專利名稱：溶液相合成低聚核苷酸的結(jié)構(gòu)單元的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用酶方法由常規(guī)的前體制備3′-O和5′-O-乙酰丙酰基核苷的方法。這些方法對(duì)大規(guī)模生產(chǎn)低聚核苷酸很有用。
發(fā)明的
背景技術(shù)：
已經(jīng)知道哺乳動(dòng)物的身體狀況，包括大部分疾病癥狀都會(huì)受到蛋白質(zhì)的影響。這些蛋白質(zhì)或者直接作用或通過(guò)它們的酶作用對(duì)動(dòng)物和人的很多疾病有很大作用。傳統(tǒng)的治療方法一般集中在與這些蛋白質(zhì)的相互作用，以努力減少這些疾病的起因或疾病可能的功能。但是，最近在嘗試通過(guò)與這些蛋白質(zhì)直接合成的例如細(xì)胞內(nèi)RNA的相互作用減少這些蛋白質(zhì)的實(shí)際生成量。通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)生成過(guò)程的干擾希望能夠達(dá)到最大的治療效果和最小的副作用。這些治療方法的一般目的是干擾或者減少導(dǎo)致不希望生成的蛋白質(zhì)的基因表達(dá)。
抑制特定基因表達(dá)的一種方法是使用低聚核苷酸和低聚核苷酸類似物作為“反義”劑。使用與特定的、靶、信使RNA(mRNA)序列有互補(bǔ)作用的低聚核苷酸和低聚核苷酸類似物。反義的方法常常直接指向相對(duì)較小的低聚核苷酸和低聚核苷酸類似物與單鏈mRNA或單鏈DNA的互補(bǔ)雜交，如此可使這些細(xì)胞內(nèi)核酸的正常、基本功能被切斷。雜交是低聚核苷酸和低聚核苷酸類似物與RNA的Watson-Crick堿基對(duì)或單鏈DNA的序列以特定氫鍵鍵合。這些堿基對(duì)被認(rèn)為是相互互補(bǔ)的。
現(xiàn)已經(jīng)接受以低聚核苷酸和低聚核苷酸類似物作為治療劑，對(duì)作為治療和診斷的方法有更大的期望。但是用作反義劑的低聚核苷酸和低聚核苷酸類似物在用于治療、診斷和作為研究試劑時(shí)常常需要大量生產(chǎn)低聚核苷酸和低聚核苷酸類似物。
生產(chǎn)低聚核苷酸有三種基本方法。Reese，Tetrahedron 1978，34，3143描述了磷酸三酯的方法；氨基磷酸(phosphoramidite)法由Beaucage在Methods in Molecular BiologyProtocols for Oligonucleotides andAnalogs描述；Agrawal編輯，Humana PressTotowa，1993，Vol.20，33-61；以及H-膦酸酯法由Froehier描述在Methods in Molecular BiologyProtocols for Oligonucleotides and Analogs，Agrawal編輯；Humana PressTotowa，1993，Vol.20，63-80。
磷酸三酯法被廣泛用于溶液相合成，而氨基磷酸法和H-膦酸酯法主要應(yīng)用于固相合成。最近，Reese報(bào)道了低聚核苷酸在H-膦酸酯上耦合的液相合成新方法，參見Reese等人，Nucleic Acids Research，1999，27，963-971，和Reese等人，Biorg.Med.Chem.Lett.，1997，7，2787-2792，它們被引入此文作為參考。溶液相合成是大規(guī)模生產(chǎn)低聚核苷酸選用的方法。
這些溶液相方法需要應(yīng)用在3’-位和/或5’-位帶有保護(hù)基團(tuán)的核苷單體結(jié)構(gòu)單元。保護(hù)基團(tuán)在耦合條件下和選擇性分解時(shí)應(yīng)該是穩(wěn)定的，不會(huì)影響分子中的其它保護(hù)基團(tuán)。一種這樣的保護(hù)基團(tuán)是乙酰丙?；?C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3。但是，帶有這些保護(hù)基團(tuán)的核苷的制備包括幾個(gè)冗長(zhǎng)的化學(xué)保護(hù)/脫保護(hù)和/或純化步驟。
例如，核苷的3′，5′-二-O-乙酰丙?；Ｗo(hù)用已知的方法完成，通過(guò)使核苷與乙酰丙酸在DCC(二環(huán)己基碳二亞胺)存在下進(jìn)行反應(yīng)，使其中的核苷在其羥基位置進(jìn)行選擇性?；?。雖然使用了這種方法，依然至少存在一個(gè)重要的問(wèn)題。該方法需要大量過(guò)量的DCC以達(dá)到最佳的產(chǎn)率。在完成反應(yīng)之后過(guò)量的DCC轉(zhuǎn)化成DCU(二環(huán)己基碳二亞胺)，必須將其由反應(yīng)混合物中分離。不辛的是，在大規(guī)模合成時(shí)，分離步驟需要可觀的時(shí)間和費(fèi)用。
在本發(fā)明之前，5′-O-乙酰丙?；塑盏暮铣墒峭ㄟ^(guò)使母體核苷與乙酰丙酸和2-氯-1-甲基氯化吡啶鎓進(jìn)行反應(yīng)來(lái)完成。Iwai等人，Nucleic Acids Res.，1988，16，9443-9456；Iwal等人，Tetrahedron，1990，46，6673-6688。但是，由于此方法對(duì)5′-羥基官能團(tuán)不能進(jìn)行選擇性?；仨毩硗膺M(jìn)行純化和脫保護(hù)步驟，因?yàn)樵诜磻?yīng)中會(huì)形成3′-酰基和3′，5′-二酰基衍生物。通過(guò)色譜法將3′，5′-二?；苌锓蛛x出來(lái)之后，殘余物必須用DMTrCl處理以除去3′-酰基化合物。最后，還要附加色譜純化步驟以很低的產(chǎn)率分離5′-O-乙酰丙酰基衍生物。
以前，3′-O-乙酰丙酰基核苷(2′-脫氧或2′-保護(hù)的)的合成是通過(guò)用乙酰丙酸或乙酰丙酸酐和DCC處理母體核苷來(lái)實(shí)現(xiàn)的。此方法主要的缺點(diǎn)之一是在用乙酰丙酸酰化之前必須將5′-羥基官能團(tuán)保護(hù)成為5′-O-DMTr基團(tuán)，而5′-O-DMTr基團(tuán)必須在酸介質(zhì)中除去以得到3′-O-保護(hù)的核苷。參見Reese等人，Nucleic Acids Res.，1999，27，963-971，和Reese等人，J.Chem.Soc.，Perkin Trans.，1，1999，1477-1486。
人們一直在探索大規(guī)模合成低聚核苷酸的工業(yè)上可利用的方法?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在有機(jī)合成中應(yīng)用生物催化劑比常規(guī)的化學(xué)合成方法更具有吸引力。參見Carrea，等人，Angew.Chem.Int.Ed.2000，39，2226-2254；Bomscheuer，等人，Hydrolases in Organic Synthesis.Regio- andStereoselective Biotransformations，Wiley-VCHWeinheim，1999，Enzymes catalyze reactions with high chemo-，reglo-，andstereoselectivity，參見Ferrero等人，Chem.Rev.，2000，100，4319-4347；Ferrero等人，Monatsh.Chem.，2000，131，585-616。以前已有報(bào)道南極洲假絲酵母(Candida antarctica)脂酶B(CAL-B)以高選擇性催化核苷5′-羥基基團(tuán)的?；?。蔥頭假單胞菌(Pseudomonas cepacia)脂酶(PSL)對(duì)2’-脫氧核苷的3′-位的仲醇有不尋常的區(qū)域選擇性。Moris等人，J.Org.Chem.，1993，58，653-660；Gotor等人，Synthesis，1992，626-628。
最近幾年，反義低聚核苷酸作為新的治療方法脫穎而出。其結(jié)果是，不久的將來(lái)需要有大量應(yīng)用低聚核苷酸的治療。關(guān)于合成低聚核苷酸結(jié)構(gòu)單元所需要的費(fèi)用和時(shí)間，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的努力已經(jīng)成功地開發(fā)出高效和高產(chǎn)品純度的制備方法。
發(fā)明綜述本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)例如用于大規(guī)模合成低聚核苷酸的方法和試劑。本發(fā)明的方法有助于以最少的步驟用酶方法達(dá)到所需產(chǎn)率。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了由常用的前體合成3′-O-乙酰丙?；塑蘸?′-O-乙酰丙?；塑盏姆椒ê驮噭?。在這些實(shí)施方案中，使3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷進(jìn)行區(qū)域選擇性地脫保護(hù)，根據(jù)本文公開的參數(shù)，可得到3′-O-乙酰丙?；塑栈?′-O-乙酰丙?；塑?。具體地說(shuō)，通過(guò)使相應(yīng)的3′，5′-二-O-乙酰丙?；塑涨绑w與特定的水解酶如脂酶接觸，可選擇性地生成5′-O-乙酰丙酰基核苷或3′-O-乙酰丙?；塑?。出人意料的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在脫保護(hù)反應(yīng)中，根據(jù)所選脂酶不同，選擇性水解酶如脂酶的存在可提高3’-或5′-位脫酰基化的區(qū)域選擇性。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了選擇性制備在3′-O或5′-O位具有乙酰丙?；暮塑盏姆椒ǎ摲椒ㄍㄟ^(guò)使核苷與?；瘎┙佑|，以便能在所選擇的水解酶(例如脂酶)存在下引入乙酰丙?；?。出人意料的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)根據(jù)為催化反應(yīng)所選擇的特定水解酶，可以在核苷的3’-或5′-位發(fā)生選擇性?；?。
根據(jù)某些實(shí)施方案，提供了3′，5′-二-O-乙酰丙?；塑諈^(qū)域選擇性脫保護(hù)的方法，所說(shuō)的方法包括選擇水解酶，如脂酶，該水解酶對(duì)一個(gè)乙酰丙?；恢玫闹苯訁^(qū)域選擇性水解是有效的，而其它位置的乙酰丙?；粫?huì)發(fā)生不希望水平的水解，以及在有效生成3′-O-乙酰丙?；塑蘸?′-O-乙酰丙?；塑盏臅r(shí)間和條件下使3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷與該脂酶接觸。本發(fā)明所涉及的水解酶的實(shí)例包括南極洲假絲酵母(Candida antarctica)脂酶B(CAL-B)、南極洲假絲酵母脂酶A(CAL-A)、蔥頭假單胞菌(Pseudomonas cepacia)脂酶(PSL)、豬胰脂肪酶(porcine pancreatic lipase)、粘稠色桿菌(Chromobactenaum viscosum)脂酶、米赫毛霉(Mucor miehei)脂酶、Humicola lanuginosa脂酶、沙門氏柏干酪青霉(penicillium camemberti)脂酶、皺落念珠菌(Candidarugosa)脂酶等。
根據(jù)一些實(shí)施方案，提供了核苷區(qū)域選擇性?；姆椒?，該方法包括選擇水解酶，如脂酶，所述的水解酶對(duì)核苷一個(gè)-OH位置的直接區(qū)域選擇性?；怯行У?，而其它位置的羥基不會(huì)發(fā)生不希望水平的酰化，以及在有效生成3′-O-乙酰丙?；?′-O-乙酰丙?；塑盏臅r(shí)間和條件下使核苷與?；瘎┖退x的脂酶接觸，以引入乙酰丙酰基。本發(fā)明所涉及的水解酶的實(shí)例包括南極洲假絲酵母脂酶B(CAL-B)、南極洲假絲酵母脂酶A(CAL-A)、蔥頭假單胞菌脂酶(PSL)、豬胰脂肪酶、粘稠色桿菌脂酶、米赫毛霉脂酶、Humicola lanuginosa脂酶、沙門氏柏干酪青霉脂酶、皺落念珠菌脂酶等。
根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷在5′-O-乙酰丙?；幻摫Ｗo(hù)，所說(shuō)的脫保護(hù)是在5′-O-乙酰丙?；恢媚苡行У剡M(jìn)行區(qū)域選擇性水解，但不會(huì)影響3′-O-乙酰丙?；恢玫臅r(shí)間和條件下使使二保護(hù)核苷與CAL-B接觸。
根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施方案，核苷在5′-OH位(或簡(jiǎn)稱5′-位)可選擇性酰化，所述的?；窃贑AL-B存在下，和在使核苷在5’-位有效進(jìn)行區(qū)域選擇性?；孕纬?′-O-乙酰丙?；塑盏臅r(shí)間和條件下使核苷與?；瘎┙佑|，以引入乙酰丙?；?br> 在另一些實(shí)施方案中，3′，5′-二-O-乙酰丙?；塑盏?′-O-位的乙酰丙?；拿摫Ｗo(hù)是在3′-O-乙酰丙?；奈恢媚苡行У剡M(jìn)行區(qū)域選擇性水解，但不會(huì)影響5′-O-乙酰丙?；恢玫臅r(shí)間和條件下，使二保護(hù)核苷與CAL-A或PSL-C接觸。
在另一實(shí)施方案中，在核苷3′-OH位進(jìn)行區(qū)域選擇性?；?，該酰化是在CAL-A或PSL-C存在下，和能使核苷在3’-位有效地進(jìn)行區(qū)域選擇性?；臅r(shí)間和條件下，通過(guò)將核苷與?；瘎┙佑|引入乙酰丙酰基基團(tuán)，以制備3′-O-乙酰丙?；塑铡?br> 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，公開了多種使3′，5′-二-O-乙酰丙?；塑盏?′-O-乙酰丙?；粎^(qū)域選擇性脫保護(hù)的方法，其中所述的核苷為下式之一 其中
R1是-H，-羥基，保護(hù)的羥基，2’-取代基或2′-保護(hù)的取代基；和R2和R3各自獨(dú)立地是-H或氨基保護(hù)基團(tuán)；G是N或CH；和Lev是-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3，乙酰丙酰基；該方法包括選擇對(duì)所述核苷的5’-O-位乙酰丙?；苓M(jìn)行直接有效的區(qū)域選擇性水解，但不會(huì)引起3’-O-位乙酰丙?；獾乃饷?，和使所述的3’，5’-二-O-乙酰丙?；塑赵谟行У厣?′-O-乙酰丙酰基核苷的時(shí)間和條件下，與所述的酶接觸以產(chǎn)生3′-O-乙酰丙酰基核苷。對(duì)5′-O-乙酰丙?；鈨?yōu)選的酶是CAL-B。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中提供了使3′-O-乙酰丙?；贿M(jìn)行區(qū)域選擇性脫保護(hù)的方法，其中所述的核苷為下式之一 其中
R6是-H或-羥基；R2、R3、R4和R5各自獨(dú)立地是-H或氨基保護(hù)基團(tuán)；G是N或CH；和Lev是-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3；該方法包括選擇對(duì)所述3’-O-位乙酰丙?；苓M(jìn)行直接有效的區(qū)域選擇性水解，但不會(huì)引起5’-O-位乙酰丙?；獾乃饷福褪顾龅?’，5’-二-O-乙酰丙酰基核苷在有效地生成5′-O-乙酰丙?；塑盏臅r(shí)間和條件下，與所述的酶接觸。對(duì)3′-O-乙酰丙酰基位水解優(yōu)選的酶例如是CAL-A或PSL-C。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，公開了多種核苷的5′-OH位置上區(qū)域選擇性地引入乙酰丙?；姆椒?， 其中所述的核苷為下式之一 其中
R1是-H，-羥基，保護(hù)的羥基，2’-取代基或2′-保護(hù)的取代基；和R2和R3各自獨(dú)立地是-H或氨基保護(hù)基團(tuán)；G是N或CH；和Lev是-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3，乙酰丙酰基；該方法包括選擇對(duì)所述核苷的5’-O-位能進(jìn)行直接有效的區(qū)域選擇性酰化，但不會(huì)引起3’-O-位酰化的水解酶，和使所述的核苷在有效地生成5′-O-乙酰丙酰基核苷的時(shí)間和條件下，與?；瘎┖退龅拿附佑|，以制備5’-O-乙酰丙酰基核苷。對(duì)5′-O-乙酰丙?；；?，優(yōu)選的酶是CAL-B。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供了使核苷的3′-OH位進(jìn)行區(qū)域選擇性酰化的方法， 其中所述的核苷為下式之一 其中
R6是-H或-羥基；R2、R3、R4和R5各自獨(dú)立地是-H或氨基保護(hù)基團(tuán)；G是N或CH；和Lev是-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3；該方法包括選擇對(duì)所述核苷的3’-O-位能進(jìn)行直接有效的區(qū)域選擇性酰化，但不會(huì)引起5’-O-位?；乃饷福褪顾龅暮塑赵谟行У厣?′-O-乙酰丙?；塑盏臅r(shí)間和條件下，與酰化劑和所述的酶接觸，以制備3’-O-乙酰丙?；塑?。對(duì)3′-O-乙酰丙酰基?；裕瑑?yōu)選的酶是CAL-A或PSL-C。
在本發(fā)明一些實(shí)施方案中提供了多種使核酸如核苷或核苷酸的羥基部分，例如2′-O、3’-O或5′-O位的一個(gè)或多個(gè)羥基?；姆椒?，該方法包括使所述的核酸與乙酰丙酸在有連接于高分子載體的偶合劑如碳二亞胺存在下，和能在2′-O、3′-O或5′-O位有效地形成酯的時(shí)間和條件下反應(yīng)。優(yōu)選的高分子載體包括連接于環(huán)己基碳二亞胺的聚苯乙烯或聚乙二醇高分子載體。
本發(fā)明還包括使例如碳水化合物或類固醇分子中的任何羥基部分酯化或?；姆椒ǎ摲椒òㄊ购辛u基部分的所述化合物與乙酰丙酸在有連接于高分子載體的偶合劑存在下，和在能使羥基部分和乙酰丙酸的乙酰丙?；鶊F(tuán)之間有效地形成酯的時(shí)間和條件下反應(yīng)。
在本發(fā)明一些實(shí)施方案中，提供了多種使下式化合物上的至少一個(gè)羥基部分?；姆椒ǎ?其中
Bx是核堿基(nucleobase)；T1和T2各自獨(dú)立地是羥基、羥基保護(hù)基團(tuán)、活化的磷酸酯基、核苷酸、核苷或低聚核苷酸；R是-H、-羥基、保護(hù)的羥基或2′-取代基；條件是T1、T2或R中至少一個(gè)是-羥基；該方法包括使所述的化合物與乙酰丙酸在有連接于固體載體的偶合劑如PS-環(huán)己基碳二亞胺存在下，和能在羥基部分和乙酰丙?；g有效地形成酯的時(shí)間和條件下反應(yīng)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，T1和T2是-OH，以及R是-H或是2′-取代基。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了?；率交衔锏?′-O或5′-O位的方法 其中Bx是核堿基；R是-H或選擇保護(hù)的2′-取代基；該方法包括使所述的化合物與乙酰丙酸在有連接于固體載體的偶合劑存在下，和在能有效地形成下式化合物的時(shí)間和條件下反應(yīng) 其中Lev是乙酰丙?；?。
根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案，提供了多種由環(huán)己基脲衍生的高分子載體制備環(huán)己基碳二亞胺衍生的高分子載體的方法，該方法包括使所述環(huán)己基脲衍生的高分子載體與脫水劑如甲苯磺酰氯或POCl3在有機(jī)溶劑中，和在能有效地生成環(huán)己基碳二亞胺衍生的高分子載體的時(shí)間和條件下反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，所用的有機(jī)溶劑是CH2Cl2，CHCl3，己烷或吡啶。
在本發(fā)明另一些實(shí)施方案中，提供了多種由環(huán)己基脲衍生的高分子載體制備環(huán)己基碳二亞胺衍生的高分子載體的方法，該方法包括以下步驟使所述環(huán)己基脲衍生的高分子載體與脫水劑在能有效地生成鹽，進(jìn)而使該鹽與水溶液如NaOH水溶液接觸，以形成環(huán)己基碳二亞胺衍生的高分子載體的時(shí)間和條件下反應(yīng)。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明參照本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明和下面說(shuō)明性的附圖，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更好的理解本發(fā)明。所述附圖中

圖1說(shuō)明用乙酰丙酸和DCC，或乙酰丙酸和PS-碳二亞胺使2′-脫氧核苷的3′，5′-二-O-酰化。
圖2說(shuō)明3′，5′-二-O-乙酰丙酰基2′-脫氧核苷的酶區(qū)域選擇性水解。
圖3說(shuō)明3′，5′-二-O-乙酰丙酰基2′-取代核苷的酶區(qū)域選擇性水解。
圖4列表說(shuō)明了核苷2a-2g區(qū)域選擇性水解的結(jié)果。
圖5說(shuō)明2′-脫氧核苷的區(qū)域選擇性?；?。
圖6列表說(shuō)明2′-脫氧核糖核苷1a、1c、1e和1g區(qū)域選擇性?；慕Y(jié)果。
圖7說(shuō)明核糖核苷的區(qū)域選擇性?；?。
圖8列表說(shuō)明核糖核苷5a-5g區(qū)域選擇性?；慕Y(jié)果。
發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明涉及核苷結(jié)構(gòu)單元如3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷、3′-O-乙酰丙?；塑蘸?′-O-乙酰丙酰基核苷的制備，該方法在大規(guī)模合成低聚核苷酸時(shí)特別有用。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，提供了多種保護(hù)核酸2′-O、3′-O或5′-O位羥基部分的至少一個(gè)羥基的方法，該方法包括使所述核酸在有與高分子載體連接的耦合劑存在下，和在2′-O、3′-O或5′-O位能有效地生成酯的時(shí)間和條件下，與乙酰丙反應(yīng)。本發(fā)明所述的核酸包括核苷、核苷酸、低聚核苷和低聚核苷酸。在一些實(shí)施方案中，所述的核酸是核苷，所述的高分子載體是與耦合劑如環(huán)己基碳二亞胺耦合的聚苯乙烯載體或聚乙二醇載體。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的核酸具有下式結(jié)構(gòu) 其中Bx是核堿基；T1和T2各自獨(dú)立地是羥基、保護(hù)的羥基、活化的磷酸酯基、核苷酸、核苷或低聚核苷酸；R是-H、-羥基、保護(hù)的羥基或2′-取代基；條件是T1、T2或R中至少一個(gè)是-OH；該方法包括使所述的化合物與乙酰丙酸在有連接于固體載體的偶合劑存在下，和能在羥基部分和乙酰丙酰基之間有效地形成酯的時(shí)間和條件下反應(yīng)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，T1和T2是-OH，以及R是H。
本發(fā)明的保護(hù)方法并不限于核苷的羥基的?；魏瘟u基官能團(tuán)都可以用本發(fā)明的方法?；?，包括碳水化合物或類固醇分子中的羥基。
按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，參見圖1，由具有相應(yīng)性質(zhì)的核苷制備3′，5′-二-O-乙酰丙?；塑?2)，所述的制備是在1，4-二噁烷中，以DMAP作為催化劑，用乙酰丙酸和PS-碳二亞胺進(jìn)行處理，過(guò)濾出聚苯乙烯珠，除去聚合物鍵合的脲和N-乙酰丙酰基脲衍生物。分離出3′，5′-二-O-乙酰丙?；剀?2a)和3′，5′-二-O-乙酰丙?；?2′-脫氧腺苷(2d)，產(chǎn)率分別為91％和95％。PS-碳二亞胺是昂貴的試劑，使環(huán)己基脲衍生的高分子載體與脫水劑在有機(jī)溶劑中反應(yīng)，以進(jìn)行回收。優(yōu)選的脫水劑包括POCl3和甲苯磺酰氯。優(yōu)選的有機(jī)溶劑是CH2Cl2，CHCl3，己烷和吡啶。
參見圖1，1，3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷還可以由相應(yīng)性質(zhì)的核苷(1)在1，4-二噁烷中，以DMAP作為催化劑，用5.2當(dāng)量乙酰丙酸(LevOH)和二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)進(jìn)行處理來(lái)制備。通過(guò)用DCC活化乙酰丙酸而發(fā)生該反應(yīng)，得到O-?；逯虚g體。在反應(yīng)過(guò)程中，過(guò)量的加合物成為穩(wěn)定的N-酰基脲，該化合物以DCU作為副產(chǎn)物分離出來(lái)。在進(jìn)行快速色譜之后，以高產(chǎn)率(70-95％)生成3′，5′-二乙酰丙?；苌?2)。該反應(yīng)的粗制殘余物用Et2O洗滌以消除N-?；澹又鴮⑵淙苡贓tOAc，由該溶液中過(guò)濾分離出留下的DGU。此酰化反應(yīng)的產(chǎn)率幾乎是定量的。1H-NMR分析結(jié)果給出了純度水平，指出只有痕量DCU和N-乙酰丙?；?。在此條件下，2′-脫氧腺苷(1d)和2′-脫氧鳥苷(1f)的氨基位置不發(fā)生?；Ｔ?′-脫氧胞苷(1b)的情況下，用較少量的LevOH和DCC(3當(dāng)量)將氨基酰基衍生物的形成減到最少。其結(jié)果，需要較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間和，并且有一些反應(yīng)原料不變。在進(jìn)行快速色譜之后，以68％分離產(chǎn)率得到3′，5′-二-O-乙酰丙?；?2′-胞苷(2b)。
常用前體，3′，5′-二-O-乙酰丙?；塑赵?′-O-乙酰丙酰基位置的區(qū)域選擇性脫保護(hù)可通過(guò)下述方法進(jìn)行選擇可直接地在5’-乙酰丙?；恢糜行У剡M(jìn)行區(qū)域選擇性水解，但不會(huì)引起3′-O-乙酰丙?；恢盟獾乃饷福缰?，使二保護(hù)的核苷與所述的脂酶在使3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷的5′-O-乙酰丙?；恢糜行獾臅r(shí)間和條件下接觸。在一些實(shí)施方案中，二保護(hù)的核苷具有下式之一的結(jié)構(gòu) 其中R1是-H，-羥基，保護(hù)的羥基或2’-取代基；和R2和R3各自獨(dú)立地是-H或氨基保護(hù)基團(tuán)；G是N或CH；和Lev是-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3。
例如，參見圖2，于40℃和在含有18％1，4-二噁烷的0.15M磷酸鹽緩沖溶液(pH＝7)中，將3′5′-二-O-乙酰丙?；剀?2a)用CAL-B處理。TLC表明62小時(shí)后起始原料全部消失(表1，第一行)。經(jīng)過(guò)如下文所述的常規(guī)的精制Myers等人，Trends Pharmacol.Sci.，2000，21，19-23；Cook，Nucleosides Nucleotides，1999，18，1141-1162；Crooke等人，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.，1996，36，107-129；和Matteucci等人，1996，384，20-22，其中所述內(nèi)容全部引入本文作為參考。1H-NMR譜清楚地指出5′-乙酰丙酰基酯選擇性水解，以及3′-O-乙酰丙酰基胸苷(3a)是唯一的產(chǎn)物。在萃取之后，酶反應(yīng)中形成的痕量的胸苷(如TLC所示)保留在水相中。因此，分離出純的化合物(3a)，產(chǎn)率85％。
如圖4所示，表1還指出基質(zhì)3′，5′-二-O-乙酰丙?；奏?2b)、3′，5′-二-O-乙酰丙?；佘?2d)和3′，5′-二-O-乙酰丙?；?N-異丁基鳥苷(2g)在CAL-B存在下進(jìn)行水解時(shí)，對(duì)5′-位有優(yōu)良的選擇性。沒(méi)有5′-O-乙酰丙酰基衍生物，且反應(yīng)以非常高的產(chǎn)率進(jìn)行。而且，在這些情況下，TLC表明完全水解的核苷的痕量物很容易通過(guò)水萃取除去。
對(duì)N-苯甲?；?二-O-乙酰丙?；?2′-脫氧胞苷(2c)和N-苯甲酰基-二-O-乙酰丙?；?2′-脫氧腺苷(2e)進(jìn)行由CAL-B催化的水解反應(yīng)可分別獲得N-苯甲酰基-2′-脫氧胞苷(1c)和N-苯甲?；?2′-脫氧腺苷(1e)。雖然嘗試了幾種反應(yīng)條件，但反應(yīng)過(guò)程不具有區(qū)域選擇性。看來(lái)CAL-B的活性點(diǎn)不能以與其未保護(hù)的對(duì)應(yīng)物那樣相同的方式適用于N-保護(hù)的腺苷和胞苷。雖然不希望被任何特定的理論所束縛，但可能是由于苯基基團(tuán)在其結(jié)合點(diǎn)有某些立體的接觸，因此而導(dǎo)致了不希望的結(jié)果。
2′-取代的核苷在其5′-O-乙酰丙?；怀晒Φ剡M(jìn)行了選擇性地脫保護(hù)。參見圖3，四種核苷，2′-甲氧基-3′，5′-二-O-乙酰丙酰基腺苷(6a)、2′-甲氧基乙氧基-3′，5′-二-O-乙酰丙?；佘?6b)、2′-甲氧基-3′，5′-二-O-乙酰丙?；?2′-脫氧胞嘧啶(6c)和2′-甲氧基乙氧基-3′，5′-二-O-乙酰丙?；?5-甲基胞嘧啶(6d)全部可用CAL-B選擇性水解，以高產(chǎn)率得到7a-7d。使核苷有效水解的時(shí)間和條件不限于本發(fā)明例舉的內(nèi)容。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，使酯有效水解的各種時(shí)間和條件是可以理解的。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，3′，5′-二-O-乙酰丙?；塑湛捎蛇x擇的水解酶如脂酶在3′-O-乙酰丙?；贿M(jìn)行區(qū)域選擇性脫保護(hù)，在3′-O-乙酰丙?；贿M(jìn)行直接地區(qū)域選擇性水解，但不會(huì)引起5′-O-乙酰丙?；坏乃?，使二保護(hù)的核苷與水解酶(如脂酶)在能使3′，5′-二-O-乙酰丙?；塑盏?′-O-乙酰丙酰基位有效水解的時(shí)間和條件下接觸。在一些實(shí)施方案中，二保護(hù)的核苷是下述結(jié)構(gòu)之一 其中R6是-H或-OH；R2、R3、R4和R5各自獨(dú)立地是-H或氨基保護(hù)基團(tuán)；G是N或CH；和Lev是-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3。
例如，參見圖2，于60℃和在0.15M磷酸鹽緩沖溶液中，使2與固定的蔥頭假單孢菌脂酶[PSL-C，比例為1∶3w/w(2/PSL-C)]反應(yīng)，完成2，3′-二-O-的選擇性水解，得到5’-O-乙酰丙酰基衍生物。對(duì)3′-O-乙酰丙?；唬蠘O洲假絲酵母脂酶A(CAL-A)也顯示出良好的選擇性，并且比用PSL-C的反應(yīng)溫度更低(40℃代替60℃)，反應(yīng)時(shí)間更短，酶/原料的比例更小(參見圖4)。因此，可以高產(chǎn)率(70-85％)得到5′-O-乙酰丙?；剀?4a)，N-苯甲?；?5’-O-乙酰丙?；?2′-脫氧胞苷(4c)，N-苯甲?；?5’-O-乙酰丙?；?2′-脫氧腺苷(4e)。對(duì)粗制反應(yīng)混合物進(jìn)行TLC或1H-NMR分析沒(méi)有檢出3′-乙酰丙?；鶇^(qū)域異構(gòu)體。TLC表明有痕量的母體核苷1。
N-異丁?；?3′，5′-二-O-乙酰丙?；?2′-脫氧鳥苷(2g)不能用CAL-A選擇性水解。但是，用PSL-C處理可得到N-異丁?；?5′-O-乙酰丙?；?2′-脫氧鳥苷(4g)，在60℃24小時(shí)后可以分離出來(lái)，產(chǎn)率93％(表1，第8項(xiàng))。N-苯甲?；?二-乙酰丙酰基衍生物(2c)和(2e)對(duì)PSL-C和CAL-A兩種脂酶都是合適的基質(zhì)。
如圖3所示，將2′-OR核苷用PSL-C或CAL-A處理，得到3′-O-乙酰丙酰基和5′-O-乙酰丙?；塑盏幕旌衔铮@說(shuō)明對(duì)2′-O和2′-脫氧核苷沒(méi)有選擇性。雖然不能與任何特定的理論結(jié)合，但這可能是由于2′-O-R基團(tuán)的空間位阻使3′-O-乙酰丙?；y以接近以便由其中的一種脂酶進(jìn)行選擇性的水解。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，可以進(jìn)行如圖5所示的酶?；?。在氮?dú)庵?，?(0.2mmol)的懸浮液、肟酯(0.6mmol)和脂酶在無(wú)水THF(1mL)中在表3所指溫度下于250rpm攪拌表3所指的時(shí)間(圖8)。反應(yīng)由TLC(10％MeOH/CH2Cl2)控制。過(guò)濾出所述的酶，用CH2Cl2洗滌，真空蒸出溶劑，將殘余物溶于NaHCO3(水溶液)并用CH2Cl2萃取，合并的有機(jī)層用Na2SO4干燥并蒸發(fā)。殘余物用乙醚中沉淀，過(guò)濾后得到單乙酰丙?；塑?或4。除了在第10和11項(xiàng)中需要分離出痕量的其它?；苌镆酝?，可以不必進(jìn)一步純化。
可以看出，?；椒ū人庑枰牟襟E更少，也更容易進(jìn)行。起始原料是母體核苷，不必首先制備二乙酰丙?；苌?。水解方法需要兩個(gè)步驟，而酰化方法只需要一個(gè)步驟。肟酯可以簡(jiǎn)單步驟制備和可通過(guò)簡(jiǎn)單的過(guò)濾純化。?；^(guò)程可避免快速色譜法。通過(guò)在CAL-B存在下進(jìn)行?；磻?yīng)，可以得到5′-O-Lev-T、5′-O-Lev-dCBz、5′-O-Lev-dABz和5′-O-Lev-dGiBu。另一方面，用PSL-C可得到3′-O-Lev-T、3′-O-Lev-dCBz和5′-O-Lev-dABz(但不是3′-O-Lev-dGiBu)。為了制備3′-O-Lev-dGiBu必須進(jìn)行酶水解反應(yīng)。表3(圖6)指出的擴(kuò)大反應(yīng)產(chǎn)率提高，在酶過(guò)濾(即避免萃取和沉淀)之后的快速色譜產(chǎn)率也較高。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，?；椒ㄒ部捎糜谌缡絏VI-XX定義的核糖核苷。核糖核苷的常規(guī)?；椒ㄈ鐖D7所示，其數(shù)據(jù)見表4(圖8)。2′-烷基核糖核苷的單乙酰丙?；苌锟扇芙庥谝颐?，不可能通過(guò)沉淀由剩余的肟酯中分離出來(lái)。因此，在酶過(guò)濾之后，殘余物可用快速色譜法純化(梯度淋洗液5-20％MeOH/CH2Cl2)。
用CAL-B，采用?；椒?，可能得到5′-0-Lev-2′-OMOE-T、5′-O-Lev-2′-O-MOE-5-Me-C、5′-O-Lev-2′-O-MOE-5Me-CBz、5′-O-Lev-2′-O-MOE-A、5′-O-Lev-2’-O-MOE-ABz、5′-O-Lev-2’-O-Me-A和5′-O-Lev-2′-O-MOE-GiBu。另一方面用PSL-C可得到3′-O-Lev-2’-O-MOE-5-Me-CBz、3′-O-Lev-2’-O-MOE-ABz和3′-O-Lev-2’-O-Me-ABz。需要通過(guò)水解反應(yīng)制備相應(yīng)的3′-Lev-T和3′-Lev-GiBu衍生物。
本發(fā)明實(shí)踐中有用的核酸包括天然存在的和非天然存在的核苷和核苷酸。本發(fā)明所述的核苷和核苷酸不限于單體單元，而且也可以含有多個(gè)相連的單體單元形成二核苷、核苷酸和低聚核苷酸，并包括天然存在的和非天然存在的核堿基(nucleobase)、糖和骨架(backbones)。
非天然存在的核苷和核苷酸可以用其它具有伯和仲醇基團(tuán)的、與這些核糖類似的結(jié)構(gòu)取代糖結(jié)構(gòu)以進(jìn)行改性。非天然存在的糖和核苷堿在結(jié)構(gòu)上通?？膳c天然存在的糖(如核糖和脫氧核糖)和核苷堿(如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶)區(qū)別，其功能是可以互換的。因此，非天然存在的核堿基和糖包括所有模仿天然存在物種的結(jié)構(gòu)和/或功能，并有助于低聚核苷酸與目標(biāo)結(jié)合，或者對(duì)低聚核苷酸的性能有有益的貢獻(xiàn)的結(jié)構(gòu)。
對(duì)骨架的改性包括對(duì)磷酸酯骨架進(jìn)行改性以提高其對(duì)核酸酶的抗性。這些改性包括應(yīng)用如膦酸甲酯、硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯鍵連，以及這些改性使核苷酸間鍵合，如非-磷鍵合、肽核酸(PNAs)和2’，5’-鍵合的性質(zhì)發(fā)生引人注目的改變本發(fā)明所包含的雜環(huán)堿部分(在本領(lǐng)域中常常被簡(jiǎn)稱為“堿”或“核堿基”)包括天然存在和非天然存在的核堿基兩部分。雜環(huán)堿部分可進(jìn)一步地被保護(hù)，其中一個(gè)或多個(gè)堿官能團(tuán)帶有保護(hù)基團(tuán)。本文所用的“未改性的”或“天然的”核堿基包括嘌啉堿腺嘌呤和鳥嘌呤，以及嘧啶堿胸腺嘧啶，胞嘧啶和尿嘧啶。改性的核堿基包括其它合成的和天然的核堿基如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羥甲基胞嘧啶，黃嘌呤，次黃嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物，腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物，2-硫脲嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶，5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(pseudouracil)，4-硫代尿嘧啶，8-鹵代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羥基和其它8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤，5-鹵代，特別是5-溴代、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤，7-脫氮鳥嘌呤和7-脫氮腺嘌呤，以及3-脫氮鳥嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。其它核堿基包括下述文獻(xiàn)中公開的核堿基USP No.3,687,808；Concise Enyclopedia of PolymerScience and Engineering，p858-859，Kroschwitz，J.I.編輯，John Wiley &Sons出版，1990；Englisch等人，Angewandte Chemie，InternationalEdition，1991，30，613和Sanghvi，Y.S.，第15章Antisense Research andApplications，p289-302，Crooke，S.T.和Lebleu，B.編輯，CRC Press，1993。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法應(yīng)用于所謂的C-核苷(即是核堿基通過(guò)C-C鍵連接于核苷環(huán)的核苷，這與天然存在的C-N鍵相反)。另外，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，核苷環(huán)是α-構(gòu)型(與天然存在的β-構(gòu)型不同)、L-構(gòu)型(與天然存在的D-構(gòu)型不同) 或兩者(即α-L-構(gòu)型)。
某些雜環(huán)堿部分對(duì)于提高本發(fā)明低聚化合物的鍵合親和力以補(bǔ)充靶標(biāo)特別有用。這些包括5-取代嘧啶，6-氮雜嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已經(jīng)知道5-甲基胞嘧啶取代可提高核酸雙鏈穩(wěn)定性0.6-1.2℃(同上，p276-278)，是目前優(yōu)選的堿替代物，特別是在與選擇的2′-糖改性如2′-甲氧基乙基基團(tuán)結(jié)合更是如此。
雜環(huán)堿部分(改性核堿基)的制備已有教導(dǎo)中有代表性的美國(guó)專利包括，但不限于U.S P3,687,808；4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121，5,596,091；5,614,617；和5,681,941，其中一些是共同擁有的，所有這些都引入本文作為參考，1996年12月10日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)08/762,587也引入本文作為參考。
本發(fā)明所用有代表性的一系列2′-取代基包括C1-C20烷基、C2-C20鏈烯基、C2-C20炔基、C5-C20芳基、O-烷基、O-鏈烯基、O-炔基、O-烷基氨基、O-烷基烷氧基、O-烷基氨基烷基、O-烷基咪唑、S-鏈烯基、S-炔基、NH-烷基、NH-鏈烯基、NH-炔基、N-二烷基、O-芳基、S-芳基、NH-芳基、O-芳烷基、S-芳烷基、NH-芳烷基、N-鄰苯二甲酰亞胺基、鹵素(特別是氟)、酮、羧基、硝基、亞硝基、腈、三氟甲基、三氟甲氧基、咪唑、疊氮基、肼基、羥氨基、異氰?；嗧?、砜、硫化物、二硫化物、甲硅烷基、雜環(huán)、碳環(huán)、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇和式(O-烷基)m的聚醚，其中m是1-大約10。在這些聚醚中優(yōu)選的是線性的或環(huán)狀的聚乙二醇(PEGs)，和含有(PEG)的類型，如冠醚，以及下述文獻(xiàn)所公開Ouchi等人，(Drug Design and Discovery，1992，9，93)，Ravasio等人(J Org.Chem.，1991，56，4329)和Delgardo等人(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1992，9，249)，上述文獻(xiàn)均全文引入本申請(qǐng)作為參考。另外，糖的改性公開在Cook，P.D.，Anti-Cancer Drug Design，1991，6，585-607。氟代、O-烷基、O-烷基氨基、O-烷基咪唑、O-烷氨基烷基和烷基氨基取代公開在美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)08/398,901，1995年3月6日申請(qǐng)，發(fā)明名稱是OligomericCompounds having Pyrimidine Nucleotide(s)with 2′and 5′Substitutions，該文獻(xiàn)也全文引入本申請(qǐng)作為參考。
本發(fā)明所用其它取代基團(tuán)包括-SR和-NR2基團(tuán)，其中R各自獨(dú)立的是氫、保護(hù)基團(tuán)或取代或未取代的烷基、鏈烯基或炔基。2′-SR核苷公開在USP5,670,633，申請(qǐng)日1997年9月27日，該文獻(xiàn)也全文引入本申請(qǐng)作為參考。2′-SR單體合成子的引入公開在Hamm等人，J.Org.Chem.，1997，62，3415-3420。2′-NR2核苷公開在Goettingen，M.，J.Org.Chem.，1996，61，73-6281；和Polushin等人，Tetrahedron Lett.，1996，37，3227-3230。
其它取代基團(tuán)為式XXI或XXII之一
其中Z0是O、S或NH；J是單鍵、O或C(＝O)；E是C1-C10烷基、N(R1)(R2)、N(R1)(R5)、N＝C(R1)(R2)、N＝C(R1)(R5)或是下述式XXIII或XXIV之一
每個(gè)R6、R7、R8、R9和R10各自獨(dú)立的是氫、C(O)R11、取代或未取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C2-C10鏈烯基、取代或未取代的C2-C10炔基、烷基磺?；?、芳基磺酰基、化學(xué)官能基團(tuán)或共軛基團(tuán)，其中取代基團(tuán)選自羥基、氨基、烷氧基、羧基、芐基、苯基、硝基、巰基、硫代烷氧基、鹵素、烷基、芳基、鏈烯基和炔基；或R7和R8與它們相連的氮原子一起選擇性的形成鄰苯二甲酰亞胺部分；或R9和R10與它們相連的氮原子一起選擇性地形成鄰苯二甲酰亞胺部分；每個(gè)R11個(gè)R12各自獨(dú)立的是取代或未取代的C1-C10烷基、三氟甲基、氰基乙氧基、甲氧基、乙氧基、叔丁氧基、烯丙氧基、9-芴基甲氧基、2-(三甲基甲硅烷基)-乙氧基、2，2，2-三氯乙氧基、苯甲酰氧基、丁?；惗□；⒈交蚍蓟?
R5是T-L；T是鍵或是連接部分；L是化學(xué)官能基團(tuán)、共軛基團(tuán)或固體載體物質(zhì)；每個(gè)R1和R2各自獨(dú)立的是H、氮保護(hù)基團(tuán)、取代或未取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C2-C10鏈烯基、取代或未取代的C2-C10炔基，其中所說(shuō)的取代基是OR3、SR3，、NH3+、N(R3)(R4)、胍基或?；渲兴f(shuō)的?；撬岬孽０坊蝓?；或者R1和R2，一起是氮保護(hù)基團(tuán)，或結(jié)合成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，所述的環(huán)狀結(jié)構(gòu)選擇性的含有其它選自N和O的雜原子；或R1、T和L一起是化學(xué)官能基團(tuán)；每個(gè)R3和R4各自獨(dú)立的是H、C1-C10烷基、氮保護(hù)基團(tuán)，或R3和R4一起是氮保護(hù)基團(tuán)；或R3和R4一起結(jié)合成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，所述的環(huán)狀結(jié)構(gòu)選擇性的含有其它選自N和O的雜原子；Z4是OX、SX或N(X)2；每個(gè)X各自獨(dú)立的是H、C1-C8烷基、C1-C8鹵代烷基、C(＝NH)N(H)R5、C(＝O)N(H)R5或OC(＝O)N(H)R5；R5是H或C1-C8烷基；Z1、Z2和Z3包括含有大約4-大約7個(gè)碳原子或含有大約3-大約6個(gè)碳原子和1或2個(gè)雜原子的環(huán)系，其中所說(shuō)的雜原子選自氧、氮或硫，和所說(shuō)的環(huán)系是脂族、不飽和脂族、芳族、或是飽和或不飽和的雜環(huán)；Z5是具有1至大約10個(gè)碳原子的烷基或鹵代烷基、具有2至大約10個(gè)碳原子的鏈烯基、具有2至大約10個(gè)碳原子的炔基、具有6至大約14個(gè)碳原子的芳基、N(R1)(R2)OR1、鹵素、SR1或CN；每個(gè)q1各自獨(dú)立的是1-10整數(shù)；每個(gè)q2各自獨(dú)立的是0或1；q3是0或1-10的整數(shù)；q4是1-10的整數(shù)；q5是0，1或2；和條件是當(dāng)q3是0時(shí)，q4大于1。
式I有代表性的取代基團(tuán)公開在美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)No.09/130,973，1998年8月7日申請(qǐng)，發(fā)明名稱″Capped 2′-OxyethoxyOligonucleotides″，該文獻(xiàn)全文引入本申請(qǐng)作為參考。
式II有代表性的取代基團(tuán)公開在美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)No.09/123,108，1998年7月27日申請(qǐng)，發(fā)明名稱″RNA Targeted 2’-Modified Oligonucleotides that are Conformationaliy Preorganized″，該文獻(xiàn)全文引入本申請(qǐng)作為參考。
特別優(yōu)選的取代基團(tuán)包括O[(CH2)nO]mCH3，O(CH2)nOCH3，O(CH2)nNH2，O(CH2)nCH3，O(CH2)nONH2，O(CH2)nON[(CH2)nCH3]]2(其中n和m是1至大約10)，C1-C10低級(jí)烷基，取代的低級(jí)烷基，烷芳基，芳烷基，O-烷芳基或O-芳烷基，SH，SCH3，OCN，Cl，Br，CN，CF3，OCF3，SOCH3，SO2CH3，ONO2，NO2，N3，NH2，雜環(huán)烷基，雜環(huán)烷芳基，氨基烷基氨基，多烷基氨基和取代的甲硅烷基。其它特別優(yōu)選的改性包括2′-甲氧基乙氧基(2′-O-CH2CH2OCH3或2′-MOE，Martin等人，Helv.Chim.Acta，1995，78，486)。更優(yōu)選的取代基團(tuán)是2′-二甲氨基氧基乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基團(tuán)，也稱作2′-DMAOE。有代表性的氨基氧基取代基公開在共同申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)09/344,260，1999年6月25日申請(qǐng)，發(fā)明名稱是″Aminooxy-Functionalized Oligomers”；和美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)09/370,541，1999年8月9日申請(qǐng)，代理序列編號(hào)ISIS-3993，發(fā)明名稱“Aminooxy-Functionalized Oligomers andMethods for Making Same”；該文獻(xiàn)全文引入本申請(qǐng)作為參考。
其它優(yōu)選的改性包括2′-甲氧基(2′-O-CH3)，2′-氨基丙氧基(2′-OCH2CH2CH2NH2)和2′-氟(2′-F)。在核苷和低聚體的其它位置上也可以進(jìn)行類似的改性，特別是在3′-末端核苷糖的3′-位，或在具有由2’-位鍵連的核苷如2’，5’-鍵連的低聚體的3′-位，和在5′-末端的5′-位。低聚體也具有糖的模擬形式如以環(huán)丁基部分代替呋喃戊糖基的糖。公開了這些改性糖結(jié)構(gòu)制備的有代表性的美國(guó)專利包括，但不限于U.S.P4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,0531 5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；和5,700,920，其中一些是共同擁有的，每篇文獻(xiàn)都全文引入本申請(qǐng)作為參考。共同擁有的美國(guó)專利5,859,221也全文引入本申請(qǐng)作為參考。
式III和IV表示的有代表性的胍基取代基基團(tuán)公開在共同擁有的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)09/349,040，1999年7月9日申請(qǐng)，發(fā)明名稱是″Functionalized Oligomers”，該文獻(xiàn)全文引入本申請(qǐng)作為參考。
有代表性的乙酰氨基取代基公開在美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)09/378,568，發(fā)明名稱是″2′-O-Acetamido Modified Monomers andOligomers″，1999年8月19日申請(qǐng)，代理序列編號(hào)1515-4071，該文獻(xiàn)全文引入本申請(qǐng)作為參考。
有代表性的二甲氨基乙氧基乙基取代基公開在國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US599/17895，發(fā)明名稱″2’-O-Dimethylaminoethyioxy ethyl-Modified oligonucleotides″，1999年8月6日申請(qǐng)，代理序列編號(hào)ISIS-4045，該文獻(xiàn)全文引入本申請(qǐng)作為參考。
在合成過(guò)程中，本發(fā)明的方法用不穩(wěn)定的保護(hù)基團(tuán)保護(hù)各種官能基團(tuán)部分。在常規(guī)的低聚核苷酸合成方法經(jīng)常使用保護(hù)基團(tuán)以保護(hù)幾種不同類型的官能團(tuán)。通常，保護(hù)基團(tuán)使化學(xué)官能團(tuán)對(duì)特定的反應(yīng)條件呈惰性，并可以在分子的這些官能團(tuán)上添加和除去，基本上不會(huì)破壞分子的其余部分，例如參見Green和Wuts，Protective Groups inOrganic Synthesis，第二版，John Wiley & Sons，New York，1991。合成中用于保護(hù)核苷酸的有代表性的保護(hù)基團(tuán)包括堿不穩(wěn)定保護(hù)基團(tuán)和酸不穩(wěn)定保護(hù)基團(tuán)。堿不穩(wěn)定保護(hù)基團(tuán)在合成期間用于保護(hù)雜環(huán)核堿基的外向環(huán)氨基。此類保護(hù)通?？赏ㄟ^(guò)?；瘜?shí)現(xiàn)。為達(dá)到此目的常用的兩種?；鶊F(tuán)是苯甲酰氯和異丁酰氯。這些保護(hù)基團(tuán)在低聚核苷酸合成的反應(yīng)條件下是穩(wěn)定的，合成結(jié)束后用堿處理幾乎可以等比率將其除去。
常用于低聚核苷酸合成的羥基保護(hù)基團(tuán)可以用下式基團(tuán)表示-C(R1)(R2)(R3)，其中每個(gè)R1，R2和R3是未取代的或單取代的和選自苯基、萘基、蒽基的芳基或雜芳基，具有一個(gè)選自N、O和S的雜原子、或二個(gè)氮雜原子的五或六元雜環(huán)，包括喹啉基、呋喃基和噻吩基；所述的取代基選自鹵素(即F，Cl，Br，和I)，硝基，C1-C4-烷基或烷氧基，和最多有10個(gè)碳原子的芳基，芳烷基或環(huán)烷基；以及其中的R2和R3各自可以是C1-C4-烷基或最多有10個(gè)碳原子的芳烷基或環(huán)烷基。
本發(fā)明中，引入乙酰丙?；孽；瘎┦悄軌蚺c活性基團(tuán)如羥基反應(yīng)產(chǎn)生酰化基團(tuán)，且其中的酰基部分是如上所述乙酰丙?；鶊F(tuán)的酰化劑。這些酰化劑包括乙酰丙酸，以及乙酰丙酸的活化形式，包括其酸酐、酯、肟和鹵代酸衍生物。對(duì)引入乙酰丙?；鶊F(tuán)而言，乙酰丙酸是優(yōu)選的?；瘎?。
本發(fā)明需要使用水解酶如脂酶，以影響核苷或改性核苷的脫保護(hù)或酰化。幾類水解酶是自然界存在的。其中有兩種水解酶脂酶和蛋白酶已經(jīng)廣泛用于非天然介質(zhì)。由化學(xué)的觀點(diǎn)看，可知脂酶和蛋白酶在有機(jī)溶劑中是溫和的和選擇性的試劑，它能夠活化樣品中通常的羧酸根，并且將其轉(zhuǎn)移至大量的親核體。在本發(fā)明的酰化反應(yīng)(在核苷上引入乙酰丙?；?或脫保護(hù)(即由保護(hù)的核苷上除去乙酰丙?；?時(shí)需要這些水解酶。術(shù)語(yǔ)水解酶包括脂酶、蛋白酶，和能使核苷區(qū)域選擇性的直接?；蚰苁辊；暮塑彰摫Ｗo(hù)的類似水解酶。
可以理解的是，通過(guò)考察了下面的實(shí)施例，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的目的、優(yōu)點(diǎn)和新穎的特征會(huì)更加清晰，但這些實(shí)施例并不限制本發(fā)明。
實(shí)施例試劑南美洲假絲酵母脂酶B(CAL-B)來(lái)自Novo Nordisk Co.，南美洲假絲酵母脂酶A(CAL-A)和固定的蔥頭假單胞菌脂酶(PSL-C)各自購(gòu)自Roche Diagnostics S.L.和Amano Pharmaceuticals。PS-碳二亞胺購(gòu)自Argonaut Technologies(San Carlos，CA，EE.UU.)。其它所有試劑購(gòu)自Aldrich或Fluka。試劑用適當(dāng)?shù)母稍飫┰诘獨(dú)庀抡麴s。
3’，5′-二-O-乙酰丙?；?2′-脫氧核苷(2)方法A在氮?dú)庀?，?，4-二噁烷(20mL)中的1(2mmol)和Et3N(1.7mL，12mmol)的混合物加入乙酰丙酸(1.21g，10.4mmol)、DCC(2.14g，10.4mmol)和DMAP(20mg，0.16mmol)。于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3小時(shí)。為了使三保護(hù)胞苷衍生物生成的最少，將6mmol的LevOH和DCC，和5mmol的Et3N用于1b。過(guò)濾收集不溶物，真空蒸發(fā)濾液。將殘余物溶于NaHCO3(水溶液)，并用CH2Cl2萃取，合并的有機(jī)萃取液用Na2SO4干燥和蒸發(fā)。加入冷的Et2O，在漿液中劃痕直到開始結(jié)晶。過(guò)濾出固體，用冷的Et2O洗滌，然后傾入EtOAc(在2f的情況下是MeOH)。過(guò)濾出不溶物，濃縮濾液得到目的化合物。得到的產(chǎn)物足夠純，可以直接進(jìn)行酶水解步驟。用快速色譜(EtOAc)進(jìn)一步純化得到純的3′，5′-二-O-乙酰丙?；塑?a-g。
方法B在氮?dú)庀?，?，4-二噁烷(5mL)中的1(0.4mmol)和Et3N(0.15mL，1mmol)的混合物加入乙酰丙酸(0.14g，1.2mmol)、PS-碳二亞胺(1.05g，1.2mmol)、DMAP(4mg，0.032mmol)和DMAP·HCl(3mg，0.02mmol)。于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3小時(shí)。過(guò)濾收集不溶物，真空蒸發(fā)濾液。將殘余物溶于NaHCO3(水溶液)，并用CH2Cl2萃取，合并的有機(jī)萃取液用Na2SO4干燥和蒸發(fā)。固體用冷的Et2O洗滌，得到3′，5′-二-O-乙酰丙?；塑?a和2d。
3′，5′-二-O-乙酰丙?；剀?2a).Rf(10％MeOH/CH2Cl2)0.45；Mp87-89℃；IR(KBr)υ 3315，3074，3006，2967，2947，1743，1689，和1660cm-1；1H-NMR(CDCl3，300MHz)d 1.88(s，3H，Me)，2.14(s，3H，Me-Lev)，2.15(s，3H，Me-Lev)，2.18(m，1H，H2′)，2.41(m，1H，H2′)，2.54(m，4H，2CH2-Lev)，2.73(m，4H，2CH2-Lev)，4.19(m，1H，H4′)，4.31(m，2H，H5′)，5.18(m，1H，H3)，6.28(dd，1H，H1′，3JHH8.5，3JHH5.4Hz)，7.32(s，1H，H6)，和9.99(s，1H，NH)；13C-NMR(CDCl3，75.5MHz)d 12.3(Me)，27.48(CH2-Lev)，27.54(CH2-Lev)，29.4(2Me-Lev)，36.8(C2′)，37.5(2CH2-Lev)，63.7(C5′)，74.2，81.8，84.3(C1′+C3′+C4′)，111.2(C5)，134.6(C6)，150.3(C2)，163.8(C4)，171.97(C＝O Lev)，172.02 (C＝OLev)，和206.3(2C＝O Lev)；MS(ESI+，m/z)439[(M+H)+，100％]，和461[(M+Na)+，50].3′，5′-二-O-乙酰丙?；?2′-脫氧胞苷(2b)Rf(20％MeOH/CH2Cl2)0.67；IR(KBr)υ 3390，2940，1737，1715，和1649cm-1；1H-NMR(MeOH-d4，200MHz)d 2.39(s，3H，Me-Lev)，2.40(s，3H，Me-Lev)，2.43(m，1H，H2′)，2.75(m，1H，H2′)，2.79(m，4H，2CH2-Lev)，3.02(m，4H，2CH2-Lev)，4.51(m，3H，H4′+2H5′)，5.46(m，1H，H3′)，6.17(d，1H，H5，3JHH7.6Hz)，6.45(dd，1H，H1′，3JHH8.6，3JHH5.7Hz)，和7.98(dd，1H，H6，3JHH7.3Hz)；13C-NMR(MeOH-d4，75.5MHz)d 29.1(CH2-Lev)，29.2(CH2-Lev)，29.9(Me-Lev)，38.9(2CH2-Lev)，39.2(C2′)，65.5(C5′)，76.5，84.1，87.9(C1′+C3′+C4′)，96.8(C5)，142.2(C6)，158.4(C2)，168.0(C4)，174.2(C＝O)，174.4(C＝O)，和209.7(C＝O)；MS(ESI+，m/z)446[(M+Na)+，70％]和462[(M+K)+，100]。
N-苯甲酰基-3′，5′-二-Q-乙酰丙酰基-2′-脫氧胞苷(2c)Rf(10％MeOH/CH2Cl2)0.61；Mp107-109℃；IR(KBr)υ 3233，1744，1731，和1668cm-1；1H-NMR(MeOH-d4，200MHz)d 2.31(s，3H，Me-Lev)，2.38(s，3H，Me-Lev)，2.50(m，1H，H2′)，2.75(m，4H，2CH2-Lev)，2.95(m，1H，H2′)，3.05(m，4H，2CH2-Lev)，4.59(m，3H，H4′+2H5′)，5.49(m，1H，H3′)，6.42(dd，1H，H1′，3JHH7.7，3JHH5.7Hz)，7.75(m，4H，H5+Hm+Hp)，8.15(m，2H，Ho)，和8.45(d，1H，H6，3JHH7.6Hz)；13C-NMR(MeOH-d4，75.5MHz)d 29.1(CH2-Lev)，29.2(CH2-Lev)，29.9(Me-Lev)，38.91(CH2-Lev)，38.94(CH2-Lev)，39.8(C2′)，65.3(C5′)，76.5，85.0，89.3(C1′+C3′+C4′)，99.0(C5)，129.5，130.1(Co+Cm)，134.4(Cp)，135.0(Ci)，146.2(C6)，158.0(C2)，165.1(C4)，169.2(PhC＝O)，174.3(C＝O)，174.4(C＝O)，209.67(C＝O)，和209.72(C＝O)；MS(ESI+，m/z)528[(M+H)+，100％]，550[(M+Na)+，30]，和566[(M+K)+，40].
3′，5′-二-O-乙酰丙酰基-2′-脫氧腺苷(2d)Rf(10％MeOH/CH2Cl2)0.44；IR(KBr)υ 3418，3165，2923，1738，1715，和1644cm-1；1H-NMR(MeOH-d4，200MHz)d2.33(s，3H，Me-Lev)，2.39(s，3H，Me-Lev)，2.79(m，5H，2CH2-Lev+1H2′)，3.00(m，4H，2CH2-Lev)，3.25(m，1H，H2′)，4.52(m，3H，H4′+2H5′)，5.65(m，1H，H3′)，6.61(dd，1H，H1′，3JHH6.0，3JHH7.9Hz)，8.41(s，1H，H2or H8)，和8.50(s，1H，H8or H2)；13C-NMR(MeOH-d4，75.5MHz)d 29.1(CH2-Lev)，29.2(CH2-Lev)，29.9(2Me-Lev)，38.1(C2′)，38.9(2CH2-Lev)，65.2(C5′)，76.5，84.2，86.2(C1′+C3′+C4′)，120.8(C5)，141.2(C8)，150.7(C4)，154.2(C2)，157.6(C6)，174.2(C＝O)，174.4(C＝O)，209.68(C＝O)，和209.73(C＝O)；MS(ESI+，m/z)448[(M+H)+，20％]，470[(M+Na)+，80]，和486[(M+K)+，100].
N-苯甲?；?3′，5′-二-O-乙酰丙?；?2′-脫氧腺苷(2e)Rf(10％MeOH/CH2Cl2)0.71；Mp69-71℃；IR(KBr)υ 3412，3086，2958，1738，1714，和1685cm-1；1H-NMR(MeOH-d4，300MHz)d 2.28(s，3H，Me-Lev)，2.35(s，3H，Me-Lev)，2.75(m，4H，2CH2-Lev)，2.87(m，1H，H2′)，2.99(m，4H，2CH2-Lev)，3.30(m，1H，H2′)，4.52(m，3H，H4′+2H5′)，5.65(m，1H，H3′)，6.70(表觀 t，1H，H1′，3JHH6.8Hz)，7.75(m，3H，2Hm+Hp)，8.25(表觀d，2H，2Ho，3JHH7.4Hz)，8.75(s，1H，H2or H8)，和8.88(s，1H，H8or H2)；13C-NMR(MeOH-d4，75.5MHz)d 29.0(CH2-Lev)，29.2(CH2-Lev)，30.0(Me-Lev)，37.9(C2′)，38.87(CH2-Lev)，38.91(CH2-Lev)，65.2(C5′)，76.4，84.3，86.5(C1′+C3+C4′)，125.5(C5)，129.7，130.0(Co+Cm)，134.1(Cp)，135.1(Ci)，144.5(C8)，151.3(C4)，153.3(C6)，153.5(C2)，168.1(PhC＝O)，174.2(C＝O)，174.3(C＝O)，209.6(C＝O)，和209.7(C＝O)；MS(ESI+，m/z)552[(M+H)+，100％]和574[(M+Na)+，17].
3′，5′-二-O-乙酰丙?；?2′-脫氧鳥苷(2f)Rf(20％MeOH/CH2Cl2)0.65；Mp148-150℃；IR(KBr)υ 3397，3153，2940，和1711cm-1；1H-NMR(DMSO-d6，200MHz)d 2.16(s，3H，Me-Lev)，2.22(s，3H，Me-Lev)，2.60(m，5H，2CH2-Lev+1H2′)，2.83(m，4H，2CH2-Lev)，3.00(m，1H，H2′)，4.29(m，3H，H4′+2H5′)，5.35(m，1H，H3′)，6.22(dd，1H，H1′，3JHH5.8，3JHH8.8Hz)，6.69(br s，2H，NH)，和8.00(s，1H，Hs)；13C-NMR(DMSO-d6，50.3MHz)d 27.5(CH2-Lev)，27.7(CH2-Lev)，29.55(Me-Lev)，29.60(Me-Lev)，35.5，37.4，37.50(2CH2-Lev+C2′)，63.8(C5′)，74.7，81.5，82.6(C1′+C3′+C4′)，116.8(C5)，135.1(C8)，151.2(C4)，154.0(C2)，156.9(C6)，172.1(C＝O)，172.2(C＝O)，206.9(C＝O)，和207.1(C＝O)；MS(ESI+，m/z)464[(M+H)+，22％]，486[(M+Na)+，75]，and 502[(M+K)+，100].N-異丁?；?3′，5′-二-O-乙酰丙?；?2′-脫氧鳥苷(2g)Rf(20％MeOH/CH2Cl2)0.85；Mp45-47℃；IR(KBr)υ 3413，2935，1740，1714，1680，and 1613cm-1；1H-NMR(DMSO-d6，200MHz)d 1.23(d，6H，Me-iBu，3JHH6.5Hz)，2.15(s，3H，Me-Lev)，2.20(s，3H，Me-Lev)，2.55-3.19(幾個(gè)m，11H，4CH2-Lev+2H2′+CH-iBu)，4.32(m，3H，H4′+2H5′)，5.35(m，1H，H3′)，6.35(表觀 t，1H，H1′，3JHH7.2Hz)，8.35(s，1H，H8)，11.80(br s，1H，NH)，and 12.20(br s，1H，NH)；13C-NMR(DMSO-d6，50.3MHz)d 18.86(Me-iBu)，18.91(Me-iBu)，27.5(CH2-Lev)，27.6(CH2-Lev)，29.5(Me-Lev)，29.6(Me-Lev)，34.8(CH-iBu)，35.5(C2′)，37.38(CH2-Lev)，37.45(CH2-Lev)，63.7(C5′)，74.6，81.7，82.9(C1′+C3′+C4′)，120.3(C5)，137.3(C8)，148.3，148.7(C2+C4)，154.8(C6)，172.1(C＝O)，172.2(C＝O)，180.2(iBu-C＝O)，206.9(C＝O)，和207.1(C＝O)；MS(ESI+，m/z)534[(M+H)+，100％]，556[(M+Na)+，60]，和572[(M+K)+，27].
3′，5′-二-O-乙酰丙酰基-2′-脫氧核苷酶水解的一般方法。在2(0.2mmol)的1，4-二噁烷(0.35mL)溶液中加入0.15M磷酸鹽緩沖溶液pH7(1.65mL)和相應(yīng)的脂酶[對(duì)CAL-A或CAL-B，2∶酶＝1∶1(w/w)，對(duì)PSL-C為1∶3(w/w)]。使混合物在250rpm按照表1指出的溫度和時(shí)間進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)由TLC(10％MeOH/CH2Cl2)控制。過(guò)濾出酶，用CH2Cl2洗滌，真空蒸發(fā)溶劑，殘余物溶于NaHCO3(水溶液)，并用CH2Cl2萃取，合并的有機(jī)層用Na2SO4干燥，蒸發(fā)后得到單酰基核苷3或4。在3b的情況下，殘余物用快速色譜而不是萃取進(jìn)行純化。
3′-O-乙酰丙?；剀?3a)Rf(10％MeOH/CH2Cl2)0.32；Mp50-52℃；IR(KBr)υ 3449，3065，2927，和1706cm-1；1H-NMR(MeOH-d4，200MHz)d 2.09(d，3H，Me，JHH1.3Hz)，2.39(s，3H，Me-Lev′)，2.57(m，2H，H2′)，2.80(t，2H，CH2-Lev，3JHH6.0Hz)，3.05(t，2H，CH2-Lev，3JHH6.2Hz)，4.01(m，2H，H5′)，4.29(m，1H，H4′)，5.02(m，1H，H3′)，6.50(dd，1H，H1′，3JHH8.1，3JHH6.5Hz)，和8.04(d，1H，H6，JHH1.3Hz)；13C-NMR(CDCl3，75.5MHz)d 12.4(Me)，27.8(CH2-Lev)，29.6(Me-Lev)，37.1(C2′)，37.7(CH2-Lev)，62.2(C5′)，74.9，85.0，85.7(C1′+C3′+C4′)，111.1(C5)，136.5(C6)，150.6(C2)，164.3(C4)，172.4(2C＝O Lev)，和206.8(2C＝O Lev)；MS(ESI+，m/z)363[(M+Na)+，100％]和379[(M+K)+，30].
3′-O-乙酰丙酰基-2′-胞苷(3b)Rf(20％MeOH/CH2Cl2)0.41；1H-NMR(MeOH-d4，200MHz)d 2.39(s，3H，Me-Lev)，2.47(m，1H，H2′)，2.67(m，1H，H2′)，2.75(m，2H，CH2-Lev)，3.02(m，2H，CH2-Lev)，4.00(m，2H，2H5′)，4.30(m，1H，H4′)，5.49(m，1H，H3′)，6.15(d，1H，H5，3JHH6.8Hz)，6.48(表觀 t，1H，H1′，3JHH6.8Hz)，and 8.32(d，1H，H6，3JHH7.3Hz)；13C-NMR(MeOH-d4，75.5MHz)d 29.2(CH2-Lev)，29.9(Me-Lev)，38.9，39.5(C2′+CH2-Lev)，63.2(C5′)，76.9，87.1，87.8(C1′+C3′+C4′)，96.6(C5)，143.0(C6)，158.2(C2)，167.6(C4)，174.2(C＝O)，and 209.8(C＝O).
3′-O-乙酰丙酰基-2′-脫氧腺苷(3d)Rf(20％MeOH/CH2Cl2)0.66；IR(KBr)υ3292，2925，1730，1715，1690，1644，和1610cm-1；1H-NMR(MeOH-d4，200MHz)d 2.40(s，3H，Me-Lev)，2.76(m，1H，H2′)，2.80(t，2H，CH2-Lev，3JHH6.2Hz)，3.05(t，2H，CH2-Lev，3JHH6.2Hz)，3.14(m，1H，H2′)，4.04(m，2H，2H5′)，4.40(m，1H，H4′)，5.66(d，1H，H3′，3JHH6.0Hz)，6.61(dd，1H，H1′，3JHH5.7，3JHH9.1Hz)，8.39(s，1H，H2or H8)，和8.50(s，1H，H8orH2)；13C-NMR(MeOH-d4，75.5MHz)d 29.1(CH2-Lev)，29.9(Me-Lev)，38.9，39.0(C2′+CH2-Lev)，64.0(C5′)，77.5，87.6，87.9(C1′+C3′+C4′)，121.2(C5)，141.9(C8)，150.1(C4)，153.8(C2)，157.8(C6)，174.3(C＝O)，和209.8(C＝O)；MS(ESI+，m/z)350[(M+H)+，100％]，372[(M+Na)+，100]，和388[(M+K)+，60].
N-異丁?；?3′-O-乙酰丙酰基-2′-脫氧鳥苷(3g)Rf(20％MeOH/CH2Cl2)0.75；Mp170-172℃；IR(KBr)υ 3415，2961，2929，2859，1725，1686，和1614cm-1；1H-NMR(MeOH-d4，200MHz)d 1.41(d，6H，Me-iBu，3JHH6.8Hz)，2.38(s，3H，Me-Lev)，2.70-3.09(m，7H，2CH2-Lev+2H2+CH-iBu)，3.98(d，2H，2H5′，3JHH3.4Hz)，4.45(m，1H，H4′)，5.60(m，1H，H3′)，6.51(dd，1H，H1′，3JHH5.9，3JHH8.4Hz)，和8.45(s，1H，H8)；13C-NMR(MeOH-d4，50.3MHz)d 19.6(Me-iBu)，29.2(CH2-Lev)，30.0(Me-Lev)，37.2(CH-iBu)，38.9，39.3(C2′+CH2-Lev)，63.3(C5′)，76.8，85.8，87.3(C1′+C3′+C4′)，121.5(C5)，139.7(C8)，150.0，150.5(C2+C4)，157.6(C6)，174.2(C＝O)，182.0(iBu-C＝O)，和209.7(C＝O)；MS(ESI+，m/z)436[(M+H)+，15％]和458[(M+Na)+，50].
5′-O-乙酰丙?；剀?4a)Rf(10％MeOH/CH2Cl2)0.22；Mp141-143℃；IR(KBr)υ 3393，3215，2934，1737，1724，1643，和1629cm-1；1H-NMR(DMSO-d6，200MHz)d 1.91(s，3H，Me)，2.27(s，3H，Me-Lev′)，2.30(m，2H，H2′)，2.66(m，2H，CH2-Lev)，2.89(t，2H，CH2-Lev，3JHH6.2Hz)，4.07(m，1H，H4′)，4.35(m，3H，H3′+2H5′)，5.55(d，1H，OH)，6.32(t，1H，H1′，3JHH7.0Hz)，7.6(s，1H，H6′)，和11.45(s，1H，NH)；13C-NMR(DMSO-d6，50.3MHz)d 12.02(Me)，27.4(CH2-Lev)，29.4(Me-Lev)，37.2(C2′)，38.4(CH2-Lev)，63.8(C5′)，70.1(C3′)，83.5，83.6(C1′+C4′)，109.7(C5)，135.7(C6)，150.3(C4)，163.6(C2)，172.1(C＝O Lev)，和206.7(C＝O Lev)；MS(ESI+，m/z)341[(M+H)+，40％]，379[(M+Na)+，100]，and 379[(M+K)+，80].
N-苯甲?；?5′-O-乙酰丙?；?2′-胞苷(4c)Rf(10％MeOH/CH2Cl2)0.37；Mp50-52℃.IR(KBr)υ 3410，2919，1738，1701，和1650cm-1；1H-NMR(CDCl3，300MHz)d 2.20(s，3H，Me-Lev)，2.25(m，1H，H2′)，2.58(m，2H，CH2-Lev)，2.75(m，1H，H2′)，2.82(m，2H，CH2-Lev)，3.35(s，1H，OH)，4.25(m，1H，H3′)，4.40(m，3H，2H5′+H4′)，6.30(表觀 t，1H，H1′，3JHH6.2Hz)，7.55(m，4H，H5+2Hm+Hp)，7.90(表觀 d，2H，Ho，3JHH7.1Hz)，8.20(d，1H，H6，3JHH7.4Hz)，和8.78(s，1H，NH)；13C-NMR(CDCl3，50.3MHz)d 27.7(CH2-Lev)，29.6(Me-Lev)，37.7(CH2-Lev)，41.3(C2′)，63.7(C5′)，70.6，84.8，87.4(C1′+C3′+C4′)，96.8(C5)，127.6，128.7(Co+Cm)，132.8(Ci)，133.0(Cp)，144.2(C6)，155.1(C2)，162.4(C4)，166.7(PhC＝O)，172.6(C＝O)，和206.8(C＝O)；MS(ESI+，m/z)430[(M+H)+，20％]，452[(M+Na)+，65]，和468[(M+K)+，40].
N-苯甲?；?5′-O-乙酰丙?；?2′-脫氧腺苷(4e)Rf(10％MeOH/CH2Cl2)0.50；Mp69-71℃；IR(KBr)υ 3413，2959，2928，1726，1637，和1616cm-1；1H-NMR(MeOH-d4，300MHz)d 2.30(s，3H，Me-Lev)，2.70(m，3H，CH2-Lev+1H2′)，2.92(m，2H，CH2-Lev)，3.15(m，1H，H2′)，4.40(m，1H，H4′)，4.52(m，2H，2H5′)，4.85(m，1H，H3′)，6.75(表觀 t，1H，H1′，3JHH6.2Hz)，7.80(m，3H，2Hm+Hp)，8.30(m，2H，2Ho)，8.78(s，1H，H2or H8)，和8.92(s，1H，H8or H2)，13C-NMR(MeOH-d4，75.5MHz)d 29.0(CH2-Lev)，29.9(Me-Lev)，38.9，40.8(CH2-Lev+C2′)，65.3(C5′)，72.6，86.51，86.54(C1′+C3′+C4′)，125.7(C5)，129.7，130.0(Co+Cm)，134.2(Cp)，135.2(Ci)，144.6(C8)，151.4(C4)，153.3(C5)，153.5(C2)，168.4(PhC＝O)，174.5(C＝O)，和209.7(C＝O)；MS(ESI+，m/z)476[(M+Na)+，100％]和492[(M+K)+，53].
N-異丁?；?3′-O-乙酰丙?；?2′-脫氧鳥苷(4g)Rf(20％MeOH/CH2Cl2)0.60；Mp45-47℃；IR(KBr)υ3415，2930，1720，和1685 cm-1；1H-NMR(MeOH-d4，200MHz)d 1.41(d，6H，Me-iBu，3JHH6.8Hz)，2.33(s，3H，Me-Lev)，2.59-3.07(m，7H，2CH2-Lev+2H2′+CH-iBu)，4.32(m，1H，H4′)，4.50(m，2H，H5′)，4.75(m，1H，H3′)，6.50(表觀t，1H，H1′，3JHH6.4Hz)，和8.32(s，1H，H8)；13C-NMR(MeOH-d4，75.5MHz)d 19.7(Me-iBu)，29.0(CH2-Lev)，29.9(Me-Lev)，37.2(CH-iBu)，38.9，41.1(C2′+CH2-Lev)，65.3(C5′)，72.6，86.1，86.5(C1′+C3′+C4′)，121.8(C5)，139.8(C8)，150.0，150.5(C2+C4)，157.8(C6)，174.5(C＝O)，182.0(iBu-C＝O)，和209.7(C＝O)；MS(ESI+，m/z)436[(M+H)+，20％]，458[(M+Na)+，100]，和474[(M+K)+，50].
帶有乙酰丙酰基保護(hù)基團(tuán)的胸苷四聚物在3′-O和5′-O端基的各個(gè)位置上進(jìn)行酶水解的一般方法。
在二保護(hù)四聚物的1，4-二噁烷溶液中加入0.15M磷酸鹽緩沖溶液pH＝7和相應(yīng)的脂酶[對(duì)CAL-A或CAL-B，四聚物∶酶＝1∶1(w/w)，對(duì)PSL-C為1∶3(w/w)]?；旌衔镌?0℃于250rpm反應(yīng)62h。反應(yīng)用TLC(10％MeOH/CH2Cl2)控制。過(guò)濾出酶，用CH2Cl2洗滌，真空蒸發(fā)溶劑，殘余物溶于NaHCO3(水溶液)，并用CH2Cl2萃取，合并的有機(jī)層用Na2SO4干燥，蒸發(fā)后得到單?；酆塑账?。
2′-脫氧核苷區(qū)域選擇性酶?；囊话惴椒?。2′-脫氧核苷酶?；囊话惴椒ㄒ妶D5。在氮?dú)庵校?(0.2mmol)、肟酯(0.6mmol)和脂酶在無(wú)水THF(1mL)中的懸浮液在250rpm按照表3指出的溫度和時(shí)間進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)由TLC(10％MeOH/CH2Cl2)控制。過(guò)濾出酶，用CH2Cl2洗滌，真空蒸發(fā)溶劑，殘余物溶于NaHCO3(水溶液)，并用CH2Cl2萃取，合并的有機(jī)層用Na2SO4干燥和蒸發(fā)。殘余物在乙醚中沉淀，過(guò)濾后得到單乙酰丙?；塑?或4。除了在10和11項(xiàng)的情況下，不需要進(jìn)一步純化分離出其它痕量的?；苌?。
2′-改性核糖核酸區(qū)域選擇性酶?；囊话惴椒?。2′-改性核糖核酸酶酰化的一般方法見圖7。使2′-改性核糖核酸5與肟乙酰丙酰基酯在THF中和在脂酶(CAL-B或PSL-C)存在下反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物8(CAL-B)在5’-位?；磻?yīng)產(chǎn)物9(PSL-C)在3’-位?；?。
由前述可以看出，本發(fā)明提供了由核苷和/或3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷前體選擇性制備3′-O-乙酰丙?；塑蘸?′-O-乙酰丙?；塑盏臏睾偷姆椒?。本發(fā)明適合用于大規(guī)模生產(chǎn)保護(hù)的核苷。用本發(fā)明方法制備的化合物可用于制備低聚核苷酸的各種方法。
上文已經(jīng)參照一些實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了說(shuō)明，本文所公開的方法是常規(guī)方法，可用于各種基質(zhì)，特別是其中具有羥基的基質(zhì)。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是這里所描述的一般方法的其它實(shí)施方案也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。沒(méi)有任何特定的實(shí)施方案會(huì)限制本發(fā)明的范圍。
本文所引用的所有文獻(xiàn)都以全文引入本發(fā)明作為參考。
權(quán)利要求
1.使3′，5′-二-O-乙酰丙?；塑者x擇性脫保護(hù)的方法，該方法包括a.選擇對(duì)所述核苷的乙酰丙?；恢媚苤苯佑行У膮^(qū)域選擇性水解的水解酶；和b.使3′，5′-二-O-乙酰丙?；塑张c所述的水解酶在有效地生成相應(yīng)的3′-O-乙酰丙酰基和5′-O-乙酰丙?；塑盏臈l件下接觸一定時(shí)間
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的水解酶是脂酶。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述的脂酶是CAL-A、CAL-B、PSL-C、豬胰脂肪酶(porcine pancreatic lipase)，粘稠色桿菌(Chromobactenaum viscosum)脂酶、米赫毛霉(Mucor miehei)脂酶，Humicola lanuginosa脂酶，沙門氏柏干酪青霉(Penicilliumcamemberti)脂酶或皺落念珠菌(Candida rugosa)脂酶。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述的脂酶是CAL-A。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述的脂酶是CAL-B。
6.權(quán)利要求3的方法，其中所述的脂酶是PSL-C。
7.使3′，5′-二-O-乙酰丙?；塑赵?’-O-乙酰丙?；恢眠x擇性脫保護(hù)的方法，該方法包括選擇對(duì)所述3′，5′-二-O-乙酰丙?；塑盏?’-乙酰丙?；恢媚苤苯佑行У膮^(qū)域選擇性水解的水解酶，和使所述的3′，5′-二-O-乙酰丙?；塑张c所述的水解酶在有效地生成3′-O-乙酰丙酰基核苷時(shí)間和的條件下接觸。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述的水解酶是脂酶。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述的脂酶是CAL-B。
10.使3′，5′-二-O-乙酰丙?；塑赵?’-O-乙酰丙酰基位置選擇性脫保護(hù)的方法，該方法包括選擇對(duì)所述3′，5′-二-O-乙酰丙?；塑盏?’-乙酰丙?；恢媚苤苯佑行У膮^(qū)域選擇性水解的水解酶，和使所述3′，5′-二-O-乙酰丙?；塑张c所述的水解酶在有效地生成相應(yīng)的5′-O-乙酰丙?；塑盏臅r(shí)間和條件下接觸。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述的水解酶是脂酶。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述的脂酶是CAL-A。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述的脂酶是PSL-C。
14.使3′，5′-二-O-乙酰丙?；塑赵?’-O-乙酰丙?；恢眠x擇性脫保護(hù)的方法，該方法包括選擇對(duì)所述3′，5′-二-O-乙酰丙?；塑盏?’-乙酰丙?；恢媚苤苯佑行У膮^(qū)域選擇性水解的水解酶，和使所述3′，5′-二-O-乙酰丙?；塑张c所述的水解酶在有效地生成3′-O-乙酰丙?；塑盏臅r(shí)間和條件下接觸，其中所述的3′，5′-二-O-乙酰丙?；塑諡橄率街?其中R1是-H，-羥基，保護(hù)的羥基，或2′-取代基；和R2和R3各自獨(dú)立地是-H或氨基保護(hù)基團(tuán)；G是N或CH；和Lev是-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述的水解酶是脂酶。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述的脂酶是CAL-B。
17.權(quán)利要求14的方法，其中所述的3′，5′-二-O-乙酰丙?；塑帐窍佘?、胞嘧啶、胸苷或N-異丁基鳥苷。
18.使3′，5′-二-O-乙酰丙?；塑赵?’-O-乙酰丙?；恢眠x擇性脫保護(hù)的方法，該方法包括選擇對(duì)所述3′，5′-二-O-乙酰丙?；塑盏?’-乙酰丙?；恢媚苤苯佑行У膮^(qū)域選擇性水解的水解酶，和使所述3′，5′-二-O-乙酰丙?；塑张c所述的水解酶在有效地生成5′-O-乙酰丙酰基核苷的時(shí)間和條件下接觸，其中所述的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷為下式之一 其中R6是-H或-OH；R2、R3、R4和R5各自獨(dú)立地是-H或氨基保護(hù)基團(tuán)；G是N或CH；和Lev是-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述的水解酶是脂酶。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述的脂酶是CAL-A。
21.權(quán)利要求19的方法，其中所述的脂酶是PSL-C。
22.權(quán)利要求18的方法，其中所述的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷是3′，5′-二-O-乙酰丙?；剀铡?′，5′-二-O-乙酰丙酰基胞嘧啶或3′，5′-二-O-乙酰丙酰基N-苯甲?；佘铡?br> 23.權(quán)利要求22的方法，其中所述的3′，5′-二-O-乙酰丙?；塑帐荖-異丁基鳥苷。
24.使3′，5′-二-O-乙酰丙?；塑赵?′-O-乙酰丙?；恢眠x擇性脫保護(hù)的方法，其中所述的3′，5′-二-O-乙酰丙?；塑諡橄率街?其中R1是-H，-羥基，保護(hù)的羥基，或2′-取代基；和R2和R3各自獨(dú)立地是-H或氨基保護(hù)基團(tuán)；G是N或CH；和Lev是-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3；該方法包括使3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷與CAL-B在有效地水解所述的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷的時(shí)間和條件下接觸。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述的3′，5′-二-O-乙酰丙?；塑瞻ㄏ佘铡奏?、胸苷或N-異丁基鳥苷部分。
26.使3′，5′-二-O-乙酰丙?；塑赵?’-O-乙酰丙酰基位置選擇性脫保護(hù)的方法，其中所述的3′，5′-二-O-乙酰丙?；塑諡橄率街?其中R6是-H或-OH；R2、R3、R4和R5各自獨(dú)立地是-H或氨基保護(hù)基團(tuán)；G是N或CH；和Lev是-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3；該方法包括使3′，5′-二-O-乙酰丙?；塑张cPSL-C在有效地水解所述的3′，5′-二-O-乙酰丙?；塑盏臅r(shí)間和條件下接觸。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述的3′，5′-二-O-乙酰丙?；塑瞻∟-異丁基鳥苷部分。
28.使3′，5′-二-O-乙酰丙?；塑赵?’-O-乙酰丙酰基位置選擇性脫保護(hù)的方法，其中所述的3′，5′-二-O-乙酰丙?；塑諡橄率街?其中R6是-H或-OH；R2、R3、R4和R5各自獨(dú)立地是-H或氨基保護(hù)基團(tuán)；G是N或CH；和Lev是-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3；該方法包括使3′，5′-二-O-乙酰丙?；塑张cCAL-A在有效地水解所述的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷的時(shí)間和條件下接觸。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述的3′，5′-二-O-乙酰丙?；塑瞻ㄐ剀?、胞嘧啶、或N-苯甲?；佘詹糠帧?br> 30.至少保護(hù)核酸2′-O-3′-O或5′-O的一個(gè)羥基部分的方法，該方法包括使所述核酸與乙酰丙酸在有連接于高分子載體的偶合劑存在下，和在使2′-O、3′-O或5′-O位有效地形成酯的時(shí)間和條件下反應(yīng)。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述的核酸是核苷。
32.權(quán)利要求30的方法，其中所述的偶合劑是碳二亞胺。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述的碳二亞胺是環(huán)己基碳二亞胺。
34.權(quán)利要求30的方法，其中所述的高分子載體是聚苯乙烯。
35.權(quán)利要求30的方法，其中所述的高分子載體是聚乙二醇。
36.至少?；妓衔锏囊粋€(gè)羥基部分的方法，該方法包括使所述的碳水化合物與乙酰丙酸在有連接于高分子載體的偶合劑存在下，和能有效地形成酯的時(shí)間和條件下反應(yīng)。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述的偶合劑是碳二亞胺。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述的碳二亞胺是環(huán)己基碳二亞胺。
39.權(quán)利要求36的方法，其中所述的高分子載體是聚苯乙烯載體。
40.權(quán)利要求36的方法，其中所述的高分子載體是聚乙二醇載體。
41.至少?；惞檀挤肿拥囊粋€(gè)羥基部分的方法，該方法包括使所述的類固醇分子與乙酰丙酸在有連接于高分子載體的偶合劑存在下，和能有效地形成酯的時(shí)間和條件下反應(yīng)。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述的偶合劑是碳二亞胺。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述的碳二亞胺是環(huán)己基碳二亞胺。
44.權(quán)利要求41的方法，其中所述的高分子載體是聚苯乙烯載體。
45.權(quán)利要求41的方法，其中所述的高分子載體是聚乙二醇載體。
46.保護(hù)下式化合物的羥基的方法， 其中Bx是核堿基；T1和T2各自獨(dú)立地是OH、羥基保護(hù)基團(tuán)、活化的磷酸酯基、核苷酸、核苷或低聚核苷酸；R是-H、-羥基、保護(hù)的羥基或2′-取代基；條件是T1、T2或R中至少一個(gè)是-OH；該方法包括使所述的化合物與乙酰丙酸在有連接于高分子載體的偶合劑存在下，和在能使所述羥基部分和乙酰丙?；糠种g有效地形成酯的時(shí)間和條件下反應(yīng)。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述的偶合劑是碳二亞胺。
48.權(quán)利要求47的方法，其中所述的碳二亞胺是環(huán)己基碳二亞胺。
49.權(quán)利要求46的方法，其中所述的高分子載體是聚苯乙烯載體。
50.權(quán)利要求46的方法，其中所述的高分子載體是聚乙二醇載體。
51.保護(hù)下式化合物的3′-O或5′-O位的方法 其中Bx是核堿基；R是-H或2′-取代基；該方法包括使所述的化合物與乙酰丙酸在有連接于固體載體的偶合劑存在下，和在能有效地形成下式化合物的時(shí)間和條件下反應(yīng) 其中Lev是乙酰丙酰基。
52.權(quán)利要求51的方法，其中所述的連接于高分子載體的偶合劑是連接于高分子載體的環(huán)己基碳二亞胺。
53.權(quán)利要求52的方法，其中所述的高分子載體是聚苯乙烯高分子載體。
54.保護(hù)下式化合物的3′-O或5′-O位的方法 其中Bx是核堿基；R是-H或2′-取代基；該方法包括使所述的化合物與乙酰丙酸在有連接于聚苯乙烯該分子載體的環(huán)己基碳二亞胺存在下，和能有效地形成下式化合物的時(shí)間和條件下反應(yīng) 其中Lev是乙酰丙酰基。
55.酰化羥基部分的方法，該方法包括使所述的羥基部分與乙酰丙酸在有連接于高分子載體的偶合劑存在下，和能有效形成酯的時(shí)間和條件下反應(yīng)。
56.權(quán)利要求55的方法，其中所述的偶合劑是碳二亞胺。
57.權(quán)利要求56的方法，其中所述的碳二亞胺是環(huán)己基碳二亞胺。
58.權(quán)利要求55的方法，其中所述的高分子載體是聚苯乙烯。
59.權(quán)利要求55的方法，其中所述的高分子載體是聚乙二醇。
60.由環(huán)己基脲衍生的高分子載體制備環(huán)己基碳二亞胺衍生的高分子載體的方法，該方法包括使所述環(huán)己基脲衍生的高分子載體與脫水劑在有機(jī)溶劑中，和在有效地形成所述環(huán)己基碳二亞胺衍生的高分子載體的時(shí)間和條件下反應(yīng)。
61.權(quán)利要求60的方法，其中所述的脫水劑是POCl3。
62.權(quán)利要求61的方法，其中所述的脫水劑是甲苯磺酰氯。
63.權(quán)利要求62的方法，其中所述的有機(jī)溶劑是CH2Cl2、CHCl3、己烷或吡啶。
64.權(quán)利要求61的方法，其中所述的高分子載體是聚苯乙烯高分子載體。
65.由環(huán)己基脲衍生的高分子載體制備環(huán)己基碳二亞胺衍生的高分子載體的方法，該方法包括以下步驟a.使所述環(huán)己基脲衍生的高分子載體與脫水劑在有機(jī)溶劑中，和在有效地形成鹽的時(shí)間和條件下反應(yīng)；和b.使所述的鹽與水溶液接觸以生成所述的環(huán)己基碳二亞胺衍生的高分子載體。
66.權(quán)利要求65的方法，其中所述的脫水劑是POCl3。
67.權(quán)利要求65的方法，其中所述的脫水劑是甲苯磺酰氯。
68.權(quán)利要求65的方法，其中所述的有機(jī)溶劑是CH2Cl2、CHCl3、己烷或吡啶。
69.權(quán)利要求65的方法，其中所述的高分子載體是聚苯乙烯高分子載體。
70.使核苷選擇性酰化的方法，該方法包括a.選擇對(duì)所述核苷的5’-或3’-位能直接有效的區(qū)域選擇性?；乃饷福缓蚥.使所述核苷與?；瘎┰谠撍饷复嬖谙拢驮谟行У厣蛇x自3′-O-乙酰丙?；塑蘸?′-O-乙酰丙?；塑盏臅r(shí)間和條件下接觸。
71.權(quán)利要求70的方法，其中所述的水解酶是脂酶。
72.權(quán)利要求71的方法，其中所述的脂酶是CAL-A、CAL-B、PSL-C、豬胰脂肪酶(porcine pancreatic lipase)，粘稠色桿菌脂酶(Chromobactenaum viscosum)、米赫毛霉(Mucor miehei)脂酶，Humicola lanuginosa脂酶，沙門氏柏干酪青霉(Penicilliumcamemberti)脂酶或皺落念珠菌(Candida rugosa)脂酶。
73.權(quán)利要求72的方法，其中所述的脂酶是CAL-A。
74.權(quán)利要求72的方法，其中所述的脂酶是CAL-B。
75.權(quán)利要求72的方法，其中所述的脂酶是PSL-C。
76.使核苷在5’-位選擇性?；姆椒ǎ摲椒òㄟx擇對(duì)所述核苷的5’-位能直接有效的區(qū)域選擇性?；乃饷福褪顾龊塑赵谒鏊饷复嬖谙潞驮谟行У厣?′-O-乙酰丙?；塑盏臅r(shí)間和條件下，與?；瘎┙佑|。
77.權(quán)利要求76的方法，其中所述的水解酶是脂酶。
78.權(quán)利要求77的方法，其中所述的脂酶是CAL-B。
79.使核苷在3’-位選擇性?；姆椒?，該方法包括選擇對(duì)所述核苷的3’-位能直接有效的區(qū)域選擇性?；乃饷?，和使所述核苷在所述水解酶存在下和在有效地生成3′-O-乙酰丙?；塑盏臅r(shí)間和條件下，與酰化劑接觸。
80.權(quán)利要求79的方法，其中所述的水解酶是脂酶。
81.權(quán)利要求80的方法，其中所述的脂酶是CAL-B。
82.權(quán)利要求80的方法，其中所述的脂酶是PSL-C。
83.使核苷在5’-位選擇性酰化的方法，該方法包括選擇對(duì)所述核苷的5’-位能直接有效的區(qū)域選擇性?；乃饷福褪顾龊塑赵谒鏊饷复嬖谙潞驮谟行У厣?′-O-乙酰丙酰基核苷的時(shí)間和條件下，與?；瘎┙佑|，所述的核苷為下式之一 其中R1是-H，-羥基，保護(hù)的羥基，或2′-取代基；和R2和R3各自獨(dú)立地是-H或氨基保護(hù)基團(tuán)；和G是N或CH。
84.權(quán)利要求83的方法，其中所述的水解酶是脂酶。
85.權(quán)利要求84的方法，其中所述的脂酶是CAL-B。
86.權(quán)利要求83的方法，其中所述的核苷是腺苷、胞嘧啶、胸苷或N-異丁基鳥苷。
87.使核苷在3’-位選擇性?；姆椒?，該方法包括選擇對(duì)所述核苷的3’-位能直接有效的區(qū)域選擇性?；乃饷?，和使所述核苷在所述水解酶存在下和在有效地生成3′-O-乙酰丙?；塑盏臅r(shí)間和條件下，與?；瘎┙佑|，所述的核苷為下式之一 其中R6是-H或-OH；R2、R3、R4和R5各自獨(dú)立地是-H或氨基保護(hù)基團(tuán)；G是N或CH；和Lev是-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3。
88.權(quán)利要求87的方法，其中所述的水解酶是脂酶。
89.權(quán)利要求88的方法，其中所述的脂酶是CAL-A。
90.權(quán)利要求88的方法，其中所述的脂酶是PSL-C。
91.權(quán)利要求87的方法，其中所述的核苷是胸苷、胞嘧啶或N-異丁基腺苷。
92.權(quán)利要求91的方法，其中所述的核苷是N-異丁基鳥苷。
93.使核苷在5’-位選擇性?；姆椒?，其中所述的核苷為下式之一 其中R1是-H，-羥基，保護(hù)的羥基，或2′-取代基；和R2和R3各自獨(dú)立地是-H或氨基保護(hù)基團(tuán)；和G是N或CH；該方法包括使所述的核苷在有效地?；龊塑?′-位的時(shí)間和條件下與酰化劑和CAL-B接觸。
94.權(quán)利要求93的方法，其中所述的核苷包括腺苷、胞嘧啶、胸苷或N-異丁基鳥苷部分。
95.使核苷在3’-位選擇性?；姆椒?，其中所述的核苷為下式之一 其中R6是-H或-OH；R2、R3、R4和R5各自獨(dú)立地是-H或氨基保護(hù)基團(tuán)；G是N或CH；和Lev是-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3；該方法包括使所述核苷在PSL-C存在下和有效地?；龊塑?′-位的時(shí)間和條件下，與酰化劑接觸。
96.權(quán)利要求95的方法，其中所述的核苷包括N-異丁基鳥苷部分。
97.使核苷在3’-位選擇性?；姆椒?，其中所述的核苷為下式之一 其中R6是-H或-OH；R2、R3、R4和R5各自獨(dú)立地是-H或氨基保護(hù)基團(tuán)；和G是N或CH；該方法包括使所述核苷在有效地?；龊塑?′-位的時(shí)間和條件下，與CAL-A接觸。
98.權(quán)利要求97的方法，其中所述的核苷包括胸苷、胞嘧啶或N-異丁基腺苷部分。
全文摘要
本發(fā)明涉及由常規(guī)的前體用酶方法制備3’－和5’－乙酰丙?；塑盏姆椒?。a,B=T;b,B=C;c,B=C
文檔編號(hào)C12P19/30GK1500094SQ02807529
公開日2004年5月26日 申請(qǐng)日期2002年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月30日
發(fā)明者約根施·S·桑維, 維桑斯·戈托爾, 米格爾·費(fèi)雷羅, 蘇珊娜·費(fèi)爾南德斯, 雅維耶·加西亞, 加西亞, 戈托爾, 費(fèi)爾南德斯, 費(fèi)雷羅, 約根施 S 桑維 申請(qǐng)人:Isis藥物公司, 奧維多大學(xué)