專利名稱：一種酪蛋白活性單肽及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉抑制酸乳發(fā)酵及儲藏的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從酪蛋白酶解液分離得到的 具有促進(jìn)酸乳發(fā)酵和抑制酸乳后酸化的生物活性單肽及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
酸乳是指在保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的作用下，使用添加(或不添加)乳 粉(全脂或脫脂)的乳進(jìn)行乳酸發(fā)酵而得到的凝固乳制品，最終產(chǎn)品中必須含有大量的活 菌。乳酸菌的發(fā)酵作用可以使乳白蛋白變成微細(xì)的凝乳粒，易于消化吸收，發(fā)酵過程中乳酸 菌可以產(chǎn)生機(jī)體營養(yǎng)所必需的維生素、煙酸和葉。酸乳除了保留了牛奶的全部營養(yǎng)外，其 與鮮奶最顯著的差異就是在于它還含有大量的乳酸及易于人體腸道健康的活性乳酸菌。我國酸乳生產(chǎn)中所用的乳酸菌大多為國外購進(jìn)的直投式發(fā)酵劑(Direct-to vat caulture，簡稱DVS)，繼代式酸乳菌種的應(yīng)用量相當(dāng)小。與液體菌種相比，直投式發(fā)酵劑的 潛伏期要長得多。其發(fā)酵時間通常比使用傳統(tǒng)的翻代液體發(fā)酵劑要延長2 3小時左右， 對于大型乳品廠，這是一個不容忽視的影響因素。因此，如何縮短直投式菌種的發(fā)酵時間， 提高生產(chǎn)效率，以及如何采取有效手段在減少發(fā)酵劑使用量，同時保證產(chǎn)品品質(zhì)，來降低成 本也是重要的研究方向。在酸乳發(fā)酵過程中嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌具有生長互補(bǔ)的作用或稱為共 生(Mutualism)，球菌的生長同時會促進(jìn)桿菌的生長，而桿菌生長形成的代謝產(chǎn)物又保證球 菌的生長。乳桿菌對酸乳的貢獻(xiàn)是分解蛋白質(zhì)、產(chǎn)酸，鏈球菌對酸乳的良好風(fēng)味和感官品質(zhì) 具有重要作用。酸乳在貨架期必須保持微生物活性和良好的質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味。即使冷藏在0 5°C條件下，乳酸菌的新陳代謝導(dǎo)致的后酸化現(xiàn)象依然存在，這造成過乳清析出、酸味過重 甚至產(chǎn)生澀味。以上現(xiàn)象嚴(yán)重影響酸乳的品質(zhì)導(dǎo)致其保質(zhì)期被大大縮短。因此，通過在酸乳中添加具有含有益生功能因子的酪蛋白生物活性肽，有效地促 進(jìn)酸乳發(fā)酵縮短發(fā)酵時間并且抑制酸乳再儲藏期間產(chǎn)生后酸化延長酸乳保質(zhì)期，對酸乳行 業(yè)具有重大的經(jīng)濟(jì)價值和現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種有牛乳來源的、高安全性 的、具有可產(chǎn)業(yè)化的酪蛋白活性單肽及其制備方法與應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以 下技術(shù)方案?！N酪蛋白活性單肽的制備方法與應(yīng)用，包括如下步驟
(1)在50°C 55°C，pH6. 0-7. 5的條件下加入木瓜蛋白酶對酪蛋白進(jìn)行酶解，得酶解
液；
(2)當(dāng)水解度達(dá)到9% 10%時，90 95°C加熱15 20min滅酶，終止酶解反應(yīng)以控 制生物活性肽的分子量；
(3)將滅酶活的酶解液依次通過膜分離、大孔樹脂、凝膠色譜、反相高效液相進(jìn)行分離純化，即得所述生物活性肽。上述的制備方法，步驟(3)中將滅酶活的酶解液在4°C下以6000 g離心20分鐘，將 上清液經(jīng)超濾(取分子量小于3000道爾頓的組分)后，采用大孔樹脂NKA-II，收集10-20% (w/w)乙醇洗脫液，接著采用S^hadex (葡聚糖凝膠)G-25，流動相為去離子水，檢測波長 220nm，按吸收峰順序收集；經(jīng)S印hadex G-25分離得到的具有較強(qiáng)活性的組分再經(jīng)C18高效 液相色譜分離純化，分離條件為5_40%乙腈和95-60%去離子水梯度洗脫，檢測波長220nm， 按吸收峰順序收集。本發(fā)明還提供了由上述制備方法制得的具有促進(jìn)酸乳發(fā)酵和抑制酸乳后酸化的 酪蛋白活性單肽。上述酪蛋白活性單肽，通過液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜測定其分子量為801. 4道 爾頓，該活性單肽氨基酸序列如序列表中序列1所示。所述的酪蛋白活性單肽可應(yīng)用于酸乳發(fā)酵中，促進(jìn)酸奶發(fā)酵，抑制酸奶后酸化。本發(fā)明采用了以上技術(shù)方案，具有如下優(yōu)點(diǎn)和效果
1、本發(fā)明通過對酪蛋白酶解液的進(jìn)一步分離、純化得到了氨基酸序列為NPSKENL的 肽，該活性肽具有明顯縮短酸乳發(fā)酵時間和抑制酸乳后酸化作用。2、本發(fā)明分離純化所得的生物活性肽是從酪蛋白中分離得到的乳源性肽，可以安 全的添加的到酸乳中。


圖1為S印hadex G-25對酪蛋白酶解液的初步分離圖； 圖2為RP-HPLC對生物活性肽的分離純化圖3為實(shí)施方式中添加50ppm (w/w)生物活性單肽對酸乳發(fā)酵周期和空白對照對應(yīng)酸 乳發(fā)酵周期的影響曲線；
圖4為實(shí)施方式中添加50ppm (w/w)生物活性單肽對酸乳儲存期產(chǎn)酸的影響曲線和空 白對照對應(yīng)的影響曲線。圖5為實(shí)施方式中添加50ppm (w/w)的生物活性單肽對酸乳儲存期乳酸菌活菌數(shù) 的影響曲線和空白對照對應(yīng)的影響曲線。
具體實(shí)施方案下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明的具體實(shí)施作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1 利用酪蛋白酶解液生產(chǎn)具有顯著的促進(jìn)酸乳發(fā)酵和抑制酸乳后酸化的 生物活性單肽
1、可控酶解在50°C，PH 6. 0的條件下加入木瓜蛋白酶對酪蛋白進(jìn)行酶解，得酶解液。2、酶解液滅酶90°C加熱15min滅酶，終止酶解反應(yīng)。3、將滅酶活的酶解液離心(6000 χ g，4°C ) 20分鐘，將上清液經(jīng)超濾(取分子量小 于3000道爾頓的組分)后，采用大孔樹脂NKA-II，收集10% (w/w)乙醇洗脫液，接著
采用S印hadex G-25,流動相為去離子水，檢測波長220nm，按吸收峰順序收集，如圖1所示。 經(jīng)S印hadex G-25分離得到的具有較強(qiáng)活性的組分再經(jīng)C18高效液相色譜分離純化，分離條 件為5% (w/w)乙腈和95% (w/w)去離子水梯度洗脫，檢測波長220nm，按吸收峰順序收集， 如圖2所示。
實(shí)施例2 利用酪蛋白酶解液生產(chǎn)具有顯著的促進(jìn)酸乳發(fā)酵和抑制酸乳后酸化的生物 活性單肽
1、可控酶解在55°C，pH 7. 5的條件下加入木瓜蛋白酶對酪蛋白進(jìn)行酶解，得酶解液。2、酶解液滅酶95°C加熱20min滅酶，終止酶解反應(yīng)。3、將滅酶活的酶解液離心(6000 χ g，4°C ) 20分鐘，將上清液經(jīng)超濾(取分子量小 于3000道爾頓的組分)后，采用大孔樹脂NKA-II，收集20% (w/w)乙醇洗脫液，接著
采用Si^phadex G-25,流動相為去離子水，檢測波長220nm，按吸收峰順序收集，如圖1所示。 經(jīng)S^hadex G-25分離得到的具有較強(qiáng)活性的組分再經(jīng)C18高效液相色譜分離純化，分離條 件為40% (w/w)乙腈和60% (w/w)去離子水梯度洗脫，檢測波長220nm，按吸收峰順序收 集，如圖2所示。
實(shí)施例3 生物活性肽對酸乳發(fā)酵周期的影響
在酸乳發(fā)酵前添加50ppm (w/w)實(shí)施例1所得生物活性肽HAQQKE替換等蛋白的奶 粉，測定酸乳發(fā)酵周期，即TPH4.5，酸乳發(fā)酵到pH4. 5所需要的時間，單位為小時。如圖3所 示，添加NPSKENL后酸乳發(fā)酵周期縮短了 23. 00%。實(shí)施例3 生物活性肽對酸乳儲藏期的酸度變化的影響
測定按實(shí)施例2所發(fā)酵酸奶在28天儲藏期間的滴定酸度即潔尼爾度T°變化。試驗(yàn)方法用5ml吸管取攪拌均勻的發(fā)酵乳5ml，加入含25ml蒸餾水錐形瓶中，滴 入3 4滴1%酚酞指示劑，用0. INNaOH滴定至淺紅色，保持20s不退色。消耗NaOH溶液 的毫升數(shù)乘以20即為酸度T°。由圖4可見，添加NPSKENL后酸乳儲存28天后產(chǎn)酸量相對于空白樣減少了 24. 07%，這表明50ppm的NPSKENL可明顯抑制酸乳乳儲存過程中產(chǎn)酸，有助于保持酸乳產(chǎn)品 風(fēng)味，延長保質(zhì)期。實(shí)施例4 生物活性肽對酸乳儲藏期的乳酸菌活菌數(shù)變化的影響
測定按實(shí)施例2所發(fā)酵酸奶在28天儲藏期間的乳酸菌活菌數(shù)變化，采用試管法。試驗(yàn)方法在無菌操作條件下，將酸乳充分?jǐn)嚢杈鶆?，移?ml，加入含9ml稀釋 液試管內(nèi)，制成1 : 10的均勻稀釋液，并在渦流儀上充分混勻。再從后者中吸取Iml于9ml 稀釋液中，并依次做10倍遞增稀釋至10_6，ΙΟ"7兩個稀釋度。每個稀釋度吸取Iml于滅菌試 管培養(yǎng)基中，做兩個平行樣，在37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。圖5表明，添加NPSKENL后，酸乳在儲藏28天后乳酸菌活菌數(shù)是空白的2. 35倍， 結(jié)果表明生活活性肽NPSKENL能夠顯著促進(jìn)乳酸菌生長繁殖，提高酸乳品質(zhì)。
權(quán)利要求
一種酪蛋白活性單肽，該活性單肽氨基酸序列如序列表中序列1所示。
2.權(quán)利要求1所述一種酪蛋白活性單肽的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)在50°C 55°C，pH6. 0-7. 5的條件下加入木瓜蛋白酶對酪蛋白進(jìn)行酶解，得酶解液；(2)當(dāng)水解度達(dá)到9% 10%時，90 95°C加熱15 20min滅酶，終止酶解反應(yīng)以控 制生物活性肽的分子量；(3)將滅酶活的酶解液依次通過膜分離、大孔樹脂、凝膠色譜、反相高效液相進(jìn)行分離 純化，即得所述生物活性肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟(3)中將滅酶活的酶解液在4°C 下以6000 g離心20分鐘，將上清液經(jīng)超濾，取分子量小于3000道爾頓的組分，采用大孔樹 脂NKA-II，用10-20% (w/w)乙醇洗脫，收集洗脫液，接著采用Sephadex G-25，流動相為去 離子水，檢測波長220nm，按吸收峰順序收集；經(jīng)S印hadex G-25分離得到的具有較強(qiáng)活性 的組分再經(jīng)C18高效液相色譜分離純化，分離條件為5-40%乙腈和95-60%去離子水梯度洗 脫，檢測波長220nm，按吸收峰順序收集。
4.權(quán)利要求1所述的酪蛋白活性單肽應(yīng)用于酸乳發(fā)酵中，促進(jìn)酸奶發(fā)酵，抑制酸奶后 酸化。
全文摘要
本發(fā)明提供一種酪蛋白活性單肽及其制備方法與應(yīng)用，氨基酸序列為Asn-Pro-Ser-Lys-Glu-Asn-Leu。本發(fā)明應(yīng)用現(xiàn)代酶催化技術(shù)對酪蛋白進(jìn)行酶解，利用生物分子分離純化技術(shù)對具有促進(jìn)酸乳發(fā)酵和抑制酸乳后酸化活性較強(qiáng)的部分進(jìn)行分離純化，對純化得到的活性單肽進(jìn)行氨基酸序列分析。該活性肽具有明顯縮短酸乳發(fā)酵時間和抑制酸乳后酸化作用，可以安全的添加的到酸乳中，將該生物活性肽作為酸乳發(fā)酵添加劑提高酸乳產(chǎn)品質(zhì)量。
文檔編號A23C9/13GK101993476SQ201010277790
公開日2011年3月30日 申請日期2010年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月10日
發(fā)明者崔春, 張清麗, 趙海鋒, 趙謀明 申請人:華南理工大學(xué)