專利名稱：抗h5n1型高致病性禽流感病毒反義寡核苷酸的結(jié)構(gòu)及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程藥物領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種靶向H5N1型高致病性禽流感病毒(HPAIV，Highly Pathogenic Avian Influenza A Virus)末端保守序列，治療該病毒的反義寡核苷酸(ASODN，antisense oligodexynucleotide)的序列、結(jié)構(gòu)及其用途。
背景技術(shù)：
H5N1型HPAIV已經(jīng)穿越種間屏障，是可引起人、禽類等動(dòng)物共患的急性傳染病，傳播途徑以呼吸道為主，也有可能通過(guò)密切接觸病原污染物傳播。香港、泰國(guó)、越南、柬埔寨等地先后出現(xiàn)過(guò)由H5N1型HPAIV引起的人禽流感患者。患者急性起病，早期表現(xiàn)類似普通流感患者，普遍體溫升高，重度患者有下呼吸道感染的臨床表現(xiàn)，外周血淋巴細(xì)胞均明顯降低，病情發(fā)展快，短期(2～5d)急劇惡化，因多器官功能衰竭死亡，死亡率高。我國(guó)湖南、湖北、安徽、廣東、廣西、上海、新疆等地也先后發(fā)現(xiàn)H5N1引起的禽流感，但尚未發(fā)現(xiàn)感染人。由于流感病毒變異，常規(guī)疫苗不能有效預(yù)防流感的發(fā)生和流行。研究發(fā)現(xiàn)目前用于治療普通流感的兩種較低廉的抗病毒藥物三環(huán)癸胺(amantadine)和金剛乙胺(remantadine)對(duì)人體內(nèi)禽流感病毒幾乎不起作用。因此研究特異性高、毒副作用小的新型抗H5N1型HPAIV藥物對(duì)治療與預(yù)防具有重要現(xiàn)實(shí)意義。
ASODN是一類經(jīng)過(guò)人工合成的寡核苷酸片段，長(zhǎng)度多為15～30個(gè)核苷酸。通過(guò)堿基互補(bǔ)的原理，干擾相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，或者整個(gè)基因組的復(fù)制，其優(yōu)點(diǎn)在于其理論上的高度靶特異性，是一種理想的具有精確選擇性的基因靶向治療藥物。由于ASODN作用的高度特異性，因此被認(rèn)為是極具潛力的抗腫瘤和抗病毒新藥。國(guó)外已有一些著名制藥企業(yè)已將反義藥物作為其新藥研究開(kāi)發(fā)的重點(diǎn)方向之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是根據(jù)H5N1型HPAIV病毒基因組設(shè)計(jì)并制備一種寡核苷酸，以抑制病毒基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而阻止病毒的復(fù)制增殖，以此作為預(yù)防和治療H5N1型HPAIV感染的藥物。
具體的說(shuō)，本發(fā)明提供了一種靶向H5N1型HPAIV末端保守序列的寡核苷酸，其特征為包含SEQ1～12所示的任一核苷酸序列。
上述寡核苷酸可以通過(guò)修飾來(lái)增加其穩(wěn)定性，組成寡核苷酸的磷酸二酯鍵部分的單鍵氧位置可以是氧、甲基或硫。
優(yōu)選的，上述寡核苷酸包含SEQ1～3所示的任一核苷酸序列；更優(yōu)選的為包含SEQ1的核苷酸序列。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種最佳的方案，其中寡核苷酸選自SEQ1。
根據(jù)本發(fā)明，針對(duì)病毒基因組的ASODN能特異性抑制H5N1型HPAIV的復(fù)制和表達(dá)，其長(zhǎng)度、細(xì)胞通透性與靶序列結(jié)合親和性及作用特異性等因素相關(guān)。本發(fā)明的寡核苷酸及其修飾物可單獨(dú)或以組合物形式包括聯(lián)合其它反義寡核苷酸及其衍生物用于制備治療及預(yù)防H5N1型HPAIV感染的新型生物工程藥物。
另一發(fā)明，本發(fā)明提供了一種用于防治H5N1型HPAIV感染的藥物組合物，其中至少含有一種本發(fā)明的寡核苷酸或其修飾物，如果適當(dāng)?shù)脑挘€可以含有治療上可以接受的載體材料，如脂質(zhì)體、融合肽或病毒載體等。該藥物組合物可依不同情況，包括特定藥物的藥物動(dòng)力學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)、給藥模式、給藥途徑、受者的年齡、體重、肝腎功能狀態(tài)、疾病的性質(zhì)、程度及治療時(shí)限等，以適宜的劑量給藥。
本發(fā)明通過(guò)以下方法得以完成以H5N1型HPAIV基因組末端保守序列以及PA、PB1、PB2、NS、NP、MP基因，對(duì)其進(jìn)行RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)模擬，共設(shè)計(jì)了16條反義寡核苷酸。從所設(shè)計(jì)的16條ASODNs中進(jìn)行初步篩選，優(yōu)選出效果較好的ASODNs。結(jié)果顯示除AIAV-3、9、14、15外，其余12種寡核苷酸均顯示出較好的活性；其中AIAV-1抑制病毒致細(xì)胞CPE作用最佳，AIAV-2和-4次之。
反義寡核苷酸的分子設(shè)計(jì)

在MDCK細(xì)胞系中以AIAV-1為代表進(jìn)一步評(píng)價(jià)了其抑制HPAIV復(fù)制的特性。結(jié)果表明AIAV-1的IC50(半數(shù)有效濃度)、TC50(半數(shù)細(xì)胞毒濃度)、TC0(最大無(wú)毒濃度)和治療指數(shù)分別為4.44、500、250μmol/L和112.61，并且AIAV-1對(duì)病毒的抑制率呈劑量依賴關(guān)系；而RBV的各項(xiàng)對(duì)應(yīng)值分別為9.658、363.74、30μmol/L和32.66?？梢?jiàn)AIAV-1的細(xì)胞毒性、病毒抑制和治療指數(shù)均優(yōu)于RBV。在病毒感染小鼠動(dòng)物模型中AIAV-1能有效的延緩病程、提高存活率、減輕肺臟病變程度、降低肺臟內(nèi)病毒的滴度。
總之，根據(jù)本發(fā)明，與H5N1型HPAIV基因組各個(gè)片斷5′端保守序列互補(bǔ)結(jié)合的寡核苷酸均能有效的抑制病毒復(fù)制，是一種特異性高、毒副作用小的新型抗H5N1型HPAIV藥物。本發(fā)明的實(shí)施對(duì)嚴(yán)重危害人類健康的H5N1型HPAIV感染的治療具有重要的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。


圖1 AIAV1～16(4μmol/L)抑制病毒病變的作用。
圖2 AIAV-1和RBV的體外細(xì)胞毒性。
圖3 A～E為AIAV對(duì)A/Tiger/Harbin/01/2002(H5N1)病毒致細(xì)胞病變的抑制作用，其中A.病毒感染陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞；B.流感病毒+0.5μmol/LAIAV-1；C.流感病毒+1μmol/LAIAV-1；D.流感病毒+2μmol/LAIAV-1；E.流感病毒+4μmol/LAIAV-1；F.流感病毒+8μmol/LAIAV-1；G未感染病毒的正常細(xì)胞對(duì)照；圖4 AIAV-1抑制病毒致細(xì)胞CPE的抑制率。
圖5 RBV抑制病毒致細(xì)胞CPE的抑制率。
圖6 靜脈注射實(shí)驗(yàn)各組小鼠平均日增重變化趨勢(shì)。
圖7 靜脈注射實(shí)驗(yàn)各組小鼠攻毒后存活情況。
圖8 攻毒后第7天靜脈注射各組小鼠肺指數(shù)和肺臟病毒滴度，其中A.肺指數(shù)；B.肺臟病毒滴度。
圖9 滴鼻實(shí)驗(yàn)各組小鼠平均日增重變化趨勢(shì)。
圖10 滴鼻實(shí)驗(yàn)各組小鼠攻毒后存活情況。
圖11 攻毒后第6天滴鼻各組小鼠肺指數(shù)和肺臟病毒滴度，其中A.肺指數(shù)；B.肺臟病毒滴度。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一本實(shí)施例主要說(shuō)明抗H5N1型高致病性禽流感病毒反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)、合成和篩選。
1.反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)和合成參考H5N1型流感病毒基因組末端保守序列，設(shè)計(jì)16條反義寡核苷酸。寡核苷酸采用ABI8909型自動(dòng)DNA合成儀合成并在合成時(shí)進(jìn)行硫代修飾，過(guò)程如下將硫代試劑(Beaucageregent，Transgenomic)溶于無(wú)水乙腈中使其終濃度為1g/100ml，置于DNA合成儀的AUX位置處，采用合成儀上提供的DNA硫化程序進(jìn)行自動(dòng)合成硫代寡核苷酸。合成完畢濃氨水55℃切割并脫保護(hù)15小時(shí)后，經(jīng)Micro PureII反相純化柱(Oligo Prep OP120，SAVANT)純化，紫外定量后真空干燥，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.MDCK細(xì)胞、病毒和病毒唑
A/Tiger/Harbin/01/2002(H5N1)病毒在10日齡SPF雞胚傳代，收集尿囊液，測(cè)定其血凝(Hemagglutination，HA)效價(jià)，取HA價(jià)＞1∶26者，混勻、分裝、保存于-70℃?zhèn)溆谩CID50為10-7.36/0.1ml。MDCK細(xì)胞培養(yǎng)液為含8％小牛血清(GIBCO.BRL)的DMEM培養(yǎng)液，病毒感染和CPE測(cè)定時(shí)使用含2％小牛血清和5g/ml胰蛋白酶的維持液。病毒唑注射液作為陽(yáng)性對(duì)照藥物(山東魯抗集團(tuán))。
3.反義寡核苷酸的篩選以10000～12000個(gè)細(xì)胞/孔將細(xì)胞接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，次日90％長(zhǎng)滿。用含2％FBS的DMEM稀釋AIAV-1～-16至4μmol/L。以100μl/孔的量加入各孔，37℃作用60min，再以PBS(pH7.5)沖洗三次，加入100TCID50的病毒液50μl，37℃感作60min。用PBS(pH7.5)沖洗3次，加入維持液稀釋的含相同濃度得AIAV。同時(shí)設(shè)立病毒感染陽(yáng)性對(duì)照和MDCK細(xì)胞陰性對(duì)照。37℃培養(yǎng)2d。利用CellTiter96 Aqueous One Solution試劑盒(Promega產(chǎn)品)測(cè)定細(xì)胞病變程度(以O(shè)D490表示)，并以如下公式計(jì)算藥物的病毒抑制率[(OD試驗(yàn)-OD病毒)/(OD細(xì)胞-OD病毒)]×100。篩選出最佳的反義寡核苷酸以進(jìn)一步評(píng)價(jià)。
結(jié)果從所設(shè)計(jì)的16條ASODNs中進(jìn)行初步篩選，以選出效果最佳的ASODNs，以便于進(jìn)一步的評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示在濃度為4μmol/L時(shí)以AIAV-1抑制病毒致細(xì)胞CPE作用最佳，抑制率為30.71％，AIAV-2和-4次之，抑制率為20.26％和22.03％(見(jiàn)圖1)。
實(shí)施例二本實(shí)施例主要說(shuō)明體外MDCK細(xì)胞水平AIAV-1抗H5N1型高致病性禽流感病毒活性的研究。
1.AIAV-1體外細(xì)胞毒性測(cè)定以10000～12000個(gè)細(xì)胞/孔將細(xì)胞接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(Nunc.)，細(xì)胞生長(zhǎng)液為含8％小牛血清的DMEM，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，次日90％長(zhǎng)滿。用含2％FBS的DMEM稀釋AIAV-1至7.5、15、31.25、62.5、125、250、500μmol/L，稀釋病毒唑至15、30、60、120、240、480、960、1920μmol/L。棄去細(xì)胞培養(yǎng)液分別加入AIAV-1和病毒唑不同濃度的稀釋液，每個(gè)濃度加三個(gè)孔。48h后觀察記錄CPE，用CellTiter96 Aqueous One Solution試劑盒(Promega產(chǎn)品)測(cè)定細(xì)胞病變程度(以O(shè)D490表示)，并按Reed-Meuench法計(jì)算TC50(半數(shù)細(xì)胞毒濃度)。
2.AIAV-1抑制病毒致細(xì)胞CPE作用以10000～12000個(gè)細(xì)胞/孔把MDCK細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，次日90％長(zhǎng)滿。用含2％FBS的DMEM稀釋AIAV-1至0.5、1、2、4、8μmol/L，稀釋病毒唑至5、10、20、40、80μmol/L。以100μl/孔的量加入各孔，37℃作用60min，再以PBS(pH7.5)沖洗三次，加入100TCID50的病毒液50μl，37℃感作60min。用PBS(pH7.5)沖洗3次，加入維持液稀釋的含相同濃度的AIAV-1。同時(shí)設(shè)立病毒感染陽(yáng)性對(duì)照和MDCK細(xì)胞陰性對(duì)照。37℃培養(yǎng)2d。利用CellTiter96 Aqueous One Solution試劑盒(Promega產(chǎn)品)測(cè)定細(xì)胞病變程度(以O(shè)D490表示)，計(jì)算藥物的病毒抑制率。計(jì)算IC50(半數(shù)有效濃度)和TI(治療指數(shù)，TC50/IC50)。
結(jié)果1.AIAV-1體外細(xì)胞毒性不同濃度AIAV-1和RBV致細(xì)胞CPE測(cè)定值(以O(shè)D490表示)見(jiàn)圖2。
在體外細(xì)胞水平篩選具有抗病毒活性的ASODN的前提條件是ASODN不具有細(xì)胞毒性，因此測(cè)定ASODN抗病毒活性之前應(yīng)先測(cè)定ASODN是否具有細(xì)胞毒性。AIAV-1在250μmol/L未見(jiàn)細(xì)胞毒性作用，TC50和TC0(最大無(wú)細(xì)胞毒濃度)分別為500和250μmol/L，CPE測(cè)定在250μmol/L時(shí)OD490才出現(xiàn)明顯降低。對(duì)照病毒唑的TC50和TC0分別為363.74和30μmol/L，在120μmol/L其OD490就出現(xiàn)顯著降低。說(shuō)明AIAV-1不具有明顯的細(xì)胞毒性，且其細(xì)胞毒性低于病毒唑。
2.AIAV-1抑制病毒致細(xì)胞CPE作用圖3為接毒48h后不同濃度AIAV-1抑制病毒致細(xì)胞CPE的光鏡照片，明顯可見(jiàn)隨著AIAV-1濃度的增加，病毒受到抑制，CPE逐漸減輕，生長(zhǎng)趨于正常。
AIAV-1在2μmol/L時(shí)就表現(xiàn)出一定的抑制病毒的作用。AIAV-1和RBV均可抑制A/Tiger/Harbin/01/2003(H5N1)在MDCK細(xì)胞引起的CPE(圖4、5)，且存在劑量效應(yīng)的依賴關(guān)系。AIAV-1的IC50為4.44μmol/L，TI為112.61，RBV的IC50為9.658μmol/L，TI為37.66。AIAV-1和RBV均可抑制病毒，但是AIAV-1的TI優(yōu)于RBV。
實(shí)施例三本實(shí)施例主要以人工感染小鼠動(dòng)物模型為基礎(chǔ)，在體內(nèi)研究了AIAV-1抗高致病性毒的活性。
材料和方法1.病毒、AIAV-1和病毒唑虎源HPAIV A/Tiger/Harbin/01/2002(H5N1)株第3代雞胚尿囊液，保存在-70℃，LD50為10-7.25/0.05ml。AIAV-1用生理鹽水進(jìn)行稀釋，動(dòng)物用量分別為30、60、120mg/kg。陽(yáng)性對(duì)照藥物病毒唑注射液(RBV，山東魯抗集團(tuán))動(dòng)物用量為80mg/kg。
2.給藥方式 滴鼻和尾靜脈注射兩種方式。
3.小鼠分組和處置方法18～20g昆明系普通1級(jí)(清潔級(jí))雄性昆明鼠，隨機(jī)分組，每組16只，在此基礎(chǔ)上又分成兩組，分別10和6只。后者用于實(shí)驗(yàn)中期宰殺，獲取肺指數(shù)和肺臟病毒滴度，前者持續(xù)觀察。同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照組和正常對(duì)照組。標(biāo)記小鼠并稱重。乙醚麻醉小鼠后，通過(guò)滴鼻接種1～2LD50/50μl用DMEM稀釋的病毒液，正常對(duì)照組同時(shí)滴鼻50μlDMEM。攻毒前5h首次給藥(滴鼻和尾靜脈注射)，對(duì)應(yīng)藥物劑量AIAV-1分為AIAV-1 30、60、120組，對(duì)應(yīng)藥物劑量RBV設(shè)RBV80組，連續(xù)給藥6d，正常對(duì)照組和病毒對(duì)照組同時(shí)給予等體積的生理鹽水。連續(xù)觀察14d，每天稱重，記錄死亡情況。所有小鼠均在P3實(shí)驗(yàn)室的負(fù)壓隔離器中隔離飼養(yǎng)觀察?？共《净钚栽u(píng)價(jià)指標(biāo)為(1)小鼠日增重變化；(2)肺指數(shù)；(3)小鼠存活率；(4)小鼠肺臟病毒滴度。
結(jié)果
1.AIAV-1靜脈注射方式在小鼠模型中的抗病毒作用1.1小鼠日增重變化實(shí)驗(yàn)各組小鼠平均日增重變化趨勢(shì)見(jiàn)圖6。小鼠感染病毒后伴隨發(fā)病和耐過(guò)過(guò)程，日增重會(huì)出現(xiàn)先降后升的趨勢(shì)。與病毒對(duì)照組相比，AIAV-1隨著給藥劑量的加大，日增重的降幅較小，體重的下降得到改善。RBV組的日增重沒(méi)有出現(xiàn)明顯的下降，在實(shí)驗(yàn)觀察期間其變化趨勢(shì)相似于正常對(duì)照組，但是其日增重值不及正常對(duì)照組。
1.2小鼠存活率攻毒后各組小鼠的死亡存活情況見(jiàn)圖7。AIAV-1 30、AIAV-1 60、AIAV-1 120、RBV80、病毒對(duì)照各組小鼠平均存活天數(shù)依次為8.4、11.6、12.3、13.1、7.8d，可見(jiàn)用藥有延緩病程的作用。總存活率經(jīng)x2檢驗(yàn)的結(jié)果RBV80、AIAV-1 120組與病毒對(duì)照之間差異顯著(P＜0.05)，AIAV-1 120與AIAV-1 30組之間差異顯著(P＜0.05)，其它各組間差異不顯著。說(shuō)明AIAV-1 120、RBV80有明顯的延緩病程和治療作用。
1.3攻毒后第7d小鼠肺指數(shù)和肺臟病毒滴度肺指數(shù)AIAV-1 120組和RBV80組相近，其值最低。肺臟病毒滴度也以AIAV-1 120和RBV80組顯著低于病毒對(duì)照組(P＜0.05)。肺指數(shù)和病毒滴度與AIAV-1的劑量之間存在劑量和效應(yīng)的依賴關(guān)系。見(jiàn)圖8。
2.AIAV-1滴鼻方式在小鼠模型中的抗病毒作用2.1小鼠日增重變化相比較靜脈注射方式，滴鼻方式病毒對(duì)照組小鼠體重一直呈降低趨勢(shì)，這可能與滴鼻方式本身需要乙醚麻醉的刺激有關(guān)。滴鼻方式的AIAV-1 60、AIAV-1 120、RBV80均表現(xiàn)出了一定程度的延緩體重下降的作用(見(jiàn)圖9)。RBV80組的日增重下降出現(xiàn)較晚，降幅較小，但是實(shí)驗(yàn)觀察期結(jié)束時(shí)始終沒(méi)有恢復(fù)，這可能與其發(fā)病和死亡稍晚，后期依然有發(fā)病的小鼠有關(guān)。
2.2小鼠存活率從圖10可見(jiàn)，AIAV-1 60和120組的存活率高于病毒對(duì)照組。AIAV-1 30、AIAV-1 60、AIAV-1 120、RBV80、病毒對(duì)照各組小鼠平均存活天數(shù)依次為7.5、8.6、9.5、9.4、6.1d，可見(jiàn)用藥有延緩病程的作用。RBV80明顯的延緩了病程，死亡出現(xiàn)的晚。與靜脈注射方式向比較，死亡數(shù)量多，死亡規(guī)律性差，實(shí)驗(yàn)第13d還出現(xiàn)死亡。后期小鼠死亡不能耐過(guò)的原因可能是乙醚麻醉的刺激可能導(dǎo)致小鼠處于應(yīng)激狀態(tài)，從而免疫力下降。
2.2.5滴鼻方式第6d小鼠肺指數(shù)和肺臟病毒滴度病毒對(duì)照組肺指數(shù)明顯高于靜脈注射方式，可見(jiàn)滴鼻方式的刺激影響較大。與病毒對(duì)照相比，AIAV-1 120和RBV80組的肺指數(shù)顯著低于病毒對(duì)照(P＜0.05)。AIAV-1 60、AIAV-1 120和RBV80組肺臟病毒滴度顯著低于病毒對(duì)照(P＜0.05)。見(jiàn)圖11。
核苷酸序列表<110>中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所<120>抗H5N1型高致病性禽流感病毒反義寡核苷酸的結(jié)構(gòu)及其用途<160>12<210>1<211>13<212>DNA<213>人工序列<400>1CCTTGTTTCT ACT 13<210>2<211>12<212>DNA<213>人工序列<400>2AGCAAAAGCA GG 12<210>3<211>12<212>DNA<213>人工序列<400>3CCTGCTTTTG CT 12<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4
TTGGACAGTA TGGATAGCAA 20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>5GAGACAGCTT GCCCTCAATG 20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>6CAATGGTGGA ACAGATCTTC 20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>7GTCAGTAAGT ATGCTAGAGT 20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>8AGTAGAAACA AGGTCGTTTT 20<210>9
<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>9TTTGTCACCC TGCTTTTGCT 20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>10GTAGAAACAA GGGTGTTTTT 20<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>11CCCTGCTTTT GCTCTCGAGA 20<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>12AGTAGAAACA AGGTAGTTTT 20
權(quán)利要求
1.一類靶向H5N1型高致病性禽流感病毒末端保守序列PA、PB1、PB2、NS、NP、MP基因的寡核苷酸，其特征為包含如下所示的任一核苷酸序列1)CCTTGTTTCT ACT2)AGCAAAAGCA GG3)CCTGCTTTTG CT4)TTGGACAGTA TGGATAGCAA5)GAGACAGCTT GCCCTCAATG6)CAATGGTGGA ACAGATCTTC7)GTCAGTAAGT ATGCTAGAGT8)AGTAGAAACA AGGTCGTTTT9)TTTGTCACCC TGCTTTTGCT10)GTAGAAACAA GGGTGTTTTT11)CCCTGCTTTT GCTCTCGAGA12)AGTAGAAACA AGGTAGTTTT。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述寡核苷酸，其特征為組成寡核苷酸的磷酸二酯鍵部分的單鍵氧位置選自氧、甲基或硫。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的寡核苷酸，其特征為包含如下所示的任一核苷酸序列1)CCTTGTTTCT ACT2)AGCAAAAGCA GG3)CCTGCTTTTG CT。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的寡核苷酸，其特征為包含如下所示的核苷酸序列CCT TGT TTC TACT。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的寡核苷酸，其特征為具有如下所示的核苷酸序列CCTTGTTTCT ACT。
6.一種治療H5N1型高致病性禽流感病毒的藥物組合物，其特征為活性成分選自權(quán)利要求1-5所述任一寡核苷酸或其組合。
7.權(quán)利要求1-5所述任一寡核苷酸或其組合在制備治療H5N1型高致病性禽流感病毒的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種可用于抑制H5N1型高致病性禽流感病毒(HPAIV)復(fù)制的反義寡核苷酸藥物的結(jié)構(gòu)和用途。針對(duì)病毒末端保守序列和PA、PB1、PB2、NS、NP、MP基因設(shè)計(jì)合成了與其互補(bǔ)的寡核苷酸，具有很好的特異性和可藥性，能夠抑制病毒在MDCK細(xì)胞中的復(fù)制，抑制病毒致細(xì)胞病變的作用。在病毒感染小鼠動(dòng)物模型中，可通過(guò)滴鼻和靜脈注射的方式減輕病毒感染引起的肺臟病變，提高小鼠的存活率，改善體重下降。該類反義寡核苷酸可成為治療H5N1型禽流感病毒感染的一種新型生物工程藥物。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1936007SQ200510103348
公開(kāi)日2007年3月28日 申請(qǐng)日期2005年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月20日
發(fā)明者王升啟, 段銘, 伯曉晨, 楊靜 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所