運載新城疫病毒的禽疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明包括經(jīng)加工的新城疫病毒（NDV）疫苗或組合物。疫苗或組合物可為重組疫苗。本發(fā)明也包括編碼及表達禽病原體抗原，更特別禽流感蛋白，表位或免疫原的重組載體。該疫苗或組合物可用于保護動物，尤其是禽，免于疾病。
【專利說明】運載新城疫病毒的禽疫苗
[0001]本申請是分案申請，母案的申請?zhí)枮?01080022159.3 (國際申請?zhí)朠CT/US2010/029825)，申請日為2010年4月2日，發(fā)明名稱為“運載新城疫病毒的禽疫苗”。
[0002]【援引加入】
[0003]本申請要求2009年4月3日提交的US臨時申請系列N0.61/166，481的權(quán)利。【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0004]本發(fā)明包括運載NDV的禽疫苗或組合物,尤其是禽流感疫苗。疫苗可為經(jīng)加工的禽疫苗。
【【背景技術(shù)】】
[0005]近年的幾項研究點燃了新城疫病毒(NDV)用作禽疾病的疫苗載體的潛力(Krishnamurthy et al.,Virology278, 168-182, 2000;Huang et al.,J.Gen.Virol.82，1729-1736，2001;Nakaya et al.,J.Virol.75，11868-11873，2001;Parket al.PNAS103,8203-8208,2006;Veits et al PNAS103,8197-8202，2006;Geet a 1.j.Virol.81，150-158，2 0 0 7； Romer-Oberdorfer e tal.Vaccine26, 2307-2313，2008)。
[0006]NDV屬于副粘病毒亞科(Paramyxovirinae)和禽副粘病毒屬(Avulavirus)。NDV在呼吸和消化道中，在輸卵管中，及對于一些分離物，在神經(jīng)系統(tǒng)中復制。傳播是產(chǎn)氣的，且通過口及糞便途徑。NDV導致高度接觸傳染及致死的疾病，其影響全部物種的鳥，及可感染一些哺乳動物種。疾病可從臨床不明顯變化到高度強毒形式，依賴于病毒株和宿主物種。由NDV株顯示的毒力的連續(xù)譜致使將它們分為3種不同致病型組:緩發(fā)型，中發(fā)型及速發(fā)型(Alexander, D.J.，Diseases of Poultry, 1wa State Un1.Press, AmesIA，541-569，1997)。緩發(fā)型株通常不在成年雞中導致疾病，且在美國和其他國家在家禽工業(yè)中作為活疫苗廣泛使用。中間毒力的病毒稱之為中發(fā)型，而導致高死亡率的病毒稱之為速發(fā)型。疾病具有世界性分布，且對商業(yè)家禽生產(chǎn)保持恒定的主要威脅。
[0007]NDV基因組是約15kb的RNA的非-分段的陰性鏈。基因組RNA含有編碼依序以下蛋白的6個基因:核殼蛋白(NP)，磷蛋白(P)，基質(zhì)蛋白(M)，融合蛋白(F)，血細胞凝集素-神經(jīng)酰胺酶(HN)和大聚合酶蛋白(L)15P基因轉(zhuǎn)錄期間通過RNA編輯產(chǎn)生未知的功能的2種額外的蛋白，V 和 W (Steward et al., 1993, Journal of General Virology74:2539-2547)。
[0008]近年建立了自克隆的cDNA完全恢復非-分段的陰性RNA病毒的方法的開發(fā)，開啟了遺傳操作此病毒組，包括NDV的可能性(Conzelmann, K.K., Ann.Rev.Genet.32，123-162，1998; Roberts and Rose, Virology247, 1-6, 1998)。此獨特分子遺傳方法，稱之為“反向遺傳學”，提供不僅研究各種病毒-編碼的基因的功能的手段(Paleseet al., PNAS93, 11354-11358，1996;Nagai, Y., Rev.Med.Virol.9, 83-99, 1999)，而且允許使用這些病毒來表達異源基因(Bukreyev et al., J.Virol.70, 6634-6641, 1996;Mebatsion et al.,PNAS93, 7310-7314，1996;Schnell et al., PNAS93, 11359-11365, 1996;Hasan etal., J.Gen.Virol.78, 2813-2820, 1997;He et al., Virology237, 249-260, 1997;Sakai etal.，F(xiàn)EBS Lett.45，221-226，1999)。此提供產(chǎn)生改善的疫苗和疫苗載體的新方法。
[0009]2個獨立小組在1999年同時報道了基于NDV的緩發(fā)型疫苗株(LaSota)自克隆的cDNA 恢復系統(tǒng)(Peeters et al., 1999; Romer-Oberdorfer et al.，1999)。在第 I 報道的系統(tǒng)中，將自LaSota株(ATCC-VR699)的全長NDV cDNA組裝進含有T7DNA-依賴性-RNA聚合酶啟動子的P0LTV5轉(zhuǎn)錄載體。將NDV轉(zhuǎn)錄酶復合物的個體克隆(NP，P和L)在真核表達載體中克隆。共轉(zhuǎn)染流程在感染的單層細胞中產(chǎn)生了幾個感染中心(Peeters et al.，J.Virol.73，5001-5009, 1999)。第2系統(tǒng)報道了自克隆的cDNA的緩發(fā)型NDV的恢復，基本上使用組裝全長反基因鏈表達質(zhì)粒及支持質(zhì)粒的相同的策略(Romer-Oberdorfer etal., Journal of General Virology, 80, 2987 - 2995,1999)。最近開發(fā)其他系統(tǒng)來恢復NDV 的緩發(fā)型 Hitchner BI (Nakaya 等人，2001)或 LaSota 株(Huang 等人，2001 )?？蓪τ谥亟M體中發(fā)型NDV的恢復有用的系統(tǒng)僅被Krishnamurthy等人描述(2000)。此系統(tǒng)利用痘苗病毒重組(MVA)和用于轉(zhuǎn)染的HEP-2細胞。使用中發(fā)型株Beaudette C的全長克隆和自相同的株的支持質(zhì)粒(N，P和L)用于轉(zhuǎn)染。將編碼CAT報告子基因的額外的轉(zhuǎn)錄單元放置在HN和L基因之間。表達CAT基因的rNDV的生長延遲及病毒衰減。CAT報告子基因在細胞培養(yǎng)中穩(wěn)定地表達幾代。
[0010]禽流感(AIV)，有時稱之為禽流感(Avian flu)，且通常認識為鳥流感，指由適應(yīng)于鳥的流感病毒導致的流感。AIV是分段的，單-鏈，負義RNA病毒，屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae),及分類為A型流感病毒。A型病毒是動物和人流感的最頻繁的病原。此類型在主要基于2種表面脂質(zhì)-包裹的膜蛋白，血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)分化的許多株或亞型中發(fā)生。HA,輔助病毒進入宿主細胞，及NA輔助后代病毒從感染的細胞釋放(deJong et al., J Clin Virol.35 (I): 2-13，2006)。A 型病毒流感基于它們的特定 HA 和 NA 含量分為亞型。有16種不同HA亞型，及9種不同NA亞型。許多不同HA和NA蛋白的組合是可能的。流感A病毒亞型根 據(jù)它們的HA和NA表面蛋白命名。例如，“H7N2病毒”指具有H7亞型的HA蛋白和自N2亞型的NA蛋白的流感A亞型。類似地，“H5N1 ”病毒具有H5亞型的HA和自NI亞型的NA。H5N1亞型特別相關(guān)于新近在亞洲，俄羅斯，中東，歐洲和非洲的暴發(fā)(Olsen et al.，Science21;312(5772):384-8，2006)。
[0011]流感A病毒可感染人，豬，馬，海豹，鯨，家禽，貓，狗，雪貂及其他動物，但野生鳥是它們的天然的宿主。水生鳥構(gòu)成主要流感攜帶者，由此病毒系進化及適應(yīng)它們的宿主，例如，人，豬及馬流感。宿主特異性不是絕對的，且物種間傳播可發(fā)生，如通過高度病原性禽流感(HPAI) H5N1亞型感染人，貓，狗和豬物種的能力例證。
[0012]高度病原性流感A病毒亞型H5N1病毒是全球關(guān)心的作為潛在流行病威脅的新出現(xiàn)的禽流感病毒。H5N1已經(jīng)在越來越多的貫穿亞洲，歐洲和非洲的國家殺了幾百萬家禽。不像B型流感，A型流感經(jīng)歷抗原位移(至少2種不同株的病毒組合而形成新亞型)，且流行病學家，感染性疾病研究者，及其他健康專家急切關(guān)注，人流感病毒和禽流感病毒(尤其H5N1)的共-存在可提供遺傳物質(zhì)在物種-特異性病毒之間交換的機會，可能創(chuàng)建容易傳染和對人致死的新強毒流感株(Food Safety Research Information Office.〃A Focus on AvianInfluenza".Created May2006, Updated November2007)o
[0013]由于在1997年發(fā)生首次H5N1暴發(fā)，已有越來越多的HPAI H5N1鳥-至-人傳播導致臨床嚴重的和致死的人感染。但是，因為有鳥和人之間存在的顯著物種屏障，病毒不容易跨到人。盡管自其被發(fā)現(xiàn)，幾百萬的鳥已被所述病毒感染，在印度尼西亞，老撾，越南，羅馬尼亞，中國，土耳其和俄羅斯總共僅約200人死于禽流感。
[0014]考慮到動物，包括人對AIV的的感受性，防止AIV感染及保護動物的手段是必要的。因此，有對抵抗流感的有效疫苗的需求。
[0015]本申請中任何文獻的引用或鑒定不是認可該文獻可作為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
[0016]【發(fā)明概述】
[0017]本發(fā)明部分基于 申請人:的發(fā)現(xiàn)，由新城疫病毒(NDV)的向腸AVINEW?;株表達的AIV血凝素基因在禽中是高度免疫原性的。
[0018]本發(fā)明涉及運載NDV的禽疫苗或組合物，其可包含有效量的具有固有腸向性的經(jīng)加工的NDV載體，其包含及表達某些禽抗原，更特別禽流感抗原，及藥學或獸醫(yī)學可接受的
載體，賦形劑或媒質(zhì)。向腸NDV可為由Merial Limited商業(yè)化的AVINEW?'修飾的活
疫苗的NDV株。
[0019]禽流感抗原可為血凝素。禽流感HA抗原可為自H5亞型的HA。
[0020]本發(fā)明也涉及免疫接種禽的方法，包括給禽施用有效量的疫苗，其可包含有效量的重組NDV載體和藥學或獸醫(yī)學可接受的載體，賦形劑或媒質(zhì)。施用可通過卵內(nèi)，眼滴，噴霧，飲用水或腸胃外(皮下，肌內(nèi)，經(jīng)皮)施用。
[0021]本發(fā)明涉及修飾Avinew NDV的基因組來產(chǎn)生經(jīng)加工的Avinew NDV的方法,其中方法包括在Avinew NDV基因組的非必要區(qū)內(nèi)將分離的多核苷酸導入Avinew NDV基因組。非必要區(qū)可為編碼非必要蛋白的開放閱讀框或開放閱讀框的非-必要的部分；或位于NP基因上游的非翻譯(或非-編碼)區(qū)，或2個基因(基因間區(qū))之間，或自Avinew NDV基因組的L基因的下游。
[0022]本發(fā)明還涉及使用初施-追施流程施用疫苗或組合物。本發(fā)明涉及在施用可包含有效量的經(jīng)加工的NDV載體和藥學或獸醫(yī)學可接受的載體，賦形劑或媒質(zhì)的本發(fā)明的疫苗之前，用禽流感疫苗初施禽?；蛘撸景l(fā)明還涉及在施用禽流感疫苗之前，用本發(fā)明的疫苗(表達至少一種禽流感抗原的經(jīng)加工的NDV載體和藥學或獸醫(yī)學可接受的載體)初施。
[0023]本發(fā)明還包括實施引發(fā)或誘導免疫應(yīng)答的方法的試劑盒，其可包含:任何一種重組流感免疫學組合物或疫苗，或滅活的免疫學組合物或疫苗，及用于實施方法的使用說明。
[0024]因此，本發(fā)明的目的是不在本發(fā)明之內(nèi)包括任何之前知道的產(chǎn)品，制造產(chǎn)品的方法，或使用產(chǎn)品的方法，以至于 申請人:保留權(quán)益及由此公開放棄任何之前知道的產(chǎn)品，處理或方法。還應(yīng)注意，本發(fā)明不旨在在本發(fā)明的范圍之內(nèi)包括不符合書面描述及啟動USPTO(35U.S.C.§ 112，第I段落)或EPO (EPC的第83條)要求的任何產(chǎn)品，處理或產(chǎn)品的制造或使用產(chǎn)品的方法，以至于 申請人:保留權(quán)益及由此公開放棄任何之前描述的產(chǎn)品，制造產(chǎn)品的方法，或使用產(chǎn)品的方法。
[0025]這些和其他實施方式被以下詳述公開或顯而易見和含蓋。
【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0026]以下詳述，通過例的方式給出，但不旨在單獨限制本發(fā)明到描述的特定實施方式，可通過附圖最好理解，其中:
[0027]圖1A描繪全長NDV基因組的遺傳圖譜；圖1B描繪顯示有流感HA插入到2個代表性轉(zhuǎn)基因插入位點到全長NDV基因組的2種經(jīng)加工的NDV的遺傳圖譜的圖譜；圖1C是NDV反向遺傳學系統(tǒng)的流程圖的例；
[0028]圖2描繪將AVINEW全基因組克隆到用于反向遺傳學開發(fā)的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和允許容易轉(zhuǎn)基因克隆的獨特限制性位點(PacI&Fsel)插入到P和M基因之間的示意圖。
[0029]圖3描繪質(zhì)粒pIV029的質(zhì)粒圖譜。
[0030]圖4a~4ο提供質(zhì)粒pIV0291的插入子序列。斜體字指非A VINE W?序列,
及加下劃線的斜體字指P和M基因之間的內(nèi)部Pac1-FseI插入，斜體字指HDV核酶(3’端)及加下劃線的斜體字指T7啟動子(5’端)和終止子(3’端)。在圖譜中指出轉(zhuǎn)錄開始序列(GS=基因開始)和轉(zhuǎn)錄終止序列(GE=基因結(jié)束)，及給序列加了下劃線。環(huán)繞的T (圖4c中
的第3190位)指環(huán)繞的核苷酸(在Pac1-FseI插入之前):這是組裝的AV丨NE\￥?,基因
組進轉(zhuǎn)錄載體的T (SEQ ID NO:24的第3190位)(T來自用于創(chuàng)建PacI和FseI限制性位
點的引物)。在共有A VINE 基因組(SEQ ID NO:1)中，在對應(yīng)第3150位的核苷酸是
C0
[0031]圖5描繪質(zhì)粒pI V32的質(zhì)粒圖譜。
[0032]圖6描繪質(zhì)粒pIV33的質(zhì)粒圖譜。
[0033]圖7描繪質(zhì)粒pIV034的質(zhì)粒圖譜。
[0034]圖8描繪質(zhì)粒pNS151的質(zhì)粒圖譜。
[0035]圖9描繪將AIV HA基因經(jīng)NDV插入盒導入NDV基因組的示意方法。
[0036]圖10描繪質(zhì)粒pIV039的質(zhì)粒圖譜。
[0037]圖1IA和IlB描繪由經(jīng)加工的NDV vAVW02的HA表達。將不含有插入子的vAVWOl用作陰性對照。通過病毒-接種的含胚的蛋的尿囊液中(圖1lA中的左圖)或自感染的CHO細胞裂解物(圖1lA的右圖)的蛋白印跡或通過感染的CHO細胞中的免疫熒光(圖11B)使用對感染的CHO細胞的抗-H5陽性雞血清檢測HA表達。
[0038]圖12顯示分配給DNA和蛋白序列的SEQ ID NO的表。
[0039]圖13描繪免疫接種的SPF層的不同組的一日齡雞后代中的抗-NDV和抗-Al (針對H5N1C12或H5N9LP抗原)母源的抗體(MDA) HI滴度。
[0040]圖14描繪評估SPF雞中由經(jīng)加工的NDV誘導的禽流感保護的疫苗接種/攻擊時間線及流程。
[0041]圖15顯示在日齡用vAVWOl (vOl或01;無插入的基因)或vAVW03 (v03或03;AIHA插入子)免疫接種的無MDA (SPF)或NDV MDA (21A)，或NDV和H5MDA或H5僅MDA (21B)雞的死亡率的動力學表。
[0042]圖16描繪自用vAVWOl或vAVW03免疫接種的無(SPF)或有MDA的雞中的口(&C)和泄殖腔(B&D)拭子的AIV脫落的比較。C和D中的結(jié)果表示為在不同時間點攻擊之后，vAVWOl-免疫的雞的HPAI H5N1攻擊脫落和vAVW03_免疫的雞的那些的平均水平之間的以1glO的比。
[0043]圖17描繪疫苗接種(D21)之后和攻擊(D35)之后對vAVW03_誘導的AIV HI滴度(使用 H5N9 (A)或 H5N1 分化體 2.2 (B)抗原)的 NDV MDA 效應(yīng)(SPF --無 MDA; NDV:抗-NDVMDA)。書寫在圖上的編號對應(yīng)于測試的陽性血清/總和的編號。在NDV MDA存在下，相比無NDV MDA的SPF雞中的結(jié)果，AIV HI滴度在疫苗接種之后更高且在攻擊之后不增加。
[0044]圖 18 描繪在無 MDA (SPF)jAI H5N9 和 NDV MDA (H5N9+NDV), NDV MDA (NDV)或 AlH5N1 (H5NDMDA ；NDV MDA 的雞中用 vAVWOl 或 vAVW03 疫苗接種后(在 D0)D21NDV HI 滴度對由vAVWOl或vAVW03誘導的NDV HI滴度水平不具有負面效應(yīng)。
[0045]圖19 描繪在 DO 和 D21 用 AVINEW(Gl)，vAVW02 (G2)和 vAVW03 (G3) 2 次疫苗接種后的NDV HI滴度。
[0046]圖20描繪在DO和D21用vAVW02 (G2)或vAVW03 (G3) 2次疫苗接種后的Al H5N1HI滴度。
[0047]圖21描繪在DO和D21用vAVW02 (G2)或vAVW03 (G3) 2次疫苗接種后的Al H5N1SN滴度。
[0048]圖22A和22B分別描繪通過vAVW03的I次(在DO)或2次(在DO和D14)眼滴劑施用誘導的NDV HI滴度和AIV SN滴度。
[0049]圖23A~23D描繪自未疫苗接種的(組I)或免疫接種的(組2:在D0，I次施用vAVW03;組 3:在 DO 和 D142 次施用 vAVW03;組 4:在 DO 用 vFP89 和在 D14 用 vAVW03 初施-追施)在第28天用HPAI H5N1分離物攻擊的俄國小鴨的口咽(A和C)和泄殖腔(B和D)拭子中的病毒載量(A和B)及陽性樣品的百分率(C和D)的動力學。
[0050]圖24A~24D描繪自未疫苗接種的(組I)或免疫接種的(組2:1次施用vAVW03在DO;組3:2次施用vAVW03在DO和D14;組4:在DO用vFP89和在D14用vAVW03初施-追施)在第42天用HPAI H5N1分離物攻擊的俄國小鴨的口咽(A和C)和泄殖腔(B和D)拭子中的病毒載量(A和B)及陽性樣品的百分率(C和D)的動力學。
[0051]圖25提供在氨基酸水平禽流感HA蛋白和序列同一性百分率之間的序列比對。
[0052]圖26提供在核酸水平禽流感HA蛋白和序列同一性百分率之間的序列比對。
[0053]【發(fā)明詳述】
[0054]需知，在此公開中和特別在權(quán)利要求和/或段落中，術(shù)語例如“包括(comprises)”, “包括(comprised)”, “包括(comprising)”等可具有美國專利法中規(guī)定的含義；例如，它們可表示“包括(includes)”，“包括(included)”，“包括(including)”，等；及that術(shù)語例如“基本上由…組成(consisting essentially of)”和“基本上由…組成(consists essentially of )”具有美國專利法中規(guī)定的含義，例如,它們允許因素不明確地敘述，但排除見于現(xiàn)有技術(shù)或影響本發(fā)明的基本或新特征的因素。
[0055]除非另外解釋，本文所用的全部技術(shù)和科學術(shù)語與本公開所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的具有相同的含義。除非背景明顯另外指示，單數(shù)術(shù)語“a”，“an”和“the”包括復數(shù)個指示物。類似地，詞匯“或”旨在包括“及”，除非背景明顯另外指示。
[0056]在本發(fā)明中，將AVINEW疫苗株用作載體。AVINEff是世界上廣泛使用的活NDV疫苗(Merial Limited)。此疫苗株①天然地無毒力及呈現(xiàn)雙呼吸和腸向性。此外，AVINEW株屬于可感染鴨的NDV基因組(II類，基因型I)。相比LaSota(其向性基本上針對呼吸道)，其不誘導呼吸性副反應(yīng)。
[0057]本發(fā)明涉及可包含有效量的經(jīng)加工的NDV載體和藥學或獸醫(yī)學可接受的載體，賦形劑或媒質(zhì)的禽疫苗。
[0058]本發(fā)明包括任何表達在動物，例如禽中引發(fā)免疫原性應(yīng)答的蛋白，多肽，抗原，表位或免疫原的經(jīng)加工的NDV載體。蛋白，多肽，抗原，表位或免疫原可為流感蛋白，多肽，抗原，表位或免疫原，例如但不限于在動物，例如禽中引發(fā)，誘導或刺激應(yīng)答的蛋白，多肽，肽或其片段。
[0059]說道“動物”期望是哺乳動物，鳥，等。動物或宿主包括哺乳動物和人。動物可選自馬(例如，馬)，狗(例如、狗、狼、狐、山狗、財)，貓(例如，獅、虎、家養(yǎng)貓、野生貓、其他大貓、及其他貓包括獵豹和山貓),綿羊(例如,綿羊),牛(例如,牛),豬(例如,豬),禽(例如,雞、鴨、鵝、火雞、鵪鶉、雉雞、鸚鵡、雀、鷹、烏鴉、鴕鳥、鴯鹋和鶴鴕)，靈長類動物(例如，狐猴、跗猴、猴、長臂猿、猿)和魚。術(shù)語“動物”也包括在全部發(fā)育階段，包括胚胎和胚胎階段的個體動物。
[0060]在一實施方式中，禽流感免疫學組合物或疫苗包含經(jīng)加工的載體和藥學或獸醫(yī)學可接受的賦形劑，載體或媒質(zhì)。經(jīng)加工的載體可為可包含編碼流感蛋白，多肽，抗原，表位或免疫原的多核苷酸的NDV表達載體。流感蛋白，多肽，抗原，表位或免疫原，可為血凝素，基質(zhì)蛋白，神經(jīng)氨酸酶，非結(jié)構(gòu)性蛋白，核蛋白，聚合酶或其任何片段。
[0061]在另一實施方式中，流感蛋白，多肽，抗原，表位或免疫原可源于經(jīng)流感或禽流感株感染的禽。禽流感蛋白，抗原，表位或免疫原可為血凝素(HA)例如但不限于HA前體，H1，H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15 或 H16 蛋白，基質(zhì)蛋白(例如但不限于基質(zhì)蛋白Ml或M2)，神經(jīng)氨酸酶(例如但不限于ΝΑΙ, NA2, NA3, NA4, NA5, NA6, NA7, NA8或NA9)，非結(jié)構(gòu)性(NS)蛋白(例如但不限于NSl或NS2)，核蛋白(NP)和聚合酶(例如但不限于PA聚合酶，PBl聚合酶I或PB2聚合酶2)。
[0062]禽流感抗原可為血凝素，例如H5HA。在一實施方式中，H5分離自H5N1A/火雞/土耳其/1/2005 (分化體2 .2)，A/雞/印度尼西亞/7/2003 (分化體2.1), A/鴨/老撾/3295/2006 (分化體 2.3)，A/ 雞 / 西爪哇 /PWT-WIJ/2006 (分化體 2.1)株。
[0063]在另一實施方式中，禽流感蛋白，多肽，抗原，表位或免疫原可源于經(jīng)源自任何亞型的新近分離物的流感或禽流感株感染的禽。
[0064]本文使用的術(shù)語“抗原”或“免疫原”是指在宿主動物中誘導特定免疫應(yīng)答的物質(zhì)?？乖砂瑲⑺赖?，衰減的或活的全生物；生物的亞單位或部分；含有表達有免疫原性性質(zhì)的表位，多肽，肽，蛋白或其片段的插入子的重組載體；呈遞給宿主動物后能誘導免疫應(yīng)答的核酸的碎片或片段；蛋白，多肽，肽，表位，半抗原，或其任何組合?；蛘?，免疫原或抗原可包含毒素或抗毒素。
[0065]本文使用的術(shù)語“免疫原性蛋白或肽”也包括免疫學活躍的肽和多肽，意為一旦施用到宿主，其能引發(fā)針對蛋白的體液和/或細胞類型的免疫應(yīng)答。優(yōu)選蛋白片段為其與總蛋白具有基本上相同的免疫學活性。由此，根據(jù)本發(fā)明的蛋白片段包含至少一個表位或抗原決定簇，或基本上由其組成或由其組成。術(shù)語表位，也稱為抗原決定簇，是被免疫系統(tǒng)識別的及能誘導體液類型(B細胞)和/或細胞類型(T細胞)的免疫反應(yīng)的大分子的部分。
[0066]術(shù)語“免疫原性蛋白或肽”還涵蓋序列的缺失，添加和置換，只要多肽如本文定義發(fā)揮產(chǎn)生免疫學應(yīng)答的功能。在這點上，特別優(yōu)選的置換會通常是性質(zhì)上保守的，即，在氨基酸家族內(nèi)發(fā)生的那些置換。例如，氨基酸通常分為的4個家族:(I)酸性一天冬氨酸和谷氨酸；(2)堿性一賴氨酸，精氨酸，組氨酸；(3)非-極性一丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸；及(4)不帶電的極性一甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，胱氨酸，絲氨酸蘇氨酸，酪氨酸。苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸有時分類為芳族氨基酸。可合理預(yù)測，用異亮氨酸或纈氨酸單獨取代亮氨酸，或反之；用谷氨酸單獨取代天冬氨酸或反之；用絲氨酸單獨取代蘇氨酸或反之；或用結(jié)構(gòu)上相關(guān)的氨基酸的氨基酸的類似保守性取代，不會對生物學活性具有主要效應(yīng)。因此，與參照分子具有基本上相同的氨基酸序列但具有基本上不影響蛋白的免疫原性的少數(shù)氨基酸置換的蛋白在參照多肽的定義內(nèi)。
[0067]術(shù)語表位是被免疫系統(tǒng)識別的及能誘導體液類型(B細胞)和/或細胞類型(T細胞)的免疫反應(yīng)的大分子的部分。該術(shù)語也與"抗原決定簇"或"抗原決定簇位點"互換使用。認識相同的表位的抗體可在顯示一種抗體阻斷另一抗體與靶抗原的結(jié)合的能力的簡單免疫測定中鑒定。
[0068]對組合物或疫苗的〃免疫學應(yīng)答〃是在宿主中發(fā)展的對目標組合物或疫苗的細胞和/或抗體-介導的免疫應(yīng)答。通常，〃免疫學應(yīng)答〃包括但不限于一種或更多以下效應(yīng):特別針對包括在目標組合物或疫苗中的抗原的抗體，B細胞,輔助性T細胞,和/或細胞毒性T細胞的產(chǎn)生。優(yōu)選地，宿主會展示治療性或保護性免疫學應(yīng)答，以至于對新感染的抗性會增強和/或疾病的臨床嚴重性減小。該保護會展示為:由感染的宿主正常顯示的癥狀的減小或缺乏，更快恢復時間和/或感染的宿主中降低的病毒滴度。
[0069]本文使用的術(shù)語"免疫原性"蛋白或多肽也指引發(fā)以上描述的免疫學應(yīng)答的氨基酸序列。本文使用的"免疫原性"蛋白或多肽包括蛋白的全長序列，其類似物，或其免疫原性片段。說道〃免疫原性片段〃是指包括一種或更多表位，由此引發(fā)上述免疫學應(yīng)答的蛋白的片段。該片段可使用本領(lǐng)域熟知的任意數(shù)的表位標位技術(shù)鑒定。見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,Vol.66(GlennE.Morris，Ed.，1996)。例如，線性表位可如下測定，例如，在固體支持物上同時合成大量肽，對應(yīng)蛋白分子的部分的肽，及使肽與抗體反應(yīng)而肽仍附接到支持物。該技術(shù)本領(lǐng)域已知及描述于，例如，U.S.專利 N0.4, 708, 871 ；Geysen等人，1984 ；Geysen等人，1986,全部通過引用整體并入本文。類似地，通過測定氨基酸的空間構(gòu)象，例如通過，例如，X-射線晶體學和2維核磁共振容易鑒定構(gòu)象表位。見,例如,Epitope Mapping Protocols,見上。尤其可應(yīng)用于小泰勒蟲(T.parva)蛋白的方法完全描述于PCT申請系列No。PCT/US2004/022605，通過引用整體并入本文。
[0070]合成抗原也包括在定義內(nèi)，例如，多表位，側(cè)接表位，及其他重組體或合成來源的抗原。見，例如，Bergmann 等人，1993 ;Bergmann 等人，1996 ；Suhrbier, 1997 ;Gardner 等人，1998。免疫原性片段，為本發(fā)明的目的，會通常包括分子的至少約3個氨基酸，優(yōu)選至少約5個氨基酸，更優(yōu)選至少約10~15個氨基酸，及最優(yōu)選約15~25個氨基酸或更多氨基酸。片段長度無關(guān)鍵上限，其可包含蛋白序列的幾乎全長，或甚至包含蛋白的至少一個表位的融合蛋白。
[0071]因此，表達表位的多核苷酸的最小結(jié)構(gòu)是其包含編碼流感蛋白或多聚蛋白的表位或抗原決定簇的核苷酸，或基本上由其組成或由其組成。編碼總蛋白或多聚蛋白的片段的多核苷酸，更有利地，包含編碼總蛋白或多聚蛋白的序列的最小15個核苷酸，有利地約30~45個核苷酸，及優(yōu)選約45~75，至少57，87或150個連續(xù)或連續(xù)的核苷酸，或基本上由其組成或由其組成。表位確定方法，例如，產(chǎn)生重疊肽庫(Hemmer等人，1998), Pepscan (Geysen et al., 1984;Geysen et al., 1985;Van der Zee R.etal., 1989;Geysen, 1990;Multipin.RTM.Peptide Synthesis Kits de Chiron)和算法(DeGroot等人，1999)和在PCT申請系列N0.PCT/US2004/022605，均通過引用并入本文，無需過度實驗而可用于本發(fā)明的實踐。也可諮詢本文引用的及合并的其他文獻有關(guān)測定免疫原或抗原的表位由此編碼該表位的核酸分子的方法。
[0072]“多核苷酸”是含有以任何組合的脫氧核糖核苷酸，核糖核苷酸和類似物的任何長度的核苷酸的聚合物形式。多核苷酸可具有3維結(jié)構(gòu)，及可實施知道的或未知的任何功能。術(shù)語“多核苷酸”包括雙_，單鏈和三-鏈化的螺旋分子。除非別有指定或需要，本文所述的發(fā)明的任何實施方式是包括雙鏈形式和已知或預(yù)測組成DNA，RNA或雜交體分子的雙鏈形式的各2個互補形式的多核苷酸。
[0073]術(shù)語“密碼子優(yōu)化”指最佳配置編碼用于在選定的宿主表達/翻譯的蛋白，多肽，抗原，表位，結(jié)構(gòu)域或片段的核酸序列的過程。一般而言，基因表達水平依賴于許多因素，例如啟動子序列和調(diào)控元件。最重要因素之一是將轉(zhuǎn)錄物基因的密碼子利用適應(yīng)到宿主的典型密碼子利用(Lithwich, G.and Margalit, H.，Genome Res.13，2665-2673，2003)。因此，原核生物基因組中在翻譯選擇下高度表達的基因具有顯著的密碼子使用偏好。這是因為它們使用被最豐富的tRNA物種識別的小子集的密碼子(Ikemura, T., J.Mol.Biol.151，389-409，1981)。調(diào)節(jié)此密碼子適應(yīng)的力稱為翻譯選擇，且其強度在快速-生長細菌中重要(Rocha, E.P., Genome Res.14, 2279-2286，2004; Sharp, P.M.et al., NucleicAcids Res.33，1141-1153)。如果基因含有宿主罕見使用的密碼子，其表達水平不會最大。此可為異源蛋白表達(Gustafsson, C.et al., Trends Biotechnol.22，346-353，2004)和 DNA 疫苗開發(fā)(Ivory, C.and Chadee, K., Genet.Vaccines Ther.2, 17, 2004)的限制之一。已重新設(shè)計大量合成基因來增加它們的表達水平。合成基因數(shù)據(jù)庫(SOTB) (ffu, G.et al.,Nucleic Acids Res.35，D76-D79, 2007)含有自多于200個公布的對于合成基因的實驗的信息。在會插入新宿主來以最佳量表達某些蛋白的核酸序列的設(shè)計過程中，密碼子利用優(yōu)化通常是第 I 步驟之一 (Gustafsson, C., Trends Biotechnol.22, 346-353，2004)。密碼子利用優(yōu)化基本上涉及改變靶基因中的罕見密碼子，從而無需修飾編碼的蛋白的氨基酸序列而使它們更緊密反映宿主的密碼子利用(Gustafsson, C.，TrendsBiotechnol.22，346-353，2004)。通常用于優(yōu)化處理的信息因此是待優(yōu)化的DNA或蛋白序列及宿主的密碼子利用表(參照組)。
[0074]有幾個公共網(wǎng)頁服務(wù)器和獨立申請允許由本領(lǐng)域技術(shù)人員一些密碼子優(yōu)化。‘GeneDesign’(Richardson, S.M.et al., Genome Res.16, 550-556，2006),‘Synthetic GeneDesigner’ (ffu, G.et al., Protein Expr.Purif.47, 441-445, 2006)和 ‘Gene Designer’(Villalobos, A.et al., BMC Bioinformatics7, 285, 2006)是提供用于合成基因設(shè)計，包括密碼子優(yōu)化步驟的平臺的包裝。有關(guān)可在各服務(wù)器或程序中得到的密碼子利用優(yōu)化的方法，開發(fā)的第I個程序僅使用‘一個氨基酸-一個密碼子’方法。更新近程序和服務(wù)器現(xiàn)在還包括創(chuàng)建一些密碼子利用變異性的方法。此變異性反映天然高度表達的基因的密碼子利用變異性及致使在優(yōu)化過程中導入額外的標準(例如限制性位點的回避)。本文所述的多數(shù)申請及網(wǎng)頁服務(wù)器提供3種密碼子優(yōu)化方法:全部密碼子的完全優(yōu)化，使用Monte Carlo方法的基于參照組的相對密碼子利用頻度的優(yōu)化，和設(shè)計為用查詢及優(yōu)化的序列之間的最小變化最大化優(yōu)化的新方法。在本文中的一實施方式中，編碼NDV的蛋白補體的序列是用于在禽細胞中表達而優(yōu)化的密碼子，在優(yōu)選的實施方式中，編碼NDV P，L和NP的核酸序列是用于在禽細胞中表達而優(yōu)化的密碼子。在再一實施方式中，編碼重組蛋白，抗原，肽，多肽，片段，結(jié)構(gòu)域或表位的核酸序列是用于在禽中表達優(yōu)化的密碼子。在另一實施方式中，密碼子優(yōu)化的序列編碼用于禽表達的AIV蛋白，抗原，肽，多肽，片段，結(jié)構(gòu)域或表位。在再一實施方式中，密碼子優(yōu)化的序列編碼用于禽表達的AIV HA和/或N蛋白，抗原，肽，多肽，片段，結(jié)構(gòu)域或表位。
[0075]以下是多核苷酸的非限制性例:基因或基因片段，外顯子，內(nèi)含子，mRNA, tRNA,rRNA, siRNA，核酶，cDNA，重組多核苷酸，分支的多核苷酸，質(zhì)粒，載體，任何序列的分離的DNA，任何序列的分離的RNA，核酸探針和引物。多核苷酸可包含修飾的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸類似物，尿嘧啶，其他糖和連接基，例如氟核糖和硫醇鹽，及核苷酸分支。核苷酸序列可還在聚合之后修飾，例如通過與標記組分綴合。包括在此定義中的其他類型的修飾是加帽，一個或更多天然存在的核苷酸用類似物置換，及多核苷酸附接到蛋白，金屬離子，標簽組分，其他多核苷酸或固體支持物的手段的導入。多核苷酸可通過化學合成得到或源自微生物。
[0076]本發(fā)明還包括編碼流感蛋白，抗原，表位或免疫原的多核苷酸的互補鏈?；パa鏈可為聚合物及任何長度，及可含有以任何組合的脫氧核糖核苷酸，核糖核苷酸和類似物。
[0077]術(shù)語“蛋白”，“肽”，“多肽”和“多肽片段”在本文使用互換來指任何長度的氨基酸殘基的聚合物。聚合物可為線性或分支的，其可包含修飾的氨基酸或氨基酸類似物，及其可由非氨基酸的化學部分打斷。術(shù)語也包括已天然地或通過干擾修飾的氨基酸聚合物；例如二硫鍵形成，糖基化，脂質(zhì)化，乙?；?，磷酸化或任何其他操作或修飾，例如與標簽或生物活性組分綴合。
[0078]“分離的”多核苷酸或多肽是基本上無在其天然環(huán)境中與其相聯(lián)的物質(zhì)的多核苷酸或多肽。基本上無，是指 至少50%，至少70%，至少80%，至少90%，或至少95%無這些物質(zhì)。
[0079]雜交反應(yīng)可在不同“嚴格度”條件下進行。熟知增加雜交反應(yīng)的嚴格度的條件。見例如，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”，第 2 版(Sambrook 等人，1989)。關(guān)聯(lián)條件的例包括(為了增加嚴格度):25°C，37°C，50°C和68°C的溫育溫度；10 X SSC, 6 X SSC,I X SSC, 0.1 X SSC的緩沖液濃度(其中SSC是0.15M NaCl和15mM檸檬酸鹽緩沖液)和使用其他緩沖液系統(tǒng)的它們的相當體；0%，25%，50%和75%的甲酰胺濃度；溫育時間自5分鐘到24小時；1，2或更多次洗滌步驟；1，2或15分鐘的洗滌溫育時間；&6XSSC，1XSSC，0.1XSSC或去離子水的洗滌溶液。
[0080]本發(fā)明還包括編碼流感多肽的功能性地相當?shù)淖凅w和衍生物和可增強，降低或不顯著影響由此編碼的多肽的固有性質(zhì)的功能性地相當體片段的多核苷酸。這些功能性地相當?shù)淖凅w，衍生物和片段顯示保留流感活性的能力。例如，不改變編碼的氨基酸序列的DNA序列的變化，以及導致氨基酸殘基的保守性置換，一個或更少氨基酸缺失或添加，及氨基酸殘基被氨基酸類似物置換的那些是不會顯著影響編碼的多肽的性質(zhì)的那些。保守性氨基酸置換是甘氨酸/丙氨酸；纈氨酸/異亮氨酸/亮氨酸；天冬酰胺/谷氨酰胺；天冬氨酸/谷氨酸；絲氨酸/蘇氨酸/甲硫氨酸；賴氨酸/精氨酸；及苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸。在一實施方式中，變體與目標流感多核苷酸或多肽具有至少50%，至少55%，至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同源性或同一'I"生。
[0081]一方面，本發(fā)明提供流感多肽，特別禽流感多肽。在另一方面，本發(fā)明提供具有SEQID NO: 15，17，19，21或23所示的序列的多肽，及其變體或片段。
[0082]在另一方面，本發(fā)明提供多肽與本發(fā)明的禽HA多肽，特別與具有SEQ ID NO: 15,17，19，21或23所示的序列的多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少 95%，96%, 97%, 98% 或 99% 序列同一性。
[0083]在再一方面，本發(fā)明提供以上鑒定的流感多肽的片段和變體(SEQ IDNO: 15，17，19，21和23)，其可由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用良好-知道的分子生物學技術(shù)容易制備。
[0084]變體是具有與本發(fā)明的抗原性多肽，特別與SEQ ID NO: 15，17，19，21或23所示的氨基酸序列具有至少約75%，80%, 85%，90%, 95%，96%，97%，98%或99%同一性的氨基酸序列的同源多肽。
[0085]流感多肽的免疫原性片段包括具有SEQ ID NO: 2，4，5，8，10，12或14所示的序列的流感多肽的至少8，10，15或20個連續(xù)氨基酸，至少21個氨基酸，至少23個氨基酸，至少25個氨基酸，或至少30個氨基酸，或其變體。在另一實施方式中，流感多肽的片段包括見于全長流感多肽的特定抗原性表位。
[0086]在另一方面，本發(fā)明提供編碼流感HA多肽的多核苷酸，例如編碼具有SEQ IDNO: 15，17，19，21或2 3所示的序列的多肽的多核苷酸。在再一方面，本發(fā)明提供編碼與具有SEQ ID NO: 15，17，19，21或23所示的序列的多肽，或保守性變體，等位基因變體，同源物或包含這些多肽之一的至少8或至少10連續(xù)氨基酸的免疫原性片段，或這些多肽的組合具有至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，96%, 97%, 98%或99%序列同一性的多肽的多核苷酸。編碼流感HA多肽的多核苷酸可經(jīng)密碼子-優(yōu)化用于在特定動物種中表達。HA蛋白可在自高度病原性禽流感序列(多堿性氨基酸:RERRRKKR-SEQ ID NO: 25)到低病原性禽流感序列(RETR-SEQ ID NO: 26)的切割位點修飾。
[0087]在另一方面，本發(fā)明提供具有如SEQ ID NO: 14，16，18，21，22所示的核苷酸序列，或其變體的多核苷酸。在再一方面，本發(fā)明提供與具有SEQ ID NO: 14，16，18，21，22所示的序列的多核苷酸之一，或其變體具有至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%,至少95%，96%, 97%, 98%或99%序列同一性的多核苷酸。
[0088]為本發(fā)明的目的，通過當比對以最大化重疊及同一性而最小化序列間隔時比較序列來測定序列同一性或同源性。尤其是，序列同一性可使用許多數(shù)學算法之任何測定。用于比較2個序列的數(shù)學算法的非限制性例是如在Karlin等人，1993中修飾的Karlin等人，1990的算法。
[0089]用于序列比較的數(shù)學算法的另一例是Myers等人，1988的算法。該算法合并入ALIGN程序(2.0版)，其為GCG序列比對軟件包裝的部分。當利用用于比較氨基酸序列的ALIGN程序時，可使用PAM120加權(quán)殘基表，12的間隔長度罰分，及4的間隔罰分。用于鑒定局部序列相似性區(qū)和比對的再一有用的算法是描述于Pearson等人，1988的FASTA算法。[0090]—般而言，氨基酸序列的比較通過將已知的結(jié)構(gòu)的多肽的氨基酸序列與未知結(jié)構(gòu)的多肽的氨基酸序列比對來實現(xiàn)。然后比較序列中的氨基酸及同源的氨基酸組分在一組。此方法檢測多肽的保守的區(qū)及解釋氨基酸插入和缺失。氨基酸序列之間的同源性可通過使用可商購的算法(也見以上同源性描述)測定。除了本文另外提及的那些之外，提及由美國生物技術(shù)信息中心提供的程序BLAST，空位BLAST，BLASTN，BLASTP和PS1-BLAST。這些程序在本領(lǐng)域中為此目的廣泛使用，和可比對2個氨基酸序列的同源區(qū)。 [0091]套件中的全部搜索程序，空位比對常規(guī)整合到數(shù)據(jù)庫搜索本身。如果需要,空位可關(guān)閉。長度I的間隔的默認罰分(Q)，對于蛋白和BLASTP是Q=9，及對于BLASTN是Q=10，但可在任何整數(shù)中變化。對于延伸間隔(R)的默認每-殘基罰分，對于蛋白和BLASTP是R=2，及對于BLASTN是R=10，但可在任何整數(shù)中變化?？墒褂肣和R的值的任何組合以便比對序列，以最大化重疊及同一性而最小化序列間隔。默認氨基酸比較矩陣是BL0SUM62，但可利用其他氨基酸比較矩陣例如PAM。
[0092]替代性地或額外地，術(shù)語“同源性”或“同一性”，例如，有關(guān)核苷酸或氨基酸序列，可指2個序列之間的同源性的定量測量。百分率序列同一性可計算為(NMf-Ndif)*100/NMf，其中Ndif是當比對時2個序列中非-同一殘基的總數(shù)，且其中NMf是序列之一中的殘基數(shù)。因此，DNA序列AGTCAGTC會與序列AATCAATC (Nref=8;Ndif=2)具有75%的序列同一性。
[0093]替代性地或額外地，“同源性”或“同一性”有關(guān)序列可指具有同一核苷酸或氨基酸的位置數(shù)除以2個序列中較短者的核苷酸或氨基酸數(shù)，其中2個序列的比對可根據(jù)Wilbur和Lipman算法測定(Wilbur等人，1983，通過引用并入本文),例如,使用20個核苷酸的窗口大小，4個核苷酸的字長，及4的間隔罰分，及包括比對的序列數(shù)據(jù)的計算機-輔助的分析和解析可使用可商購的程序(例如，Vector NTI軟件?, Invitrogen Inc.CA, USA)便利地進行。當說到RNA序列類似，或與DNA序列具有一定程度的序列同一性或同源性，DNA序列中的胸苷(T)認為是等于RNA序列中的尿嘧啶(U)。由此，RNA序列在本發(fā)明的范圍內(nèi)，且可源于DNA序列，通過DNA序列中的胸苷(T)認為是等于RNA序列中的尿嘧啶(U)。
[0094]并且，無需過度實驗，本領(lǐng)域技術(shù)人員可借助許多其他程序或參照用于測定百分率同源性。
[0095]本發(fā)明還包括含有在載體分子或表達載體內(nèi)和運作性連接到啟動子元件和任選地連接到增強子的流感多核苷酸。
[0096]“載體”指包含待體外或體內(nèi)遞送到靶細胞的異源多核苷酸的重組DNA或RNA質(zhì)粒，噬菌體或病毒。異源多核苷酸可包含預(yù)防或治療目的的目標序列，及可任選地以表達盒形式。如本文使用，載體不需能在最后靶細胞或受試者中復制。術(shù)語包括用于克隆的載體以及病毒載體。
[0097]術(shù)語“經(jīng)加工的”或“重組的”是指不天然存在或以不見于天然的排列連接到另一多核苷酸的半合成，或合成起源的多核苷酸。
[0098]“異源”是指源于自相比較的其余實體遺傳不同的實體。例如，多核苷酸可通過遺傳加工技術(shù)合并到源自不同來源的質(zhì)?；蜉d體，且由此是異源多核苷酸。自其天然編碼序列移出的且運作性連接到非天然序列的編碼序列的啟動子是異源啟動子。
[0099]本發(fā)明的多核苷酸可在相同的轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)包含附加序列，例如額外的編碼序列，控制元件例如啟動子，核糖體結(jié)合位點，5’ UTR，3’ UTR,轉(zhuǎn)錄終止子，多聚腺苷酸化位點，在相同的或不同啟動子控制下的額外的轉(zhuǎn)錄單元，允許克隆，表達，同源重組，及宿主細胞轉(zhuǎn)化的序列，及可期望提供本發(fā)明的實施方式的任何該構(gòu)建體。
[0100]本發(fā)明的載體中有利地存在用于表達流感多肽，抗原，表位或免疫原的元件。以最小方式，此包含起始密碼子(ATG)，終止密碼子和啟動子，及任選地用于某些載體的多聚腺苷酸化序列，例如質(zhì)粒和某些病毒載體，例如，非痘病毒的病毒載體，基本上由其組成或由其組成。當多核苷酸有利地，在載體中編碼多聚蛋白片段，例如流感肽時，ATG放置在閱讀框的5’處，和終止密碼子放置在3’處?？纱嬖谟糜诳刂票磉_的其他元件，例如增強子序列，穩(wěn)定化序列，例如內(nèi)含子及或未翻譯的5 ‘或3 ‘序列和允許蛋白分泌的信號序列。
[0101]制造和/或施用用于體內(nèi)或體外表達本發(fā)明的基因的基因產(chǎn)物的載體或重組體或質(zhì)粒的方法可為任何期望的方法，例如，方法是通過或類似于公開于下列文獻，或公開于下列文獻中引用的文獻的方法:美國專利N0.4，603, 112 ;4，769，330 ;4，394，448 ；4，722，848 ;4，745，051 ;4，769，331 ;4，945，050 ;5，494，807 ;5，514，375 ;5，744，140 ；5，744，141 ;5，756，103 ;5，762，938 ;5，766，599 ;5，990，091 ;5，174，993 ;5，505，941 ；5，338，683 ;5，494，807 ;5，591，639 ;5，589，466 ;5，677，178 ;5，591，439 ;5，552，143 ；5，580，859 ;6，130，066 ;6，004，777 ;6，130，066 ;6，497，883 ;6，464，984 ;6，451，770 ；6，391，314 ;6，387，376 ;6，376，473 ;6，368，603 ;6，348，196 ;6，306，400 ;6，228，846 ；6，221，362 ;6，217，883 ;6，207，166 ;6，207，165 ;6，159，477 ;6，153，199 ;6，090，393 ；6，074，649 ;6，045，803 ;6，033，670 ;6，485，729 ;6，103，526 ;6，224，882 ;6，312，682 ；6，348，450 ;6，312，683，及6，596，279 ；1986年10月16日提交的美國專利申請系列N0.920，197 ；W090/01543 ；W091/11525 ；W094/16716 ；W096/39491 ；W098/33510 ；EP265785 ；EP0370573 ；Andreansky 等人，1996 ；Ballay 等人，1993 ；Felgner 等人，1994 ；Frolov 等人，1996 ；Graham, 1990 ;Grunhaus 等人，1992 ; Ju 等人，1998 ;Kitson 等人，1991 ;McClements 等人，1996 ；Moss,1996 ；Paoletti,1996 ；Pennock 等人，1984 ；Richardson (Ed),1995 ；Smith等人，1983 ；Roberts on 等人，1996 ；Robinson 等人，1997 ;及 Roizman, 1996。本文引用的及通過引用文獻并入本文的，除了提供本發(fā)明的實踐中有用的載體的例之外，也可提供用于待由在本發(fā)明的組合物中或在本發(fā)明的組合物中包括的載體表達的非-流感肽或其片段的源。
[0102]本發(fā)明也涉及包含載體，例如表達載體的制備物，例如，預(yù)防劑或治療組合物。制備物可包含一種或更多包含一種或更多流感多肽，抗原，表位或免疫原，基本上由其組成或由其組成(及有利地表達)的載體，例如，表達載體，例如體內(nèi)表達載體，基本上由其組成或由其組成。載體在藥學或獸醫(yī)學可接受的載體，賦形劑或媒質(zhì)中含有及表達包含編碼(及有利地表達)流感抗原，表位或免疫原的多核苷酸，基本上由其組成或由其組成的多核苷酸。由此，根據(jù)本發(fā)明的實施方式，制備物中的其他載體包含編碼，及在適當?shù)沫h(huán)境下，載體表達一種或更多流感多肽，抗原，表位或免疫原(例如，血凝素，神經(jīng)氨酸酶，核蛋白)或其片段的其他蛋白的多核苷酸，或基本上由其組成或由其組成。
[0103]根據(jù)另一實施方式，制備物中的載體包含編碼流感多肽，抗原，表位或免疫原的一種或其更多蛋白或片段的多核苷酸，表達多核苷酸的載體，或基本上由其組成或由其組成。本發(fā)明的制備物包含至少2種包含自編碼相同的蛋白和/或不同蛋白的不同流感分離物的多核苷酸，基本上由其組成或由其組成，及有利地在適當?shù)臈l件或適合的條件下或在適合的宿主細胞中體內(nèi)表達的載體，基本上由其組成或由其組成。制備物含有一種或更多載體包含流感多肽，抗原，融合蛋白或其表位，基本上由其組成或由其組成多核苷酸編碼，及有利地體內(nèi)表達。本發(fā)明也針對載體混合物,其含有,基本上由其組成或由其組成,編碼,及表達，不同流感蛋白，多肽，抗原，表位或免疫原，例如，自不同物種例如但不限于人，馬，豬，海豹，鯨，除了包括雞，火雞，鴨和鵝的禽物種之外的流感多肽，抗原，表位或免疫原。
[0104]術(shù)語質(zhì)粒覆蓋任何DNA轉(zhuǎn)錄單元，其包含:根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸和在期望的宿主或祀細胞內(nèi)體內(nèi)表達必需的元件；及，在這點上，需知，超螺旋的質(zhì)粒和全部其拓撲異構(gòu)體，開環(huán)質(zhì)粒，以及質(zhì)粒的線性形式，旨在在本發(fā)明的范圍內(nèi)。 [0105]各質(zhì)粒包含或含有或基本上由其組成，除了編碼重組蛋白，抗原，表位或免疫原的異源多核苷酸之外，任選地與編碼異源肽序列，變體，類似物或片段的多核苷酸融合，運作性連接到啟動子或在啟動子控制下或依賴于啟動子。一般而言，有利地采用在真核細胞中發(fā)揮功能的強啟動子。優(yōu)選的強啟動子是人或鼠起源，或任選地具有另一起源例如大鼠或豚鼠的立即早期巨細胞病毒啟動子(CMV-1E)。CMV-1E啟動子可包含實際啟動子段，其可或可不相聯(lián)于增強子段?？蓞⒖糆P-A-260148，EP-A-323597，美國專利N0.5，168,062，5，385，839和4，968，615，以及參考PCT申請No W087/03905。CMV-1E啟動子有利地是人CMV-1E (Boshart 等人，1985)或鼠 CMV-1E。
[0106]在更通常情況下，啟動子是病毒或細胞起源的。可在本發(fā)明的實踐中有用地采用的非CMV-1E的強病毒啟動子是SV40病毒的早期/晚期啟動子或Rous肉瘤病毒的LTR啟動子。在本發(fā)明的實踐中有用地采用的強細胞啟動子可為細胞骨架基因的啟動子，例如結(jié)蛋白啟動子(Kwissa等人，2000),或肌動蛋白啟動子(Miyazaki等人，1989)。
[0107]這些啟動子的功能亞片段，即，維持充足的啟動活性的這些啟動子的部分,包括在本發(fā)明內(nèi)，例如根據(jù)PCT申請N0.W098/00166或美國專利N0.6，156，567的截短的CMV-1E啟動子可用于本發(fā)明的實踐。在本發(fā)明的實踐中啟動子隨之包括維持充足的啟動活性和因此發(fā)揮啟動子的作用，優(yōu)選基本上類似于衍生出衍生物或亞片段的實際或全長啟動子的啟動活性，例如，類似于美國專利N0.6，156，567的截短的CMV-1E啟動子的活性，類似于全長CMV-1E啟動子的活性的全長啟動子的衍生物及亞片段。由此，在本發(fā)明的實踐中CMV-1E啟動子可包含全長啟動子的啟動子部分和/或全長啟動子的增強子部分，以及衍生物及亞片段，或基本上由其組成或由其組成。
[0108]優(yōu)選地，質(zhì)粒包含其他表達控制元件，或基本上由其組成。特別有利地合并穩(wěn)定化序列，例如，內(nèi)含子序列，優(yōu)選hCMV-1E的第I內(nèi)含子(PCT申請N0.TO89/01036)，兔β-珠蛋白基因的內(nèi)含子II (van Ooyen等人，1979)。
[0109]作為質(zhì)粒和非痘病毒的病毒載體的多聚腺苷酸化信號(多聚A)，可利用牛生長激素(bGH)基因的聚(A)信號(見美國專利N0.5，122，458)，或兔β-珠蛋白基因的聚(A)信號或SV40病毒的聚(A)信號。
[0110]根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式，表達載體是用于在適當?shù)募毎到y(tǒng)中體外表達蛋白的表達載體。表達的蛋白可在分泌之后或非在分泌之后(如果無分泌，細胞裂解一般發(fā)生或進行)在培養(yǎng)上清中或自培養(yǎng)上清收獲，任選地通過濃縮方法例如超濾濃縮和/或通過純化手段，例如親和性，離子交換或凝膠過濾-類型層析方法純化。
[0111]“宿主細胞”表示已遺傳改變的，或能通過施用外源多核苷酸，例如重組質(zhì)粒或載體遺傳改變的原核生物或真核細胞。當指遺傳改變的細胞時，術(shù)語兼指原本改變的細胞和其后代。有利的宿主細胞包括，但不限于，幼侖鼠腎(BHK)細胞，結(jié)腸癌(Caco-2)細胞，C0S7細胞，MCF-7 細胞，MCF-1OA 細胞，Madin-Darby 狗腎(MDCK)系，貂肺(MvlLu)細胞，MRC-5 細胞，U937細胞和VERO細胞。包含期望的序列的多核苷酸可插入適合的克隆或表達載體，及載體，進而可導入用于復制和擴增的適合的宿主細胞。可通過任何本領(lǐng)域知道的手段將多核苷酸導入宿主細胞。可通過許多適當?shù)氖侄沃魏螌⒑心繕硕嗪塑账岬妮d體導入宿主細胞，包括直接攝取，胞吞，轉(zhuǎn)染，交配，電穿孔，采用氯化鈣，氯化銣，磷酸鈣，DEAE-葡聚糖或其他物質(zhì)的轉(zhuǎn)染；微投射物轟擊；脂轉(zhuǎn)染；及感染(其中載體是感染性的，例如，反轉(zhuǎn)錄病毒載體)。引導載體或多核苷酸的選擇會常常依賴于宿主細胞的特征。
[0112]在本發(fā)明的一實施方式中，載體是新城疫病毒(NDV)載體。也稱之為禽副粘病毒I的新城疫病毒(APMV1,副粘病毒科(Paramyxoviridae)，副粘病毒亞科(Paramyxovirinae),禽副粘病毒屬(Avulavirus))是禽病原體，其天然存在的株呈現(xiàn)廣范圍的疾病嚴重性。NDV作為用于獸醫(yī)學使用的疫苗載體特別有利，因為載體本身作為需要的家禽疫苗。NDV株致病型是無癥狀腸性(例如Ulster2C，QueenslandV4),緩發(fā)型(例如,Hitchner BI, F (例如,Asplin), La Sota),中發(fā)型(例如，株
H,Mukteswar, Roakin, Beaudette C)或速發(fā)型(例如，Texas GB, NY parrot70181, Italien,Milano1Herts 33/56)的。基于NDV載體的禽流感載體疫苗的優(yōu)勢包括，但不限于，(I)誘導廣免疫，包括體液，細胞和粘膜應(yīng)答(2)不表達NP和M蛋白，由此與DIVA (區(qū)分自免疫接種的動物感染的)策略相容，(3)誘導免疫的快速發(fā)作，(4) 二價，和(5)產(chǎn)生位置相比意外釋放中滅活的疫苗對環(huán)境風險更少。
[0113]NDV的某些特征提示，表達外源病毒蛋白的重組NDV (rNDV)或經(jīng)加工的NDV會是非常良好的疫苗候選體。NDV在許多細胞系和蛋中生長到非常高滴度，及其引發(fā)強體液和細胞免疫應(yīng)答體內(nèi)。NDV天然地感染經(jīng)呼吸道和食道粘膜表面，因此，遞送呼吸性疾病病原體，例如AIV的保護性抗原尤其 有用。此外，在美國和多數(shù)其他國家廣泛使用可商購的活NDV疫苗?；诨頝DV重組體的疫苗也可相比其他活重組疫苗載體具有優(yōu)勢。首先，外源蛋白隨僅少量NDV蛋白表達。相反，痘和皰疹病毒載體自它們的大-尺寸基因組表達大量的額外的蛋白。對于疫苗應(yīng)用中特定免疫應(yīng)答的產(chǎn)生，可有利地使僅有限數(shù)量的蛋白表達。第2，NDV無DNA期地在感染的細胞的細胞質(zhì)中復制，其消除病毒基因組整合到宿主細胞DNA的問題。病毒不經(jīng)歷可檢測的遺傳重組。
[0114]反向遺傳學的另一應(yīng)用是開發(fā)如本文所述的更有效和更佳NDV疫苗。當前NDV疫苗利用天然存在的緩發(fā)型株，例如Hitchner BI和LaSota。如其他活衰減的疫苗所面對的，當前NDV疫苗仍可由于毒力逆轉(zhuǎn)而導致疾病。NDV疫苗株作為載體的選擇是重要的，由于以Hitchner BlNDV株報道的首次數(shù)據(jù)是令人失望的。其后，以LaSota NDV株獲得的數(shù)據(jù)是鼓舞人心，且基于此株的疫苗候選體現(xiàn)場用于中國和墨西哥。
[0115]本發(fā)明描述了 申請人:利用NDV AVINEW?:疫苗株作為用于將源于重組體的抗
原遞送到禽的載體。更特別抗原可為禽流感病毒(Aiv)抗原。AVINE\￥?是全世界使
用的由Merial Ltd.開發(fā)的活NDV疫苗。此疫苗株天然地無毒力，且呈現(xiàn)雙呼吸和腸向性。禽中的趨異向性可給重組NDV (rNDV)或經(jīng)加工的NDV疫苗提供獨特生物學特征，其利用AVINEW?，主鏈用于在禽中基因遞送，有關(guān)自母源抗體(MDA)到NDV本身的干涉。該對MDA的抗性可允許可固有地具有顯著水平的NDV-特異性MDA和另外反抗更常規(guī)重組NDV免疫的商業(yè)和野生型禽的活躍的免疫。
[0116]此外，AVINEW?;株屬于可感染鴨的NDV基因組或類型(2類，基因型I)。相比LaSota (其向性基本上針對呼吸道)，AVINEW?株不誘導呼吸性副反應(yīng)。
[0117]在一實施方式中，NDV載體是NDVAV1NEW?。NDV載體也可為美國專利N0.5，118，502的載體，尤其是作為ATCC N0.VR2239保藏的株。
[0118]本發(fā)明的一實施方式提供AVINEW的基因組DNA序列及編碼的蛋白序列。AVINEWNDV株的基因組DNA序列具有SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列。AVINEW基因組cDNA序列(SEQ ID 勵:1)不同于￥6/64序列(661^31^登錄吣』似89028)。AVINEW(SEQ ID NO:1)和VG/GA (EU289028)基因組序列之間的序列同一性是89.6%。Avinew株和VG/GA株的蛋白之間的氨基酸序列同一性是:對于NP蛋白(Avinew的SEQ ID N0:3和GenBank N0.ABZ80386)是 95.9%，對于 P 蛋白(Avinew V.的 SEQ ID N0:5GenBank ABZ80387)是 89.7%，對于 M 蛋白(Avinew V.的 SEQ ID N0:7GenBank N0.ABZ80388)是94.2%，對于F 蛋白(Avinew v.的 SEQID N0:9GenBank N0.ABZ80389)是92.4%，對于HN蛋白(Avinew v.的SEQ ID NO:1lGenBankN0.ABZ80390)是 88.1%，及對于 L 蛋白(Avinew v.的 SEQ ID N0:13GenBank N0.ABZ80391)是96.9%。Avinew株及VG/GA株的基因之間的核酸序列同一性是:對于NP基因(AvinewV.的 SEQ ID N0:2EU289028 的 122 ~1591bp)是 90.6%，對于 P 基因(Avinew v.的 SEQ IDN0:4EU289028 的 1887 ~3074bp)是88.6%，對于M基因(Avinew v.的 SEQ ID N0:6EU289028的 3290 ~4384bp)是 90.1%，對于 F 基因(Avinew v.的 SEQ ID N0:8EU289028 的 4544 ~6205bp)是 90.0%，對于 HN 基因(Avinew v.的 SEQ ID NO: 10EU289028 的 6412 ~8145bp)是 84.7%,及對于 L 基因(Avinew v.的 SEQ ID NO: 12EU289028 的 8381 ~14995bp)是90.9%。完全基因組和個體基因序列與其他可得到的NDV參照序列的比較顯示，AVINEW NDV株與澳大利亞緩發(fā)型株98- 1154和Queensland V4遺傳緊密相關(guān)。NDV98-1154全基因組序列示于GenBank AY935491。ANIVEW (SEQ ID NO:1)和AY935491基因組序列之間的序列同一性是98.8%。Avinew株和VG/GA株的蛋白之間的氨基酸序列同一性是:對于NP蛋白(Avinew v.的 SEQ ID N0:3GenBank N0.AAX45376)是99.8%，對于P 蛋白(Avinew v.的 SEQID N0:5GenBank N0.AAX45377)是 97.7%，對于 M 蛋白(Avinew v.的 SEQ ID N0:7GenBankΝο.ΑΑΧ45378)是 98.4%，對于 F 蛋白(Avinew v.的 SEQ ID N0:9GenBank N0.AAX45379)是98.7%，對于 HN 蛋白(Avinew v.的 SEQ ID NO:1lGenBank N0.AAX45380)是 92.4%，及對于 L蛋白(Avinew v.的 SEQ ID N0:13GenBank N0.AAX45381)是99.5%。Avinew株及 VG/GA株的基因之間的核酸序列同一性是:對于NP基因(Avinew v.的SEQ ID NO: 2AY935491的122~1591bp)是 99.0%，對于 P 基因(Avinew v.的 SEQ ID NO:4AY935491 的 1887 ~3074bp)是98.2%,對于 M 基因(Avinew v.的 SEQ ID N0:6AY935491 的 3290 ~4384bp)是 98.6%,對于 F 基因(Avinew v.的 SEQ ID NO: 8AY935491 的 4544 ~6205bp)是 98.8%，對于 HN 基因(Avinew v.的 SEQ ID NO: 10AY935491 的 6412 ~8154bp)是 93.1%，及對于 L 基因(AvinewV.的 SEQ ID NO: 12AY935491 的 8381 ~14995bp)是 98.8%。對于 Queensland V4，僅部分序列可在GenBank得到。
[0119]在另一實施方式中，本發(fā)明提供具有SEQ ID N0:l，2，4，6，8，10，12或24所示的序列，及其變體或片段的多核苷酸。本發(fā)明還包括與本文所述的多核苷酸的互補鏈。在再一實施方式中，本發(fā)明提供具有SEQ ID NO: 3，5，7，9，11或13所示的序列的多肽，及其變體或片段。
[0120]在另一方面，本發(fā)明提供具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 24所示的序列的AVINEW的基因組cDNA。在再一實施方式中，多核苷酸是具有SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:24所示的序列的多核苷酸的反向互補鏈。在再一實施方式中，本發(fā)明的多核苷酸或多核苷酸的反向互補鏈與具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 24所示的序列的多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，96%, 97%, 98%或99%序列同一性。 [0121]在一實施方式中，本發(fā)明提供編碼AVINEW多肽的多核苷酸的片段，例如編碼具有SEQ ID NO: 3，5，7，9，11或13所示的序列的多肽的多核苷酸。在再一方面，本發(fā)明提供編碼與具有SEQ ID N0:3，5，7，9，ll或13所示的序列的多肽，或保守性變體，等位基因變體，同源物或包含這些多肽之一的至少8或至少10個連續(xù)氨基酸的免疫原性片段，或這些多肽的組合具有至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，96%, 97%, 98%或99%序列同一'I"生的多肽的多核苷酸。
[0122]在另一方面，本發(fā)明提供具有SEQ ID NO: 1，2，4，6，8，10，12或24所示的核苷酸序列的多核苷酸，或其變體。在再一實施方式中，多核苷酸是具有SEQ ID N0:l，2，4，6，8，10，12或24所示的序列的多核苷酸的反向互補鏈。在再一方面，本發(fā)明提供與具有SEQ IDNO: 1，2，4，6，8，10，12或24所示的序列的多核苷酸之一，或其變體具有至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，96%, 97%, 98%或99%序列同一性的多核苷酸或多核苷酸的反向互補鏈。
[0123]一方面，本發(fā)明涉及用于在用疫苗或組合物接種的宿主動物中誘導免疫學應(yīng)答的藥物組合物或疫苗,組合物包括藥物可接受的載體和修飾的AVINEW重組病毒。在本發(fā)明的再一方面，經(jīng)加工的AVINEW病毒，在病毒基因組的非必要區(qū)內(nèi)，包括編碼源自病原體的抗原性蛋白的異源DNA序列，其中當疫苗施用給宿主時，能誘導特異于由病原體編碼的蛋白的免疫學應(yīng)答。
[0124]術(shù)語“非必要區(qū)”指對于病毒在組織培養(yǎng)中的復制和繁殖不是必要的及其缺失或滅活可減少在各種動物系統(tǒng)中的毒力的病毒基因組區(qū)。任何非必要區(qū)或其部分可自AVINEW基因組缺失或外源序列可插入其中，及由缺失或插入所致的經(jīng)加工的AVINEW的活力和穩(wěn)定性可用于確定是否刪除的區(qū)或其部分的確非必要。在另一實施方式中，AVINEW基因組的非必要區(qū)是AVINEW基因組的P基因和M基因之間的區(qū)，或M基因和F基因之間的區(qū)。在再一實施方式中，非必要區(qū)可在SEQ ID NO:1的第3075~第3289核苷酸或第4385~第4543核苷酸，SEQ ID NO:24的第3115~第3353核苷酸或第4449~第4607核苷酸的區(qū)內(nèi)。
[0125]本發(fā)明的一方面涉及表達禽抗原的NDV載體?？乖蔀榍萘鞲锌乖?。禽流感抗原可為血凝素,例如H5HA。
[0126]本發(fā)明也涵蓋表達禽流感基因的NDV載體，例如:兼有自HPAIV野生鳥分離物的野生型及突變的HA開放閱讀框(ORF)，A/斑頭雁/青海/3/2005 (H5N1)插入到LaSotaNDV疫苗株的P和M基因之間的基因間區(qū)的表達H5亞型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)的NDV 的構(gòu)建體(例如，Ge et al., Journal of Virology, Jan.2007, vol.81, n0.1, pp.105-158)，以登錄號N0.AF375823提交到GenBank的表達流感病毒的新城疫病毒(NDV)疫苗株Hitchner BI 的完全 cDNA 克隆(見，例如，Nakaya et al., Journal of Virology, Dec.2001，pp.11868-11873)，表達 HPAIV A/雞 / 越南/P41/05 (H5N1)的 H5 蛋白的 NDV 重組體(NDVH5Vm)(見，例如，Romer-Oberdorfer et al., Vaccine.2008May2; 26 (19):2307-1
3.Epub2008Marl8)，使用有自禽流感病毒(AIV)A/雞/NY/13142-5/94(H7N2)的血凝素(HA)基因插入的緩發(fā)型副粘病毒I型載體(NDV BI株)構(gòu)建的rNDV-AIV-H7 (見，例如，Swayneet al.,Avian Diseases47:1047-1050, 2003)，通過反向遺傳學構(gòu)建的亞型H5的NDV-表達禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)(見，例如，Veits et al.，PNAS, May23, 2006，vol.103，n0.2
I,pp.8197-8202)和基于緩發(fā)型 NDV 疫苗株 Clone30 的 AIV A/ 雞 / 越南 /P41/2005(H5N1)的表達 HA 基因的重組 NDV-H5 (見，例如，Veits et al.，Vaccine (2008) 26，1688-1696)
O
[0127]在本發(fā)明的再一實施方式中，也涵蓋表達NDV基因的禽流感病毒，例如代替表達H7禽流感病毒血凝素的胞外域的H5N1禽流感病毒或二價疫苗的神經(jīng)氨酸酶蛋白表達NDV的血凝素-神經(jīng)氨酸酶基因的胞外域的嵌合禽流感病毒到成融及衰減的NDV基因(含僅其胞外域，具有源自NDV的F蛋白的跨膜和細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域)(見，例如，Park et al., PNAS,May23, 2006, vol.103, n0.21, pp.8203-8308)。
[0128]在一實施方式中，本發(fā)明用于將治療有效量的用于遞送和表達蛋白，抗原，表位或免疫原的制劑施用到靶細胞。預(yù)防性地或治療有效量的確定是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的常規(guī)實驗。在另一實施方式中，制劑包含:包含表達流感抗原，表位或免疫原的多核苷酸表達載體的和藥學或獸醫(yī)學可接 受的載體，媒質(zhì)或賦形劑。在另一實施方式中，藥學或獸醫(yī)學可接受的載體，媒質(zhì)或賦形劑輔助轉(zhuǎn)染和/或改善載體或蛋白的保存。
[0129]本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知藥學或獸醫(yī)學可接受的載體或媒質(zhì)或賦形劑。例如，藥學或獸醫(yī)學可接受的載體或媒質(zhì)或賦形劑可為無菌水，0.9%NaCl (例如，鹽水)溶液或磷酸鹽緩沖液?？捎糜诒景l(fā)明的方法的其他藥學或獸醫(yī)學可接受的載體或媒質(zhì)或賦形劑包括，但不限于，聚-(L-谷氨酸)或聚乙烯吡咯烷酮。藥學或獸醫(yī)學可接受的載體或媒質(zhì)或賦形劑可為輔助載體施用的任何化合物或化合物的組合(或自本發(fā)明的載體外表達的蛋白)；有利地，載體，媒質(zhì)或賦形劑可輔助轉(zhuǎn)染和/或改善載體(或蛋白)的保存。本文在一般描述中討論了劑量體積，且也可由本領(lǐng)域技術(shù)人員自本公開以及本領(lǐng)域中的知識，無需任何過度實驗確定。
[0130]有利地但不排他性地適于質(zhì)粒的含有季銨鹽的陽離子脂質(zhì)，有利地是具有以下式的那些:
[0131]


CH3




I +
R1-O -CH2- CH-CH2-N-R2-X




I

OR1CH3
[0132]其中Rl是具有12~18個碳原子的飽和的或不飽和的直鏈脂肪族自由基，R2是含有2或3個碳原子的另一脂肪族自由基，且X是胺或羥基，例如DMRIE。在另一實施方式中陽離子脂質(zhì)可與中性脂質(zhì)，例如DOPE相聯(lián)。
[0133]這些陽離子脂質(zhì)中，偏好DMRIE (N-(2_羥乙基)-N，N-二甲基_2，3_雙(十四烷基氧基)-1-丙烷銨；W096/34109)，有利地與中性脂質(zhì)關(guān)聯(lián)，有利地為DOPE (二油酰-磷脂酰-乙醇胺；Behr，1994)，以形成 DMRIE-D0PE。
[0134]有利地，無準備地及有利地與施用制備物同時或在施用制備物之前不久形成具有佐劑的質(zhì)?；旌衔铮焕?，在施用之前不久或之前，形成質(zhì)粒-佐劑混合物，有利地為了施用之前給足夠的時間用于混合物形成復合物,例如施用之前約10和約60分鐘之間，例如施用之前約30分鐘。
[0135]當DOPE存在時，DMRIE:DOPE摩爾比有利地為約95:約5~約5:約95，更有利地約1:約I,例如，1:1。
[0136]DMRIE或DMRIE-D0PE佐劑:質(zhì)粒重量比可為約50:約I和約1:約10之間，例如約10:約I和約1:約5之間，及有利地約1:約I和約1:約2之間，例如，1:1和1:2之間。
[0137]在另一實施方式中，藥學或獸醫(yī)學可接受的載體，賦形劑或媒質(zhì)可為油包水乳劑。適合的油包水乳劑的例包括基于油的油包水疫苗乳劑，其穩(wěn)定和于4°C流動，其含有:6~50v/v%的含有抗原的水相，優(yōu)選12~25v/v%，50~94v/v%的含有(總共或部分)非-可代謝的油(例如，礦物油例如石蠟油)和/或可代謝的油(例如，植物油或脂肪酸，多元醇或醇酯)的油相，0.2~20p/v%的表面活性劑，優(yōu)選3~8p/v%，后者總共或部分，或以混合物是聚甘油酯，所述聚甘油酯優(yōu)選為聚甘油(聚)蓖麻油酸酯，或聚氧乙烯蓖麻毒素油或氫化的聚氧乙烯蓖麻毒素油?？捎糜谟桶閯┑谋砻婊钚詣┑睦?br> 乙氧基化的山梨糖醇酐酯(例如，聚氧乙烯(20)單油酸山梨糖醇酐(Tween 80? ),
可得自AppliChem, Inc.，Cheshire, CT)和山梨糖醇酐酯(例如，單油酸山梨糖醇酐
(Span 80? )，可得自Sigma Aldrich, St.louis，MO)。此外，有關(guān)油包水乳劑，也見US
專利N0.6,919, 084，例如，其實施例8，通過引用并入本文。在一些實施方式中，含有抗原的水相包含鹽溶液包含一種或更多緩沖劑。適合的緩沖溶液的例是磷酸鹽緩沖的鹽水。在有利的實施方式中，油包水乳劑可為水/油/水(W/0/W)三層乳劑(見，例如，美國專利N0.6，358，500,通過引用并入本文)。其他適合的乳劑的例描述于美國專利N0.7，371，395，通過引用并入本文。
[0138]免疫學組合物和疫苗根據(jù)本發(fā)明可包含一種或更多佐劑，或基本上由其組成。本發(fā)明的實踐中使用的適合的佐劑是:(1)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，馬來酐和烯基衍生聚合物，(2)免疫刺激序列(ISS)，例如具有一個或更多非-甲基化的CpG單元的寡脫氧核苷酸序列(Klinman等人，1996 ;W098/16247)，(3)水包油乳劑，例如描述于由M.Powell, M.Newman, Plenum Pressl995 出版 的“Vaccine Design, The Subunit and AdjuvantApproach”的pl47的SPT乳劑，及描述于相同的文章的P183的MF59乳劑，(4)含有季銨鹽的陽離子脂質(zhì)，例如，DDA (5)細胞因子，(6)氫氧化鋁或磷酸鋁，(7)皂苷或(8)引用的及通過引用合并到本申請的任何文獻中討論的其他佐劑，或(9)其任何組合或混合物。
[0139]水包油乳劑(3)，其尤其適于病毒載體，可基于:輕液體石蠟油(歐洲藥典類型)，類異戊二烯油，例如角鯊烷，角鯊烯，由烯，例如異丁烯或癸烯的寡聚化產(chǎn)生的油，具有直鏈烷基的酸或醇的酯，例如植物油，油酸乙酯，丙二醇，二(辛酸酯/癸酸酯)，甘油三(辛酸酯/癸酸酯)和丙二醇二油酸酯，或分支的，脂肪醇或酸的酯，尤其是異硬脂酸酯。
[0140]油與乳化劑聯(lián)用而形成乳劑。乳化劑可為非離子表面活性劑，例如:一方面是山梨糖醇酐的酯，二縮甘露醇(例如無水甘露糖醇油酸酯)，甘油，聚甘油或丙二醇，而另一方面是油酸，異硬脂酸，蓖麻油酸或羥基硬脂酸，所述酯任選地是乙氧基化的，或聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物,例如Pluronic，例如，L121。
[0141]類型(I)佐劑聚合物中，偏好交聯(lián)的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，尤其通過糖或多元醇的聚烯基醚的交聯(lián)。這些化合物已知名稱為卡波姆(Pharmeuropa, vol.8, N0.2, 1996年6月)。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可參考美國專利N0.2，909，462，其提供通過具有至少3個羥基，優(yōu)選不多于8個該基團，被具有至少2個碳原子的不飽和的，脂肪族自由基取代的至少3個羥基的氫原子的聚羥基化合物交聯(lián)的該丙烯酸聚合物。優(yōu)選的自由基是含有2~4個碳原子的那些，例如乙烯基，烯丙基和其他乙烯鍵合地不飽和基團。不飽和的自由基也可含有其他取代基，例如甲基。尤其適合以名稱卡波泊爾售的產(chǎn)品(BF Goodrich, Ohio, USA)。它們通過烯丙基蔗糖或通過烯丙基季戊四醇交聯(lián)。它們之中，參考卡波泊爾974P，934P和971P。
[0142]有關(guān)馬來酐-烯基衍生共聚物,偏好EMA(Monsanto),其是直鏈或交聯(lián)的乙烯-馬來酐共聚物，且它們，例如，通過二乙烯基醚交聯(lián)。也參考J.Fields等人，1960。
[0143]有關(guān)結(jié)構(gòu)，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和EMA優(yōu)選通過具有以下式的基本單元形
成:
[0144]
【權(quán)利要求】
1.組合物，其包含: (i)經(jīng)加工的NDV載體、和 (?)藥學或獸醫(yī)學可接受的載體。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中經(jīng)加工的NDV載體包含編碼禽流感HA抗原的異源多核苷酸或其變體。
3.權(quán)利要求1或2的組合物，其中經(jīng)加工的NDV載體包含: 與具有SEQ ID NO:1所不的序列的多核苷酸具有至少90%序列同一'丨生的多核苷酸、或 和與具有SEQ ID NO:1所不的序列的多核苷酸具有至少90%序列同一'丨生的多核苷酸互補的多核苷酸。
4.權(quán)利要求2或3的組合物，其中禽流感HA抗原是H5HA多肽。
5.權(quán)利要求2~4中任一項的組合物，其中HA抗原具有修飾的切割位點。
6.權(quán)利要求2~5中任一項的組合物，其中HA抗原與具有SEQID NO: 15，17，19，21或23所示的序列的多肽具有至少80%氨基酸序列同一性。
7.權(quán)利要求2~6中任一項的組合物，其中異源多核苷酸與具有SEQID NO: 14,16,18,20或22所不的序列的多核苷酸具有至少80%序列同一'丨生。
8.修飾NDV的基因組來產(chǎn)生經(jīng)加工的NDV載體的方法，其中方法包括將分離的多核苷酸在NDV基因組的非必要區(qū)內(nèi)導入NDV基因組中。
9.權(quán)利要求8的方法，其中NDV包含: 與具有SEQ ID NO:1所不的序列的多核苷酸具有至少90%序列同一'丨生的多核苷酸、或 和與具有SEQ ID NO:1所不的序列的多核苷酸具有至少90%序列同一'丨生的多核苷酸互補的多核苷酸。
10.權(quán)利要求8或9的方法，其中非必要區(qū)選自由下列組成的區(qū):位于NP基因上游，APMV基因組的2個基因之間，及L基因的下游的非翻譯區(qū)。
11.權(quán)利要求8~10中任一項的方法，其中非必要區(qū)位于P和M基因之間或M和F基因之間。
12.表達至少一種抗原的經(jīng)加工的NDV載體用于制備組合物的用途，所述組合物用于引發(fā)禽的保護性應(yīng)答或針對至少一種禽病原體而給禽免疫接種。
13.權(quán)利要求12的用途，其中NDV載體包含: 與具有SEQ ID NO:1所不的序列的多核苷酸具有至少90%序列同一'丨生的多核苷酸、或 和與具有SEQ ID NO:1所不的序列的多核苷酸具有至少90%序列同一'丨生的多核苷酸互補的多核苷酸。
14.權(quán)利要求12或13的用途，其中抗原是禽流感抗原。
15.權(quán)利要求14的用途，其中禽流感抗原是血凝素(HA)。
16.權(quán)利要求15的用途，其中禽HA抗原與具有SEQID NO: 15，17，19，21或23所示的序列的多肽具有至少80%序列同一性。
17.權(quán)利要求12~16中任一項的用途，其中所述組合物用于通過眼滴，噴霧，飲用水，卵內(nèi)，肌內(nèi)或皮下來施用。
18.權(quán)利要求12~17中任一項的用途，其中所述組合物用于通過初施-追施而施用。
19.權(quán)利要求18的用途，其中所述初施-追施包括:初次施用權(quán)利要求1~7中任一項的組合物，及 追加_施用: 包含含有及體內(nèi)表達禽病原體抗原的重組病毒載體的疫苗或組合物，或 包含禽病原體抗原的滅活的病毒疫苗，或 包含禽病原體抗原(亞基)的疫苗或組合物，或 含有或表達禽病原體抗原的DNA質(zhì)粒疫苗或組合物。
20.權(quán)利要求18的用途，其中初施-追施包括: 初次施用: 包含含有及體內(nèi)表達禽病原體抗原的重組病毒載體的疫苗或組合物，或 包含禽病原體抗原的滅活的病毒疫苗，或 包含禽病原體抗原(亞基)的疫苗或組合物，或 含有或表達禽病原體抗原的DNA質(zhì)粒疫苗或組合物,及 追加-施用權(quán)利要求1~7中任一項的組合物。
21.權(quán)利要求20的用途，其中， 初次施用包括包含含有及表達禽流感抗原的痘病毒的組合物，而 追加施用包括包含禽流感抗原的權(quán)利要求1~7中任一項的組合物。
22.權(quán)利要求18的用途，其中初施-追施包括: 初次施用權(quán)利要求1~7中任一項的組合物，和 追加施用權(quán)利要求1~7中任一項的組合物。
23.權(quán)利要求12~22中任一項的用途，其中禽是雞或鴨。
24.經(jīng)加工的NDV載體，其包含與SEQID NO:1具有至少90%序列同一性的多核苷酸。
25.分離的多核苷酸,其選自: (a)與具有SEQID N0:l，2，4，6，8，10，12或24所示的序列的多核苷酸具有至少90%序列同一'I"生的多核苷酸； (b)與編碼具有SEQID NO: 3，5，7，9，11或13所示的序列的多肽的多核苷酸具有至少.90%序列同一'丨生的多核苷酸；以及 (C)與(a)或(b)的多核苷酸互補的多核苷酸。
【文檔編號】A61P31/16GK103585643SQ201310493419
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2010年4月2日 優(yōu)先權(quán)日:2009年4月3日
【發(fā)明者】M·巴布洛特, F·雷納爾, F-X·勒格羅斯 申請人:梅里亞有限公司