應(yīng)用線蟲Hsp12.2蛋白表達量作為標(biāo)識物鑒定農(nóng)藥滴丁酯的方法
【專利摘要】應(yīng)用線蟲Hsp12.2蛋白表達量作為標(biāo)識物鑒定農(nóng)藥滴丁酯的方法，本發(fā)明涉及一種農(nóng)藥滴丁酯的檢測方法，它為了解決現(xiàn)有農(nóng)藥滴丁酯的檢測方法的檢出限較低的問題。鑒定方法：一、配置培養(yǎng)液；二、加入待測液體；三、再接入秀麗隱桿線蟲進行培養(yǎng)；四、配置浸泡液；五、凍融后的線蟲置于浸泡液中；六、配置反應(yīng)試劑；七、反應(yīng)試劑中加入Hsp12.2蛋白抗體和線蟲，孵育處理；八、加入熒光標(biāo)記的二抗染色；九、進行熒光強度檢測，完成滴丁酯的檢測。本發(fā)明通過線蟲Hsp12.2蛋白表達量作為標(biāo)識物鑒定農(nóng)藥滴丁酯，可檢測出濃度為0.002％的滴丁酯，實現(xiàn)了對可疑農(nóng)藥的高效檢測。
【專利說明】
應(yīng)用線蟲HsP12.2蛋白表達量作為標(biāo)識物鑒定農(nóng)藥滴丁酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種農(nóng)藥滴丁酯的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]滴丁酯是一種在我國廣泛應(yīng)用的除草劑，主要防除水稻等禾本科作物田中雙子葉雜草，莎草及某些惡性雜草。現(xiàn)有農(nóng)藥常用檢測方法包括高效液相色譜法、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、化學(xué)分析法等。應(yīng)用分子生物學(xué)方法進行化學(xué)品的靶位標(biāo)識，可提高待測物質(zhì)的檢出限與精確度。線蟲對滴丁酯農(nóng)藥反映敏感，應(yīng)激蛋白Hspl2.2受滴丁酯誘導(dǎo)表達顯著。熒光免疫定位化學(xué)法(Immunostaining)可選擇相應(yīng)抗體，使用焚光標(biāo)識，根據(jù)焚光表達量換算出蛋白表達量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是要解決現(xiàn)有農(nóng)藥滴丁酯的檢測方法的檢出限較低的問題，而提供應(yīng)用線蟲Hspl2.2蛋白表達量作為標(biāo)識物鑒定農(nóng)藥滴丁酯的方法。
[0004]本發(fā)明應(yīng)用線蟲Hspl2.2蛋白表達量作為標(biāo)識物鑒定農(nóng)藥滴丁酯的方法按下列步驟實現(xiàn):
[0005]一、將0.3g KH2P04、0.6g Na2HPO4和0.4?0.6g NaCl溶于10mL去離子水中，得到培養(yǎng)液；
[0006]二、將步驟一得到的1mL培養(yǎng)液置于培養(yǎng)皿中，然后加入待測液體，得到待測培養(yǎng)液體；
[0007]三、向待測培養(yǎng)液體中接入100?120條秀麗隱桿線蟲進行培養(yǎng)，得到接有秀麗隱桿線蟲的待測培養(yǎng)液；
[0008]四、將0.88恥(:1、0.028KCU0.18gNa2HP04.2出0和0.0lgKH2PO4混合，用蒸餾水定容至10mL，調(diào)節(jié)體系的pH=7.0?7.5，再加入1g牛血清蛋白，得到浸泡液；
[0009]五、取出步驟三中的秀麗隱桿線蟲置于液氮中反復(fù)凍融多次，然后放入步驟四的浸泡液中，得到浸泡處理的秀麗隱桿線蟲；
[0010]六、將2.48的1'1^-1^186、8.88的他(]1和0.51111^的1￥6611 20混合，然后用去離子水定容至I OOOmL，得到反應(yīng)試劑；
[0011]七、將0.1g Hspl2.2蛋白抗體加入5mL步驟六的反應(yīng)試劑中，然后加入浸泡處理的秀麗隱桿線蟲，在搖床上搖動孵育處理，得到孵育處理的秀麗隱桿線蟲；
[0012]八、通過浸泡液清洗孵育處理的秀麗隱桿線蟲，然后加入0.1g熒光標(biāo)記的二抗染色處理，得到染色后的秀麗隱桿線蟲；
[0013]九、在熒光顯微鏡下進行熒光強度檢測，通過顯微分析量化Hspl2.2蛋白表達量，檢測待測液體中是否含有農(nóng)藥滴丁酯。
[0014]本發(fā)明通過線蟲Hspl2.2蛋白表達量作為標(biāo)識物鑒定農(nóng)藥滴丁酯，彌補了常規(guī)化學(xué)分析中檢出限較低的不足，本發(fā)明對目標(biāo)檢測物特異性高，可檢測出濃度為0.002%的滴丁酯，實現(xiàn)了對可疑農(nóng)藥的高效檢測。
【附圖說明】
[0015]圖1為實施例不同滴丁酯濃度誘導(dǎo)下線蟲Hspl2.2蛋白表達相對量的柱狀圖。
【具體實施方式】
[0016]【具體實施方式】一:本實施方式應(yīng)用線蟲Hspl2.2蛋白表達量作為標(biāo)識物鑒定農(nóng)藥滴丁酯的方法按下列步驟實施:
[0017]一、將0.3g KH2P04、0.6g Na2HPO4和0.4?0.6g NaCl溶于10mL去離子水中，得到培養(yǎng)液；
[0018]二、將步驟一得到的1mL培養(yǎng)液置于培養(yǎng)皿中，然后加入待測液體，得到待測培養(yǎng)液體；
[0019]三、向待測培養(yǎng)液體中接入100?120條秀麗隱桿線蟲進行培養(yǎng)，得到接有秀麗隱桿線蟲的待測培養(yǎng)液；
[0020]四、將0.88恥(:1、0.028KCU0.18gNa2HP04.2H20和0.0lgKH2PO4混合，用蒸餾水定容至10mL，調(diào)節(jié)體系的pH=7.0?7.5，再加入1g牛血清蛋白，得到浸泡液；
[0021]五、取出步驟三中的秀麗隱桿線蟲置于液氮中反復(fù)凍融多次，然后放入步驟四的浸泡液中，得到浸泡處理的秀麗隱桿線蟲；
[0022]六、將2.48的1'1^3-1^186、8.88的他(]1和0.51111^的1￥6611 20混合，然后用去離子水定容至I OOOmL，得到反應(yīng)試劑；
[0023]七、將0.1g Hspl2.2蛋白抗體加入5mL步驟六的反應(yīng)試劑中，然后加入浸泡處理的秀麗隱桿線蟲，在搖床上搖動孵育處理，得到孵育處理的秀麗隱桿線蟲；
[0024]八、通過浸泡液清洗孵育處理的秀麗隱桿線蟲，然后加入0.1g熒光標(biāo)記的二抗染色處理，得到染色后的秀麗隱桿線蟲；
[0025]九、在熒光顯微鏡下進行熒光強度檢測，通過顯微分析量化Hspl2.2蛋白表達量，檢測待測液體中是否含有農(nóng)藥滴丁酯。
[0026]本實施方式步驟八是將孵育處理的線蟲置于浸泡液中進行清洗。步驟九通過Hspl2.2蛋白表達量來鑒定待測液體是否含有農(nóng)藥滴丁酯，當(dāng)?shù)鞍妆磉_量高于正常值15%即表明待測液體中含有滴丁酯，其中正常值是指步驟二的待測液體為純水時的蛋白表達量。
[0027]本實施方式中所使用的秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)編號為N2，取自美國線蟲遺傳中心(Caenorhabditis Genetics Center，CGC)。通過線蟲Hspl2.2蛋白表達量作為標(biāo)識物鑒定農(nóng)藥滴丁酯特異性高，可檢測出濃度為0.002%的滴丁酯，通過熒光免疫定位化學(xué)法表征線蟲Hspl2.2蛋白表達量可實現(xiàn)食品安全與環(huán)境保護要求下農(nóng)藥滴丁酯的尚效檢測。
[0028]【具體實施方式】二:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是步驟三中所述培養(yǎng)的時間為3.5?4.5h。其它步驟及參數(shù)與【具體實施方式】一相同。
[0029]【具體實施方式】三:本實施方式與【具體實施方式】一或二不同的是步驟五放入浸泡液中浸泡I?2小時。其它步驟及參數(shù)與【具體實施方式】一或二相同。
[0030]【具體實施方式】四:本實施方式與【具體實施方式】一至三之一不同的是步驟五取出步驟三中的線蟲置于液氮中反復(fù)凍融3?5次。其它步驟及參數(shù)與【具體實施方式】一至三之一相同。
[0031]【具體實施方式】五:本實施方式與【具體實施方式】一至四之一不同的是步驟七在搖床上搖動孵育處理I小時。其它步驟及參數(shù)與【具體實施方式】一至四之一相同。
[0032]【具體實施方式】六:本實施方式與【具體實施方式】一至五之一不同的是步驟八通過浸泡液反復(fù)清洗孵育處理的線蟲3?5次。其它步驟及參數(shù)與【具體實施方式】一至五之一相同。
[0033]【具體實施方式】七:本實施方式與【具體實施方式】一至六之一不同的是步驟八加入
0.1g熒光標(biāo)記的二抗染色處理I小時。其它步驟及參數(shù)與【具體實施方式】一至六之一相同。
[0034]【具體實施方式】八:本實施方式與【具體實施方式】一至七之一不同的是當(dāng)步驟二所述的待測液體為純水時，步驟九通過顯微分析得到量化Hspl2.2蛋白表達量設(shè)為正常值。其它步驟及參數(shù)與【具體實施方式】一至七之一相同。
[0035]【具體實施方式】九:本實施方式與【具體實施方式】八不同的是步驟九當(dāng)通過顯微分析量化Hspl2.2蛋白表達量高于正常值時，則鑒定結(jié)果為待測培養(yǎng)液體中含有農(nóng)藥滴丁酯。其它步驟及參數(shù)與【具體實施方式】八相同。
[0036]【具體實施方式】十:本實施方式與【具體實施方式】九不同的是步驟九當(dāng)通過顯微分析量化Hspl2.2蛋白表達量高于正常值15%時，則鑒定結(jié)果為待測培養(yǎng)液體中含有農(nóng)藥滴丁酯。其它步驟及參數(shù)與【具體實施方式】九相同。
[0037]實施例一:本實施例應(yīng)用線蟲Hspl2.2蛋白表達量作為標(biāo)識物鑒定農(nóng)藥滴丁酯的方法按下列步驟實現(xiàn):
[0038]一、將 0.3g KH2P04、0.6g Na2HPO4 和 0.5g NaCl 溶于 10mL 去離子水中，得到培養(yǎng)液；
[0039]二、將步驟一得到的1mL培養(yǎng)液置于培養(yǎng)皿中，然后加入10yL含0.002%滴丁酯液體，得到待測培養(yǎng)液體；
[0040]三、向待測培養(yǎng)液體中接入100條秀麗隱桿線蟲進行培養(yǎng)4h，得到接有秀麗隱桿線蟲的待測培養(yǎng)液；
[0041 ]四、將0.88恥(:1、0.028 KCU0.18gNa2HP04.2H20和0.0lgKH2PO4混合，用蒸餾水定容至10mL，調(diào)節(jié)體系的pH=7.4，再加入1g牛血清蛋白，得到浸泡液；
[0042]五、取出步驟三中的秀麗隱桿線蟲置于液氮中反復(fù)凍融3次，然后放入步驟四的浸泡液中I小時，得到浸泡處理的秀麗隱桿線蟲；
[0043]六、將2.48的1'1^3-1^186、8.88的他(]1和0.51111^的1￥6611 20混合，然后用去離子水定容至I OOOmL，得到反應(yīng)試劑；
[0044]七、將0.1g Hspl2.2蛋白抗體加入5mL步驟六的反應(yīng)試劑中，然后加入浸泡處理的秀麗隱桿線蟲，在搖床上搖動孵育處理I小時，得到孵育處理的秀麗隱桿線蟲；
[0045]八、通過浸泡液反復(fù)清洗孵育處理的秀麗隱桿線蟲3次，然后加入0.1g熒光標(biāo)記的二抗染色處理I小時，得到染色后的秀麗隱桿線蟲；
[0046]九、在ze i SS焚光顯微鏡(Axi ο Observer Al)下進行焚光強度檢測，利用Ax1Vis1n LE圖像軟件顯微分析系統(tǒng)量化Hspl2.2蛋白表達量，蛋白表達量高于正常值15%，完成農(nóng)藥滴丁酯的鑒定。
[0047]本實施例步驟二所述的含0.002%滴丁酯液體是指質(zhì)量濃度為0.002%滴丁酯的水溶液。
[0048]實施例二:本實施例與實施例一不同的是步驟二加入10yL含0.01 %滴丁酯液體。
[0049]本實施例步驟九利用Ax1Vis1nLE圖像軟件顯微分析系統(tǒng)量化Hspl2.2蛋白表達量，蛋白表達量高于正常值30 %。
[0050]實施例三:本實施例與實施例一不同的是步驟二加入10yL含0.05%滴丁酯液體。[0051 ]本實施例步驟九利用Ax1Vis1n LE圖像軟件顯微分析系統(tǒng)量化Hspl2.2蛋白表達量，蛋白表達量高于正常值50 %。
[0052]實施例四:本實施例與實施例一不同的是步驟二加入10yL含0.1%滴丁酯液體。
[0053]本實施例步驟九利用Ax1Vis1nLE圖像軟件顯微分析系統(tǒng)量化Hspl2.2蛋白表達量，蛋白表達量高于正常值70 %。
[0054]實施例中所述的正常值是當(dāng)步驟二中加入10yL純水，得到的Hspl2.2蛋白表達量。
[0055]實施例一至四不同濃度下滴丁酯誘導(dǎo)下線蟲Hspl2.2蛋白表達相對量的柱狀圖如圖1所示，圖1顯示出通過熒光免疫定位化學(xué)法表征線蟲Hspl2.2的蛋白表達量，實現(xiàn)了對農(nóng)藥滴丁酯的尚效檢測。
【主權(quán)項】
1.應(yīng)用線蟲Hspl2.2蛋白表達量作為標(biāo)識物鑒定農(nóng)藥滴丁酯的方法，其特征在于是按下列步驟實現(xiàn): 一、將0.3gKH2P04、0.6g Na2HPO4和0.4?0.6g NaCl溶于10mL去離子水中，得到培養(yǎng)液； 二、將步驟一得到的1mL培養(yǎng)液置于培養(yǎng)皿中，然后加入待測液體，得到待測培養(yǎng)液體； 三、向待測培養(yǎng)液體中接入100?120條秀麗隱桿線蟲進行培養(yǎng)，得到接有秀麗隱桿線蟲的待測培養(yǎng)液； 0J#0.8gNaCl、0.02g KCU0.18gNa2HP04.2H20和0.0lgKH2PO4混合，用蒸餾水定容至10mL，調(diào)節(jié)體系的pH=7.0?7.5，再加入1g牛血清蛋白，得到浸泡液； 五、取出步驟三中的秀麗隱桿線蟲置于液氮中反復(fù)凍融多次，然后放入步驟四的浸泡液中，得到浸泡處理的秀麗隱桿線蟲； 六、將2.4g的Tris-Base、8.8g的NaCl和0.SmlJtlTween20混合，然后用去離子水定容至100mL，得到反應(yīng)試劑； 七、將0.1g Hspl2.2蛋白抗體加入5mL步驟六的反應(yīng)試劑中，然后加入浸泡處理的秀麗隱桿線蟲，在搖床上搖動孵育處理，得到孵育處理的秀麗隱桿線蟲； 八、通過浸泡液清洗孵育處理的秀麗隱桿線蟲，然后加入0.1g熒光標(biāo)記的二抗染色處理，得到染色后的秀麗隱桿線蟲； 九、在熒光顯微鏡下進行熒光強度檢測，通過顯微分析量化Hspl2.2蛋白表達量，檢測待測液體中是否含有農(nóng)藥滴丁酯。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用線蟲Hspl2.2蛋白表達量作為標(biāo)識物鑒定農(nóng)藥滴丁酯的方法，其特征在于步驟三中所述培養(yǎng)的時間為3.5?4.5h。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用線蟲Hspl2.2蛋白表達量作為標(biāo)識物鑒定農(nóng)藥滴丁酯的方法，其特征在于步驟五放入浸泡液中浸泡I?2小時。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用線蟲Hspl2.2蛋白表達量作為標(biāo)識物鑒定農(nóng)藥滴丁酯的方法，其特征在于步驟五取出步驟三中的線蟲置于液氮中反復(fù)凍融3?5次。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用線蟲Hspl2.2蛋白表達量作為標(biāo)識物鑒定農(nóng)藥滴丁酯的方法，其特征在于步驟七在搖床上搖動孵育處理I小時。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用線蟲Hspl2.2蛋白表達量作為標(biāo)識物鑒定農(nóng)藥滴丁酯的方法，其特征在于步驟八通過浸泡液反復(fù)清洗孵育處理的線蟲3?5次。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用線蟲Hspl2.2蛋白表達量作為標(biāo)識物鑒定農(nóng)藥滴丁酯的方法，其特征在于步驟八加入0.1g熒光標(biāo)記的二抗染色處理I小時。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用線蟲Hspl2.2蛋白表達量作為標(biāo)識物鑒定農(nóng)藥滴丁酯的方法，其特征在于當(dāng)步驟二所述的待測液體為純水時，步驟九通過顯微分析得到量化Hspl2.2蛋白表達量設(shè)為正常值。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用線蟲Hspl2.2蛋白表達量作為標(biāo)識物鑒定農(nóng)藥滴丁酯的方法，其特征在于步驟九當(dāng)通過顯微分析量化Hspl2.2蛋白表達量高于正常值15%時，則鑒定結(jié)果為待測培養(yǎng)液體中含有農(nóng)藥滴丁酯。
【文檔編號】G01N33/68GK105911290SQ201610236084
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月15日
【發(fā)明人】王云彪
【申請人】中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所