專利名稱：基因大片段、單拷貝缺失檢測芯片及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測芯片及其應用，更具體地說涉及一種基因大片段、單拷貝缺失檢測芯片及其應用。
背景技術：
遺傳學、分子生物學理論和技術的發(fā)展給醫(yī)學帶來的直接成果之一是疾病的基因診斷、特別是遺傳性疾病的基因診斷成為可能。
90年代之前，由于受到分析技術和分析目標的限制，大多數(shù)實驗室在開展醫(yī)學遺傳學分析時主要圍繞細胞遺傳學和分子細胞遺傳學技術，觀察染色體異常與疾病發(fā)生的關系。光鏡下可見的染色體改變可能是Mb大小、涉及一個或多個基因的DNA片段。而對于單基因遺傳病，DNA的微小改變即可能導致基因功能的喪失，從而引起疾病的發(fā)生，因此染色體水平的遺傳學分析極大地限制了遺傳性疾病的基因診斷。進入90年代，隨著人類基因組計劃的開展和不斷取得進展，愈來愈多的疾病相關基因得到分離；與此同時多種敏感性較高的基因突變分析技術的出現(xiàn)和完善，使遺傳性疾病發(fā)病相關基因的突變分析和基因診斷逐步得到推廣。人類絕大多數(shù)遺傳性疾病發(fā)病相關基因一般沒有突變熱點，即病理性突變可以出現(xiàn)在基因的各個位點；發(fā)病相關基因的全基因篩查是準確作出基因診斷的基礎。目前實驗室常用的突變基因分析技術包括分子雜交技術、變性梯度凝膠電泳技術(DGGE)、單鏈構象多態(tài)性技術(SSCP)、變性高效液相色譜技術(DHPLC)、實時定量PCR技術、DNA序列分析技術等。這些技術具有足夠的敏感性，可以檢出絕大多數(shù)單個堿基的改變。然而這些技術單次實驗可分析的DNA片段較短，在檢測未知突變時，須對某一病例的一個或多個疾病相關基因的每個外顯子進行突變篩查，分片段完成整個基因的分析。這樣需要的時間較長，工作量很大。臨床常規(guī)開展基因診斷，迫切需要分析效率較高、樣本通量較大、敏感性較強的突變基因分析技術。
近年興起的建立在分子雜交原理上的基因芯片技術是自90年代中期以來影響最深遠的重大科技進展之一，是融微電子學、生物學、物理學、化學、計算機科學為一體的高度交叉的新技術，具有重大的基礎研究價值。同時，這項技術可開發(fā)多種商業(yè)化的芯片應用于基礎研究和臨床診斷，具有明顯的產(chǎn)業(yè)化前景?；蛐酒夹g作為一種高度平行、大規(guī)模、快速的生物信息檢測方案，將大量的探針通過點樣或原位合成固定到基底材料上，通過分子標記和分子雜交實現(xiàn)高通量的樣本檢測。根據(jù)點于芯片上的核酸序列來源，基因芯片有寡核苷酸芯片、cDNA芯片和Genomic芯片之分，包括二種模式一是將靶DNA固定于支持物上，適合于大量不同靶DNA的分析；二是將大量探針分子固定于支持物上，適合于對同一靶DNA進行不同探針序列的分析。目前已開發(fā)的基因芯片產(chǎn)品可實現(xiàn)基因表達分析、基因微小突變分析、SNP(單核苷酸多態(tài)性)位點分析、基因某些特定變異(如甲基化)的分析，這些芯片的開發(fā)和推廣已在生物醫(yī)學研究和應用中發(fā)揮重要作用。
然而基因突變的復雜性給基因診斷技術提出了新的要求。最新研究表明，介于遺傳性染色體異常和基因微小突變之間還普遍存在另一類的基因結構異常，即DNA的大片段缺失(Deletion)和復制(Duplication)。這類DNA大片段結構變異(突變)約占基因突變的1/3，且在細胞內(nèi)多表現(xiàn)為單拷貝的異常(顯性遺傳病的患病個體；隱性遺傳病的突變基因攜帶者)。完整的突變基因分析系統(tǒng)應包含可有效檢出各類突變的分析技術，但目前實驗室常用的基因診斷技術難以檢出這類突變。目前困擾基因診斷工作的問題之一是某些遺傳性疾病發(fā)病相關基因突變的檢出率不高，其原因可能主要有兩個方面①完成診斷需要做到的全基因篩查與現(xiàn)有分析技術的樣本通量之間的矛盾；②采用的分析技術是否可以涵蓋對各種類型的基因突變分析。為此我們已發(fā)展了定量多重PCR技術，這一技術可以有效檢出基因組DNA大片段結構變異，但限于它的樣本通量，大樣本的分析難以在短期內(nèi)完成。根據(jù)我們在發(fā)展和完善定量多重PCR技術中得到的啟發(fā)，結合芯片技術，在設計和檢測中引入統(tǒng)計量的概念，研制基因組DNA大片段結構變異檢測芯片，用于篩查疾病相關基因的大片段變異(缺失或復制)。
新的基因突變檢測類芯片產(chǎn)品的開發(fā)和使用將填補目前基因芯片研究中的一個空白，可在遺傳性疾病的基因診斷(包括產(chǎn)前診斷)，遺傳相關性疾病的防治，腫瘤早期診斷，突變基因攜帶者和高危發(fā)病個體篩查等工作中發(fā)揮重要作用，產(chǎn)生良好的社會和經(jīng)濟效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決現(xiàn)有技術中受技術方法或樣本通量限制而難以臨床常規(guī)開展遺傳性疾病的基因大片段缺失檢測的不足和相關基因檢出率不高的缺點，提供一種樣本能量高、基因檢出率高的基因大片段、單拷貝缺失檢測芯片及其檢測方法。
本發(fā)明的技術方案是一種基因大片段、單拷貝缺失檢測芯片，其特征在于
1)對于僅有單個候選基因的遺傳性疾病，選取不少于3個的檢測基因，其中一個為致病基因，其余為參照基因，以基因外顯子為單位，根據(jù)基因的基因組DNA結構，選擇外顯子中具有相近Tm值長度為30～50個堿基的序列并合成探針；2)對于具有多個候選基因遺傳性疾病，選取不少于3個的疾病相關基因作為檢測基因，以基因外顯子為單位，互為參照，根據(jù)基因的基因組DNA結構，選擇外顯子中具有相近Tm值長度為30～50個堿基的序列并合成探針。所述的參照基因為基因組內(nèi)結構序列保守的基因，所述的探針其分布是在玻片上以外顯子順序依次分布，并且各探針重復不少于5次。
一種利用上述檢測芯片用于基因遺傳性大片段缺失的檢測方法，其特征在于步驟如下1)核酸樣品的制備提取可疑患者外周靜脈血DNA，酸化處理，裂解DNA分子至500-1000堿基，稀釋至100ng/ul(待檢樣本)，隨機引物法低度循環(huán)擴增待檢樣本，在擴增過程中加入熒光物質(zhì)，完成樣本DNA的標記；2)雜交熒光標記的樣本DNA 95℃變性處理，特定溫度下，4×SSC+1％BSA預雜交，雜交，室溫下，2×SSC+0.1％SDS、0.1×SSC+0.1％SDS避光漂洗，雙蒸水洗凈吹干；3)雜交信號檢測熒光掃描儀掃描檢測；4)雜交信號的分析及結果判定首先以已知具有基因DNA大片段結構變異的不同陽性樣本為先例，以穩(wěn)定檢出單拷貝變異作為標準，編寫軟件，建立探針點樣及芯片雜交后各點信號之間參數(shù)的計算模式，以此計算模式進行未知樣品分析。
所述的低度擴增為低度8～10個循環(huán)擴增。
上述芯片的制備方法，包括如下步驟1)載玻片的修飾；2)針設計、合成及修飾；3)探針的固定。
影響制備獲得的DNA大片段缺失檢測芯片性能的主要因素1)芯片載體—玻片的處理玻片表面化學修飾狀況直接關系到點布的探針能否通過分子手臂有效的結合于玻片表面，使各點的探針結合量穩(wěn)定。
2)探針設計根據(jù)檢測目的基因各外顯子序列，通過選擇探針中(A+T)/(G+C)值，調(diào)整探針長度，使各探針雜交條件相近，以保證后續(xù)芯片雜交信號的穩(wěn)定。
3)芯片上參照基因探針選擇基因選擇單拷貝的保守基因；探針序列設計使其雜交條件與檢測目的基因探針相近。
4)芯片上各探針的分布和重復次數(shù)根據(jù)各探針的雜交穩(wěn)定性確定各探針的重復次數(shù)，使該探針點的雜交信號強度綜合處理后樣本拷貝數(shù)成正相關。
利用DNA大片段缺失檢測芯片對待檢樣品進行分析的條件可在以下方面進行優(yōu)化1)裂解待檢DNA樣本PH值(4.0-4.5)及其處理時間的調(diào)整，保證裂解后的DNA片段大小在500-1000堿基。
2)DNA樣本的低度擴增，通過調(diào)整DNA濃度、寡核苷酸引物量及DNA合成的循環(huán)次數(shù)，在保證DNA樣本中各基因片段拷貝數(shù)原有比值不變的前提下，各基因片段拷貝數(shù)的增加可以使芯片的雜交獲得明確的信號。
3)芯片雜交溫度，雜交后漂洗緩沖液的離子強度及漂洗時間，盡可能的去除雜交背景信號，保證雜交信號的清晰，使各探針雜交信號綜合處理后，其強度與以形成雜交的探針數(shù)成正相關。
本發(fā)明的有益效果是現(xiàn)有的基因芯片產(chǎn)品多應用于基因點突變，SNP(單核苷酸多態(tài)性)位點分析，若干堿基缺失和基因的表達分析等。我們結合醫(yī)學遺傳學、腫瘤發(fā)病相關基因突變研究的最新進展，研制了一種普遍存在的基因突變(DNA大片段結構異常)類型的檢測芯片，填補目前基因芯片研究中的一個空白，可在遺傳性疾病的基因診斷(包括產(chǎn)前診斷)，遺傳相關性疾病的防治，腫瘤早期診斷，突變基因攜帶者和高危發(fā)病個體篩查等工作中發(fā)揮重要作用，產(chǎn)生良好的社會和經(jīng)濟效益。
1)基因分析中檢測序列的“有”和“無”一般容易鑒別，難以鑒別的是DNA大片段結構異常時等位基因拷貝數(shù)的變化，特別是等位基因的單個拷貝缺失或單個拷貝復制。為解決這一問題，我們采用①以外顯子為單位設計探針，同時以外顯子為單位分析基因結構變異；②以不少于3個基因的所有外顯子同時分析，并設立參照，完成基因或其部分結構拷貝數(shù)的定量分析；③芯片檢測中引入統(tǒng)計量的概念，以穩(wěn)定基因或基因片段拷貝數(shù)的定量分析。
2)檢出發(fā)病相關基因的遺傳性突變是基因診斷和遺傳咨詢的關鍵，而DNA大片段結構變異約占基因突變的1/3。隨著功能基因組研究的深入，愈來愈多的疾病相關基因?qū)⒌玫椒蛛x，分子醫(yī)學和基因診斷在臨床上的作用也愈見重要，因此DNA大片段結構變異檢測芯片極具臨床應用前景。已經(jīng)知道，除男性性染色體上的基因外，人類體細胞中的基因都呈雙拷貝。對于顯性遺傳性疾病(包括遺傳性腫瘤)，遺傳獲得的發(fā)病相關基因的異常為單拷貝的基因突變；而對于常染色體隱性遺傳性疾病，除概率較小的純合型發(fā)病個體外，人群中更多的是單拷貝的突變基因隱性攜帶者。DNA大片段結構變異時基因單拷貝異常的分析，可檢出突變基因攜帶者、高危發(fā)病個體、明確診斷患病個體。
3)這種新的基因突變檢測類芯片產(chǎn)品的開發(fā)和使用將在遺傳性疾病的產(chǎn)前、病前診斷，遺傳相關性疾病的防治，腫瘤早期診斷，突變基因攜帶者和高危發(fā)病個體篩查等工作中發(fā)揮重要作用。
具體實施例方式
實施例1遺傳性非息肉性大腸癌(HNPCC)發(fā)病相關基因大片段缺失檢測芯片的制備1)玻片的清洗及表面化學修飾選擇合適尺寸的玻片，1∶1的甲醇鹽酸溶液清洗，蒸餾水洗凈，濃硫酸浸泡，95％的乙醇充分沖洗，空氣干燥。95％的乙醇和硅烷按49∶1的比例配置成硅烷化試劑，玻片置于其中浸泡，雙蒸水洗凈，立置玻片，自上向下吹干，110℃烘烤。95％的乙醇或異丙醇浸泡，雙蒸水洗凈吹干，Ph7.0、0.01M的PBS溶液配置5％的戊二醛溶液，玻片置于其中浸泡，0.01M的PBS溶液清洗，蒸餾水洗凈，吹干。掃描儀掃描，選擇熒光背景較弱的玻片用于下一步實驗。
2)探針的合成序列選自MLH1、MSH2、MSH6基因的45個外顯子，探針長度30-50個堿基，具有相近的Tm植，氨基化修飾3’末端。
3)探針的固定和分布碳酸鹽緩沖液稀釋探針，霧化條件下，點于預處理的玻片上。玻片置于封閉環(huán)境中，室溫放置一小時后轉至潮濕小室中37℃水浴兩小時。0.1％SDS水溶液浸洗，雙蒸水洗凈吹干。玻片置于硼氫化鈉還原液中浸泡，將表面的醛基還原為羥基。每張芯片上各探針的點樣量不少于5，重復次數(shù)以滿足統(tǒng)計量的要求為準。
實施例2遺傳性非息肉性大腸癌(HNPCC)發(fā)病相關基因遺傳性大片段缺失分析與檢測1)核酸樣品的制備提取可疑患者外周靜脈血DNA，酸化處理，裂解DNA分子至500-1000堿基，稀釋至100ng/ul(待檢樣本)。隨機引物法低度8個循環(huán)擴增待檢樣本，在擴增過程中參入熒光物質(zhì)，完成樣本DNA的標記。
2)雜交熒光標記的樣本DNA 95℃變性處理，特定溫度下，4×SSC+1％BSA預雜交，雜交。室溫下，2×SSC+0.1％SDS、0.1×SSC+0.1％SDS避光漂洗，雙蒸水洗凈吹干。
3)雜交信號檢測熒光掃描儀掃描檢測。
4)雜交信號的分析及結果判定首先以已知具有基因DNA大片段結構變異的不同陽性樣本為先例，以穩(wěn)定檢出單拷貝變異作為標準，編寫軟件，建立探針點樣及芯片雜交后的計算模式，以此計算模式進行未知樣品分析。
實施例3假肥大型肌營養(yǎng)不良癥發(fā)病相關基因大片段缺失檢測芯片的制備探針的合成序列選自DMD致病基因的79個外顯子、參照基因β-actin基因的3個外顯子及參照基因GAPDP基因的3個外顯子，探針長度30-50個堿基，具有相近的Tm植，氨基化修飾3’末端。其余方法步驟同實施例1。
實施例4假肥大型肌營養(yǎng)不良癥發(fā)病相關基因大片段缺失分析與檢測1)核酸樣品的制備提取可疑患者外周靜脈血DNA，酸化處理，裂解DNA分子至500-1000堿基，稀釋至100ng/ul(待檢樣本)。隨機引物法低度9個循環(huán)擴增待檢樣本，在擴增過程中參入熒光物質(zhì)，完成樣本DNA的標記。
其余方法步驟同實施例2。
實施例5苯丙酮尿癥相關基因大片段缺失檢測芯片的制備探針的合成序列選自PAH基因的13個外顯子、參照基因β-actin基因的3個外顯子及參照基因GAPDP基因的3個外顯子，探針長度30-50個堿基，具有相近的Tm植，氨基化修飾3’末端。
其余方法步驟同實施例1。
實施例6苯丙酮尿癥相關基因大片段缺失分析與檢測1)核酸樣品的制備提取可疑患者外周靜脈血DNA，酸化處理，裂解DNA分子至500-1000堿基，稀釋至100ng/ul(待檢樣本)。隨機引物法低度10個循環(huán)擴增待檢樣本，在擴增過程中參入熒光物質(zhì)，完成樣本DNA的標記。
其余方法步驟同實施例2。
權利要求
1.一種基因大片段、單拷貝缺失檢測芯片，其特征在于1)對于僅有單個候選基因的遺傳性疾病，選取不少于3個的檢測基因，其中一個為致病基因，其余為參照基因，以基因外顯子為單位，根據(jù)基因的基因組DNA結構，選擇外顯子中具有相近Tm值長度為30～50個堿基的序列并合成探針；2)對于具有多個候選基因遺傳性疾病，選取不少于3個的疾病相關基因作為檢測基因，以基因外顯子為單位，互為參照，根據(jù)基因的基因組DNA結構，選擇外顯子中具有相近Tm值長度為30～50個堿基的序列并合成探針。
2.根據(jù)權利要求1所述的基因大片段、單拷貝缺失檢測芯片，其特征在于所述的參照基因為基因組內(nèi)結構序列保守基因。
3.根據(jù)權利要求1所述的基因大片段、單拷貝缺失檢測芯片，其特征在于所述的探針其分布是在玻片上以外顯子順序依次分布，并且各探針重復不少于5次。
4.一種利用上述檢測芯片用于基因遺傳性大片段缺失的檢測方法，其特征在于步驟如下1)核酸樣品的制備提取可疑患者外周靜脈血DNA，酸化處理，裂解DNA分子至500-1000堿基，稀釋至100ng/ul(待檢樣本)，隨機引物法低度循環(huán)擴增待檢樣本，在擴增過程中加入熒光物質(zhì)，完成樣本DNA的標記；2)雜交熒光標記的樣本DNA 95℃變性處理，特定溫度下，4×SSC+1％BSA預雜交，雜交，室溫下，2×SSC+0.1％SDS、0.1×SSC+0.1％SDS避光漂洗，雙蒸水洗凈吹干；3)雜交信號檢測熒光掃描儀掃描檢測；4)雜交信號的分析及結果判定首先以已知具有基因DNA大片段結構變異的不同陽性樣本為先例，以穩(wěn)定檢出單拷貝變異作為標準，編寫軟件，建立探針點樣及芯片雜交后各點信號之間參數(shù)的計算模式，以此計算模式進行未知樣品分析。
5.根據(jù)權利要求4所述的基因遺傳性大片段缺失的檢測方法，其特征在于所述的低度擴增為低度8～10個循環(huán)擴增。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基因大片段、單拷貝缺失檢測芯片及其應用，解決了現(xiàn)有技術中受技術方法或樣本通量限制而難以臨床常規(guī)開展遺傳性疾病的基因大片段缺失檢測的不足和相關基因檢出率不高的缺點，提供一種樣本能量高、基因撿出率高的基因大片段、單拷貝缺失檢測芯片和檢測方法，其特征在于選取檢測基因，以基因外顯子為單位，根據(jù)基因的基因組DNA結構，選擇外顯子中具有相近Tm值長度為30～50個堿基的序列并合成探針；探針點樣固定于玻片，探針的分布符合統(tǒng)計量的要求；待檢DNA樣本酸化處理，制備成一定大小的DNA片段；待檢DNA樣本內(nèi)加引物低度擴增，并標記熒光；待檢DNA樣本與芯片雜交，專用軟件分析各雜交探針點熒光信號，確定待檢DNA的目標基因是否存在大片段缺失。
文檔編號C12Q1/68GK1483837SQ0313174
公開日2004年3月24日 申請日期2003年7月25日 優(yōu)先權日2003年7月25日
發(fā)明者王亞平, 張曉梅, 李金田, 吳曉柳, 朱明 , 張元穎 申請人:江蘇省腫瘤醫(yī)院