專利名稱：酶解與膜濾集成連續(xù)制取酪蛋白生物活性多肽的工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種將酶解反應與膜分離技術集成連續(xù)制取酪蛋白源多肽的新工藝，屬于以酪蛋白為底物酶促水解制取活性多肽的技術。
背景技術：
酪蛋白是乳中含量最高的蛋白質，為幾種含磷蛋白的復合體，主要成分為αs1、αs2、β、κ四種多肽鏈。酪蛋白經(jīng)單酶或復合酶系水解作用，再經(jīng)分離純化可制得近10類百余種生物活性多肽。復雜的酶解產(chǎn)物、多樣性的序列結構使該類物質具有免疫調節(jié)、自由基清除、礦物質載體、抗癌抑菌、溶栓降壓、安神麻醉等多種生理功能(表1)，是極具開發(fā)價值的一類生物活性物質。
表1酪蛋白源生物活性多肽示例

目前，酪蛋白生物活性多肽的生產(chǎn)工藝廣泛采用間歇酶解，即在普通水解罐中進行分批操作，當酶解反應結束后，通過調節(jié)溶液pH值使蛋白酶變性失活，并使未水解的酪蛋白沉淀后離心分離，再經(jīng)溶劑選擇性沉淀或離子交換樹脂處理等多步分離純化步驟，方能制得目標多肽產(chǎn)品，工藝過程中存在如下問題(1)由于酶解產(chǎn)物無法從反應體系中及時分離，容易造成產(chǎn)物抑制現(xiàn)象，酶解反應轉化率及目標多肽產(chǎn)率均較低；(2)不同反應批次之間水解條件有一定差異，產(chǎn)品質量不穩(wěn)定；(3)從反應體系中分離產(chǎn)物以及從反應混合物中將酶回收再用均非常困難，故酶耗量大，工藝成本高，不能完全滿足商品化的要求。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種將酶解反應與膜濾技術集成連續(xù)制取酪蛋白活性多肽的新工藝。采用該工藝制得的生物活性多肽產(chǎn)率高，成本低，并具有多種生理功效，且安全無毒，可作為保健品食用。
為達到上述目的，本發(fā)明采用下述技術方案加以實現(xiàn)在由酶解罐與不同截留分子量的超濾、納濾膜組合而成的多級酶膜反應器中，實施酶解與膜濾集成連續(xù)制取酪蛋白生物活性多肽的工藝。所述酶解反應是以全酪蛋白、αs1、αs2、β、κ-酪蛋白單體、酪蛋白酸鹽中的至少一種為底物，在蛋白酶適宜反應溫度25～50℃與pH值4～10的條件下，經(jīng)胰酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、羧肽酶中的一種或復配催化作用而實現(xiàn)酶促水解反應，上述工藝中初始底物質量濃度為2～4％，初始酶與底物質量濃度之比為1∶20～1∶40；通過滴加NaOH溶液維持體系pH恒定；通過水浴加熱維持體系溫度恒定。其特征在于在酶解罐中進行水解反應的同時，連續(xù)由罐底將酶解液引入平均截留分子量為6000～10000的超濾器中，超濾膜截留液回流至酶解罐繼續(xù)循環(huán)降解，超濾膜滲透液被連續(xù)引入平均截留分子量為1000～2000的納濾器中，納濾膜滲透液排棄，收集納濾膜截留濃縮液，在進口溫度150～200℃，出口溫度70～85℃、進料速度1.0～1.5L/h、操作壓力0.1～1MPa的條件下，經(jīng)噴霧干燥制得分子量為1000～10000的多功能酪蛋白源生物活性多肽，包括酪蛋白磷酸肽、降血壓肽、免疫活性肽、血管緊張素轉化酶抑制劑、阿片活性肽、溶栓肽、抑菌肽、自由基清除肽。
上述膜分離單元包括至少一級用于截留酪蛋白底物和蛋白酶的超濾膜和一級用于多肽溶液濃縮、脫鹽和除苦味肽的納濾膜超濾膜操作壓力0.02～0.05MPa、循環(huán)流量20～40L/h，反應物平均停留時間3～4h；納濾膜操作壓力0.1～0.5MPa。
上述工藝中需不斷向酶解罐中補加底物溶液和蛋白酶以維持體系恒定向酶解罐連續(xù)流加質量濃度為1～2％的底物溶液，流加速度與超濾膜滲透通量一致；每6～8小時向酶解罐分批補加蛋白酶，使罐體內蛋白酶有效質量濃度保持0.1～0.15％。
本發(fā)明集酶促水解反應、催化劑回收再用、產(chǎn)物分離純化與濃縮脫鹽、苦味肽脫除五步工序于一體，相比現(xiàn)有技術具有如下優(yōu)點(1)采用膜技術及時將水解產(chǎn)物從反應單元分離，移動化學平衡，消除產(chǎn)物抑制，使活性多肽單位時間產(chǎn)量由30g/h增至50g/h；(2)以不同截留分子量的超濾和納濾膜組合處理酶解液，可實現(xiàn)對酶解產(chǎn)物分子量分布的有效調控，使目標多肽分子量分布集中、成分趨向均一、品質穩(wěn)定；(3)以超濾膜截留反應物系中的高分子物質，可使酪蛋白底物有效濃度升高，酶解反應轉化率由50％增至80％，并可實現(xiàn)蛋白酶的重復循環(huán)使用，酶利用率提高1.5倍，原料成本降低1倍；(4)以納濾膜處理超濾膜滲透液，可一步實現(xiàn)高效脫鹽(脫鹽率達65～95％)、透水濃縮(脫水率達50～70％)和去除引起苦味的小分子雜肽，使產(chǎn)品風味更好、功效更高；(5)在反應物流中富集濃縮產(chǎn)物，使蛋白質總收率由50％提高至70％，同時簡化了下游分離純化步驟，工藝成本明顯降低；(6)強化反應過程，大幅度延長有效反應時間，使酶解工藝適于大規(guī)模連續(xù)化生產(chǎn)的要求；(7)常壓常溫操作，溫和易控，節(jié)約能耗，且無有毒有害試劑污染環(huán)境，屬綠色工藝。
本發(fā)明所制得的具有多種生物功能的酪蛋白活性多肽，安全無毒，無副作用，易于被人體吸收，理化與衛(wèi)生學檢測達到國家保健(功能)食品通用標準，可廣泛用于食品、保健品、化妝品等多個領域，經(jīng)進一步純化還可開發(fā)為活性多肽類藥物。


附圖1為本發(fā)明提出的酶解與膜濾集成連續(xù)制取酪蛋白活性多肽的工藝流程框圖。
具體實施例方式
下面舉例對本發(fā)明做進一步詳細描述。
實施例1稱取酪蛋白800g，加入20L水置于儲液罐中，微熱并充分攪拌，緩慢加入1g/mL的NaOH溶液16mL，配成pH＝8.5、濃度為4％的酪蛋白底物溶液，泵入水解罐中，調節(jié)攪拌轉速為80rmp，啟動恒溫水浴，待溫度恒定于45℃后，開啟超濾循環(huán)裝置，超濾膜平均截留分子量為10000，使底物溶液以30L/h的循環(huán)流量，常壓穩(wěn)定循環(huán)15min，向水解罐中加入20克堿性蛋白酶，開始連續(xù)酶解反應并記時，10min后調節(jié)超濾膜操作壓力達0.05MPa，酪蛋白、蛋白酶及高分子多肽等大分子物質被超濾膜截留而返回反應單元繼續(xù)循環(huán)降解，而小于超濾膜平均截留分子量的多肽通過膜件形成滲透液，反應過程中通過滴加4mol/L的NaOH溶液維持體系pH＝8.5恒定，通過水浴加熱維持體系溫度45℃恒定，根據(jù)所測超濾膜滲透通量以相同數(shù)值連續(xù)流加1.5％的酪蛋白底物溶液維持反應體積與有效底物濃度恒定，每隔6小時補加5g堿性蛋白酶維持體系酶活力恒定，當超濾膜滲透側緩沖罐收集到5L滲出液時，開啟納濾循環(huán)裝置以同時完成多肽溶液脫水、脫鹽和除苦味肽，納濾膜平均截留分子量為1000，操作壓力0.2MPa，當濃縮脫水達50％時結束納濾，此時脫鹽率達70％，收集納濾膜截留液，在進口溫度180℃，出口溫度75℃、進料速度1.5L/h、操作壓力0.5MPa的條件下，經(jīng)噴霧干燥制得分子量為1000～10000的多功能酪蛋白活性多肽產(chǎn)品，經(jīng)計算蛋白質收率＞70％，活性多肽單位時間生成速率為50g/h。
實施例2采用平均截留分子量為6000的超濾膜和平均截留分子量為2000的納濾膜與20L酶解罐組成連續(xù)反應分離系統(tǒng)，向20L質量濃度為2％的酪蛋白底物溶液中加入20g胰酶，反應過程中維持體系溫度40℃、pH＝8.0恒定，連續(xù)流加1％的酪蛋白底物溶液維持反應體積與有效底物濃度恒定，每隔4小時補加4g胰酶維持體系酶活力恒定，其他酶解反應和膜分離操作步驟與工藝參數(shù)同實施例1，制得以酪蛋白磷酸肽為主的活性多肽產(chǎn)品，產(chǎn)品經(jīng)HPSEC檢測分析，分子量主要集中于3000～5000對應的譜峰中，氮磷比值＜10。
權利要求
1.一種酶解與膜濾集成連續(xù)制取酪蛋白生物活性多肽的工藝，該工藝在由酶解罐與不同截留分子量的超濾、納濾膜組合而成的多級酶膜反應器中具體實施；所述酶解反應是以全酪蛋白、αs1、αs2、β、κ-酪蛋白單體、酪蛋白酸鹽中的至少一種為底物，在蛋白酶適宜反應溫度25～50℃與pH值4～10的條件下，經(jīng)胰酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、羧肽酶中的一種或復配催化作用而實現(xiàn)酶促水解反應，上述工藝中初始底物質量濃度為2～4％，初始酶與底物質量濃度之比為1∶20～1∶40，通過滴加NaOH溶液維持體系pH恒定，通過水浴加熱維持體系溫度恒定，其特征在于在酶解罐中進行水解反應的同時，連續(xù)由罐底將酶解液引入平均截留分子量為6000～10000的超濾器中，超濾膜截留液回流至酶解罐繼續(xù)循環(huán)降解，超濾膜滲透液被連續(xù)引入平均截留分子量為1000～2000的納濾器中，納濾膜滲透液排棄，收集納濾膜截留濃縮液，在進口溫度150～200℃，出口溫度70～85℃、進料速度1.0～1.5L/h、操作壓力0.1～1MPa的條件下，經(jīng)噴霧干燥制得分子量為1000～10000的多功能酪蛋白源生物活性多肽，包括酪蛋白磷酸肽、降血壓肽、免疫活性肽、血管緊張素轉化酶抑制劑、阿片活性肽、溶栓肽、抑菌肽、自由基清除肽。
2.如權利要求1所述的酶解與膜濾集成連續(xù)制取酪蛋白生物活性多肽的工藝，其特征在于膜分離單元包括至少一級用于截留酪蛋白底物和蛋白酶的超濾膜和一級用于多肽溶液濃縮、脫鹽和除苦味肽的納濾膜，超濾膜操作壓力0.02～0.05M Pa、循環(huán)流量20～40L/h，反應物平均停留時間3～4h；納濾膜操作壓力0.1～0.5M Pa。
3.如權利要求1所述的酶解與膜濾集成連續(xù)制取酪蛋白生物活性多肽的工藝，其特征在于反應過程中需不斷向酶解罐中補加底物溶液和蛋白酶以維持體系恒定，向酶解罐連續(xù)流加質量濃度為1～2％的底物溶液，流加速度與超濾膜滲透通量一致；每6～8小時向酶解罐分批補加蛋白酶，使罐體內蛋白酶有效質量濃度保持0.1～0.15％。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種酶解與膜濾集成連續(xù)制取酪蛋白生物活性多肽的工藝。該工藝以酪蛋白為原料，在由酶解罐與不同截留分子量的超濾、納濾膜組合而成的多級酶膜反應器中，經(jīng)至少一種蛋白酶作用，制得具有多種功能的生物活性多肽。本發(fā)明集酶促水解反應、催化劑回收再用、產(chǎn)物分離純化與濃縮脫鹽、苦味肽脫除五步工序于一體，相比現(xiàn)有工藝技術，使酶解反應轉化率由50％增至80％、活性多肽單位時間產(chǎn)量由30g/h增至50g/h、蛋白質收率由50％提高至70％、蛋白酶利用率提高1.5倍，工藝成本降低1倍。所制得的活性多肽產(chǎn)品組成趨向均一，且安全無毒，在食品、化妝品、保健品、醫(yī)藥等領域應用前景極其廣闊。
文檔編號C12P21/00GK1546682SQ20031010755
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月16日 優(yōu)先權日2003年12月16日
發(fā)明者何志敏, 齊崴, 何明霞, 喬文, 鄒超 申請人:天津大學