得到產(chǎn)黃青霉的轉(zhuǎn)化載體，定名為pPIPKA，其物理譜圖如圖1所示。
根據(jù)帶小棒鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus)的青霉素N擴(kuò)環(huán)酶基因(cefE)序列(Kovacevic et al.J Bacteriol.(1984)，754-760)，設(shè)計(jì)引物CEF1(SEQ ID NO.4)5’-GTGAGAGTCCATGGACACGACGGTGCCCACCTTCAGCCTG-3’CEF2(SEQ IDNO.5)5’-TTAGATAAGCTTCGCCTTGACCGCGGTGAGGTCGACTC-3’。
用帶小棒鏈霉菌染色體DNA為模板，以CEF1、CEF2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到0.9kb PCR產(chǎn)物，該P(yáng)CR產(chǎn)物為cefE開放閱讀框，其5’端引入了Nco I內(nèi)切酶位點(diǎn)，3’端引入了Hind III內(nèi)切酶位點(diǎn)。
將棒狀鏈霉菌的擴(kuò)環(huán)酶基因cefE經(jīng)Nco I酶切，然后與經(jīng)過(guò)同樣酶切處理的Pipns序列(帶有BamH I和Nco I酶切位點(diǎn))在16℃下連接12小時(shí)，得到表達(dá)盒pcef；然后將連接產(chǎn)物經(jīng)BamH I/Hind III雙酶切，與同樣經(jīng)BamH I/Hind III雙酶切的質(zhì)粒pPIPKA連接，得到產(chǎn)黃青霉菌的表達(dá)載體pPCE9，其物理譜圖如圖2所示。
在構(gòu)建載體的過(guò)程中，酶切、回收、克隆、連接等操作均按照常規(guī)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。
2、產(chǎn)黃青霉菌的轉(zhuǎn)化與陽(yáng)性克隆的篩選采用Ca-PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法來(lái)轉(zhuǎn)化細(xì)胞。具體操作按Cantoral的方法(Bio/Technol.1987，5494-497)進(jìn)行，用pPCE9載體轉(zhuǎn)化產(chǎn)黃青霉ATCC10003。陽(yáng)性克隆在含有平陽(yáng)霉素的YPD選擇性培養(yǎng)基中篩選，得到產(chǎn)黃青霉工程菌(Penicilliumchrysogenum)CGMCC № 1018。單一的穩(wěn)定菌落用于制備孢子并篩選含有cefE表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化子，平陽(yáng)霉素抗性菌落的菌體以Novozyme234消化，用苯酚抽提后作為PCR模板，所用引物為CEF15′--GTG AGA GTC CAT GGA CAC GAC GGT GCC CAC CTT CAGCCT G--3′和CEF25′—TTA GAT AAG CTT CGC CTT GAC CGC GGT GAG GTCGAC TC--3′，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酶切分析，證明該菌體含有cefE表達(dá)盒。
實(shí)施例2、產(chǎn)黃青霉工程菌(Penicillium chrysogenum)CGMCC № 1018的發(fā)酵及發(fā)酵產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定一、產(chǎn)黃青霉工程菌發(fā)酵將產(chǎn)黃青霉工程菌(Penicillium chrysogenum)CGMCC № 1018以2×106分生孢子/ml接種到種子培養(yǎng)基，26℃培養(yǎng)48小時(shí)。種子培養(yǎng)基配方(g/l)葡萄糖，30；乳糖，10；棉籽餅粉，10；酵母粉，10；玉米漿，10；(NH4)2SO4，2；KH2PO4，1；CaCO3，5；pH5.8。
然后將種子培養(yǎng)物以5％接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，26℃培養(yǎng)144小時(shí)。發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)為(g/l)乳糖，120；棉籽餅粉，30；玉米漿，20；(NH4)2SO4，5；KH2PO4，1；K2SO4，5；CaCO3，10；pH6.5。
發(fā)酵結(jié)束后，離心發(fā)酵液以8000g離心力離心15分鐘除去菌絲體，得到工程菌發(fā)酵上清液。
二、發(fā)酵產(chǎn)物鑒定1、發(fā)酵產(chǎn)物的酶解分析按步驟一的發(fā)酵條件發(fā)酵產(chǎn)黃青霉ATCC10003(X-1612)，得到宿主菌發(fā)酵上清液。
將所得工程菌上清液和宿主菌上清液以表1中的條件進(jìn)行HPLC分析，分別如圖14A和圖14B所示，結(jié)果表明工程菌比宿主菌在保留時(shí)間為16.8分鐘處多了一個(gè)洗脫峰，說(shuō)明工程菌比宿主菌多一個(gè)發(fā)酵產(chǎn)物。
表1 目的產(chǎn)物HPLC分析條件


已知青霉素酶可特異水解青霉素的內(nèi)酰胺環(huán)，頭孢菌素酶可特異水解頭孢菌素的內(nèi)酰胺環(huán)。按表2所列的條件以青霉素酶和頭孢菌素酶于25℃，1小時(shí)分別水解發(fā)酵產(chǎn)物，然后進(jìn)行HPLC分析，其色譜圖分別如圖15A和圖15B所示，結(jié)果表明青霉素酶消化的發(fā)酵液與沒(méi)加酶處理的對(duì)照發(fā)酵液的HPLC圖譜相同，而頭孢菌素酶消化的發(fā)酵液保留時(shí)間為16.8分鐘的洗脫峰消失，這表明基因工程菌發(fā)酵液中新得到的發(fā)酵產(chǎn)物是青霉素環(huán)擴(kuò)環(huán)產(chǎn)物。
表2 發(fā)酵液酶處理?xiàng)l件

2、發(fā)酵產(chǎn)物結(jié)構(gòu)分析1)發(fā)酵產(chǎn)物的提取將600ml正丁醇加入到120ml工程菌發(fā)酵液中，在劇烈攪拌的情況下用濃度為8.5g/ml的磷酸調(diào)pH1-2，靜置，分相，得到560ml正丁醇相。在正丁醇相中加入400ml蒸餾水，在劇烈攪拌的情況下用濃度為1M的NaOH調(diào)pH6-7，靜置，分相，水相在30℃熱浴下濃縮至干，得深色粘稠狀固體粗品。
粗品以少量DMSO溶解，經(jīng)高速離心后直接用于HPLC制備，HPLC條件如表3。
表3 HPLC純化條件


收集保留時(shí)間為8.4分鐘的洗脫液，然后在30℃熱浴下濃縮至干，得到白顏色或淡黃色固體。固體產(chǎn)物用DMSO溶解，依表4的HPLC條件進(jìn)行進(jìn)一步純化，收集保留時(shí)間為7.3分鐘的洗脫液，濃縮得到25mg純品。
表4 HPLC純化條件

2)產(chǎn)物質(zhì)譜解析儀器低分辨質(zhì)譜JC-MS DX-300Autospec-Ultima-TOf高分辨質(zhì)譜APEX II FT-ICRMS(Bruker Dallonics.Inc)條件a)低分辨FAB-MS NBA+Glycerolb)高分辨P-SIMS-Glycerol(+NaCl)結(jié)果分別如圖9、圖10所示。
a)低分辨質(zhì)譜出現(xiàn)3個(gè)離子碎片M/Z 解析359.1(M+H)185.16元環(huán)部分158.0己二酰-7-氨基部分b)高分辨M+Na(m/z)為381.0726793，由高分辨質(zhì)譜得知，該化合物的分子式為C14H18N2O7S·Na，按分子式C14H18N2O7S·Na計(jì)算理論值應(yīng)為381.0732，誤差1.4ppm。
由此判斷該化合物可能是5’-羥基-N-己二?；?7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸，分子式C14H18N2O7S，分子量按國(guó)際原子量表計(jì)算分子量為358.3722。
3)產(chǎn)物紅外吸收光譜儀器Nicolet Magna-IR 550型傅立葉紅外光譜儀，測(cè)定條件KBr壓片。波數(shù)用聚苯乙烯薄膜校正，該化合物的紅外光譜圖如圖3所示，測(cè)定數(shù)據(jù)及解析見(jiàn)表5。
表5 紅外光譜數(shù)據(jù)及解析

4)產(chǎn)物紫外吸收光譜儀器美國(guó)Beckman DU-640紫外分光光度計(jì)溶劑水，供試液濃度99.0×10-3g/100ml紫外光譜圖如圖4所示。
樣品的UV光譜圖表明該物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)λ＝257nm，在200nm處有末端吸收。
5)產(chǎn)物1H核磁共振譜儀器Varian INOVA-500型核磁共振譜儀溶劑DMSO1H-NMR譜如圖5所示。
1H-NMR譜解析該化合物1H-NMR譜中有10個(gè)信號(hào)，根據(jù)氫．氫化學(xué)位移相關(guān)譜(1H-1H COSY)實(shí)驗(yàn)(結(jié)果如圖11所示)，對(duì)各質(zhì)子進(jìn)行了歸屬，結(jié)果如表6所示。圖譜中所有信號(hào)的化學(xué)位移及多重性(裂分方式及偶合常數(shù))均與圖13所確定的結(jié)構(gòu)式相吻合，結(jié)構(gòu)式中各原子的編號(hào)見(jiàn)圖13。
表 6產(chǎn)物1HNMR數(shù)據(jù)及各質(zhì)子歸屬(DMSO，500MHZ)

6)產(chǎn)物13C核磁共振譜儀器Varian INOVA-500核磁共振譜儀溶劑DMSO13C核磁共振譜如圖6所示。
3C核磁共振譜解析在13C NMR圖譜中共出現(xiàn)14個(gè)信號(hào)，通過(guò)如圖7的無(wú)畸變極化增益法譜(DEPT譜)和圖8的異核多量子相干譜(HMQC譜)，對(duì)各個(gè)信號(hào)進(jìn)行了歸屬，各碳原子的歸屬見(jiàn)表7，解析過(guò)程詳見(jiàn)綜合解析。從DEPT圖譜上可看出有1個(gè)甲基，4個(gè)亞甲基，3個(gè)次甲基，6個(gè)季碳。
表7 產(chǎn)物13CNMR數(shù)據(jù)及歸屬(DMSO，125MHZ)

7)產(chǎn)物綜合解析由高分辨質(zhì)譜得知，該化合物的分子式為C14H18N2O7S。由DEPT譜得知化合物中有1個(gè)CH3、4個(gè)CH2、3個(gè)CH、6個(gè)季碳，這與5’-羥基-N-己二?；?7-氨基脫乙酰氧基頭孢烷酸結(jié)構(gòu)式中的碳個(gè)數(shù)和碳的種類完全一致。
由圖11的1H-1HCOSY譜可對(duì)1HNMR中的各質(zhì)子信號(hào)進(jìn)行歸屬，結(jié)果如表5所示。最高場(chǎng)1.5-1.6ppm多重峰信號(hào)分別與2.18ppm、3.87ppm處的多重峰信號(hào)偶合，并同時(shí)有自身偶合，說(shuō)明1.5-1.6ppm信號(hào)為3’、4’位上的亞甲基，2.18ppm處的信號(hào)為2’位亞甲基，3.87ppm處的多重峰為5’次甲基；出現(xiàn)在高場(chǎng)2.0ppm的最強(qiáng)信號(hào)為3位甲基峰；出現(xiàn)在3.29ppm和3.51ppm處的兩個(gè)雙峰之間的偶合常數(shù)為18Hz，屬于同碳偶合，歸屬于2位亞甲基兩個(gè)不等價(jià)的氫。出現(xiàn)在5.52ppm處的質(zhì)子同時(shí)與4.98ppm以及8.74ppm兩處的信號(hào)相偶合，說(shuō)明該信號(hào)為7位次甲基，與相鄰6位次甲基(4.98ppm)偶合常數(shù)為4.5，而與相鄰的-NH-(8.74ppm)偶合常數(shù)為8.5。
該化合物碳譜中共有14個(gè)碳信號(hào)，通過(guò)HMQC實(shí)驗(yàn)，由氫的歸宿確認(rèn)與氫直接相連的碳，對(duì)碳原子進(jìn)行歸屬，結(jié)果見(jiàn)表8。
表8 產(chǎn)物碳-氫相關(guān)關(guān)系

最終用如圖12所示的異核多鍵相干譜(HMBC)實(shí)驗(yàn)，不但對(duì)季碳原子進(jìn)行了解析和歸屬，而且證實(shí)了所有碳?xì)湓拥臍w屬。出現(xiàn)在較高場(chǎng)的兩個(gè)季碳信號(hào)(122.835ppm、129.992ppm)與2位氫有遠(yuǎn)程偶合，因此，可以推斷122.835ppm、129.992ppm兩處的季碳為3、4位季碳；與6位氫和7位氫均有遠(yuǎn)程偶合的季碳為8位羰基季碳(164.54ppm)；與2’位氫(2.19ppm)、3’位氫(1.5～1.6ppm)以及7位氫(5.52ppm)均有遠(yuǎn)程偶合的季碳為1’位羰基季碳(172.979ppm)；與4’位氫(1.5～1.6ppm)、5’位氫(3.87ppm)同時(shí)有遠(yuǎn)程偶合的季碳為6’位羰基季碳(175.737ppm)；最后只剩下4位上的羧基季碳(163.556ppm)，由于該季碳與周圍任何氫相距較遠(yuǎn)，不能產(chǎn)生偶合。
綜上所述，該化合物各碳?xì)鋱D譜上的信號(hào)都得到了合理的歸屬，由此可以推斷該化合物的結(jié)構(gòu)式如圖13所示，中文名5’-羥基-N-己二?；?7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸英文名5’-hydroxy-N-hexanedioyl-7-amino-3-deacetoxy cephalosporanic acid實(shí)施例3、5’-羥基-N-己二酰基-7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸的分離及化學(xué)法制備7-ADCA
按照實(shí)施2的方法發(fā)酵產(chǎn)黃青霉工程菌(Penicillium chrysogenum)CGMCC №1018，發(fā)酵結(jié)束后，1升發(fā)酵液過(guò)濾除去菌絲體；菌體以水洗并與濾液合并得到1.5升濾液。濾液經(jīng)10％H2SO4水溶液酸化到pH1.5左右，加入2/3體積的丁醇，充分混勻，靜置分相。水相以丁醇重復(fù)提取1次。合并有機(jī)相后用活性炭脫色，以pH2的水洗，再以0.2升2mol/L NaOH提取，靜置分相，無(wú)水硫酸鈉干燥得到5’-羥基-N-己二?；?7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸。
將所得5’-羥基-N-己二?；?7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸加入到7ml五氯化磷、吡啶的甲醇溶液(其中，含有1g五氧化磷和2ml吡啶)中，于-30℃反應(yīng)2小時(shí)脫去側(cè)鏈。然后以3份100ml飽和丁醇水溶液于pH0.4條件下提取，提取液以NaOH中和，7-ADCA從水相中結(jié)晶析出。晶體過(guò)濾，水洗，干燥，得到1.1克純度為95％的7-ADCA。
采用下面的HPLC方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果與購(gòu)自華北制藥集團(tuán)倍達(dá)有限公司的7-ADCA保留時(shí)間一致。分析方法HPLC色譜柱Inertsil C184.6×250mm，5μm；流速1.0mL/min；流動(dòng)相梯度洗脫，A相pH4.00.015M NH4Ac，HAc調(diào)pH，B相甲醇，梯度曲線為0min98％A2％B；10min90％A 10％B；20min85％A 15％B；25min5％A 95％B。
實(shí)施例4、5-羥基-N-己二酰-7-ADCA和己二酰-7-ADCA酶法制備7-ADCA1、發(fā)酵液中提取5-羥基-N-己二酰-7-ADCA和己二酰-7-ADCA由于發(fā)酵液中組分雜、雜質(zhì)多，采用大孔樹酯(SP207購(gòu)自北京綠百草科技發(fā)展有限公司)吸附法分離。
取1L工程菌發(fā)酵液，用20％H2SO4調(diào)節(jié)pH2.5，酸化4h，加硅藻土助濾，除去蛋白得到5-羥基-N-己二酰-7-ADCA(adi-OH-7-ADCA)的清液；清液用大孔吸附樹酯吸附，再用pH＝8的乙酸鈉溶液解吸，液相監(jiān)測(cè)得到5-羥基-N-己二酰-7-ADCA和己二酰-7-ADCA(adi-7-ADCA)這兩種純的組分溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干得adi-OH-7-ADCA和adi-7-ADCA。
2、將adi-OH-7-ADCA或adi-7-ADCA氧化為戊二酰-7-ADCA(gl-7-ADCA)在100ml三口燒瓶中，取1g adi-OH-7-ADCA或adi-7-ADCA溶解在含0.013g偏亞硫酸鈉鹽的40ml 25mM磷酸鉀緩沖液中，加入固定化氧化酶(D-Amino acidoxidase，購(gòu)自SIGMA公司)。在溫度25-30℃下攪拌，并向反應(yīng)器中通入氧氣進(jìn)行反應(yīng)，氧氣的通氣量為0.3L/min，用5％的氨水控制反應(yīng)液pH7.5，反應(yīng)75min后，反應(yīng)體系pH基本不再變化，過(guò)濾得到含有g(shù)l-7-ADCA的反應(yīng)液。
3、gl-7-ADCA到7-ADCA的生物轉(zhuǎn)化以上得到的gl-7-ADCA反應(yīng)液中加入固定化酰化酶(長(zhǎng)沙福來(lái)格生物技術(shù)有限公司)，在25-30℃下攪拌反應(yīng)，用5％氨水控制pH8.0，反應(yīng)120min后，pH基本穩(wěn)定，過(guò)濾并用少量水洗滌，得到7-ADCA溶液。
4、7-ADCA的結(jié)晶得到的7-ADCA溶液用1g活性炭室溫?cái)嚢?5min，過(guò)濾除去炭，用少量水洗滌；濾液用6N硫酸調(diào)節(jié)pH4.5，緩慢攪拌15min以便養(yǎng)晶，用冰水浴降溫并保持在5℃以下，最后再調(diào)到pH3.5-3.7，2h后過(guò)濾得晶體，用少量水洗滌，產(chǎn)物結(jié)晶率95％，晶體純度含量在99％以上。
所得產(chǎn)物核磁和HPLC分析，其保留時(shí)間與購(gòu)自華北制藥集團(tuán)倍達(dá)有限公司的7-ADCA一致，證明所得產(chǎn)物即為7-ADCA，每升發(fā)酵液可以得到2.2g7-ADCA。
序列表<160>7<210>1<211>1168<212>DNA<213>產(chǎn)黃青霉菌(Penicillium chrysogenum)<400>1ggatcctgtc cctagtgctg ggcttgaagt atgccattgc tgggtttgat ggtcccattt 60ttcacactcg agctcccact ggcgttcagg gatgtagtgg ccgagaagcc tatcggcgtg120gttccgttcg gtggcttcag ttgagtcatg tctgtcaatg accaataatt ggtagggacg180gatcggatgc aacaacaagt gttagaaaaa acgcaatcac agacaagctc gaggggaatt240ccttatactg ggcctgctgc attggtctgc cattgcaggg tatatatggc tgacctggcc300aatctccatc gagaatctgg gcgactgaag cactgcccgc agacaagatg gagactttcg360tctagcacgg tctagggcag atccgatgcc attggctctg tcaactgtcg actacatgta420tctgcatgtt gcatcgggaa atcccaccac agggacagcc aagcggcccc gcgacttggc480agtgggcaaa ctacgcccga ttctggtgcc aagaaccgag aagaatgaga cagacccacg540ttgcactcta accggatgct atcgacttac ggtggctgaa gattcaacac gctgcaacga600gagccaaggt ggtccggaca ttttctacgt gccggtttac cttggaacat cgccgtcgtt660gagtgcacgt tgcctactct ctcgtggctt ggctgggccc acgagcccga ttgactcgac720ggtgttactt gggtatctat ggccccgttt tctggcacgg taatgataag tacttactag780tcttcgagcg ggggagtgtt gctctgcccg agcatcaacg attggcctga tcgcaccgtc840tgcaaatgcc acggtgcgga ccgactgaaa tctcagacca ccaaagaccc tccgacttcg900agatacggtt actaatttta cactggctcc agcggcccca tccagtaagc atctgggctg960caagcgtata atgtctccag gttgtctcag cataaatacc ccgcccccgc tcaggcacac 1020aggaagagag ctcaggtcgt ttccattgcg tccatactct tcactcattg tcatctgcag 1080gagaacttcc cctgtccctt tgccaagccc tctcttcgtc gttgtccacg ccttcaagtt 1140ttcaccatta tttttctaga caccatgg 1168<210>2<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2
tgaagcttgt cagctactgg gctatcagga c31<210>3<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3acagatctaa agtgccacct gtatgcggtg tg 32<210>4<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4gtgagagtcc atggacacga cggtgcccac cttcagcctg 40<210>5<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>5ttagataagc ttcgccttga ccgcggtgag gtcgactc 38<210>6<211>37
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>6tcgcggatcc tgtccctagt gctgggcttg aagtatg 37<210>7<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>7tggaagccat ggtgtctaga aaaataatgg tgaaaact 38
權(quán)利要求
1.產(chǎn)黃青霉菌(Penicillium chrysogenum)CGMCC№1018。
2.一種產(chǎn)黃青霉菌的重組載體pPIPKA，是利用載體pGEM-T與啟動(dòng)子Pipns序列酶切、連接，得到載體pGEM-T/Pipns；然后將載體pGEM-T/Pipns與載體pCR4Blunt-TOPO、pPICZA酶切、連接，構(gòu)建得到重組載體pPIPKA。
3.一種產(chǎn)黃青霉菌的表達(dá)青霉素N擴(kuò)環(huán)酶基因的重組表達(dá)載體pPCE9，是將青霉素N擴(kuò)環(huán)酶基因cefE與啟動(dòng)子Pipns序列連接，然后與權(quán)利要求2所述的重組載體pPIPKA酶切、連接，構(gòu)建得到重組表達(dá)載體pPCE9。
4.權(quán)利要求1所述產(chǎn)黃青霉菌的應(yīng)用，為一種生產(chǎn)7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸的方法，包括1)發(fā)酵產(chǎn)黃青霉菌(Penicillium chrysogenum)CGMCC №1018，從發(fā)酵液中提取5’-羥基-N-己二?；?7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸；2)將5’-羥基-N-己二?；?7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸制備成7-ADCA。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟1)所述的提取是指在發(fā)酵液中加入萃取劑，調(diào)節(jié)pH值至1-2，分離有機(jī)相；然后在有機(jī)相中加水，調(diào)節(jié)pH值至6-7，分離水相，得5’-羥基-N-己二酰基-7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸；所述萃取劑為正丁醇、異丙醇或乙酸乙酯。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于步驟1)所述提取是指將發(fā)酵液調(diào)節(jié)pH2-3，酸化、過(guò)濾，清液用大孔吸附樹脂吸附，洗脫得到5’-羥基-N-己二?；?7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述洗脫采用pH7-8乙酸鈉溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-7任一所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟2)所述的制備是指將所述的5’-羥基-N-己二?；?7-氨基脫乙酰氧基頭孢烷酸在五氯化磷、吡啶的甲醇溶液中反應(yīng)1-2h，得到7-ADCA。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于反應(yīng)溫度為-40--20℃。
10.根據(jù)權(quán)利要求4-7任一所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟2)所述的制備具體包括a)將所得5’-羥基-N-己二?；?7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸溶解于含有偏亞硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液中，在25-30℃、pH7.5條件下通入氧氣用固定化D-氨基酸氧化酶催化氧化，過(guò)濾得到戊二酰-7-ADCA溶液；b)向所得戊二酰-7-ADCA溶液中加入固定化GL-7-ACA酰化酶，在25-30℃、pH8條件下催化?；?，得到7-ADCA。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種產(chǎn)黃青霉工程菌及其在生產(chǎn)7－氨基－3－脫乙酰氧基頭孢烷酸(7－ADCA)的應(yīng)用，涉及β－內(nèi)酰胺類抗生素的生產(chǎn)領(lǐng)域。本發(fā)明所提供的工程菌是產(chǎn)黃青霉菌(Penicillium chrysogenum)CGMCC №1018。本發(fā)明所提供的生產(chǎn)7－氨基－3－脫乙酰氧基頭孢烷酸的方法，包括1)發(fā)酵產(chǎn)黃青霉菌(Penicilliumchrysogenum)CGMCC №1018，從發(fā)酵液中提取5’－羥基－N－己二?；?－氨基－3－脫乙酰氧基頭孢烷酸；2)將5’－羥基－N－己二?；?－氨基－3－脫乙酰氧基頭孢烷酸制備成7－ADCA。本發(fā)明的產(chǎn)黃青霉工程菌直接發(fā)酵得到5’－羥基－N－己二?；?－氨基－3－脫乙酰氧基頭孢烷酸，經(jīng)過(guò)化學(xué)法或酶法脫去其側(cè)鏈，即可制備得到7－ADCA，簡(jiǎn)化了7－ADCA的制備工藝，降低了其生產(chǎn)成本。本發(fā)明工程菌培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，表達(dá)量高，一般可得到2.2g7－ADCA/L發(fā)酵液。
文檔編號(hào)C12N15/79GK1807581SQ200510002430
公開日2006年7月26日 申請(qǐng)日期2005年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月30日
發(fā)明者徐平, 王富強(qiáng), 任志紅, 牛長(zhǎng)群, 周子振, 趙穎, 王紅怡, 代明偉, 夏紅雪, 王亞娟 申請(qǐng)人:華北制藥集團(tuán)有限責(zé)任公司