專利名稱：樹突狀細胞腫瘤疫苗及其制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物學和醫(yī)學領(lǐng)域，更具體地涉及一種腫瘤抗原mRNA(如HER2 mRNA)致敏的樹突狀細胞腫瘤疫苗及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
HER2是人類腫瘤中常見的癌基因，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是表皮生長因子受體(EGFR)家族的第二位成員。表皮生長因子受體家族，也稱為HER或ErbB2家族，在細胞信號轉(zhuǎn)導中發(fā)揮重要作用，是細胞生長、分化及存活的重要調(diào)節(jié)者。
人HER2基因定位于17號染色體短臂，表達產(chǎn)物為分子量185KDa的單鏈跨膜糖蛋白，即p185。p185含有1255個氨基酸殘基，細胞內(nèi)段具有酪氨酸激酶活性，是一種酪氨酸激酶受體。正常情況下，與配體結(jié)合后，HER2與EGFR、HER3(erbB3)或HER4(erbB4)形成異二聚體，導致這些受體的磷酸化，啟動一個信號鏈導致下游信號分子的活化，調(diào)控細胞的生長。HER2的過度表達能引起HER2同二聚體的激活而無需配體的結(jié)合，從而引起不受控制的細胞生長和癌基因的轉(zhuǎn)化。
通常情況下，HER2只在胎兒時期表達，到成年以后，用免疫組化染色只能在極少組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)其低水平表達于細胞表面。
在人類癌癥，多種腫瘤組織均存在HER2過度表達，如乳腺癌(25％-30％)、卵巢癌(25％-32％)、肺腺癌(30％-35％)、原發(fā)性腎細胞癌(30％-40％)等。大多數(shù)病例中HER2過度表達是基因擴增引起的。HER2基因的擴增導致HER2基因轉(zhuǎn)錄增加，受體的合成增加，在細胞表面的表達增加。HER2蛋白水平在HER2陽性細胞表面比相鄰的正常乳腺上皮高幾個數(shù)量級。
已知HER2陽性狀態(tài)與乳腺癌的預后較差有關(guān)，這種關(guān)系提示HER2陽性可能在癌的發(fā)生方面起關(guān)鍵作用。日益增多的證據(jù)支持HER2可作為乳腺癌化療和激素治療的重要的反應預示指標。HER2過度表達在乳腺癌細胞表面的發(fā)生率和已明確的預后價值，意味著HER2是重要的治療靶點。
HER2蛋白低量表達于某些正常細胞，為一種自身蛋白。自身反應性T細胞識別并對自身顯性表位耐受，而對次顯性表位未產(chǎn)生耐受。自身蛋白通常不能誘導出免疫反應。以截斷的不含顯性表位HER2蛋白或HER2次顯性表位肽免疫能產(chǎn)生對次顯性表位的免疫反應。
近年來以HER2為靶點的抗腫瘤治療在HER2抗體、肽疫苗、DNA疫苗等方面取得很大進展。
HER2抗體美國FDA已批準人源化的抗HER2單克隆抗體-trastuzumab(Herceptin)用于治療晚期乳腺癌。臨床研究顯示它能有效抑制體內(nèi)HER2高表達乳腺癌細胞的增殖，顯著延長HER2陽性乳腺癌病人的生存期。但用HER2抗體進行治療的費用昂貴，且Herceptin治療具有一定的心臟毒性。
HER2肽疫苗Ikuta等人合成一種與H-2Kd連接、鼠HER2來源肽HER2P780。HER2P780免疫后能誘導鼠HER2特異性CTL產(chǎn)生。用HER2過度表達腫瘤細胞建立BABL/C荷瘤小鼠后，再以HER2P780致敏的DC接種，可有效抑制腫瘤生長。但HER2的肽類疫苗往往免疫原性較弱、局限于某些表位并受病人個體的單倍型限制，對腫瘤的治療或預防意義有限。
HER2DNA疫苗DNA疫苗亦稱基因疫苗或核酸疫苗，是指構(gòu)建攜帶目的基因的重組真核表達質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒做為疫苗通過各種方式導入動物體內(nèi)，直接免疫機體，轉(zhuǎn)染宿主細胞，使載體上的基因在體內(nèi)持續(xù)表達出天然抗原物質(zhì)，這些目的蛋白經(jīng)正確的糖基化修飾等加工處理后，與主要組織相容性復合物(MHC)分子形成復合物并被提呈到細胞表面，誘導機體產(chǎn)生特異性細胞免疫和體液免疫，尤其是能誘導產(chǎn)生具細胞毒殺傷性功能的T淋巴細胞(CTL)。HER2是一種原癌基因，以其全長基因進行免疫可能引起細胞轉(zhuǎn)化。HER2胞外區(qū)基因片段包含多個已被證明的CTL表位，利用胞外區(qū)基因片段進行免疫，提高了其安全性，并期望暴露一些次要抗原表位，達到打破機體免疫耐受的狀態(tài)。Pilon等以HER2的胞外區(qū)免疫小鼠，可以有效地在小鼠體內(nèi)誘發(fā)特異性CTL應答，而且對HER2陽性腫瘤細胞在體內(nèi)生長有明顯的抑制作用。但DNA疫苗普遍存在抗原基因表達量低，所誘導的免疫應答不足的缺點。
樹突狀細胞腫瘤疫苗是新一代的腫瘤疫苗，這種新型疫苗的的特點是采用機體內(nèi)功能最強的抗原遞呈細胞樹突狀細胞作為瘤苗載體(或稱佐劑)，以腫瘤抗原體外沖擊使其致敏，不僅可以保證腫瘤抗原被有效地攝取，而且可以提供所需的共刺激信號，顯示了優(yōu)于“常規(guī)”疫苗的前景。
樹突狀細胞(dendritic cell，簡稱為“DC”)是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強大的抗原遞呈細胞(APC)，DC系統(tǒng)作為機體內(nèi)免疫反應的始動者和調(diào)解者，具有強大的激活CD8+CTL和CD4+T輔助細胞的能力，控制著體內(nèi)免疫應答反應的過程，因而成為抗腫瘤免疫反應的中心環(huán)節(jié)。近年來隨著體外大量擴增DC和制備DC疫苗技術(shù)的日趨成熟，采用DC疫苗進行抗腫瘤治療已成為當今腫瘤生物治療領(lǐng)域備受關(guān)注的焦點之一。
動物實驗表明，用腫瘤抗原肽、蛋白、腫瘤細胞DNA或RNA等體外沖擊致敏DC并回輸體內(nèi)可誘導機體產(chǎn)生較強的抗腫瘤免疫應答，甚至可治療已建立的低免疫原性腫瘤。國外，DC作為新的腫瘤治療手段已進入I/II期臨床試驗階段。在I/II期臨床試驗階段中，DC疫苗能激發(fā)特異性抗腫瘤免疫應答，未觀察到明顯的不良反應。
美國西雅圖西北醫(yī)院以Murphy為首的小組選擇前列腺特異性抗原(PSMA)的HLA-A0201特異性抗原多肽(PSM-P)體外沖擊致敏外周血來源自體DC，回輸治療了51例對激素療法無效的前列腺癌病人，他們將病人分為5組(每例回輸4～5次)，其中第1，2組病人分別單獨回輸抗原多肽PSM-P1或PSM-P2，第3組病人回輸自體DC，第4、5組分別回輸PSM-P1或PSM-P2體外沖擊致敏的自體DC，結(jié)果表明，所有病人均未出現(xiàn)毒副作用，在第4、5組HLA-A2+病人中均觀察到針對PSM-P2的細胞免疫反應增強，第5組病人PSA水平下降，7例病人病情緩解，進一步觀察表明，該治療作用能持續(xù)較長時間。表明該療法具有一定的臨床應用的可行性，并發(fā)表了II期臨床試驗報告。
美國學者Fong還觀察了抗原致敏的DC瘤苗不同途徑免疫包括靜脈、皮下、淋巴結(jié)周圍注射時對抗腫瘤免疫功能的誘導作用，對32例經(jīng)治療病人的分析表明，三種注射方式均產(chǎn)生了特異性細胞免疫反應，皮下、淋巴結(jié)周圍注射時還能誘導機體產(chǎn)生IFN-γ，而靜脈注射也檢測到體液免疫反應。
Nestle等應用黑色素瘤抗原肽或腫瘤裂解物致敏的DC治療了16例黑色素瘤病人并觀察了其治療反應，結(jié)果在5例病人取得了一定治療效果，多處轉(zhuǎn)移灶消退，在所有病人中均未檢測到自身免疫反應的發(fā)生，11例病人中檢測到針對多肽的遲發(fā)型變態(tài)反應。Rieser等將此療法用于治療腎癌，也取得一定療效。
目前DC疫苗在乳腺癌中的治療研究主要包括以下4種類型1.DC與乳腺癌細胞融合DC與腫瘤細胞融合，一方面可表達DC自身相關(guān)的表面免疫分子病分泌相應的細胞因子，另一方面又可同時獲得腫瘤細胞的腫瘤抗原信息，在體內(nèi)外誘導出特異性CTL應答。Gong等將乳腺癌患者的乳腺癌細胞與自身的DC進行融合，融合后的細胞既能表達腫瘤相關(guān)抗原，也能表達DC來源的免疫分子和共刺激分子，誘導出抗自身腫瘤細胞的特異性CTL免疫應答。采用腫瘤細胞與DC的融合細胞作為瘤苗的缺點是其制備周期更長，融合率低，體外操作復雜，具有許多的不確定性，難以臨床大規(guī)模應用。
2.腫瘤抗原多肽刺激DCDC及腫瘤細胞抗原多肽的聯(lián)合應用可提高腫瘤細胞的免疫原性，更有效的激發(fā)抗腫瘤免疫應答。目前研究大多集中在HER2與MUC-1兩種腫瘤相關(guān)抗原，并已應用于臨床試驗。應用抗原多肽刺激DC是目前DC瘤苗較常采用的方法，具有很好的靶向性，可以刺激機體產(chǎn)生腫瘤特異性的免疫應答，避免不必要的免疫刺激。但是該方法的缺點是大部分腫瘤的特異性抗原尚未明確且腫瘤發(fā)生的抗原突變能抵抗單一抗原的免疫攻擊，不利于其在其它腫瘤治療上的應用。
3.腫瘤抗原基因轉(zhuǎn)染DC將腫瘤抗原的編碼基因轉(zhuǎn)染DC，能在DC內(nèi)持續(xù)表達腫瘤抗原，既克服了肽與DC負載后MHC-抗原多肽復合物的解離問題，又能使表達的抗原有效地與MHC分子結(jié)合并遞呈給CTL。但缺點是由于需要采用載體介導基因轉(zhuǎn)染，制備過程較為復雜，而且由于DC是分化終末期細胞，其轉(zhuǎn)染效率較低而且備選的載體也有限，不適合其大規(guī)模使用。此外，直接使用組成型表達腫瘤抗原的DC有潛在的致癌危險。
4.細胞性腫瘤抗原體外致敏DCFields等在小鼠動物模型上，用乳腺癌細胞碎片體外沖擊致敏骨髓細胞來源的DC，在體內(nèi)外試驗中，均誘導出特異性抗腫瘤免疫應答。直接利用超聲波破碎或反復凍融等方法制備的腫瘤細胞性抗原雖更具實用價值，但缺點是在臨床上難以提供所需的大量瘤體組織。
最近的研究顯示，用腫瘤RNA致敏的DC疫苗，能提供更多更有效的可供識別的抗原表位，并可克服HLA限制，從而能持續(xù)刺激CTL的激活增殖，是一種最具發(fā)展前景的DC疫苗制備方法。
與其它種類的DC疫苗相比，腫瘤RNA致敏的DC疫苗有以下優(yōu)點(1)無需明確腫瘤特異性抗原，應用范圍廣；(2)對于來源有限的腫瘤組織，通過核酸擴增出腫瘤RNA或相應的cDNA文庫，不僅可降低腫瘤組織的需求量，還可以提高或純化腫瘤相關(guān)抗原在DC表面的濃度，提高抗腫瘤免疫應答的強度；(3)mRNA可編碼多種抗原表位，遞呈給不同的HLA表位，可擴展免疫的范圍到每個腫瘤患者，而不依賴于他們的基因背景；(4)從臨床應用角度，以mRNA編碼的形式遞送特異性的腫瘤相關(guān)抗原更具吸引力，因為與蛋白質(zhì)相比mRNA更易獲得及純化；(5)應用轉(zhuǎn)染電穿孔等技術(shù)可顯著提高RNA的轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染DC的能力可與重組病毒相當，如牛痘病毒或腺病毒，但又避免了病毒載體的缺陷；(6)用差異篩選法或減數(shù)雜交等方法篩選出腫瘤特異性mRNA，用于沖擊DC或直接導入DC用來治療腫瘤，既可產(chǎn)生顯著的抗腫瘤免疫反應，又可避免誘發(fā)自身免疫性疾??；(7)由于在哺乳動物細胞中即使穩(wěn)定的mRNA的半衰期也小于24小時，因此幾乎不存在整合到宿主基因組的危險性。
美國杜克大學Eli Gilboa實驗室率先將編碼腫瘤抗原的RNA轉(zhuǎn)染DC，體外誘發(fā)出腫瘤特異性CTL免疫反應。Boczkowski等人發(fā)現(xiàn)用編碼卵清白蛋白(ovalbumin，OVA)的RNA轉(zhuǎn)染DC細胞后，再用此種RNA致敏的DC免疫，可在體內(nèi)、外誘導出強烈的OVA特異性CTL應答，其反應強度要高于單純用OVA肽致敏的DC所引起的CTL反應，并可保護小鼠抵御表達OVA的腫瘤細胞的攻擊；用來源于惡性黑色素瘤B16/F9.10細胞的總RNA或mRNA致敏的DC免疫小鼠，可顯著減少腫瘤的肺轉(zhuǎn)移。
Schmitt等嘗試使用膀胱癌患者腫瘤細胞來源的mRNA轉(zhuǎn)染患者自體DC，體外檢測其誘導自體T細胞殺傷腫瘤細胞的能力。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后的DC能有效激活可識別自體腫瘤細胞的T細胞，當效靶比為50∶1時，其細胞毒性約為26％，這一結(jié)果為人類臨床試驗研究提供了有利的依據(jù)。
前列腺癌已發(fā)現(xiàn)具有特異的抗原成分PSA，Heisser的臨床前實驗表明PSA-mRNA轉(zhuǎn)染的DC能有效激活抗原特異性CTL，即使針對與PSA相似的同樣產(chǎn)生kallikrein抗原也不發(fā)生交叉反應，提示不會引起有害的自身免疫反應，健康志愿者或前列腺癌患者的體外試驗表明，PSA-mRNA轉(zhuǎn)染的DC同樣可誘導PSA特異的CTL。Heiser在此基礎(chǔ)上對13例前列腺癌患者進行I期臨床試驗，逐漸增加PSA-mRNA轉(zhuǎn)染的DC用量，未產(chǎn)生劑量依賴的毒性和自身免疫的副反應，所有患者均能持續(xù)測到PSA特異性的T細胞反應，在7例中有6例的PSA水平明顯下降，證明該治療是安全和有效的。
端粒酶活性增強是多種腫瘤的共性表現(xiàn)，用端粒酶多肽復合物(TERT)RNA轉(zhuǎn)染DC，體外觀察發(fā)現(xiàn)有明顯的腎及前列腺癌細胞溶解現(xiàn)象，故轉(zhuǎn)染TERT的DC對腎癌、前列腺癌、EB病毒轉(zhuǎn)染的B淋巴細胞產(chǎn)生同樣的特異性CTL。
用于致敏DC的RNA可以是通過體外轉(zhuǎn)錄得到的編碼確定抗原的RNA或來源于腫瘤細胞的總RNA。用腫瘤細胞總RNA致敏的DC比單個腫瘤抗原RNA致敏的DC在裂解腫瘤靶細胞時更有效。到底選擇何種RNA很大程度上依賴于所要開發(fā)的DC疫苗的類型、是否有明確的腫瘤抗原及可能得到的腫瘤的量。當無明確的腫瘤抗原，或希望誘導抗廣譜腫瘤抗原的免疫反應時，可選用總的細胞RNA致敏DC，這種方法需要有足夠的外科切除或活檢腫瘤組織。當有明確的腫瘤抗原時，可通過體外轉(zhuǎn)錄得到大量的腫瘤抗原RNA致敏DC，而無需外科切除的瘤體組織。
另外，也可以RT-PCR擴增出來的cDNA庫為模板，通過體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生大量的腫瘤抗原RNA，當腫瘤組織有限和/或很難得到時，這方法特別有用。
Boczkowski和Heiser用從冰凍組織切片或針吸活檢的腫瘤組織擴增出來的RNA致敏DC在體外可有效激發(fā)腫瘤特異性的CTL反應。事實上，體外轉(zhuǎn)錄得到的腫瘤抗原RNA量是無限制的，因此，可有充足的抗原用于臨床試驗。最近應用體外轉(zhuǎn)錄的前列腺特異抗原(PSA)進行的I期臨床實驗證實了體外轉(zhuǎn)錄RNA轉(zhuǎn)染的DC疫苗的可行性及安全性。
綜上所述，目前用腫瘤RNA致敏的DC疫苗最有發(fā)展前景。然而，在用腫瘤RNA致敏DC時的轉(zhuǎn)染效率都較低(通常低于50％)，因此限制了腫瘤RNA致敏的DC疫苗的臨床使用。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)高效地用腫瘤RNA轉(zhuǎn)染樹突狀細胞的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種高效地用腫瘤RNA轉(zhuǎn)染樹突狀細胞的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供用所述方法制備的DC腫瘤疫苗及其在治療和預防腫瘤(如乳腺癌等)方面用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種腫瘤抗原mRNA致敏的樹突狀細胞的方法，它包括以下步驟(a)將樹突狀細胞與腫瘤抗原mRNA以1×106細胞～1×107細胞10～50微克HER2 mRNA混合，形成混合物；(b)將所述混合物在0±4℃放置15±10分鐘；(c)將所述混合物在以下條件下進行電穿孔505±50V、99±10μs、2±1個電脈沖、電脈沖間間隔10±2s；(d)將電穿孔后的的混合物在0±4℃放置15±10分鐘；(e)將混合物在適合樹突狀細胞生長的條件下培養(yǎng)10-30小時，(f)加入成熟誘導劑使樹突狀細胞成熟；(g)收集成熟的樹突狀細胞。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)中，樹突狀細胞與HER2 mRNA的以2×106細胞～8×106細胞15～40微克HER2 mRNA混合。更佳地，混合比例為3×106細胞～7×106細胞20～40微克HER2 mRNA。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)中，所述的腫瘤抗原mRNA是HER2 mRNA。較佳地，所述的HER2 mRNA是HER2陽性腫瘤細胞的總mRNA，或轉(zhuǎn)入外源HER2編碼序列的宿主細胞的mRNA。更佳地，所述的HER2陽性腫瘤細胞是源自乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、或原發(fā)性腎細胞癌的細胞系；而所述的宿主細胞是人乳腺癌細胞系MCF-7或小鼠結(jié)腸癌細胞系CT26。
在另一優(yōu)選例中，HER2 mRNA編碼全長HER2或其胞外區(qū)片段。
在另一優(yōu)選例中，步驟(c)的條件是505±25 V、99±5μs、2±1個電脈沖、電脈沖間間隔10±1s；
步驟(e)的所述條件是在37±2℃，5±2％CO2孵箱中培養(yǎng)；步驟(f)的條件是加入TNF-α刺激24±8小時。
在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括步驟(h)對步驟(g)收集成熟的樹突狀細胞進行滅活(如用約30Gy的放射線照射)。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種腫瘤抗原mRNA致敏的樹突狀細胞的細胞群，所述細胞群中60％-99％樹突狀細胞的胞內(nèi)含有導入的外源腫瘤抗原mRNA。
在另一優(yōu)選例中，所述細胞群中80％-99％(更佳地85-99％，最佳地90-99％)樹突狀細胞的胞內(nèi)含有導入的外源腫瘤抗原mRNA，且所述的腫瘤抗原mRNA是HER2 mRNA。
在另一優(yōu)選例中，所述的樹突狀細胞是人的樹突狀細胞。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種藥物組合物，它含有有效量的本發(fā)明上述的腫瘤抗原mRNA致敏的樹突狀細胞的細胞群，以及藥學上可接受的載體、賦型劑和/或稀釋劑。
在另一優(yōu)選例中，該腫瘤抗原mRNA致敏的樹突狀細胞的細胞群是滅活的。
在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物是用于腫瘤的疫苗。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種本發(fā)明的腫瘤抗原mRNA致敏的樹突狀細胞的細胞群的用途，它們被用于制備預防和/治療腫瘤的藥物。


圖1顯示了HER2 mRNA致敏樹突狀細胞體外誘導正常人外周血細胞毒T淋巴細胞的殺傷活性。
圖2顯示了HER2 mRNA致敏樹突狀細胞體外誘導HER2陽性腫瘤患者外周血細胞毒T淋巴細胞的殺傷活性。
圖3顯示了HER2 mRNA致敏的樹突狀細胞疫苗免疫誘導小鼠T淋巴細胞對HER2+-CT26腫瘤細胞的殺傷活性。
圖4顯示了經(jīng)HER2 mRNA致敏的樹突狀細胞疫苗免疫后荷瘤小鼠的存活曲線。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過深入而廣泛的研究，改進了腫瘤抗原mRNA轉(zhuǎn)染樹突狀細胞的電穿孔參數(shù)，導致顯著提高了轉(zhuǎn)染效率，從而可以高效制備用腫瘤RNA轉(zhuǎn)染樹突狀細胞。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
術(shù)語如本文所用，術(shù)語“腫瘤抗原mRNA”和“腫瘤RNA”可互換使用，指含有編碼腫瘤抗原的核酸序列的mRNA。它可以是(a)一種僅編碼和翻譯某一腫瘤抗原的mRNA，也可以是(b)編碼和翻譯多種腫瘤抗原的mRNA的混合物，還可以是(c)由(a)、(b)與其他不編碼腫瘤抗原的mRNA構(gòu)成的混合物。
如本文所用，術(shù)語“HER2 mRNA”指含有編碼HER2核酸序列(全長HER2或其胞外區(qū)片段)的mRNA，它可以是純凈物，也可以是混合物。代表性的例子包括(但并不限于)HER2陽性腫瘤細胞的總mRNA，或轉(zhuǎn)入外源HER2編碼序列的宿主細胞的mRNA。所述的HER2陽性腫瘤細胞是源自乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、或原發(fā)性腎細胞癌的細胞系；而所述的宿主細胞是各種常用的真核宿主細胞，尤其是哺乳動物細胞，如人乳腺癌細胞系MCF-7或小鼠結(jié)腸癌細胞系CT26。
如本文所用，術(shù)語“本發(fā)明的樹突狀細胞”指用腫瘤抗原mRNA致敏的從而在胞內(nèi)含有導入的外源腫瘤抗原mRNA的樹突狀細胞。
腫瘤抗原mRNA致敏的樹突狀細胞及其制法適用于本發(fā)明的腫瘤抗原mRNA和樹突狀細胞可用本發(fā)明常規(guī)的方法制備。
在制備腫瘤抗原mRNA致敏的樹突狀細胞時，可采用本發(fā)明的電穿孔方法，它包括步驟(a)將樹突狀細胞與腫瘤抗原mRNA以1×106細胞～1×107細胞10～50微克HER2 mRNA混合，形成混合物；(b)將所述混合物在0±4℃放置15±10分鐘；(c)將所述混合物在以下條件下進行電穿孔505±50V、99±10μs、2±1個電脈沖、電脈沖間間隔10±2s；
(d)將電穿孔后的的混合物在0±4℃放置15±10分鐘；(e)將混合物在適合樹突狀細胞生長的條件下培養(yǎng)10-30小時，(f)加入成熟誘導劑使樹突狀細胞成熟；(g)收集成熟的樹突狀細胞。
其中，最關(guān)鍵的是步驟(c)的電穿孔條件，當電穿孔超出505±50V、99±10μs、2±1個電脈沖、電脈沖間間隔10±2s時，轉(zhuǎn)染效率會顯著下降。
其次，步驟(a)中樹突狀細胞與腫瘤抗原mRNA的混合比例，當混合比例超出1×106細胞～1×107細胞10～50微克HER2 mRNA時，轉(zhuǎn)染效率會下降。
至于步驟(e)、(f)、(g)等步驟，可采用本領(lǐng)域采用的條件。
藥物組合物用本發(fā)明方法制備的DC疫苗可以廣泛應用于預防和治療各種HER2陽性腫瘤，代表性的例子包括(但并不限于)乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、原發(fā)性腎細胞癌。
因此本發(fā)明還提供了一種用于預防和治療各種HER2陽性腫瘤藥物組合物，它含有安全有效量(如104-108個樹突狀細胞)的本發(fā)明上述的腫瘤抗原mRNA致敏的樹突狀細胞的細胞群，以及藥學上可接受的載體、賦型劑和/或稀釋劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約104-108個樹突狀細胞，更佳地為105-107個樹突狀細胞。
配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
在治療和預防腫瘤時，本發(fā)明的樹突狀細胞可以單用，還可同時和其他治療劑(如TNF-α、TNF-β等)聯(lián)用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的腫瘤抗原mRNA致敏的樹突狀細胞施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常每天約104-108個樹突狀細胞，更佳地為105-107個樹突狀細胞。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(a)本發(fā)明的制法效率高、制備簡便；(b)本發(fā)明的HER2 mRNA致敏的DC疫苗的抗腫瘤譜廣，特異性強。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1高表達HER2腫瘤細胞株的建立及篩選本發(fā)明采用以下引物上游引物5’CGCTCGAGCACCATGGAGCTGGCGGC 3’(SEQ ID NO1)下游引物5’CGAAGCTTGAGCAGAGAGCCAGCCC 3’(SEQ ID NO2)應用標準的RT-PC方法從人乳腺癌細胞株SK-BR-3(可購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC HTB-30)中克隆人HER2原癌基因胞外區(qū)片段，經(jīng)測序正確，插入pCDNA3.1(Invitrogen)，構(gòu)建成HER2真核表達載體pCDNA3.1-HER2。采用常規(guī)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，將表達載體pCDNA3.1-HER2分別導入人乳腺癌細胞系MCF-7(可購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC HTB-22)及小鼠結(jié)腸癌細胞系CT26(可購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC CRL-26)，經(jīng)G418選擇培養(yǎng)，檢測陽性克隆HER2基因表達，分別選出高表達HER2的乳腺癌細胞系MCF-7和小鼠結(jié)腸癌細胞系CT26。
實施例2HER2 mRNA的制備及純化
(a)HER2 mRNA的制備對于實施例1獲得的高表達HER2的腫瘤細胞克隆(即高表達HER2的乳腺癌細胞系MCF-7或小鼠結(jié)腸癌細胞系CT26)，進行大量擴增，然后收集細胞。用PBS洗兩遍，棄上清，置冰浴。加異硫氰酸胍變性液(20ml/1×108細胞)，迅速混勻、使細胞快速、徹底地裂解。加入2ml 2mol乙酸鈉(PH 4.0)，混勻后移至50ml離心管中。加22ml酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，顛倒混合用力振蕩，冰上放置10min。小心吸取上層含有RNA的水相，轉(zhuǎn)移至一新的50ml離心管中，加等體積的異戊醇，-20℃沉淀1小時。4℃離心，12000rpm×15min。棄上清，加70％乙醇洗一遍，4℃離心，12000rpm×15min。棄上清，真空干燥，溶于無RNase水中，-70℃凍存。
(b)HER2 mRNA的純化用10ml 4mol NaOH清洗硅烷化的柱子，將Oligo(dT)纖維素干粉加入1ml0.1mol NaOH中注入柱內(nèi)，用10ml無RNase水淋洗。10-20倍柱體積的上樣緩沖液平衡Oligo(dT)，至PH值為7.5。70℃水浴加熱RNA樣品5分鐘，迅速冷卻至室溫，加入適量的LiCl使其終濃度為0.5M。將RNA樣品加入Oligo(dT)柱內(nèi)，用1ml上樣緩沖液洗柱，洗出液再過柱一次。用2ml洗脫緩沖液洗柱，洗脫出的mRNA液中加入7/10體積的乙酸氨，10倍體積預冷的無水乙醇，室溫30分鐘沉淀mRNA，4℃離心，12000rpm×15min。棄上清，加70％乙醇洗一遍，4℃離心，12000rpm×15min。棄上清，真空干燥，獲得純化的HER2 mRNA。將其溶于無RNase水中，-70℃凍存。如需長期保存，則溶于70％的乙醇中。
實施例3HER2 mRNA致敏樹突狀細胞收集培養(yǎng)至第6天的人或小鼠體外培養(yǎng)的樹突狀細胞，用無血清RPMI 1640洗兩遍，并用無血清RPMI 1640調(diào)節(jié)細胞濃度至1×107/ml。取0.4ml細胞懸液加入0.2-cm的電擊杯中，同時加入30μg HER2 mRNA，充分混勻。將電擊杯冰浴10min后，擦干，放入BTX公司ECM 830型電穿孔儀的電擊槽中進行電穿孔，電穿孔參數(shù)為505V、99μs、2個電脈沖、電脈沖間間隔10s。電穿孔后，輕輕取出電擊杯，冰浴10min。小心取出細胞懸液加入新鮮的DC完全培養(yǎng)基，37℃5％CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)20h，加入TNF-α刺激24小時，促進DC成熟，收集細胞，30 Gy放射線照射后備用。同時用EGFP mRNA轉(zhuǎn)染樹突狀細胞經(jīng)流式細胞儀檢測，以監(jiān)測該方法的轉(zhuǎn)染效率。
轉(zhuǎn)染結(jié)果如表1所示，平均轉(zhuǎn)染效率高達97.4％。
表1 mRNA以電穿孔方法轉(zhuǎn)染DC的效率

此外，重復上述操作，當電穿孔條件在505±50V、99±10μs、2±1個電脈沖、電脈沖間間隔10±2s時，轉(zhuǎn)染效率維持在為80-95％或更高。電穿孔條件超出505±50V、99±10μs、2±1個電脈沖、電脈沖間間隔10±2s時，智人效率明顯下降。
實施例4HER2 mRNA致敏樹突狀細胞的體內(nèi)、體外抗腫瘤作用在本實施例中，測定實施例3制備的HER2 mRNA致敏樹突狀細胞的體內(nèi)、體外抗腫瘤作用。
(a)人HER2 mRNA致敏樹突狀細胞體外誘導HER2特異性的細胞毒T淋巴細胞反應分離正常人和HER2陽性腫瘤患者外周血單個核細胞，置37℃培養(yǎng)2小時后，帖壁細胞用于培養(yǎng)樹突狀細胞，非貼壁細胞用5％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基懸浮，過尼龍毛柱(37℃孵育1小時)。純化的T淋巴細胞(2×106)與HER2mRNA致敏樹突狀細胞(2×105)共培養(yǎng)與24孔板中，同時加入重組人IL-7(10ng/ml；Peprotech Inc)，24h后加入重組人IL-10(10ng/ml；Peprotech Inc)。培養(yǎng)的T細胞每周用HER2mRNA致敏的經(jīng)照射的自體樹突狀細胞刺激一次，共刺激三次。每次刺激后的24及48小時分別加入重組人IL-10(10ng/ml)、重組人IL-2(20IU/ml)。最后一次刺激后7天，收集體外誘導的細胞毒T淋巴細胞，用標準的4小時51Cr釋放試驗檢測其特異性殺傷活性。用高表達HER2 MCF-7細胞(實施例1制備)及不表達HER2的HeLa細胞(購自ATCC)分別作為靶細胞，加入51Cr(100μCi/106cells)，置37℃水浴中標記90分鐘，每間隔15分鐘輕混勻一次，洗3遍，徹底洗去殘余Na251CrO4，標記好的靶細胞用完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為1×105/ml，加入96孔圓底板，每孔100μl。按50∶1、25∶1、12.5∶1三個不同效靶比加入相應的CTL，37℃孵育4小時，收集各孔上清各100μl，用γ計數(shù)儀檢測cpm值。最大釋放組各孔為單獨的靶細胞加100μl 1％SDS；自發(fā)釋放孔為單獨的靶細胞加100μl完全培養(yǎng)基。按下式計算殺傷率殺傷率(％)＝(實驗組cpm-自發(fā)釋放組cpm)/(最大釋放組cpm-自發(fā)釋放組cpm)結(jié)果表明，HER2 mRNA致敏樹突狀細胞在體外可特異性地誘導正常人(圖1)和HER2陽性腫瘤患者(圖2)外周血細胞毒T淋巴細胞的殺傷HER2陽性腫瘤細胞的活性。
(b)小鼠HER2 mRNA致敏樹突狀細胞的免疫及體內(nèi)抗腫瘤作用的觀察分離培養(yǎng)BABL/c小鼠樹突狀細胞，選用高表達HER2的小鼠腫瘤細胞系總mRNA致敏樹突狀細胞，制備樹突狀細胞疫苗。將30只BABL/c小鼠隨機分為4組，即HER2 mRNA致敏DCs、DCs和PBS對照組。免疫方法為小鼠腹腔注射DCs疫苗，疫苗細胞數(shù)為1×106/只免疫三次，間隔一周。末次免疫后10天，從各組隨機取三只小鼠，無菌操作摘取小鼠脾臟，溶解紅細胞，制成單細胞懸液。將脾細胞懸液(5×106/ml)與mRNA致敏的經(jīng)輻射的自體樹突狀細胞(按實施例3所述方法制備)以20∶1比例置于RPMI 1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。間隔一周再刺激一次，同時加入20IU/ml IL-2。最后一次刺激后7天，收集效應細胞，同上用51Cr釋放試驗檢測其特異性殺傷活性。靶細胞分別為HER2基因轉(zhuǎn)染的CT26細胞(實施例1制備)及未轉(zhuǎn)染的CT26細胞(ATCC)。
結(jié)果表明，HER2 mRNA致敏的樹突狀細胞疫苗可有效地免疫誘導小鼠T淋巴細胞對HER2+-CT26腫瘤細胞的殺傷活性(圖3)。
此外，在末次免疫后5天，在各免疫小鼠的腹部皮下接種體外培養(yǎng)擴增的活力良好的高表達HER2的CT26細胞(實施例1制備)，劑量為5×104/只。此后每隔兩天觀察腫瘤出現(xiàn)及生長情況。記錄腫瘤腫瘤的大小及小鼠存活情況。
結(jié)果表明，經(jīng)HER2 mRNA致敏的樹突狀細胞疫苗免疫后荷瘤小鼠的存活明顯高于對照(圖4)。
實施例5用腫瘤細胞的總mRNA致敏的DC疫苗具有體內(nèi)和體外抗腫瘤活性(a)制備DC疫苗在本實施例中，重復實施例2和3，從而制得腫瘤細胞的總mRNA致敏的DC疫苗，不同點僅在于用人乳腺癌細胞株SK-BR-3(可購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC HTB-30)替換實施例1制備的高表達HER2的乳腺癌細胞系MCF-7和小鼠結(jié)腸癌細胞系CT26作為制備HER2 mRNA的原料。由于人乳腺癌細胞株SK-BR-3表達HER2，因此用人乳腺癌細胞株SK-BR-3為原料制備的總mRNA仍然含有編碼HER2的mRNA。
平均轉(zhuǎn)染效率高達96.7％。
(b)抗腫瘤活性測定用實施例4相同的方法測試該用腫瘤細胞的總mRNA致敏的DC疫苗具有體內(nèi)和體外抗腫瘤活性。
結(jié)果表明，該DC疫苗也能引發(fā)小鼠T淋巴細胞針對HER2陽性細胞(高表達HER2的CT26細胞和高表達HER2 MCF-7細胞)的殺傷活性(稍低于實施例3的DC疫苗)。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種腫瘤抗原mRNA致敏的樹突狀細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟(a)將樹突狀細胞與腫瘤抗原mRNA以1×106細胞～1×107細胞10～50微克HER2 mRNA混合，形成混合物；(b)將所述混合物在0±4℃放置15±10分鐘；(c)將所述混合物在以下條件下進行電穿孔505±50V、99±10μs、2±1個電脈沖、電脈沖間間隔10±2s；(d)將電穿孔后的的混合物在0±4℃放置15±10分鐘；(e)將混合物在適合樹突狀細胞生長的條件下培養(yǎng)10-30小時，(f)加入成熟誘導劑使樹突狀細胞成熟；(g)收集成熟的樹突狀細胞。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(a)中，樹突狀細胞與HER2mRNA的以2×106細胞～8×106細胞15～40微克HER2 mRNA混合。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(a)中，所述的腫瘤抗原mRNA是HER2 mRNA。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的HER2 mRNA是HER2陽性腫瘤細胞的總mRNA，或轉(zhuǎn)入外源HER2編碼序列的宿主細胞的mRNA。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的HER2陽性腫瘤細胞是源自乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、或原發(fā)性腎細胞癌的細胞系；而所述的宿主細胞是人乳腺癌細胞系MCF-7或小鼠結(jié)腸癌細胞系CT26。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(c)的條件是505±25V、99±5μs、2±1個電脈沖、電脈沖間間隔10±1s；步驟(e)的所述條件是在37±2℃，5±2％CO2孵箱中培養(yǎng)；步驟(f)的條件是加入TNF-α刺激24±8小時。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括步驟(h)對步驟(g)收集成熟的樹突狀細胞進行滅活。
8.一種腫瘤抗原mRNA致敏的樹突狀細胞的細胞群，其特征在于，所述細胞群中60％-99％樹突狀細胞的胞內(nèi)含有導入的外源腫瘤抗原mRNA。
9.如權(quán)利要求8所述的細胞群，其特征在于，所述細胞群中80％-99％樹突狀細胞的胞內(nèi)含有導入的外源腫瘤抗原mRNA，且所述的腫瘤抗原mRNA是HER2 mRNA。
10.一種藥物組合物，其特征在于，它含有有效量的權(quán)利要求8所述的腫瘤抗原mRNA致敏的樹突狀細胞的細胞群，以及藥學上可接受的載體、賦型劑和/或稀釋劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種腫瘤抗原mRNA致敏的樹突狀細胞腫瘤疫苗及其制備方法和用途。本發(fā)明還提供了含所述樹突狀細胞的藥物組合物。本發(fā)明的腫瘤疫苗為一種采用特異性mRNA修飾的樹突狀細胞疫苗，可以明顯刺激機體產(chǎn)生針對諸如HER2陽性腫瘤的特異性免疫應答，因而可用于HER2陽性腫瘤如乳腺癌等腫瘤的預防及治療。本發(fā)明制法的轉(zhuǎn)染效率高且簡便，制得的疫苗抗腫瘤譜廣，特異性強。
文檔編號C12N5/10GK1607247SQ200310107908
公開日2005年4月20日 申請日期2003年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月15日
發(fā)明者王建莉, 王寶梅, 夏大靜 申請人:上海海欣生物技術(shù)有限公司