一種自體樹突狀細(xì)胞激活腫瘤浸潤(rùn)性t淋巴細(xì)胞的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種自體樹突狀細(xì)胞激活腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞制備方法，其中包括如下特征：來(lái)自于癌癥患者自身的腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞，在使用自體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞作為滋養(yǎng)層細(xì)胞和白介素2作用下激活大量擴(kuò)增，具有高活性的抗腫瘤細(xì)胞毒性應(yīng)答；本發(fā)明還提供了一種含通過(guò)上述方法而得到的自體腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞的試劑盒，具有高效的抗腫瘤功能。
【專利說(shuō)明】一種自體樹突狀細(xì)胞激活腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞的制備方 法及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種自體樹突狀細(xì)胞激活腫瘤浸潤(rùn)性Τ淋巴細(xì)胞的制備方法，其中包 括如下特征：來(lái)自于癌癥患者手術(shù)后新鮮自體腫瘤組織分離得到的浸潤(rùn)性Τ淋巴細(xì)胞，在 自體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞作為滋養(yǎng)層細(xì)胞和白介素2作用下激活大量擴(kuò)增，具有高 活性抗腫瘤細(xì)胞毒性應(yīng)答；本發(fā)明還提供了一種含通過(guò)上述方法而得到的自體腫瘤浸潤(rùn)性 Τ淋巴細(xì)胞的試劑盒，可用于各類癌癥包括實(shí)體瘤和血液腫瘤在內(nèi)的免疫治療。

【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤浸潤(rùn)性Τ淋巴細(xì)胞（Tumor-infiltrating lymphocytes, TIL)在體外加白介素 2 (interleukin-2, IL-2)培養(yǎng)擴(kuò)增后，其抗腫瘤作用比LAK細(xì)胞強(qiáng)50-100倍，而且只需要 小量的IL-2就可以發(fā)揮作用，并且因其對(duì)自身腫瘤靶細(xì)胞具有特異性，成為國(guó)內(nèi)外腫瘤生 物研究的熱點(diǎn)，并在臨床治療中得到使用。
[0003] TIL細(xì)胞主要含有⑶8+、⑶4+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞等，治療對(duì)黑素瘤、肺癌、腎癌、 結(jié)腸癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌和白血病等腫瘤治療有明顯療效。TIL細(xì)胞數(shù)量和殺傷功能與 療效直接相關(guān)，治療中存在的問(wèn)題在于獲得大量TIL細(xì)胞有限和培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。TIL細(xì)胞 體外擴(kuò)增至5 X 108平均需59天，擴(kuò)增至5 X 109則平均需80天，TIL在含IL-2的培養(yǎng)基中 經(jīng)過(guò)一段時(shí)間培養(yǎng)后出現(xiàn)選擇性擴(kuò)增T淋巴細(xì)胞，⑶3+占80%以上，⑶4+和⑶8+占50%以 上，NK細(xì)胞擴(kuò)增低下，占不到10%左右。因而傳統(tǒng)使用的小劑量白介素2激活生長(zhǎng)倍數(shù)有 限，培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)引起了 TIL細(xì)胞殺傷功能低下。
[0004] 本發(fā)明提供了以自體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞作為滋養(yǎng)層細(xì)胞，在小劑量IL-2 作用下大量擴(kuò)增TIL細(xì)胞，培養(yǎng)至20天細(xì)胞增殖到5X10 8以上，增殖倍數(shù)達(dá)到1000倍以 上，TIL細(xì)胞殺瘤活性在20天達(dá)到最佳，為患者臨床治療大大節(jié)約了時(shí)間，并發(fā)揮出最好的 抗腫瘤作用，有助于提高臨床療效和延長(zhǎng)患者生存期，而且可以大大降低細(xì)胞培養(yǎng)成本。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)增殖培養(yǎng)TIL細(xì)胞的不足，特別是因 TIL細(xì)胞擴(kuò)增到臨床治 療需要的細(xì)胞數(shù)量而培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，含IL-2的培養(yǎng)基選擇性擴(kuò)增T淋巴細(xì)胞占有比例很 低，因而產(chǎn)生的殺瘤活性低下。本發(fā)明通過(guò)前期研究實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)自體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀 細(xì)胞作為滋養(yǎng)層細(xì)胞，作為滋養(yǎng)層細(xì)胞和低劑量IL-2作用下培養(yǎng)TIL細(xì)胞，培養(yǎng)至20天細(xì) 胞增殖倍數(shù)達(dá)到1000倍以上，TIL細(xì)胞數(shù)達(dá)到5X10 8以上足以滿足臨床抗腫瘤的作用，保 證癌癥患者臨床治療療效。
[0006] 自體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞膜上高表達(dá)的⑶80、⑶83、⑶86和⑶137L多肽， 及其加工的腫瘤抗原表位，將可以激活T淋巴細(xì)胞大量擴(kuò)增和具有高活性的抗腫瘤細(xì)胞毒 性應(yīng)答。將該樹突狀細(xì)胞作為滋養(yǎng)層細(xì)胞，可產(chǎn)生對(duì)腫瘤細(xì)胞最佳的殺傷活性。
[0007] 本發(fā)明涉及一種自體樹突狀細(xì)胞激活腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞增殖的制備方法，其 特征在于，使用自體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞和白介素2,擴(kuò)增激活腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì) 胞，使腫瘤浸潤(rùn)性Τ淋巴細(xì)胞得以大量增殖。
[0008] 本發(fā)明所述的自體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞，通過(guò)強(qiáng)酸，強(qiáng)堿和/或輻照、及通 過(guò)高速離心收集樹突狀細(xì)胞，作為TIL激活擴(kuò)增的滋養(yǎng)層細(xì)胞。
[0009] 本發(fā)明所述方法中腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞來(lái)源于癌癥患者手術(shù)后新鮮自體腫瘤 組織。
[0010] 新鮮自體腫瘤組織使用眼科剪剪碎成1mm3的小塊，所得剪碎的組織小塊用0. 25% (質(zhì)量體積比）胰酶或100活性單位/mL I型膠原酶溶液以1克：0. 5mL的重量體積比 消化30分鐘后，加入消化液溶液體積1/5的小牛血清終止，消化液過(guò)10 μ Μ細(xì)胞篩，并用 5mLlXroS(pH= 7.4)洗滌兩次，過(guò)濾后的溶液以lOOOrpm離心收集細(xì)胞沉淀，加入AM-V 培養(yǎng)基重懸至l〇ml，單細(xì)胞懸液經(jīng)連續(xù)密度梯度離心分離得到腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞和自 體腫瘤細(xì)胞。
[0011] 腫瘤細(xì)胞用AIM-V培養(yǎng)基液稀釋成細(xì)胞濃度為2X106/mL的細(xì)胞懸液，分裝于凍 存管，嚴(yán)密封口，用液氮行快速冷凍，室溫慢融，反復(fù)凍融3-5次，5000rpm離心10分鐘后取 上清，加入到1. 5mL離心管中制備成自體腫瘤抗原，于-80°C儲(chǔ)存，用于負(fù)載樹突狀細(xì)胞。
[0012] 本發(fā)明所述自體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞與浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞首先共培養(yǎng)5 天，所述樹突狀細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的用量比例為樹突狀細(xì)胞數(shù)：淋巴細(xì)胞數(shù)=1-10 : 1，更 優(yōu)選地，為樹突狀細(xì)胞數(shù)：淋巴細(xì)胞數(shù)=3 : 1-5 : 1。
[0013] 共培養(yǎng)5天后，將浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞用5mL移液管吸出至新培養(yǎng)瓶中，并補(bǔ)充 10-20mL新鮮淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基（含50-500活性單位/mL白介素2)，在37°C、5% C02培養(yǎng)箱 中繼續(xù)培養(yǎng)2-3天；繼續(xù)補(bǔ)充20-40mL新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基（含50-500活性單位/mL白介素 2)，在37°C、5% C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2-3天；然后腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞連續(xù)增殖培養(yǎng)到 18-21天，使得細(xì)胞數(shù)達(dá)到5X108以上。
[0014] 優(yōu)選地，本發(fā)明所述自體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞用淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，力口 入到細(xì)胞培養(yǎng)板中，使用包括強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和/或輻照處理，將自體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì) 胞作為滋養(yǎng)層細(xì)胞。
[0015] 本發(fā)明使用的細(xì)胞培養(yǎng)基為淋巴細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基或RPMI1640培養(yǎng)基加入 50-500活性單位/mL白介素2和10% (體積比）自體血清或胎牛血清，優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng) 基為淋巴細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，如AM-V、X-VIV0和GT-T551等，含有500活性單位/mL白介 素2。
[0016] 本發(fā)明還提供了一種制備自體腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，所 述試劑盒包括：
[0017] A液為淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基；
[0018] B液為GM-CSF和IL-4混合液；
[0019] C液為腫瘤壞死因子α溶液；
[0020] D液為白介素2溶液；
[0021] Ε液為組織消化液；
[0022] F液為淋巴細(xì)胞分離液；
[0023] G液為生理鹽水；
[0024] 細(xì)胞培養(yǎng)板以及使用說(shuō)明書；
[0025] 其中，所述使用說(shuō)明書包括本發(fā)明中所述的方法。
[0026] 試劑盒組分分裝：試劑盒規(guī)格為1次/盒，各組分的量為：A液500mL/l瓶，B液 0· 5mL/l 支，C 液 0· 5mL/l 支，D 液 0· 5mL/l 支，E 液 lmL/Ι 支，F(xiàn) 液 20ml/l 瓶，G 液 100ml/l 瓶；分裝后進(jìn)行包裝，得到自體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞激活腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞的 試劑盒。
[0027] 經(jīng)培養(yǎng)獲得的自體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞，優(yōu)選地，還包括強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和/或 輻照處理后自體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞作為滋養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)板，如24孔細(xì)胞培養(yǎng) 板、12孔細(xì)胞培養(yǎng)板和6孔細(xì)胞培養(yǎng)板等。
[0028] 本發(fā)明還提供了上述方法及其試劑盒制備TIL細(xì)胞，可用于各類癌癥包括實(shí)體瘤 和血液腫瘤在內(nèi)的多個(gè)療程的免疫治療。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0029] 圖1表示本發(fā)明實(shí)施例一制備的實(shí)施例細(xì)胞表型流式細(xì)胞儀檢測(cè)流式圖；
[0030] 圖2表示發(fā)明實(shí)施例2制備的腫瘤細(xì)胞增殖圖；
[0031] 圖3表示本發(fā)明實(shí)施例三制備的TIL細(xì)胞表型流式細(xì)胞儀檢測(cè)流式圖；
[0032] 圖4表示本發(fā)明附子多糖誘導(dǎo)培養(yǎng)的NKT細(xì)胞酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)檢測(cè)干擾素 γ 分泌結(jié)果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0033] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)通過(guò)自體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞可以作為人工抗原遞呈細(xì)胞，可 以促進(jìn)⑶8a+、NK細(xì)胞和⑶4+中Thl+細(xì)胞大量增殖，抑制TIL細(xì)胞中調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的 增殖和產(chǎn)生，延長(zhǎng)TIL細(xì)胞端粒酶活性，產(chǎn)生對(duì)腫瘤細(xì)胞最佳的殺傷活性。TIL細(xì)胞培養(yǎng)至 20天細(xì)胞增殖倍數(shù)達(dá)到1000倍以上，TIL細(xì)胞數(shù)達(dá)到5 X108以上滿足臨床治療需要，可用 于多次抗腫瘤臨床應(yīng)用。
[0034] 對(duì)本發(fā)明涉及的一種自體腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞增殖的制備方法進(jìn)行具體說(shuō)明。 本發(fā)明涉及采用自體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞和白介素2,擴(kuò)增激活腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴 細(xì)胞，使得⑶8a+、NK細(xì)胞和⑶4+中Thl+細(xì)胞大量擴(kuò)增，獲得具有抗腫瘤作用的TIL細(xì)胞。
[0035] 本發(fā)明涉及一種自體腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞增殖的制備方法，其特征在于，使用 自體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞和白介素2,擴(kuò)增激活腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞，使腫瘤浸潤(rùn) 性T淋巴細(xì)胞得以大量增殖。
[0036] 本發(fā)明所述的自體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞膜上高表達(dá)的⑶80、⑶83、⑶86和 CD137L多肽，及其加工的腫瘤抗原表位，將可以激活T淋巴細(xì)胞大量擴(kuò)增和具有高活性的 抗腫瘤細(xì)胞毒性應(yīng)答。通過(guò)強(qiáng)酸，強(qiáng)堿和/或輻照、及通過(guò)高速離心收集樹突狀細(xì)胞進(jìn)行處 理，作為TIL激活擴(kuò)增的滋養(yǎng)層細(xì)胞。
[0037] 本發(fā)明所述方法中腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞來(lái)源于癌癥患者手術(shù)后新鮮自體腫瘤 組織。
[0038] 新鮮自體腫瘤組織使用眼科剪剪碎成1mm3的小塊，所得剪碎的組織小塊用0. 25% (質(zhì)量體積比）胰酶或100活性單位/mL I型膠原酶溶液以1克：0. 5mL的重量體積比 消化30分鐘后，加入消化液溶液體積1/5的小牛血清終止，消化液過(guò)10 μ Μ細(xì)胞篩，并用 5mLlXPBS(pH = 7.4)洗滌兩次，過(guò)濾后的溶液以lOOOrpm離心收集細(xì)胞沉淀，加入AM-V 培養(yǎng)基重懸至16mL，制備成單細(xì)胞懸液。
[0039] 用5mL移液管取5mL淋巴細(xì)胞分離液加入到15mL離心管中，再向其中緩慢加入 8mL單細(xì)胞懸液，1600rpm(轉(zhuǎn)每分鐘）離心25分鐘，經(jīng)連續(xù)密度梯度離心后，中間白膜層為 腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞，下層沉淀的細(xì)胞為自體腫瘤細(xì)胞。
[0040] 腫瘤細(xì)胞用AIM-V培養(yǎng)基液稀釋成細(xì)胞濃度為2 X 106/mL的細(xì)胞懸液，分裝于凍 存管，嚴(yán)密封口，用液氮行快速冷凍，室溫慢融，反復(fù)凍融3-5次，5000rpm離心10分鐘后取 上清，加入到1. 5mL離心管中制備成自體腫瘤抗原，于-80°C儲(chǔ)存，用于負(fù)載樹突狀細(xì)胞。
[0041] 來(lái)自腫瘤患者100mL外周血經(jīng)Ficoll-Hypaque密度梯度離心，得到單個(gè)核細(xì) 胞。外周血單個(gè)核細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)基重懸，貼壁細(xì)胞加入完全培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)，含有 1000IU/mL GM-CSF、500IU/mL IL-4,放置37°C、5% 0)2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)五天后收獲未成熟樹 突狀細(xì)胞。計(jì)數(shù)后，3-5 X 106未成熟樹突狀細(xì)胞加入500 μ L制備好的自體腫瘤抗原，負(fù)載 樹突狀細(xì)胞，放置37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-4小時(shí)，加入20ng/mL腫瘤壞死因子α培 養(yǎng)12小時(shí)，制備得到成熟樹突狀細(xì)胞。
[0042] 本發(fā)明所述自體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞與浸潤(rùn)性Τ淋巴細(xì)胞首先共培養(yǎng)5 天，所述樹突狀細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的用量比例為樹突狀細(xì)胞數(shù)：淋巴細(xì)胞數(shù)=1-10 : 1，更 優(yōu)選地，為樹突狀細(xì)胞數(shù)：淋巴細(xì)胞數(shù)=3 : 1-5 : 1。
[0043] 優(yōu)選地，本發(fā)明所述自體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞用淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，力口 入到細(xì)胞培養(yǎng)板中，使用包括強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和/或輻照處理，將自體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì) 胞作為滋養(yǎng)層細(xì)胞。
[0044] 共培養(yǎng)5天后，將浸潤(rùn)性Τ淋巴細(xì)胞用5mL移液管吸出至新培養(yǎng)瓶中，并補(bǔ)充 10-20mL新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基（含50-500IU/mL白介素2)，在37°C、5% C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 2-3天；繼續(xù)補(bǔ)充20-40mL新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基（含50-500活性單位/mL白介素2)，在37°C、 5% C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2-3天；然后腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞連續(xù)增殖培養(yǎng)到18-21天， 使得細(xì)胞數(shù)達(dá)到5 X 108以上。
[0045] 本發(fā)明使用的細(xì)胞培養(yǎng)基為淋巴細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基或RPMI1640培養(yǎng)基加入 50-500活性單位/mL白介素2和10% (體積比）自體血清或胎牛血清，優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng) 基為淋巴細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，如AM-V、X-VIV0和GT-T551等，含有500活性單位/mL白介 素2。
[0046] 本發(fā)明還提供了一種制備自體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞激活腫瘤浸潤(rùn)性T淋 巴細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：
[0047] A液為淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基；
[0048] B液為GM-CSF和IL-4混合液；
[0049] C液為腫瘤壞死因子α溶液；
[0050] D液為白介素2溶液；
[0051] Ε液為組織消化液；
[0052] F液為淋巴細(xì)胞分離液；
[0053] G液為生理鹽水；
[0054] 細(xì)胞培養(yǎng)板以及使用說(shuō)明書；
[0055] 其中，所述使用說(shuō)明書包括本發(fā)明中所述的方法。
[0056] 試劑盒組分分裝：試劑盒規(guī)格為1次/盒，各組分的量為：A液500mL/l瓶，B液 0· 5mL/l 支，C 液 0· 5mL/l 支，D 液 0· 5mL/l 支，E 液 lmL/Ι 支，F(xiàn) 液 20ml/l 瓶，G 液 100ml/l 瓶；分裝后進(jìn)行包裝，得到自體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞激活腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞的 試劑盒。
[0057] 經(jīng)培養(yǎng)獲得的自體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞，優(yōu)選地，還包括強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和/或 輻照處理后自體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞作為滋養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)板，如24孔細(xì)胞培養(yǎng) 板、12孔細(xì)胞培養(yǎng)板和6孔細(xì)胞培養(yǎng)板等。
[0058] 作為本發(fā)明TIL細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)中使用的細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培 養(yǎng)袋，可例舉，為75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶、175cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶、250mL細(xì)胞培養(yǎng)袋等細(xì)胞培養(yǎng)用器 材（容器），均可用于本發(fā)明，優(yōu)選細(xì)胞培養(yǎng)袋。
[0059] 本發(fā)明的制造方法中對(duì)TIL細(xì)胞進(jìn)行凍存，對(duì)凍存液無(wú)特殊限制，但優(yōu)選例如為 50%小牛血清、40%細(xì)胞培養(yǎng)液和10%二甲基亞砜，其中細(xì)胞培養(yǎng)液更優(yōu)選為TIL細(xì)胞培 養(yǎng)液。
[0060] 在培養(yǎng)基中可以添加血清或血漿進(jìn)行培養(yǎng)。它們?cè)谂囵B(yǎng)基中的添加量不受特殊限 制，如大于0容量％至20容量％，且可以根據(jù)不同的培養(yǎng)階段而改變血清或血漿的用量，優(yōu) 選為5% (體積比）。例如，可以階段性減少血清或血漿濃度來(lái)使用。另外，作為血清或血 楽的來(lái)源，可以是自己（意味著與所培養(yǎng)的細(xì)胞來(lái)源相同）或非自己（意味著與所培養(yǎng)的 細(xì)胞的來(lái)源不同）中的任一種，從安全性的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選自己來(lái)源的血清或血漿。另外， 也可以添加如人血清白蛋白之類經(jīng)分離純化的血清成分。
[0061] 本發(fā)明的自體TIL細(xì)胞增殖的制備使用上述各種成分及培養(yǎng)基來(lái)實(shí)施。本發(fā)明中 使用的培養(yǎng)培養(yǎng)條件也沒有特殊限制，可以使用通常的細(xì)胞培養(yǎng)中使用的條件。例如，可在 37°C、5% C02等條件下培養(yǎng)。還可以實(shí)施如下等操作：間隔適當(dāng)?shù)臅r(shí)間添加新鮮培養(yǎng)基來(lái) 稀釋細(xì)胞培養(yǎng)液，或更換培養(yǎng)基，或更換細(xì)胞培養(yǎng)用器材等。
[0062] 本發(fā)明還提供TIL細(xì)胞在臨床應(yīng)用中多次的抗腫瘤治療，更好地在生物體內(nèi)發(fā)揮 抗腫瘤免疫應(yīng)答，達(dá)到很好的治療效果。此外，上述TIL細(xì)胞還具有如下優(yōu)點(diǎn)，多次TIL細(xì) 胞治療將更好地引發(fā)CD8+、Thl細(xì)胞免疫應(yīng)答和NK細(xì)胞殺瘤活性，抑制調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞 免疫抑制活性，產(chǎn)生高效、長(zhǎng)效地抗腫瘤免疫效應(yīng)，因此非常利于患者療效的提高和生存期 的延長(zhǎng)。
[0063] 以下，結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做更具體的描述，但本發(fā)明不限于此。
[0064] 實(shí)施例一自體腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞的制備
[0065] 采集乳腺癌、肺癌、黑色素瘤和肝癌患者各1名的新鮮自體腫瘤組織（與其簽署 了知情同意書），使用眼科剪剪碎成1_3的小塊，所得剪碎的組織小塊用〇. 25% (質(zhì)量體 積比）胰酶或100活性單位/mL I型膠原酶溶液以1克：0. 5mL的重量體積比消化30分鐘 后，加入消化液溶液體積1/5的小牛血清終止，消化液過(guò)10 μ Μ細(xì)胞篩，并用5mLl XPBS (pH =7. 4)洗滌兩次，過(guò)濾后的溶液以lOOOrpm離心收集細(xì)胞沉淀，加入AIM-V培養(yǎng)基（美國(guó) Life公司）重懸至16mL，制備成單細(xì)胞懸液。
[0066] 用5mL移液管取5mL淋巴細(xì)胞分離液加入到15mL離心管中，再向其中緩慢加入 8mL單細(xì)胞懸液，1600rpm(轉(zhuǎn)每分鐘）離心25分鐘，經(jīng)連續(xù)密度梯度離心后，中間白膜層為 腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞，下層沉淀的細(xì)胞為自體腫瘤細(xì)胞。
[0067] 腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞用10mLlXPBS(pH = 7. 4)洗滌1次，1000rpm、4°C下離心 10分鐘，細(xì)胞用2mL AM-V培養(yǎng)基重懸。取10ul細(xì)胞液用lXPBS(pH7.4)稀釋10倍，稀釋 液加入1倍體積的苔盼蘭溶液，混勻后加入到細(xì)胞計(jì)數(shù)板，于倒置顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，藍(lán)色 染色的為死細(xì)胞，不染色的為活細(xì)胞，細(xì)胞活率均達(dá)到98%以上。
[0068] 取苔盼蘭染色計(jì)數(shù)后的0. 6 X 106腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞，分三組，第一組分別添 加到有20yL FITC標(biāo)記鼠抗人⑶3單抗、20yL PE標(biāo)記鼠抗人⑶56單抗和20yL PerCP 標(biāo)記鼠抗人⑶8單抗；第二組分別添加20 μ L FITC標(biāo)記鼠抗人⑶3單抗、20 μ LPE標(biāo)記鼠 抗人⑶4單抗和20 μ L PerCP標(biāo)記鼠抗人⑶25單抗；第三組為同型對(duì)照，分別添加到有 20 μ LFITC標(biāo)記鼠 IgGl、20 μ L PE標(biāo)記鼠 IgGl和20 μ L PerCP標(biāo)記鼠 IgGl。置于4°C冰箱 染色30分鐘，然后用lmL的1 X磷酸鹽緩沖液（PBS)洗滌三次，最后用0. 5mL的1 XPBS重 懸洗滌后的細(xì)胞，所得洗滌后的細(xì)胞用FACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）檢測(cè)。圖 1結(jié)果顯示，乳腺癌患者來(lái)源分離得到的TIL細(xì)胞表型為：⑶3+細(xì)胞為87. 77%，⑶3+/⑶8+ 細(xì)胞為 54. 52%，CD56+細(xì)胞為 12. 09%，CD3+/CD4+細(xì)胞為 78. 17%和 CD4+/CD25+細(xì)胞為 27. 69%，表明TIL細(xì)胞中⑶3+/⑶8+細(xì)胞和⑶56+NK細(xì)胞含量比較低下。
[0069] 實(shí)施例二自體腫瘤抗原負(fù)載樹突狀細(xì)胞的制備
[0070] 實(shí)施例一中獲得腫瘤細(xì)胞用AIM-V培養(yǎng)基液稀釋成細(xì)胞濃度為2X 106/mL的細(xì)胞 懸液，分裝于凍存管，嚴(yán)密封口，用液氮行快速冷凍，室溫慢融，反復(fù)凍融3-5次，5000rpm離 心10分鐘后取上清，加入到1. 5mL離心管中制備成自體腫瘤抗原，于-80°C儲(chǔ)存，用于負(fù)載 樹突狀細(xì)胞。
[0071] 來(lái)自腫瘤患者100mL外周血經(jīng)Ficoll-Hypaque密度梯度離心，得到單個(gè)核細(xì)胞。 外周血單個(gè)核細(xì)胞用AM-V培養(yǎng)基重懸，貼壁細(xì)胞加入完全培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)，含有1000IU/ mL GM-CSF、500IU/mL IL-4,放置371：、5%0)2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)五天后收獲未成熟樹突狀細(xì) 胞。計(jì)數(shù)后，3-5 X 106未成熟樹突狀細(xì)胞加入500 μ L制備好的自體腫瘤抗原，負(fù)載樹突狀 細(xì)胞，放置37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-4小時(shí)，加入20ng/mL腫瘤壞死因子α培養(yǎng)12小 時(shí)，收獲成熟樹突狀細(xì)胞，l〇〇〇rpm離心10分鐘后棄上清，用制備得到成熟樹突狀細(xì)胞。
[0072] 取苔盼蘭染色計(jì)數(shù)后的0. 6 X 106樹突狀細(xì)胞，分三組，第一組分別添加到有20 μ L FITC標(biāo)記鼠抗人⑶80單抗、20 μ L PE標(biāo)記鼠抗人⑶86單抗和20 μ L PerCP標(biāo)記鼠抗人 ⑶11c單抗；第二組分別添加20yL FITC標(biāo)記鼠抗人⑶137L單抗、20yL PE標(biāo)記鼠抗人 ⑶83單抗和20 μ L PerCP標(biāo)記鼠抗人⑶11c單抗；第三組為同型對(duì)照，分別添加到有20 μ L FITC標(biāo)記鼠 IgGl、20 μ L PE標(biāo)記鼠 IgGl和20 μ L PerCP標(biāo)記鼠 IgGl。置于4°C冰箱染色 30分鐘，然后用lmL的IX磷酸鹽緩沖液（PBS)洗滌三次，最后用0. 5mL的IXPBS重懸洗 滌后的細(xì)胞，所得洗滌后的細(xì)胞用FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，樹突狀細(xì) 胞表型為CD80+為96. 1 %、CD86+為98. 8 %、CD83+為86 %和CD 137L+為86 %，表明通過(guò)本 發(fā)明技術(shù)得到細(xì)胞為成熟樹突狀細(xì)胞，并高表達(dá)各類共刺激分子。
[0073] 實(shí)施例三自體腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞大量增殖培養(yǎng)
[0074] 取實(shí)施例二中制備的6X106成熟樹突狀細(xì)胞用3mLAIM-V培養(yǎng)基重懸，每孔0. 5mL 加入到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，浸潤(rùn)細(xì)胞培養(yǎng)板底面，使用100Gy γ射線輻照處理，將自體腫瘤 抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞作為滋養(yǎng)層細(xì)胞。向6孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔中加入3 X 106腫瘤浸潤(rùn) 性Τ淋巴細(xì)胞，每孔為3mL的AM-V培養(yǎng)基（含500活性單位/mL白介素2)。自體腫瘤抗 原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞與腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞首先共培養(yǎng)5天。
[0075] 激活培養(yǎng)5天后，將浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞用5mL移液管吸出至新培養(yǎng)瓶中，并補(bǔ)充 10-20mL新鮮AIM-V培養(yǎng)基（含500活性單位/mL白介素2)，在37°C、5% C02培養(yǎng)箱中繼 續(xù)培養(yǎng)2-3天；繼續(xù)補(bǔ)充20-40mL新鮮AIM-V培養(yǎng)基（含500活性單位/mL白介素2)，在 37°C、5% C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2-3天；然后腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞連續(xù)增殖培養(yǎng)到18-21 天。
[0076] 取10ul細(xì)胞液用1 XPBS (pH7. 4)稀釋10倍，稀釋液加入1倍體積的苔盼蘭溶液， 混勻后加入到細(xì)胞計(jì)數(shù)板，于倒置顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，藍(lán)色染色的為死細(xì)胞，不染色的為活 細(xì)胞，細(xì)胞活率均達(dá)到98%以上。圖2結(jié)果顯示，隨著TIL細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)間增加，擴(kuò)增倍 數(shù)也不斷增加，實(shí)施例一中四名腫瘤患者TIL細(xì)胞培養(yǎng)到20天，細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)均高于1100 倍，每位患者的TIL細(xì)胞數(shù)均高于5X 108。
[0077] 取經(jīng)激活擴(kuò)增的0. 6 X 106腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞，分三組，第一組分別添加到有 20yL FITC標(biāo)記鼠抗人⑶3單抗、20yL PE標(biāo)記鼠抗人⑶56單抗和20yL PerCP標(biāo)記鼠抗 人⑶8單抗；第二組分別添加20 μ L FITC標(biāo)記鼠抗人⑶3單抗、20 μ L PE標(biāo)記鼠抗人⑶4 單抗和20 μ L PerCP標(biāo)記鼠抗人⑶25單抗；第三組為同型對(duì)照，分別添加到有20 μ L FITC 標(biāo)記鼠 IgGl、20 μ L PE標(biāo)記鼠 IgGl和20 μ L PerCP標(biāo)記鼠 IgGl。置于4°C冰箱染色30分 鐘，然后用lmL的1 X磷酸鹽緩沖液（PBS)洗滌三次，最后用0. 5mL的1 XPBS重懸洗滌后 的細(xì)胞，所得洗滌后的細(xì)胞用FACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）檢測(cè)。圖3結(jié)果顯 示，其中一名黑色素瘤患者來(lái)源培養(yǎng)得到的TIL細(xì)胞表型為：⑶3+細(xì)胞為93. 68%，⑶3+/ CD8+ 細(xì)胞為 82. 10%，CD56+ 細(xì)胞為 42. 39%，CD3+/CD4+ 細(xì)胞為 70. 91%和 CD4+/CD25+ 細(xì) 胞為8. 73%，表明TIL細(xì)胞中⑶3+/⑶8+細(xì)胞和⑶56+NK細(xì)胞含量對(duì)比實(shí)施例一分離得到 TIL細(xì)胞顯著提高，⑶4+/⑶25+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞數(shù)量得到很大的抑制。
[0078] 實(shí)施例四TIL細(xì)胞體外殺瘤試驗(yàn)
[0079] 選擇相應(yīng)的肺癌細(xì)胞（A549)和肝癌細(xì)胞（HepG2)作為靶細(xì)胞，用51Cr標(biāo)記，即靶 細(xì)胞（2X10 6/mL)通過(guò)與300yCi51Cr在RPMI1640培養(yǎng)基中37°C孵育2小時(shí)。標(biāo)記好的 靶細(xì)胞用1 X PBS洗滌三次，并最終用RPMI1640 (含10 %小牛血清）重懸到2 X 105的濃度。 以每孔2 X 104個(gè)標(biāo)記的靶細(xì)胞（0. lmL)添加到96孔板的孔中。
[0080] 根據(jù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)雜志報(bào)道的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤中自體腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞和低劑 量白介素 2 的適應(yīng)性細(xì)胞治療（Ellebaek El，Iversen TZ，Junker N，et al. Adoptive cell therapy with autologous tumor infiltrating lymphocytes and low-dose Interleukin-2in metastatic melanoma patients. J Transl Med. 2012Aug21 ；10 ：169.) 中德現(xiàn)有技術(shù)，制備TIL細(xì)胞作為對(duì)比例。
[0081] 將實(shí)施例三中制備的TIL細(xì)胞和現(xiàn)有技術(shù)制備的TIL細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，分別以 2. 5 : 1、5 : 1、10 : 1、20 : 1和40 : 1的效靶比加入對(duì)應(yīng)的孔中，在37°C孵育4小時(shí)。 孵育后，取上清75yL組分用γ放射計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。特異的51Cr釋放的百分比根據(jù)下述的公 式進(jìn)行計(jì)算。
[0082] (檢測(cè)的每分脈沖數(shù)自發(fā)釋放的每分脈沖數(shù)） %特異裂解率=- (最大釋放的每分脈沖數(shù)(自發(fā)釋放的每分脈沖數(shù)）
[0083] 其中，自發(fā)釋放的每分脈沖數(shù)通過(guò)單獨(dú)培養(yǎng)靶細(xì)胞（未加效應(yīng)細(xì)胞）獲得，最大釋 放的每分脈沖數(shù)是用終濃度2% ΝΡ-40 (表面活性劑，上海生工）處理的單獨(dú)培養(yǎng)靶細(xì)胞后 獲得的。檢測(cè)的每分脈沖數(shù)通過(guò)添加效應(yīng)細(xì)胞的靶細(xì)胞培養(yǎng)獲得的。
[0084] 圖4顯示了由實(shí)施例三獲得的TIL細(xì)胞，對(duì)肺癌細(xì)胞（Α549)和肝癌細(xì)胞（HepG2) 產(chǎn)生抗腫瘤免疫應(yīng)答，隨著效靶比不斷提高，對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的CTL應(yīng)答也特異升高。并且 由本發(fā)明制備的TIL細(xì)胞毒性活性明顯高于現(xiàn)有技術(shù)制備的TIL細(xì)胞。
[0085] 實(shí)施例五自體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞激活腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞的試劑盒 制備
[0086] 試劑盒由如下成分組成：
[0087] A液為淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基；
[0088] B液為GM-CSF和IL-4混合液；
[0089] C液為腫瘤壞死因子α溶液；
[0090] D液為白介素2溶液；
[0091] Ε液為組織消化液；
[0092] F液為淋巴細(xì)胞分離液；
[0093] G液為生理鹽水；
[0094] 細(xì)胞培養(yǎng)板以及使用說(shuō)明書；
[0095] 其中，所述使用說(shuō)明書包括實(shí)施例1-4所述的方法。
[0096] 試劑盒組分分裝：試劑盒規(guī)格為1次/盒，各組分的量為：Α液500mL/l瓶，Β液 0· 5mL/l 支，C 液 0· 5mL/l 支，D 液 0· 5mL/l 支，E 液 lmL/Ι 支，F(xiàn) 液 20ml/l 瓶，G 液 100ml/l 瓶；分裝后進(jìn)行包裝，得到自體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞激活腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞的 試劑盒。
[0097] 培養(yǎng)獲得的自體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)板中經(jīng)Y射線輻照處 理，將自體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞作為滋養(yǎng)層細(xì)胞，使用的細(xì)胞培養(yǎng)板為1塊6孔細(xì)胞 培養(yǎng)板。
【權(quán)利要求】
1. 一種自體樹突狀細(xì)胞激活腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞的制備方法，其特征在于，使用自 體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞作為滋養(yǎng)層細(xì)胞和白介素2,激活擴(kuò)增腫瘤浸潤(rùn)性Τ淋巴細(xì) 胞，使腫瘤浸潤(rùn)性Τ淋巴細(xì)胞得以大量增殖，培養(yǎng)到20天細(xì)胞數(shù)達(dá)到5 X 108以上，增殖倍 數(shù)達(dá)到1000倍以上，并具有高活性的抗腫瘤細(xì)胞毒性應(yīng)答。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中以樹突狀細(xì)胞負(fù)載了自體腫 瘤抗原，并在樹突狀細(xì)胞膜上高表達(dá)的⑶80、⑶83、⑶86和⑶137L多肽，及其加工的腫瘤抗 原表位，通過(guò)強(qiáng)酸，強(qiáng)堿和/或輻照、及通過(guò)高速離心收集樹突狀細(xì)胞進(jìn)行純化收集。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中腫瘤浸潤(rùn)性Τ淋巴細(xì)胞和自體 腫瘤抗原來(lái)源于癌癥患者手術(shù)后新鮮自體腫瘤組織。 新鮮自體腫瘤組織使用眼科剪剪碎成1_3的小塊，所得剪碎的組織小塊用〇. 25% (質(zhì)量體積比）胰酶或100活性單位/mL I型膠原酶溶液以1克：0. 5mL的重量體積比 消化30分鐘后，加入消化液溶液體積1/5的小牛血清終止，消化液過(guò)10 μ Μ細(xì)胞篩，并用 5mLlXPBS(pH= 7.4)洗滌兩次，過(guò)濾后的溶液以lOOOrpm離心收集細(xì)胞沉淀，加入AM-V 培養(yǎng)基重懸至10mL，單細(xì)胞懸液經(jīng)連續(xù)密度梯度離心分離得到腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞和腫 瘤細(xì)胞。 腫瘤細(xì)胞用AIM-V培養(yǎng)基液稀釋成細(xì)胞濃度為2 X 106/mL的細(xì)胞懸液，分裝于凍存管， 嚴(yán)密封口，用液氮行快速冷凍，室溫慢融，反復(fù)凍融3-5次，5000rpm離心10分鐘后取上清， 加入到1. 5mL離心管中制備成自體腫瘤抗原，于-80°C儲(chǔ)存，用于負(fù)載樹突狀細(xì)胞。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述自體腫瘤抗原負(fù)載的樹 突狀細(xì)胞與腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞首先共培養(yǎng)5天，所述樹突狀細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的用量比 例為樹突狀細(xì)胞數(shù)：淋巴細(xì)胞數(shù)=1-10 : 1，更優(yōu)選地，為樹突狀細(xì)胞數(shù)：淋巴細(xì)胞數(shù)= 3 : 1-5 : 1。 共培養(yǎng)5天后，將腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞用5mL移液管吸出至新培養(yǎng)瓶中，并補(bǔ)充 10-20mL新鮮淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基（含50-500活性單位/mL白介素2)，在37°C、5% C02培養(yǎng)箱 中繼續(xù)培養(yǎng)2-3天；繼續(xù)補(bǔ)充20-40mL新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基（含50-500活性單位/mL白介素 2)，在37°C、5% C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2-3天；然后腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞連續(xù)增殖培養(yǎng)到 18-21天，使得細(xì)胞數(shù)達(dá)到5X10 8以上。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述自體腫瘤抗原負(fù)載的樹 突狀細(xì)胞，優(yōu)選地，加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中使用包括強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和/或輻照處理，將自體腫瘤 抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞作為滋養(yǎng)層細(xì)胞。
6. -種制備自體腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括： A液為淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基； B液為GM-CSF和IL-4混合液； C液為腫瘤壞死因子α溶液； D液為白介素2溶液； Ε液為組織消化液； F液為淋巴細(xì)胞分離液； G液為生理鹽水； 細(xì)胞培養(yǎng)板以及使用說(shuō)明書； 其中，所述使用說(shuō)明書包括權(quán)利要求3-5所述的方法。 試劑盒組分分裝：試劑盒規(guī)格為1次/盒，各組分的量為：A液500mL/l瓶，B液0. 5mL/l 支，C 液 0· 5mL/l 支，D 液 0· 5mL/l 支，E 液 lmL/1 支，F(xiàn) 液 20ml/l 瓶，G 液 100ml/l 瓶；分裝 后進(jìn)行包裝，得到自體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞激活腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞的試劑盒。 經(jīng)培養(yǎng)獲得的自體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞，優(yōu)選地，還包括強(qiáng)酸，強(qiáng)堿和/或輻照 處理后自體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞作為滋養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)板，如24孔細(xì)胞培養(yǎng)板、12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板和6孔細(xì)胞培養(yǎng)板等。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其中，所述自體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞，優(yōu)選 地，還包括強(qiáng)酸，強(qiáng)堿和/或輻照處理后自體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞作為滋養(yǎng)層細(xì)胞 的培養(yǎng)板，如24孔細(xì)胞培養(yǎng)板、12孔細(xì)胞培養(yǎng)板和6孔細(xì)胞培養(yǎng)板等。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法制備的腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞，可用于治療 癌癥的藥物的制備中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N5/0783GK104152411SQ201410387444
【公開日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年8月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月8日
【發(fā)明者】張?jiān)雒? 方志明 申請(qǐng)人:煙臺(tái)博毓生物科技有限公司