專利名稱：一種生物學(xué)控制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物學(xué)控制方法，這種方法使用螺旋藻(Spirulina)粉末作為控制劑或抑制劑來控制和抑制真菌感染或傳染。本發(fā)明進(jìn)一步涉及生物和動(dòng)物的生物學(xué)控制方法，更具體地說，就是使用經(jīng)過處理的螺旋藻粉末作為控制劑或抑制劑來抑制害蟲及其相關(guān)疾病的生物學(xué)控制方法。
背景技術(shù)：
依據(jù)國際食品和藥物標(biāo)準(zhǔn)，螺旋藻作為一種蛋白來源被批準(zhǔn)用于人類和動(dòng)物的食用。螺旋藻還含有多種類胡蘿卜素、維生素和礦物質(zhì)(Hayashi&Hayashi，“Calcium Spirulan，來源于藍(lán)綠藻中的盤狀螺旋藻，是一種阻礙有被膜病毒復(fù)制的抑制劑”。J.Nat Prod.(1996)59，p.83)。
正如從上述文章和美國專利No.5585354(Hayashi等)所見到的，螺旋藻還具有抗病毒能力。經(jīng)過熱水處理的螺旋藻提取物已被公開，其中的一種多糖鈣已被提純。純化的提取物治療病毒性疾病有效。
美國專利No.4845085(sesin)揭示了一種來源于Nostoc Sp.的半合成混合物具有抗真菌能力。然而這種混合物至多只顯示出抗絲狀真菌的能力。來源于螺旋藻類的次級(jí)代謝產(chǎn)物還被用作防污濁劑(DE19646324(摘要))。
此外，據(jù)報(bào)導(dǎo)螺旋藻還具有以下一些生物學(xué)活性，如降低血糖(糖尿病)；降低血膽固醇和其它一些作用(Hayashi等)。螺旋藻其它的生物學(xué)活性已經(jīng)被公開，例如Amirani的文章(化學(xué)文摘91169142n)；美國專利No 4886756(Kawamura)公開了來源于螺旋藻的一種限制性內(nèi)切酶；J6303391(摘要)公開了一種方法，這種方法利用螺旋藻制備具有生理活性的物質(zhì)。
現(xiàn)在已知，可以應(yīng)用某種制劑來阻礙競爭性生物(害蟲或污染物)的生長和建立，或者促進(jìn)伴生生物的生長。
然而，現(xiàn)在還沒有控制和抑制競爭性生物的生物學(xué)控制方法，由此可以通過外源因素在不改變螺旋藻基因型的情況下，維持螺旋藻和伴生生物之間的共生關(guān)系。
本發(fā)明人沒有看到任何報(bào)導(dǎo)說螺旋藻是特異性的抗真菌劑(或殺真菌劑)，也沒有看到任何報(bào)導(dǎo)說螺旋藻可以作為農(nóng)業(yè)和園藝中害蟲的生物控制劑。
本發(fā)明的目的是使用經(jīng)過處理的螺旋藻混合物來填補(bǔ)此項(xiàng)空白。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供改進(jìn)的生物學(xué)控制方法，由此可以通過不使用可見光來調(diào)控螺旋藻的活力。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種生物學(xué)控制方法，這種方法與伴生生物(一種與抗真菌劑存在共生關(guān)系的伙伴)協(xié)同控制和抑制真菌污染的生長和影響，此方法中抗真菌劑是經(jīng)過處理的螺旋藻混合物，該方法包括以下步驟經(jīng)過處理的螺旋藻混合物的制備；把所述混合物應(yīng)用到以下被選擇的作用部位或其附近園藝產(chǎn)品、蘑菇菌種、農(nóng)業(yè)產(chǎn)品及其組合，其中所述制備方法包括以下步驟干燥的螺旋藻再次水化，給予培養(yǎng)物以應(yīng)激刺激；并通過冷凍干燥將螺旋藻制成粉末。
優(yōu)選地，本方法進(jìn)一步包括了控制螺旋藻混合物活力的方法，此方法使用可見光，其中螺旋藻混合物被制成液體培養(yǎng)物噴霧劑來應(yīng)用。
更具優(yōu)勢的是，本混合物葉綠素綠顏色的深淺可以作為專利藥制備物保存期長短的一種指標(biāo)。
本發(fā)明還提供了一種抑制或驅(qū)除害蟲的生物學(xué)控制方法，其中使用的殺蟲劑是經(jīng)過處理的螺旋藻混合物，此方法包括以下步驟經(jīng)過處理的螺旋藻混合物的制備；把本混合物應(yīng)用到以下被選擇的作用部位或其附近，這些作用部位包括欲被抑制，驅(qū)除或控制的含有害蟲的液體；害蟲出沒地的食餌存放處或其附近；已知的害蟲飛行路徑上；其中所述制備方法包括以下步驟干燥的螺旋藻再次水化，給予培養(yǎng)物以應(yīng)激刺激，通過冷凍干燥將螺旋藻制成粉末。
甲殼蟲和昆蟲是優(yōu)選的害蟲，更具體地說，在農(nóng)業(yè)、園藝和醫(yī)藥領(lǐng)域中昆蟲被認(rèn)為是害蟲。也優(yōu)選誘餌存放處包含害蟲誘惑劑。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方案單就實(shí)例而言，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案將參考一系列實(shí)例進(jìn)行詳述，它們僅為例證。
在進(jìn)行優(yōu)選實(shí)施方案的描述中，真菌污染、伴生生物和制劑的含義如下真菌污染-分別產(chǎn)生分生孢子(conidia)或子囊(asci)的半知菌(Deutermycota)和子囊菌(Ascomycota)。
伴生生物-與螺旋藻有共生關(guān)系的伙伴。
制劑-藍(lán)細(xì)菌中螺旋藻屬細(xì)胞的存活培養(yǎng)物，具有光合作用和固氮代謝活性。
使用以下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)真菌感染由座菌科(Hypocreaceae)-綠色木霉(TrichodermaViride Canterbury/CTV1)。
真菌感染由新西蘭，Canterbury大學(xué)動(dòng)物部提供。
伴生生物～擔(dān)子菌(Basidiomycota)肺形側(cè)耳(pleurotus Pulmonaries Canterbury CPP1)的一種或是香菇(Lentinula edodes)Western Biologicals，C10、C13、C40(Shiitake mushroom)伴生生物用標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行培養(yǎng)(Staments P，GrowingGourmet&Medicinal Mushrooms，Ten Speed Press，1995)，由新西蘭，Canterbury大學(xué)動(dòng)物部提供。
制劑盤狀螺旋藻(Spirulina platensis)，(Earthrise Farms，Mass Culture Facilitico，California)。
混合物制備干燥的盤狀螺旋藻在0.84w/v碳酸氫鈉溶液(pH8.5)中再次水化約12小時(shí)，最好在光照下進(jìn)行(8～80Watts/m2)。
任選地，再次水化的溶液可含有0.04～0.25w/v的硫化鈉以便抑制細(xì)菌生長。
可以用減少營養(yǎng)供應(yīng)或部分干燥的應(yīng)激刺激使培養(yǎng)菌種進(jìn)入靜止期。
該混合物經(jīng)冷凍干燥可制備出不含其它存活生物的粉末?；蛘呤褂蒙唐坊?yīng)的干燥的盤狀螺旋藻(Earthrise Farms)實(shí)驗(yàn)實(shí)例1-伴生生物感染肺形側(cè)耳的組織標(biāo)本在25℃環(huán)境下的PDA皿中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)生成的菌苔占據(jù)培養(yǎng)基表面2/3左右時(shí)，用2.5％的綠色木霉浸濕的菌絲和孢子懸液對(duì)每個(gè)培養(yǎng)基進(jìn)行劃線接種，在25℃環(huán)境下孵育5～7天以便建立產(chǎn)生孢子的真菌污染物。真菌污染是否產(chǎn)生孢子可依據(jù)分生孢子的特征性綠顏色來判斷。被綠色木霉感染的培養(yǎng)基分成對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。
用制劑處理實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)皿分別用(0.1％、1％、5％w/v)的盤狀螺旋藻混合物噴灑在表面。
整個(gè)培養(yǎng)皿進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中微生物群體的組成每天都進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控。2～5天內(nèi)綠色木霉完全覆蓋了對(duì)照組培養(yǎng)基的表面，而實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基表面大量的綠色木霉感染卻在減少，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基含有各種濃度(0.1％、1％、5％w/v)的盤狀螺旋藻。
在噴灑螺旋藻混合物后約24小時(shí)，污染的分生孢子由綠色變?yōu)楹志G色。4天內(nèi)，污染的分生孢子表現(xiàn)為綠色球形團(tuán)塊，而肺形側(cè)耳的白色菌絲快速侵入這些綠色物質(zhì)。進(jìn)一步孵育48小時(shí)，培養(yǎng)基表面看不到污染的跡象，并且擔(dān)子菌，肺形側(cè)耳完全恢復(fù)而在實(shí)驗(yàn)組各培養(yǎng)皿上形成連續(xù)的菌苔。
光學(xué)和掃描電鏡綠色木霉污染的肺形側(cè)耳培養(yǎng)物經(jīng)螺旋藻處理前后進(jìn)行形態(tài)學(xué)比較，處理前，綠色木霉分生孢子梗的分支形態(tài)明顯地是瓶梗樣分支結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)終止于分支孢子的分支。經(jīng)過制劑處理后一天，分生孢子出現(xiàn)球形結(jié)構(gòu)，其表面基本沒有或只有一點(diǎn)裝飾結(jié)構(gòu)(ornamentation)。處理后五天，菌絲和分生孢子結(jié)構(gòu)觸合成一團(tuán)不規(guī)則形的原生質(zhì)樣的物質(zhì)，這些物質(zhì)并無細(xì)胞壁包被，還可觀察到肺形側(cè)耳菌絲侵入這些物質(zhì)。由此可得出結(jié)論，即真菌污染是通過伴生生物來進(jìn)行腐生性代謝的。
使用擔(dān)子菌香菇重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)步驟，仍然得出上述相同的結(jié)果。
實(shí)例2-真菌污染的處理25℃環(huán)境下，將2.5％綠色木霉浸潤的菌絲和孢子懸液劃線接種于PDA培養(yǎng)皿中并孵育5～7天。當(dāng)孢子形成時(shí)，用1％w/v的螺旋藻粉末噴灑到每一個(gè)培養(yǎng)皿上，噴灑面積為培養(yǎng)基表面的100％或50％。
接受制劑100％面積噴灑的培養(yǎng)基在制劑噴灑三天內(nèi)就變成黑色。綠色木霉的分生孢子梗和分生孢子干燥化，未見到孢子形成和真菌污染的再生長。
接受制劑50％面積噴灑的培養(yǎng)基；在噴灑區(qū)和未噴灑區(qū)之間出現(xiàn)間斷的界限差別。噴灑區(qū)的培養(yǎng)基變成深褐色或黑色，這和接受100％面積噴灑的培養(yǎng)基一樣，然而大約五天之后，界限漸漸消失，螺旋藻制劑可移行到未噴灑區(qū)而攻擊先前未受損的污染菌絲。以上的觀察顯示，本制劑和其它藍(lán)細(xì)菌一樣，具有游走能力。藍(lán)細(xì)菌的游走速度估計(jì)約有每天2.5毫米。
實(shí)例3-共同培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)A.用制劑預(yù)處理將5克盤狀螺旋藻粉末與商品化的蘑菇菌種體(肺形側(cè)耳和香菇(L.edodes))混合。這種螺旋藻制劑/伴生生物的混合物，使用已知的方法(袋裝培養(yǎng))，在含有Pinus radiata培養(yǎng)基的3公斤塑料袋中培養(yǎng)。培養(yǎng)菌種首次大批成熟(產(chǎn)生成熟菌體或蘑菇)的時(shí)間，成熟菌體的形態(tài)和口味都與對(duì)照組相比進(jìn)行了評(píng)價(jià)。
經(jīng)過處理的蘑菇菌種，其生長速度提高了17％(即首次大批成熟為15天，而對(duì)照組為18天)，產(chǎn)量也比對(duì)照組高出10％。經(jīng)過處理的成熟菌體，其形態(tài)或口味與對(duì)照組的菌體相比沒有變化。
從經(jīng)過處理的蘑菇菌種產(chǎn)量提高的百分率和首次大批成熟期縮短三天的分析來推斷，藍(lán)細(xì)菌與伴生的擔(dān)子菌具有協(xié)同作用。發(fā)明者認(rèn)為藍(lán)細(xì)菌可降解非擔(dān)子菌細(xì)胞壁殼多糖的組分，然而這一推測的機(jī)理還有待于證實(shí)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，藍(lán)細(xì)菌的滲出物顯示了促進(jìn)成熟菌體產(chǎn)量的作用。
B.不用可見光對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響用于食用擔(dān)子菌培養(yǎng)的商品化培養(yǎng)袋是在適宜的環(huán)境下按以下步驟進(jìn)行的擔(dān)子菌菌絲生長成為菌體支持系統(tǒng)，其中菌絲與培養(yǎng)基的接合構(gòu)成了持續(xù)穩(wěn)固的生長團(tuán)塊，以至于聚乙烯塑料生產(chǎn)袋可以被移走。生長團(tuán)塊表面的菌絲外被層逐漸老化而呈現(xiàn)出深褐色可觀察到的墊狀物，這一墊狀物被稱作“樹皮”(barking)，成熟菌體是由活躍的菌絲在老化的菌絲外被層下大量成熟起來的。
按先前描述的方法，20個(gè)3公斤的肺形側(cè)耳生長團(tuán)塊2.5％w/v綠色木霉浸濕的菌絲和孢子懸液進(jìn)行噴灑接種，并在25℃有光照的培養(yǎng)室內(nèi)孵育至出現(xiàn)有孢子形成的真菌污染物。將真菌污染的生長團(tuán)塊分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組各五個(gè)。實(shí)驗(yàn)組用1％w/v的制劑進(jìn)行表面噴灑。
對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組都進(jìn)一步孵育大約3天，直到肉眼看不到孢子形成和污染物綠色木霉外周菌絲的生長。然后，第一對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組被移至漆黑的25℃培養(yǎng)室中，其余四對(duì)繼續(xù)在光照環(huán)境中孵育。每天監(jiān)測各組微生物的相對(duì)數(shù)量。
對(duì)照組中無論是有光照組還是無光照組的生長團(tuán)塊在培養(yǎng)基周邊都無特征性“樹皮”樣老化的菌絲外被層形成。綠色木霉孢子中綠色的分布和深淺程度顯示，第一個(gè)對(duì)照組被移到漆黑的培養(yǎng)室后2～3天內(nèi)綠色木霉污染已經(jīng)占據(jù)主導(dǎo)地位或超過擔(dān)子菌的生長。對(duì)培養(yǎng)基的檢查沒有發(fā)現(xiàn)活躍代謝的肺形側(cè)耳菌絲。對(duì)照組的培養(yǎng)基因擔(dān)子菌菌絲腐敗而失去了生長團(tuán)塊的穩(wěn)固性。
實(shí)驗(yàn)組中無論是有光照組還是無光照組的生長團(tuán)塊都顯示綠色木霉污染明顯減少。在被處理后4～5天內(nèi)，綠色木霉停止形成孢子。然而，無光照環(huán)境下孵育的實(shí)驗(yàn)組從培養(yǎng)基中清除綠色木霉污染的速度較慢(與有光照實(shí)驗(yàn)組相比，時(shí)間大約滯后2～4天)。生長團(tuán)塊可見特征性的葉綠素樣綠顏色，并生長出成熟菌體。
無光照的優(yōu)勢在于，當(dāng)螺旋藻的生長因?yàn)楣夂献饔玫闹兄苟灰种茣r(shí)，螺旋藻降解綠色木霉細(xì)胞壁的能力提高了。伴生生物擔(dān)子菌從中有兩方面益處，因?yàn)閷?duì)于擔(dān)子菌的營養(yǎng)來源來說，來自綠色木霉和藍(lán)細(xì)菌的競爭受到限制，另外可能是受損的綠色木霉菌絲和藍(lán)細(xì)菌在光合作用及固氮作用中產(chǎn)生的滲出物為擔(dān)子菌提供了氮素來源。
發(fā)明者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)培養(yǎng)室的光照強(qiáng)度可以影響螺旋藻和同伴擔(dān)子菌的活力。完全無光照則完全失掉了螺旋藻的光合作用。螺旋藻是具有光合作用和固氮作用的自營性生物，來自活性細(xì)胞的滲出物可給伴生生物提供有機(jī)氮和其它豐富的有機(jī)營養(yǎng)物。
實(shí)例4-綠色木霉污染的原位處理擔(dān)子菌成熟菌體和木質(zhì)纖維素的綠色木霉感染商品化培養(yǎng)的擔(dān)子菌易于形成點(diǎn)狀真菌感染，這些真菌可以感染含木質(zhì)纖維素的培養(yǎng)基和蘑菇。對(duì)于諸如綠色木霉類的真菌感染，培養(yǎng)室為真菌感染的播散和生長各自提供了良好的含氧和潮濕環(huán)境。
發(fā)明者向真菌感染的成熟菌體噴灑1％w/v的螺旋藻懸液而有效地控制了真菌的點(diǎn)狀感染。向真菌感染的同伴擔(dān)子菌噴灑相同的懸液，當(dāng)擔(dān)子菌處于活躍狀態(tài)時(shí)，產(chǎn)生快速的反應(yīng)。在以上處理之前2～3天給擔(dān)子菌澆水即可使其活躍。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，撒到培養(yǎng)基上的螺旋藻粉末可以限制和治療輕微的真菌感染。
實(shí)例5-控制蚊子的原位處理在含有蚊子幼蟲的一個(gè)10平方米左右的池塘中進(jìn)行了三次實(shí)驗(yàn)，每次都是將15克的螺旋藻粉末(或者是上述實(shí)例中的干燥乳膏)撒到水面上。1～5天內(nèi)所有的蚊子幼蟲都死亡。
蚊子幼蟲死亡的機(jī)制還不清楚，蚊子幼蟲食用了螺旋藻是明確的。據(jù)推測是外殼多糖酶消化了襯附在幼蟲中、后腸腔的外周營養(yǎng)膜，這樣就使得蚊子幼蟲易被感染而死亡。
實(shí)例6-蒼蠅和黃蜂的實(shí)驗(yàn)處理將25％w/v的螺旋藻干燥乳膏放在商品化的油膩基座上(作為誘餌)并暴露于有蒼蠅和黃蜂存在的自然環(huán)境中而進(jìn)行了十次實(shí)驗(yàn)。在誘餌的附近可發(fā)現(xiàn)死亡的蒼蠅和黃蜂。
雖然機(jī)理還不清楚，但蒼蠅和黃蜂的死亡原因和實(shí)例5中推測的原理是相似的。
盡管在本實(shí)驗(yàn)中未使用其它誘餌，可以認(rèn)為其它誘餌也可以加到螺旋藻乳膏中而不降低其作用。
雖然本發(fā)明以有關(guān)蘑菇培養(yǎng)的生物學(xué)控制作為優(yōu)選的實(shí)施方案進(jìn)行了敘述，但還可以認(rèn)為本發(fā)明可用于防止和治療其它果品和蔬菜類農(nóng)產(chǎn)品的感染。
權(quán)利要求
1.一種與伴生生物(伴生生物是與抗真菌制劑有共生關(guān)系的伙伴)協(xié)同作用來控制和抑制真菌污染的生長和影響的生物學(xué)控制方法，其中抗真菌制劑是經(jīng)過處理的螺旋藻混合物，該方法包括以下步驟經(jīng)過處理的螺旋藻混合物的制備；把該混合物應(yīng)用到以下被選擇的作用部位上或其附近園藝產(chǎn)品、蘑菇菌種、農(nóng)業(yè)產(chǎn)品及其組合，其中制備方法包括以下步驟干燥的螺旋藻再次水化，給予培養(yǎng)物以應(yīng)激刺激，并通過冷凍干燥將螺旋藻制成粉末。
2.權(quán)利要求1所述的生物學(xué)控制方法，其中所述制備方法進(jìn)一步包括含有0.84w/v碳酸氫鈉，pH為8.5的螺旋藻再次水化溶液，水化時(shí)間為12小時(shí)左右。
3.權(quán)利要求1或2所述的生物學(xué)控制方法，其中該混合物經(jīng)冷凍干燥制備出不含其它存活生物的粉末。
4.權(quán)利要求l至3任一項(xiàng)所述的生物學(xué)控制方法，其中該混合物制備過程中的再次水化是在8～80Watts/m2的光照下進(jìn)行的。
5.權(quán)利要求1到4任一項(xiàng)所述的生物學(xué)控制方法，其中再次水化的溶液中含有0.04～0.25w/v的硫化鈉。
6.權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的控制和抑制真菌污染的生長和影響的生物學(xué)控制方法，其中該方法進(jìn)一步包括使用一種方法調(diào)控螺旋藻的活力。
7.權(quán)利要求6所述的控制和抑制真菌污染的生長和影響的生物學(xué)控制方法，其中所說的方法是使用可見光。
8.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的控制和抑制真菌污染的生長和影響的生物學(xué)控制方法，其中的伴生生物是擔(dān)子菌。
9.權(quán)利要求8所述的控制和抑制真菌污染的生長和影響的生物學(xué)控制方法，其中的伴生生物是肺形側(cè)耳和香菇中的一種。
10.控制、抑制或驅(qū)除害蟲的生物學(xué)控制方法，其中使用了殺蟲劑，所述殺蟲劑是經(jīng)過處理的螺旋藻混合物，該方法包括以下步驟經(jīng)過處理的螺旋藻混合物的制備；把所述混合物應(yīng)用到以下被選擇的作用部位或其附近含有欲被抑制、驅(qū)除或控制的害蟲的液體；有害蟲出沒地的誘餌存放處及其附近或者是這些害蟲已知的飛行路徑；其中所述制備方法包括以下步驟將干燥的螺旋藻再次水化，給予培養(yǎng)物以應(yīng)激刺激，并通過冷凍干燥將螺旋藻制成粉末。
11.權(quán)利要求10所述的控制、抑制或驅(qū)除害蟲的生物學(xué)控制方法，其中的害蟲是甲殼蟲和昆蟲。
12.權(quán)利要求11所述的控制、抑制或驅(qū)除害蟲的生物學(xué)控制方法，其中的昆蟲是那些在農(nóng)業(yè)、園藝和醫(yī)藥行業(yè)中被認(rèn)為是害蟲的昆蟲。
13.一種用作抗真菌劑的制備物，該制備物包括權(quán)利要求1到9任一項(xiàng)的方法中使用的經(jīng)處理的螺旋藻混合物。
14.一種用作殺蟲劑的制備物，該制備物包括權(quán)利要求10到12任一項(xiàng)的方法中使用的經(jīng)處理的螺旋藻混合物。
全文摘要
將干燥的螺旋藻(Spirulina)再次水化,給予培養(yǎng)物以應(yīng)激刺激,并通過冷凍干燥將螺旋藻制成粉末,然后把該粉末應(yīng)用于真菌污染部位來控制和抑制真菌污染的生長和影響。
文檔編號(hào)A61F13/00GK1245399SQ97181673
公開日2000年2月23日 申請(qǐng)日期1997年12月9日 優(yōu)先權(quán)日1996年12月9日
發(fā)明者凱爾文·溫斯頓·鄧肯, A·I·麥雷 申請(qǐng)人:凱爾文·溫斯頓·鄧肯