專利名稱：抗增殖的內(nèi)皮細(xì)胞的dna疫苗及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼可有效引發(fā)抗增殖的內(nèi)皮細(xì)胞的免疫應(yīng)答的適宜分子的脫氧核糖核酸(DNA)疫苗。具體涉及編碼血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)受體的DNA疫苗。本發(fā)明還涉及使用該DNA疫苗抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、腫瘤生長和血管發(fā)生的方法。
背景技術(shù)：
通過服用非常有限的預(yù)防性制劑，疫苗己用于對多種疾病提供長期的保護(hù)，所述的制劑可刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)在病原物增殖和引起病理反應(yīng)之前而破壞病原物。用疫苗來預(yù)防疾病和使用疫苗的各種方法已有描述(Bernard R.Glick and Jack J.Pasternak，MolecularBiotechnology，Principles and Applications of Recombinant DNA，Second Edition，ASM Press pp.253-276，1998)。
接種疫苗是誘導(dǎo)機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)在感染物引起病理反應(yīng)之前發(fā)現(xiàn)并破壞該感染物。典型的疫苗是活的，減毒的感染物(病毒或細(xì)菌)或已殺死的感染物。包括活的細(xì)菌或病毒的疫苗必須是非病原性的。典型的細(xì)菌或病毒培養(yǎng)物是通過物理或化學(xué)方式處理而減毒的。雖然這些感染物是非毒性的，但用所述疫苗對患者進(jìn)行處理后，它們?nèi)阅芤l(fā)免疫應(yīng)答。
抗原，如特異性的大分子或感染物可引發(fā)免疫應(yīng)答。這些抗原通常是蛋白質(zhì)、多糖、脂類或糖脂，它們作為“外源物”而被B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞所識(shí)別。將這兩種類型的淋巴細(xì)胞與一種抗原接觸，可迅速引發(fā)細(xì)胞間的識(shí)別反應(yīng)，結(jié)果在接觸部位形成多個(gè)淋巴細(xì)胞克隆。B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生漿細(xì)胞，后者又產(chǎn)生成為抗體(Ab)的蛋白，它可選擇性地與感染物中存在的抗原結(jié)合，從而中和或滅活病原物(體液免疫)。在有些情況下，B細(xì)胞應(yīng)答需要CD4輔助T細(xì)胞的輔助。
針對抗原應(yīng)答而形成的特異性的T細(xì)胞克隆是一種細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，它能夠與病原物和存在抗原的組織結(jié)合而除去病原物或組織(細(xì)胞介導(dǎo)或細(xì)胞免疫)。在有些情況下，抗原呈遞細(xì)胞(APC)，如樹突狀細(xì)胞將通過內(nèi)吞作用包裹病原物或其他外源細(xì)胞，該APC然后就從這些細(xì)胞中擁有了抗原，并將這些抗原以組織相容性分子肽復(fù)合體的形式呈遞給CTL上的T細(xì)胞受體(TCR)，從而刺激免疫應(yīng)答。
以形成特異性抗體為特征的體液免疫通常對急性細(xì)菌感染和病毒的反復(fù)感染有效，而細(xì)胞介導(dǎo)的免疫主要對病毒性感染、慢性細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌感染和真菌感染有效。細(xì)胞免疫也可抗癌和排斥器官移植。
針對抗原感染而產(chǎn)生的抗體在很長時(shí)間內(nèi)在血液中都可以檢測到，因而提供了一種在病原侵入前進(jìn)行檢測的可能性。在同一種病原再次侵入時(shí)，免疫系統(tǒng)可通過在該病原增殖和產(chǎn)生病理反應(yīng)之前除去病原物而抑制其再感染。
有時(shí)，與病原物具有相同抗原的非病原物也可以和病原物一樣引發(fā)同樣的免疫應(yīng)答。在這種情況下，患者在沒有受到先前的感染的情況下也可以抵抗該病原物的再感染。
但是，并不是所有的感染物都如疫苗形成所需那樣能夠培養(yǎng)和滅活。目前，重組DNA技術(shù)使得克服上述局限而尋找新的疫苗成為可能。可以將感染物改造為缺失病原基因，這樣，就可以將活的、非毒性形式的微生物作為疫苗。也可以將相對非病原性的微生物，如大腸桿菌設(shè)計(jì)為具有病原載體的細(xì)胞表面抗原的微生物。將這樣的轉(zhuǎn)基因載體施用給患者，患者的免疫系統(tǒng)就會(huì)形成針對這種病原物的抗體。將一種病原物的抗原性蛋白進(jìn)行遺傳改造，使其在非病原物中表達(dá)，分離和純化出的抗原性蛋白可作為“亞單位疫苗”。亞單位疫苗具有穩(wěn)定、安全、化學(xué)結(jié)構(gòu)確定的特點(diǎn)，但其成本較高。
近年來出現(xiàn)了產(chǎn)生疫苗的新方法，廣義地稱為基因免疫。該方法是將編碼病原物抗原的基因?qū)氲揭庖叩幕颊叩募?xì)胞中。被處理的細(xì)胞經(jīng)改造，可產(chǎn)生病原物的抗原性蛋白。體內(nèi)產(chǎn)生的抗原就可以在宿主內(nèi)引發(fā)所需的免疫應(yīng)答。在基因疫苗中使用的遺傳物質(zhì)可以是DNA或RNA構(gòu)建體。通常，將編碼抗原的多核苷酸與其它啟動(dòng)子核苷酸序列結(jié)合以增強(qiáng)基因的插入、復(fù)制或表達(dá)。
編碼抗原基因的DNA疫苗可通過各種表達(dá)系統(tǒng)導(dǎo)入到患者的宿主細(xì)胞中。這些表達(dá)系統(tǒng)包括原核、哺乳動(dòng)物和酵母表達(dá)系統(tǒng)。例如，一種方法是用病毒性載體，如導(dǎo)入了新的遺傳物質(zhì)的疫苗病毒來接種宿主細(xì)胞。另一種方法是將遺傳物質(zhì)導(dǎo)入到載體中或作為“裸”多核苷酸(如純化的DNA)直接導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中。此外，DNA可穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染到減毒的細(xì)菌，如鼠傷寒沙門氏桿菌中。如果患者用轉(zhuǎn)化的沙門氏桿菌口服免疫，則細(xì)菌就轉(zhuǎn)移到腸道的淋巴集結(jié)處(如次級(jí)淋巴組織)，然后刺激免疫應(yīng)答。
DNA疫苗提供了對非傳統(tǒng)的病原物所引起的疾病的免疫，如遺傳疾病和癌癥。對于遺傳癌癥疫苗，必須分離出針對腫瘤細(xì)胞特異類型的抗原，然后將其導(dǎo)入到疫苗中。要獲得一種可有效地抗多種癌癥的基因疫苗必需開發(fā)出多種能抗每種癌癥細(xì)胞的單個(gè)疫苗。
治療腫瘤的常規(guī)方法是給腫瘤患者服用抑制血管發(fā)生的化合物。血管發(fā)生是新的毛細(xì)管和血管發(fā)生的過程。血管發(fā)生在胚胎發(fā)育、組織生長、組織修復(fù)和組織再生中是非常重要的。除了這些正常的和必須的過程外，在許多異常的病理過程中也包含血管發(fā)生，如腫瘤生長、腫瘤轉(zhuǎn)移和眼部血管疾病，例如糖尿病性視網(wǎng)膜病。
血管發(fā)生涉及各種相互依賴的過程，包括(a)激活血管內(nèi)皮細(xì)胞；(b)通過內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)蛋白酶活性來分解細(xì)胞基質(zhì)蛋白；(c)將內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)移到可能生長的位點(diǎn)；(d)增殖內(nèi)皮細(xì)胞；(e)識(shí)別內(nèi)皮細(xì)胞而形成血管。上述的每一步驟都受到各種啟動(dòng)物質(zhì)的影響，如成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、血小板源生長因子(PDGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在內(nèi)皮細(xì)胞的生長和識(shí)別中起至關(guān)重要的作用。VEGF通過與內(nèi)皮細(xì)胞膜上的受體蛋白-酪氨酸激酶結(jié)合來啟動(dòng)刺激細(xì)胞生長的信號(hào)轉(zhuǎn)換級(jí)聯(lián)反應(yīng)。
抑制病理性的血管發(fā)生已作為一種腫瘤治療措施而提出來(Folkman et al.Science，221，719，1983)。該治療措施的出發(fā)點(diǎn)在于由于腫瘤需要血管生長，因此，通過服用抑制血管發(fā)生的組合物來抑制血管發(fā)生就可以通過切斷腫瘤的血液供應(yīng)來抑制腫瘤的生長。該方法的缺點(diǎn)在于，必須連續(xù)服用血管發(fā)生抑制劑來抑制腫瘤的生長，一旦停止供應(yīng)抑制劑，則腫瘤將恢復(fù)生長。有效抑制血管發(fā)生的疫苗將是一種有吸引力的抑制腫瘤形成的抑制劑。
通常，一種有效的疫苗可連續(xù)引發(fā)抗血管發(fā)生的免疫，該疫苗不必針對特異的腫瘤抗原也能抑制各種腫瘤的生長。本發(fā)明即滿足這種需要。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種能有效地抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的DNA疫苗，其包括可操作地編碼VEGF受體蛋白的DNA構(gòu)建體。所述DNA疫苗包括編碼VEGF受體蛋白的多核苷酸，所述的VEGF受體蛋白如VEGFR-2(KDR；SEQ ID NO2)，VEGFR-1(Flt-1；SEQ ID NO4)，和Flk-1(SEQID NO6，KDR的小鼠同系物)等，其DNA序列分別為SEQ ID NO1，SEQ ID NO3和SEQ ID NO5。該疫苗包含線性核酸，如純化的DNA構(gòu)建體，或整合到質(zhì)粒載體中的DNA構(gòu)建體。本發(fā)明的DNA疫苗能刺激CTL的形成，后者能抑制過量表達(dá)VEGFR-2的增殖的內(nèi)皮細(xì)胞。
內(nèi)皮細(xì)胞形成哺乳動(dòng)物血管組織的內(nèi)層。內(nèi)皮細(xì)胞的增殖是血管發(fā)生中的關(guān)鍵步驟。本發(fā)明的疫苗在用該疫苗處理的生物體內(nèi)提供了一種產(chǎn)生長期抑制血管發(fā)生的方法，所述方法是通過引發(fā)抗內(nèi)皮細(xì)胞增殖的免疫應(yīng)答來實(shí)現(xiàn)的。非增殖的內(nèi)皮細(xì)胞，如已形成血管的內(nèi)層，由于不具有大量VEGF受體抗原而基本上不受到對疫苗應(yīng)答而產(chǎn)生的CTL的影響。
本發(fā)明所涉及的方法的一個(gè)方面是，DNA疫苗在接受免疫的患者體內(nèi)可長期抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。一方面，包括編碼VEGF受體蛋白的多核苷酸構(gòu)建體的DNA疫苗經(jīng)口服給予需要抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的患者，所述疫苗的量足以引發(fā)抗增殖的內(nèi)皮細(xì)胞免疫應(yīng)答。
本發(fā)明也提供了一種用DNA疫苗免疫患者來抑制血管發(fā)生的方法。所述的方法包括將包括編碼VEGF受體蛋白的DNA構(gòu)建體的疫苗給予患有與血管發(fā)生相關(guān)疾病的患者，所述疫苗的量足以引發(fā)免疫應(yīng)答。
本發(fā)明還提供了另外一種方法，所述方法涉及用DNA疫苗免疫患者來抑制腫瘤生長。所述方法包括將編碼VEGF受體蛋白的DNA構(gòu)建體的疫苗給予患有腫瘤的患者，所述疫苗的量足以引發(fā)免疫應(yīng)答，免疫的結(jié)果導(dǎo)致腫瘤生長被抑制。患者的免疫系統(tǒng)破壞了內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，阻止了腫瘤的血管化，從根本上導(dǎo)致腫瘤“饑餓”而死亡。
本發(fā)明方法的另一方面涉及所述的DNA疫苗可經(jīng)腸道施用，如通過口服，或胃腸外，如通過注射或靜脈輸注。
本發(fā)明的疫苗可用于治療和防治多種疾病，如患有癌癥、糖尿病性視網(wǎng)膜病的患者可通過用本發(fā)明的疫苗進(jìn)行免疫而受益。
附圖簡述附

圖1描述了編碼人KDR的DNA序列，SEQ ID NO1；附圖2描述了人KDR的蛋白序列，SEQ ID NO2；附圖3描述了編碼人Flt-1的DNA序列，SEQ ID NO3；附圖4描述了人Flt-1的蛋白序列，SEQ ID NO4；附圖5描述了編碼小鼠Flk-1的DNA序列，SEQ ID NO5；附圖6描述了人Flk-1的蛋白序列，SEQ ID NO6；附圖7顯示了小鼠肺中腫瘤覆蓋的變化，從＞50％(標(biāo)注3)到＜10％(標(biāo)注1)；附圖8顯示了用本發(fā)明的DNA疫苗免疫的小鼠(黑粗實(shí)線)與兩組對照小鼠相比，經(jīng)靜脈注射CT-26結(jié)腸癌細(xì)胞后，其死亡率明顯降低(自然小鼠細(xì)實(shí)線；疫苗對照點(diǎn)劃線)；附圖9顯示用本發(fā)明的DNA疫苗免疫的小鼠中路易斯(Lewis)肺癌腫瘤的生長與兩組對照相比受到抑制。
附圖1 0顯示用本發(fā)明的DNA疫苗免疫的小鼠(●)中黑色素瘤腫瘤的生長與對照組(○)相比受到抑制。
附圖11顯示用本發(fā)明的DNA疫苗免疫的小鼠中CD25，CD69和CD2陽性CD8+T細(xì)胞與對照組相比得到提高。
發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案詳述本發(fā)明提供了一種能有效地抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的DNA疫苗，包括可操作地編碼血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)受體蛋白的DNA構(gòu)建體。術(shù)語“DNA構(gòu)建體”在這里是指一種能夠轉(zhuǎn)錄到靶細(xì)胞中的合成的DNA。該構(gòu)建體可以包括一種線性核酸，如純化的DNA，或整合到質(zhì)粒載體中的DNA。該DNA也可以整合到病毒或細(xì)菌載體中，優(yōu)選非病原性的減毒的病毒或細(xì)菌載體。適宜的DNA是能夠編碼VEGF受體蛋白的DNA，如VEGFR-2(KDR；SEQ ID NO2)，VEGFR-1(Flt-1；SEQ ID NO4)，F(xiàn)lk-1(SEQ ID NO6)等，其DNA序列分別為SEQ ID NO1，SEQ ID NO3和SEQ ID NO5。
目前已鑒定出5種VEGF亞型，包括VEGF-1(也稱為VEGF-A)、VEGF-2(也稱為VEGF-C)、VEGF-B、VEGF-D和VEGF-E(見Achen etal.的美國專利No.6,235,713及其引用的文獻(xiàn))。VEGF受體是內(nèi)皮細(xì)胞特異性的蛋白-酪氨酸激酶。已報(bào)道了幾種鑒定出的內(nèi)皮細(xì)胞特異性的酪氨酸激酶，包括Flt-1(VEGF受體1；BEGFR-1)、KDR(VEGFR-2)、Flk-1(KDR的小鼠同系物)、Flt-4(VEGFR-3)、Tie、Tie-2和Tek，其中幾種是VEGF受體。
本發(fā)明的DNA疫苗可刺激CTL的形成，CTL具有抗過量表達(dá)VEGFR-2的增殖內(nèi)皮細(xì)胞的活性。由于VEGF受體基本上只在增殖的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，因此，針對疫苗的應(yīng)答而產(chǎn)生的CTL基本上只在發(fā)生血管發(fā)生(如血管化)的組織中是有活性的。非增殖性的內(nèi)皮細(xì)胞，如已形成血管的內(nèi)層，基本上不存在VEGF受體抗原，因而不受疫苗所引發(fā)的CTL的影響。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，DNA疫苗包括編碼VEGF受體蛋白的多核苷酸。這種疫苗通過干預(yù)樹突狀細(xì)胞，直接或間接地能夠提高內(nèi)源T細(xì)胞的活性。
術(shù)語“免疫”在這里是指抗毒性感染物或腫瘤抗原的長期免疫保護(hù)。術(shù)語“免疫接種”是指預(yù)防性地接觸非毒性的病原物抗原，從而使被治療的患者產(chǎn)生對該病原物的免疫性。
本發(fā)明的DNA構(gòu)建體優(yōu)選包括可操作地與基因表達(dá)所需的調(diào)控元件相連的人編碼VEGF受體蛋白的核苷酸序列。
優(yōu)選使用的DNA構(gòu)建體包括核苷酸表達(dá)所必須的調(diào)控元件。這些調(diào)控元件包括啟動(dòng)子、起始密碼子、終止密碼子和多聚腺苷酸信號(hào)。此外，編碼免疫原性靶蛋白的序列的表達(dá)通常還要求有增強(qiáng)子存在。如現(xiàn)有技術(shù)中所述，這些調(diào)控元件可操作地與編碼目的蛋白的序列相連接。調(diào)控元件優(yōu)選地選自那些在其被施用的物種中是可操作的。
起始密碼子和終止密碼子優(yōu)選是編碼本發(fā)明的基因疫苗中的VEGF受體蛋白的核苷酸序列的一部分。起始密碼子和終止密碼子必須與編碼序列框一致。
本發(fā)明的疫苗中所包括的啟動(dòng)子和多聚腺苷酸信號(hào)優(yōu)選在被免疫的患者細(xì)胞中是有功能的。
本發(fā)明的疫苗中所使用的啟動(dòng)子，特別是在生產(chǎn)用于人的基因疫苗時(shí)，包括但并不局限于猿病毒40(SV 40)啟動(dòng)子、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動(dòng)子、人免疫缺陷病毒(如HIV)長末端重復(fù)序列(LTR)啟動(dòng)子、莫洛尼氏病毒啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒(CMV)，如CMV立即早期啟動(dòng)子、愛潑斯坦巴爾病毒(EBV)病毒啟動(dòng)子、勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子和來自人基因的啟動(dòng)子，如人肌動(dòng)蛋白、人肌漿球蛋白、人血色素、人肌酸和人金屬硫蛋白。
本發(fā)明的疫苗中所使用的多聚腺苷酸信號(hào)，特別是在生產(chǎn)用于人的基因疫苗時(shí)，包括但并不局限于SV 40多聚腺苷酸信號(hào)和LTR多聚腺苷酸信號(hào)。
除了DNA表達(dá)所需的調(diào)控元件外，還包括DNA分子中的其它序列，如增強(qiáng)子。增強(qiáng)子可以是人肌動(dòng)蛋白、人肌漿球蛋白、人血色素、人肌酸和病毒增強(qiáng)子，如來自CMV、RSV和EBV病毒的增強(qiáng)子。
調(diào)控元件和密碼子通常是與種屬相關(guān)的，為了最大量地生產(chǎn)蛋白，調(diào)控元件和密碼子優(yōu)選在被免疫的種屬中是有效的。制備出在目的種屬中有功能的DNA構(gòu)建體是本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)技術(shù)。
本發(fā)明的疫苗中的DNA構(gòu)建體可以是“裸”DNA(參見Restifo etal.Gene Therapy 7，89-92，2000及其引用文獻(xiàn))。另一方面，DNA也可以整合到載體中?？墒褂玫妮d體包括生物能分解的微膠囊、免疫刺激復(fù)合體(ISCOMs)或脂質(zhì)體、和經(jīng)遺傳改造的減毒的活載體，如病毒或細(xì)菌。
適宜的減毒的活細(xì)菌載體包括鼠傷寒沙門氏桿菌、傷寒沙門氏桿菌、志賀氏菌、芽孢桿菌、乳桿菌、卡介苗、大腸桿菌、霍亂弧菌、彎曲菌或本領(lǐng)域已知的任何細(xì)菌載體。用外源DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化活細(xì)菌載體的方法是現(xiàn)有技術(shù)中已知的(Joseph Sambrook and David W.Russell，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，3rd Ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，2001)。
優(yōu)選的病毒載體包括噬菌體、皰疹病毒、腺病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、牛痘病毒和Avipox。用外源DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化病毒載體的方法是現(xiàn)有技術(shù)中已知的(見上述Sambrook and Russell)。
脂質(zhì)體載體是單層或多層囊泡，具有由親脂性的物質(zhì)所形成的膜部分和內(nèi)部的水相部分。在本發(fā)明中，脂質(zhì)體的水相部分包含有要轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞中的多核苷酸。通常，優(yōu)選脂質(zhì)體形成物質(zhì)具有一個(gè)陽離子基團(tuán)，如四元銨基團(tuán)，和一個(gè)或多個(gè)親脂性基團(tuán)，如飽和的或非飽和的，具有大約6-30個(gè)碳原子的烷基。
發(fā)明者R·A·賴斯費(fèi)爾德, A·G·尼塔默, R·向 申請人:斯克里普斯研究學(xué)院