專利名稱：中藥伊貝母分子生物學(xué)鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥材種質(zhì)的品質(zhì)鑒定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
中藥伊貝母為百合科植物伊犁貝母Fritillaria pallidiflora Schrenk的干燥鱗莖，具有清肺、化痰、散結(jié)之功效，用于肺熱咳嗽，胸悶痰粘，瘰疬，癰腫等癥的治療。伊貝母療效好，生物堿含量高，毒性低，具有很好的市場前景。目前，除原產(chǎn)地新疆外，伊貝母在我國北方部分省份的引種栽培已獲得成功。由于伊貝母毒性低，市場價格較高，為防止用毒性較高的其它種類貝母冒充伊貝母的不良市場行為，需要尋找可靠的將伊貝母與其它貝母相區(qū)別的鑒別方法。然而，用通常的型態(tài)及顯微等鑒定方法難以將伊貝母與其它種類的貝母區(qū)別開來。通過比較各種貝母的一段DNA的堿基序列，找到了伊貝母與其它種類貝母DNA序列的差別，這種差別可通過以下兩種方法加以區(qū)別(1)鑒別性PCR鑒別方法；(2)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)與限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的片段多態(tài)性(RFLP)鑒別方法。但這兩種鑒別對于不同的物種，其所用的引物、限制性內(nèi)切酶的種類及鑒別方法都不相同。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供二種準(zhǔn)確鑒別伊貝母的鑒別性PCR分子鑒定方法(方法1)、PCR-RFLP分子鑒定方法(方法2)，方法1包括伊貝母的特征DNA堿基序列、一對通用PCR引物、一對鑒別性PCR引物及其鑒定方法。方法2包括伊貝母的特征DNA堿基序列、一對PCR引物、一種限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)及其鑒定方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下首先從各藥材中提取總DNA，然后利用方法1或方法2進(jìn)行鑒別。
方法1本發(fā)明設(shè)計的伊貝母聚合酶鏈反應(yīng)的鑒定引物DNA序列為引物1FpdPa5′-ACC GTG TTC ACG ATT GCC TCA GG-3′
引物2FpdPb5′-TCC GGG TCT CTT GAG CCC CTT G-3用全自動DNA合成儀按上述鑒定引物的DNA序列進(jìn)行合成，即可得到鑒定引物的白色粉未結(jié)晶。
中藥材伊貝母聚合酶鏈反應(yīng)鑒定的方法為(1)藥材DNA提取按常規(guī)進(jìn)行，用無離子水將供試品DNA模板濃度調(diào)節(jié)至0.2～0.5μg/μL。
(2)模板DNA質(zhì)量的鑒定用另一對通用引物鑒別模板DNA的質(zhì)量，該對引物可擴(kuò)增各種植物的nrDNAITS區(qū)序列。引物的DNA序列為ITS-P15’-CGTAAC AAG GTT TCC GTA GGT GAA-3’，ITS-P25’-TTA TTG ATA TGC TTA AAC TCAGCG GG-3’(Takaiwa F，Oono K，Sugiura M.Nucleotide sequence of the 17S-25Sspacer region from rice rDNA.Plant Mol Biol，1985，4355-364)；引物濃度為30pmol/μl，除將反應(yīng)體系中引物1、引物2改為ITS-P1、ITS-P2外，其它各物品用量同(3)；除復(fù)性溫度改為53℃外，擴(kuò)增反應(yīng)條件同(4)；電泳分析同(5)。若得到陽性擴(kuò)增，則表明模板合格，可進(jìn)行后續(xù)步驟的檢驗(yàn)；若無擴(kuò)增條帶，則需改進(jìn)DNA提取條件，待獲得合格的模板后再進(jìn)行后續(xù)步驟的檢驗(yàn)。
(3)鑒別性PCR引物用無離子水溶解并稀釋至30pmol/μL。以反應(yīng)體系均以30μL為參考點(diǎn)，各物品的用量為10×TaqDNA聚合酶緩沖液3μlMgCl2(25mM) 2.4μldNTP(10mM)0.6μl引物1、引物2各0.5μlTaq DNA聚合酶 1.0～2.0單位供試品DNA模板 1.0～2.0μl無離子水 加到30μl(4)PCR循環(huán)在PCR儀上，95℃予變性2～4min，然后按下列參數(shù)進(jìn)入30循環(huán)變性95℃ 20～40秒復(fù)性67～72℃ 20～40秒延伸72℃ 20～40秒循環(huán)結(jié)束后在72℃保持2～4分鐘補(bǔ)齊。
(5)電泳觀察取出PCR反應(yīng)液4μl與加樣緩沖液1μl混合，2％瓊脂糖凝膠電泳(含0.5％溴化乙錠，即EB)檢測擴(kuò)增結(jié)果。
如總的反應(yīng)體積不為30μl，反應(yīng)物品的用量以30μl反應(yīng)劑量的比例為參考點(diǎn)，相應(yīng)地增加或減少。
若有陽性擴(kuò)增，則供試品為伊貝母；若為陰性，即無擴(kuò)增條帶，則供試品不為伊貝母。
方法2利用一對引物，用PCR方法擴(kuò)增一段DNA片段，該片段中伊貝母的特征DNA堿基序列為5’-TTCGCGATTG CCTCAGGGCG CTCCGGACAC GG-3’，針對伊貝母與其它種貝母DNA序列的差異，選擇合適的DNA限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，通過分析聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物的限制酶切圖譜差異，達(dá)到快速、準(zhǔn)確鑒別伊貝母目的。對需要鑒定的貝母樣品，提取其總DNA，在給定的PCR條件下，用一對引物(ITS-P1、ITS-P3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，供試品能夠擴(kuò)增出一段DNA片段；用限制性內(nèi)切酶Eco81 I或其同切酶對供試品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，伊貝母會出現(xiàn)126，178bp的條帶，而其它種類的貝母不出現(xiàn)上述兩條帶。當(dāng)供試樣品經(jīng)用本法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA片段的大小，便可準(zhǔn)確地鑒定伊貝母或非伊貝母藥材。本發(fā)明設(shè)計的用于鑒別伊貝母PCR-RFLP分子鑒定方法是采用以下步驟(1)藥材DNA的提取按常規(guī)進(jìn)行，用無離子水將供試樣品的DNA濃度調(diào)節(jié)至0.2～0.5μg/μl；(2)擴(kuò)增DNA片段，即進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，用于聚合酶鏈反應(yīng)的一對引物的DNA序列為ITS-P15’-CGT AAC AAG GTT TCC GTA GGT GAA-3’ITS-P35’-GCT ACG TTC TTC ATC GAT-3’(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入限制性內(nèi)切酶Eco81 I或其同切酶進(jìn)行酶切，限制性內(nèi)切酶Eco81 I或其同切酶的酶切位點(diǎn)為CCTNAGG；(4)瓊脂糖凝膠電泳分析；(5)鑒定結(jié)果的判斷，若出現(xiàn)126，178bp條帶則供試品為伊貝母。
本發(fā)明的效果是可解決伊貝母與其它種貝母相區(qū)別的鑒定難題，方法1提供伊貝母的特征DNA堿基序列、一對通用PCR引物、一對鑒別性PCR引物及其鑒定方法；方法2提供鑒定所需的一對PCR引物、PCR反應(yīng)條件、伊貝母的特征DNA堿基序列、一種限制性內(nèi)切酶。與伊貝母相比，其它種類的貝母所含的有效成分有明顯差別，伊貝母毒性小，因此市場上伊貝母的價格較高。然而，伊貝母與其它種貝母難以通過形態(tài)、顯微等特征來加以區(qū)別，因此，需要找到一種可靠的鑒別方法。本發(fā)明利用伊貝母與其它種貝母藥材DNA序列的差異，建立了快速、便捷、可靠的鑒別性PCR及PCR-RFLP鑒別方法，對于保證伊貝母的藥材質(zhì)量，打擊假冒伊貝母的市場行為具有重要的價值。
具體實(shí)施例方式方法1首先從貝母類藥材不同種的原植物中提取總DNA，用PCR方法擴(kuò)增多個基因片段并分別純化，對各純化片段進(jìn)行DNA序列分析，建立伊貝母及其近緣種、混淆種的DNA序列數(shù)據(jù)庫，在比較數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上，選擇合適的DNA片段，針對藥材偽、混品出現(xiàn)的情況，設(shè)計一對鑒別性PCR引物引物1FpdPa5′-ACC GTG TTC ACG ATT GCC TCA GG-3′引物2FpdPb5′-TCC GGG TCT CTT GAG CCC CTT G-3用全自動DNA合成儀按上述鑒定引物的DNA序列進(jìn)行合成，即可得到鑒定引物的白色粉未結(jié)晶。
采用上述引物對伊貝母的真?zhèn)芜M(jìn)行鑒別，以反應(yīng)體系30μl為例，采用以下步驟進(jìn)行浙貝母的鑒別性聚合酶鏈反應(yīng)(1)藥材DNA提取按常規(guī)進(jìn)行，用無離子水將供試品DNA模板濃度調(diào)節(jié)至0.2～0.5μg/μL。
(2)模板DNA質(zhì)量的鑒定用另一對通用引物鑒別模板DNA的質(zhì)量，該對引物可擴(kuò)增各種植物的nrDNA ITS區(qū)序列。引物的DNA序列為ITS-P15’-CGTAAC AAG GTT TCC GTA GGT GAA-3’，ITS-P25’-TTA TTG ATA TGC TTA AAC TCAGCG GG-3’；引物濃度為30pmol/μl，除將反應(yīng)體系中引物1、引物2改為ITS-P1、ITS-P2外，其它各物品用量同(3)；除復(fù)性溫度為53℃外，擴(kuò)增反應(yīng)條件同(4)；電泳分析同(5)。若得到陽性擴(kuò)增，則表明模板合格，可進(jìn)行后續(xù)步驟的檢驗(yàn)；若無擴(kuò)增條帶，則需改進(jìn)DNA提取條件，待獲得合格的模板后再進(jìn)行后續(xù)步驟的檢驗(yàn)。
(3)鑒別性PCR引物用無離子水溶解并稀釋至30pmol/μL。以反應(yīng)體系均為30μL為參考點(diǎn)，各物品的用量為10×TaqDNA聚合酶緩沖液3μlMgCl2(25mM) 2.4μldNTP(10mM)0.6μl引物1、引物2各0.5μlTaq DNA聚合酶 1.0～2.0單位供試品DNA模板 1.0～2.0μl無離子水 加到30μl(4)PCR循環(huán)在PCR儀上，95℃予變性2～4min，然后按下列參數(shù)進(jìn)入30循環(huán)變性95℃ 20～40秒復(fù)性67～72℃ 20～40秒延伸72℃ 20～40秒循環(huán)結(jié)束后在72℃保持2～4分鐘補(bǔ)齊。
(5)電泳觀察取出PCR反應(yīng)4μl與加樣緩沖液1μl混合，2％瓊脂糖凝膠電泳(含0.5％溴化乙錠，即EB)檢測擴(kuò)增結(jié)果。
若有陽性擴(kuò)增，則供試品為伊貝母；若為陰性，即無擴(kuò)增條帶，則供試品不為伊貝母。
方法2(1)DNA的提取按常規(guī)進(jìn)行，用無離子水將供試樣品的DNA濃度調(diào)節(jié)至0.1～0.3μg/μl；(2)聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)以30μl為參考，各種物品的用量分別為10×PCR緩沖液3μlMgCl2(25mM) 2.4μl
dNTP(各10mM) 0.6μl引物ITS-P1、ITS-P3(30pmol/μl)各0.5μl供試品DNA模板 1～2μlTaqDNA聚合酶 1U(0.2μl)無離子水 補(bǔ)齊至30μl混勻后高速離心數(shù)秒PCR反應(yīng)條件反應(yīng)在PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)條件為95℃予變性3min，然后按以下條件進(jìn)行30循環(huán)變性95℃20～40秒復(fù)性53℃20～40秒延伸72℃20～40秒循環(huán)結(jié)束后在72℃保持2～4分鐘補(bǔ)齊，反應(yīng)結(jié)束后在4℃保存。
PCR產(chǎn)物的電泳檢測取上述反應(yīng)液4μl，與1μl載樣緩沖液混合，用2％瓊脂糖凝膠(含0.5μg/μL溴化乙錠，即EB)電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果，各種DNA樣品均能擴(kuò)增出一條約304bp的DNA條帶；(3)聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物的限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)DNA限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)反應(yīng)液參考體積為20μl，其中各種物品的用量為PCR產(chǎn)物 5～10μL10×Y+限制性內(nèi)切酶緩沖液 2μL限制性內(nèi)切酶Eco81 I 5U無離子水補(bǔ)齊至20μL將反應(yīng)液置37℃保溫3～4小時，反應(yīng)結(jié)束后置于65℃水浴10分鐘，使酶失活；(4)電泳觀察酶切結(jié)果酶切產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠(含0.5μg/μl的溴化乙錠，即EB)，在4V/cm電場強(qiáng)度下電泳30～50分鐘，觀察電泳結(jié)果；(5)測定結(jié)果的判斷，使用限制性內(nèi)切酶Eco81 I或其同切酶對聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，產(chǎn)生對伊貝母與非伊貝母具有鑒別性特征的酶切DNA片段長度圖譜。若供試品出現(xiàn)126，178bp的兩個片段，則為伊貝母；若不出現(xiàn)上述兩個片段，則不為伊貝母。中藥伊貝母分子生物學(xué)鑒定方法<110>中國藥科大學(xué)<120>中藥伊貝母分子生物學(xué)鑒定方法<160>6<210>1<211>23<212>DNA<213>伊貝母(Fritillaria pallidiflora Schrenk)<400>1accgtgttca cgattgcctc agg<210>2<211>22<212>DNA<213>伊貝母(Fritillaria pallidiflora Schrenk)<400>1tccgggtctc ttgagcccct tg<210>3<211>30<212>DNA<213>伊貝母(Fritillaria pallidiflora Schrenk)<400>1ttcgcgattg cctcagggcg ctccggacac<210>4<211>24<212>DNA<213>伊貝母(Fritillaria pallidiflora Schrenk)<400>1cgtaacaagg tttccgtagg tgaa<210>5<211>26<212>DNA<213>伊貝母(Fritillaria pallidiflora Schrenk)<400>1ttattgatat gcttaaactc agcggg<210>6<211>18<212>DNA<213>伊貝母(Fritillaria pallidiflora Schrenk)<400>1gctacgttct tcatcgat
權(quán)利要求
1.一種中藥伊貝母聚合酶鏈反應(yīng)鑒定引物，其特征在于鑒定引物DNA序列為FpdPa5′-ACC GTG TTC ACG ATT GCC TCA GG-3′，F(xiàn)pdPb5′-TCCGGG TCT CTT GAG CCC CTT G-3，用全自動DNA合成儀按上述鑒定引物的DNA序列進(jìn)行合成，即得到鑒定引物的白色粉未結(jié)晶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述鑒定引物鑒定中藥伊貝母的方法，其特征在于中藥材伊貝母聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)鑒定步驟為(1)藥材DNA提取按常規(guī)進(jìn)行，用無離子水將供試品DNA模板濃度調(diào)節(jié)至0.2～0.5μg/μL。(2)模板DNA質(zhì)量的鑒定用另一對通用引物鑒別模板DNA的質(zhì)量，該對引物擴(kuò)增各種植物的nrDNAITS區(qū)序列。引物的DNA序列為ITS-P15’-CGTAAC AAG GTT TCC GTA GGT GAA-3’，ITS-P25’-TTA TTG ATA TGC TTAAAC TCA GCG GG-3’；引物濃度為30pmol/μl，除將反應(yīng)體系中引物改為ITS-P1、ITS-P2外，其它各物品用量同(3)；除復(fù)性溫度改為53℃外，擴(kuò)增反應(yīng)條件同(4)；電泳分析同(5)。若得到陽性擴(kuò)增，則表明模板合格，可進(jìn)行后續(xù)步驟的檢驗(yàn)；若無擴(kuò)增條帶，則需改進(jìn)DNA提取條件，待獲得合格的模板后再進(jìn)行后續(xù)步驟的檢驗(yàn)。(3)鑒別性PCR引物用無離子水溶解并稀釋至30pmol/μL。以反應(yīng)體系均為30μL為參考點(diǎn)，各物品的用量為10×TaqDNA聚合酶緩沖液3μlMgCl2(25mM) 2.4μldNTP(10mM)0.6μl引物FpdPa、FpdPb各0.5μlTaq DNA聚合酶 1.0～2.0單位供試品DNA模板 1.0～2.0μl無離子水 加到30μl(4)PCR循環(huán)在PCR儀上，95℃予變性2～4min，然后按下列參數(shù)進(jìn)入30循環(huán)變性95℃ 20～40秒復(fù)性67～72℃ 20～40秒延伸72℃ 20～40秒循環(huán)結(jié)束后在72℃保持2～4分鐘補(bǔ)齊。(5)電泳觀察取出PCR反應(yīng)液4μl與加樣緩沖液1μl混合，2％瓊脂糖凝膠電泳(含0.5％溴化乙錠，即EB)檢測擴(kuò)增結(jié)果。如總的反應(yīng)體積不為30μl，反應(yīng)物品的用量以30μl反應(yīng)劑量的比例為參考點(diǎn)，相應(yīng)地增加或減少。若有陽性擴(kuò)增，則供試品為伊貝母；若為陰性，即無擴(kuò)增條帶，則供試品不為伊貝母。
3一對聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增引物的DNA堿基序列，其特征在于DNA序列為ITS-P15’-CGTAAC AAG GTT TCC GTA GGT GAA-3’，ITS-P35’-GCT ACGTTC TTC ATC GAT-3’；一種伊貝母特有的DNA堿基序列，其特征在于DNA序列為5’-TTCGCGATTG CCTCAGGGCG CTCCGGACAC GG-3’。；一種伊貝母聚合酶鏈反應(yīng)-限制性酶切圖譜，其特征在于能夠識別伊貝母特有DNA堿基序列的限制性內(nèi)切酶Eco81 I及其同切酶對聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物消化后的瓊脂糖凝膠電泳的特征圖譜。
4根據(jù)權(quán)利要求3所述鑒定引物、特有DNA堿基序列及聚合酶鏈反應(yīng)-限制性酶切圖譜鑒定中藥伊貝母的方法，其特征在于中藥伊貝母聚合酶鏈反應(yīng)-限制性酶切圖譜(PCR-RFLP)鑒定步驟為(1)、藥材DNA的提取按常規(guī)進(jìn)行，用無離子水將供試樣品的DNA濃度調(diào)節(jié)至0.2～0.5μg/μl；(2)、擴(kuò)增DNA片段，用引物ITS-P1、ITS-P3進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，得到聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物(3)、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入限制性內(nèi)切酶Eco81 I或其同切酶進(jìn)行酶切，限制性內(nèi)切酶Eco81 I或其同切酶的酶切位點(diǎn)為CCTNAGG；(4)、瓊脂糖凝膠電泳分析；(5)、鑒定結(jié)果的判斷若出現(xiàn)126，178bp的兩個片段，則供試品為伊貝母，若不出現(xiàn)上述兩個片段，則供試品不為伊貝母。
全文摘要
本發(fā)明屬于中藥鑒定技術(shù)領(lǐng)域，是用于鑒定伊貝母分子鑒定方法。發(fā)明方法設(shè)計的伊貝母聚合酶鏈反應(yīng)的鑒定引物DNA序列為FpdPa5′－ACC GTG TTCACG ATT GCC TCA GG－3′，F(xiàn)pdPb5′－TCC GGG TCT CTT GAG CCC CTT G－3。伊貝母的聚合酶鏈反應(yīng)－限制性酶切圖譜分子鑒定方法(PCR－RFLP)所用的PCR擴(kuò)增引物序列為ITS－P15’－CGT AAC AAG GTT TCC GTA GGT GAA－3’，ITS－P35’－GCT ACG TTC TTC ATC GAT－3’；伊貝母的特征DNA堿基序列為5’－TTCGCGATTG CCTCAGGGCGCTCCGGACAC GG－3’；限制性內(nèi)切酶Eco81 I及其同切酶可識別并切割該序列。本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)伊貝母的快速、準(zhǔn)確地鑒別。
文檔編號C12P19/00GK1487092SQ03131799
公開日2004年4月7日 申請日期2003年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月30日
發(fā)明者李萍, 王沖之, 李 萍 申請人:中國藥科大學(xué)