專利名稱：檸檬酸化半水硫酸鈣骨替代材料、其組合物及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種骨移植替代材料，尤其涉及一種檸檬酸化半水硫酸鈣骨移植替代材料、其組合物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
外傷、感染、外科腫瘤切除以及先天疾患外科治療等造成的骨缺損的修復(fù)及重建問題一直是骨科和整形外科等相關(guān)學(xué)科的重要研究方向。迄今為止，自體骨移植仍然是骨缺損修復(fù)的主要方法，但是需要采用第二術(shù)區(qū)取骨，增加額外手術(shù)創(chuàng)傷和感染的機會，而且骨的來源有限。其次，異體骨(包括皮質(zhì)骨、松質(zhì)骨、脫鈣骨)移植，又存在降解吸收緩慢、消毒、移植物病毒傳播及免疫排斥反應(yīng)等問題。由于生物材料具有免疫源性低、生物相容性好的優(yōu)點，人們開始探討生物材料用作骨移植替代物的研究，如羥基磷灰石、磷酸鈣、珊瑚等，已經(jīng)成為該領(lǐng)域研究的一個熱點內(nèi)容。
硫酸鈣也是一種生物材料，早在1892年Dreesmann就報告用硫酸鈣治療8例骨缺損患者，其中6例患者為骨結(jié)核(其中3例骨結(jié)核空洞缺損消失，被新形成的新骨替代，1例患者有兩個部位骨結(jié)核空洞缺損，其中一個痊愈，另一個未愈合，另外2例治療失敗)，1例骨髓炎空洞缺損和1例第5掌骨內(nèi)生軟骨瘤刮除術(shù)后空洞缺損消失痊愈。這個報告引起了許多學(xué)者的興趣，他們在臨床中應(yīng)用硫酸鈣治療各種骨缺損，同時也進行了動物實驗，認(rèn)為硫酸鈣可以填充骨缺損，恢復(fù)骨的外形輪廓，阻止軟組織長入，隨著硫酸鈣的降解吸收為血管和成骨細(xì)胞長入提供引導(dǎo)性支架。但是作為骨移植替代材料，這種早期應(yīng)用的硫酸鈣多為天然礦石經(jīng)過煅燒燒制而成，材料純度低，含雜質(zhì)多，強度差，降解吸收速度太快，一定程度上影響了新骨的形成。如煅燒石膏(Plaster of Paris，POP)作為骨移植替代材料目前已經(jīng)有100多年的歷史，大量的臨床實踐和實驗結(jié)果研究表明POP突出的優(yōu)點是體內(nèi)能夠降解吸收，其降解產(chǎn)物不干擾新骨的形成，但是存在降解吸收速度過快，約3周、缺乏必要的力學(xué)強度等問題。
因此如何延緩材料的降解速度使其接近新骨再生速度、提高材料本身的強度是材料學(xué)領(lǐng)域研究的任務(wù)。美國Wright公司將二水硫酸鈣經(jīng)特殊處理制成的半水硫酸鈣具有強度大、純度高、晶形均一特點，體內(nèi)完全降解吸收時間為6-8周，動物實驗和臨床應(yīng)用提示晶體形態(tài)均一、強度高的硫酸鈣十分適合于作骨移植替代物。但美國Wright公司利用半水硫酸鈣制備的Osteoset系列骨替代物由于制備工藝的限制，其產(chǎn)品價格十分昂貴，而且制備的半水硫酸鈣降解速度還不夠接近骨的生長修復(fù)速度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種骨移植替代材料，尤其提供一種檸檬酸化半水硫酸鈣骨移植替代材料、其組合物及其制備方法和應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的本發(fā)明提供了一種檸檬酸化半水硫酸鈣骨移植替代材料，分子式為CaSO4·H2O，為短柱狀規(guī)則的六面體晶形結(jié)構(gòu)，晶形結(jié)構(gòu)均一，自固化強度達到20Mpa-30Mpa以上，與煅燒石膏相比達到延緩降解速度30％-50％，接近新骨再生形成速度，所述檸檬酸化半水硫酸鈣骨是通過以下制備方法制備得到的骨移植替代材料，包括以下步驟取二水硫酸鈣，加入檸檬酸，優(yōu)選濃度為2‰-10‰的檸檬酸轉(zhuǎn)晶劑，最好為4‰、5‰、6‰的檸檬酸，二水硫酸鈣與檸檬酸加入比例為(0.5-1.5)∶1，最好為1∶1；或還進一步加入適量金屬轉(zhuǎn)晶劑，如硫酸鋁、硫酸鐵等，與檸檬酸配成復(fù)合轉(zhuǎn)晶劑，金屬轉(zhuǎn)晶劑加入量優(yōu)選為0.1-1‰，最好為0.5‰，二水硫酸鈣與復(fù)合轉(zhuǎn)晶劑加入比例仍為(0.5-1.5)∶1，金屬轉(zhuǎn)晶劑與檸檬酸配比比例適量即可；上述原料混勻，放入蒸壓釜內(nèi)，反應(yīng)后，取出，干燥；所述干燥優(yōu)選在鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，130℃溫度下干燥3-4小時，即得。
所述方法中最好立即取出，干燥，研磨，過篩140-200目，最好180目，或更細(xì)的顆粒，得到檸檬酸化半水硫酸鈣骨移植替材料。
所述二水硫酸鈣為已知的高純度二水硫酸鈣，優(yōu)選為分析純二水硫酸鈣，所述蒸壓釜溫度為110℃-140℃，優(yōu)選溫度為127℃，壓力為0.09-0.3Mpa，優(yōu)選壓力0.15Mpa，反應(yīng)時間為4小時-8小時，優(yōu)選反應(yīng)時間為7小時。
本發(fā)明還提供了上述制備方法得到的檸檬酸化半水硫酸鈣骨移植替代材料在修復(fù)人體骨組織中的應(yīng)用；所述檸檬酸化半水硫酸鈣骨移植替代材料在修復(fù)人體骨組織中的應(yīng)用，是將該檸檬酸化半水硫酸和已知的固化液混合均勻后，體外自固化預(yù)制成型、或注射、或直接填充到骨損部位；所述固化液選自生理鹽水、去離子水、乳酸林格氏液之一或其組合。
由于檸檬酸化半水硫酸鈣的可注射性和自固化性、以及優(yōu)良的抗壓縮強度，本發(fā)明還提供了所述檸檬酸化半水硫酸鈣骨移植替代材料實現(xiàn)微創(chuàng)技術(shù)在治療長骨干骺端與椎體壓縮骨折后松質(zhì)骨缺損及預(yù)防性治療骨質(zhì)疏松疾病方面的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了所述檸檬酸化半水硫酸鈣骨移植替代材料在齒科領(lǐng)域治療牙周病、牙髓病、下頜骨缺損、上顎竇擴大等疾病方面的應(yīng)用。
本發(fā)明檸檬酸化半水硫酸鈣的具有的降解吸收特性，可實現(xiàn)攜帶物質(zhì)控制釋放，并且檸檬酸化半水硫酸鈣固化過程產(chǎn)熱量小而對所載物質(zhì)活性影響小，可作為骨疾病藥物和生物因子的控緩釋載體，實現(xiàn)藥物和生物因子在植入部位的緩慢釋放。
因此，本發(fā)明還提供了一種控釋藥物組合物，包括上述檸檬酸化半水硫酸鈣骨移植替代材料，已知的藥物或生物因子；
所述藥物為治療骨腫瘤、骨結(jié)核、骨感染及骨缺損、骨不連疾病的抗生素、化療藥物、抗結(jié)核藥物；所述生物因子為治療骨腫瘤、骨結(jié)核、骨感染及骨缺損、骨不連疾病的選自人類重組BMP-2、血小板釋放的血小板衍化生長因子PDGF、轉(zhuǎn)化生長因子β-TGF、金葡液骨折刺激愈合素或堿性成纖維細(xì)胞因子。
本發(fā)明還提供了所述控釋藥物組合物在制備治療骨腫瘤、骨結(jié)核、骨感染及骨缺損、骨不連疾病的控釋藥物方面的應(yīng)用，是將上述檸檬酸化半水硫酸鈣骨移植替代材料作為藥物或生物因子的控緩釋載體，使藥物和生物因子在植入部位的緩慢釋放。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點和有益效果1、通過制備工藝的改進，使制備的檸檬酸化半水硫酸鈣骨移植替代材料更適宜作骨移植替代材料，具有優(yōu)良的骨傳導(dǎo)性，材料生物相容性好，能夠在體內(nèi)降解吸收，降解速度更接近新骨的再生速度，降解產(chǎn)物并不干擾骨的再生，同時具有原位固化的優(yōu)點。本材料既可以直接用于臨床手術(shù)中原位固化修復(fù)骨組織，注射、或直接填充到骨損部位，也可以體外預(yù)制成型用于填充修復(fù)骨缺損。同時可以作為藥物、生長因子的控緩釋載體。
2、以檸檬酸為添加劑，通過工藝改進制備出純度高、晶形均一、具有良好生物相容性的醫(yī)用外科級檸檬酸化半水硫酸鈣，作為骨移植替代物。體內(nèi)外實驗檢測顯示該材料降解速度與骨的再生形成速度趨于一致，體外生物力學(xué)強度優(yōu)于國外同類產(chǎn)品。用其作為化療藥物、抗生素、多種生長因子的控緩釋載體，為臨床治療骨腫瘤、骨結(jié)核、骨感染及骨缺損、骨不連提供了新的思路與方法。同時開發(fā)研制半水硫酸鈣的可注射劑型，利用微創(chuàng)技術(shù)可治療長骨干骺端與椎體壓縮骨折后松質(zhì)骨缺損及預(yù)防性治療骨質(zhì)疏松。
3、制備工藝簡單，進一步延緩了材料的降解速度，提高了材料強度，生物相容性好，應(yīng)用臨床可以大幅降低醫(yī)療成本，應(yīng)用前景廣闊。
4、延緩了煅燒石膏的降解速度，體外實驗研究表明生物相容性好，其飽和溶液對成骨細(xì)胞的增殖和分化具有一定促進作用。
為證明上述優(yōu)點，本發(fā)明進行了以下試驗以及實施例1的對比實驗。
試驗1檸檬酸化硫酸鈣對鼠成骨細(xì)胞增殖、分化的影響1.材料和方法1.1硫酸鈣溶液的制備實施例1制備的檸檬酸化硫酸鈣由Co6025KGY照射消毒。將材料和DMEM液按照0.1g/ml比例混合37℃恒溫保存10天，然后用細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基稀釋成不同濃度含硫酸鈣的培養(yǎng)液(100％濃度、25％濃度、6.25％濃度)。所有這些操作過程都在37度完成。
1.2成骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)成骨細(xì)胞取自新生SD大鼠，用連續(xù)酶解法獲得。無菌條件下取48h新生大鼠顱蓋骨，用無血清的DMEM液沖洗，再用0.1％膠原酶II消化，清除脂肪、骨表面的被膜和軟組織，用骨片剪剪成1～3mm3的小塊，棄去酶溶液。再在0.1％膠原酶II中消化45min，棄去酶溶液。將骨塊分散放置于100ml培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入含20％新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)液內(nèi)傳代貼壁培養(yǎng)。所有實驗用細(xì)胞傳至第4代細(xì)胞，先用0.25％胰酶消化貼壁細(xì)胞，再用含10％新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)至所需細(xì)胞濃度。每日觀察細(xì)胞的形態(tài)變化及特征；并用堿性磷酸酶(ALP)細(xì)胞化學(xué)定性染色(采用偶氮偶聯(lián)法)鑒定。
1.3MTT法測定存活細(xì)胞數(shù)表1 細(xì)胞毒性評估分級

四唑鹽(MTT)，化學(xué)名為3-(4，5)-2-唑噻-(2，5)-二苯基溴化四氮唑藍(lán)，活細(xì)胞中的脫氫酶可以將四唑鹽還原成不溶于水的藍(lán)色產(chǎn)物-甲贊(fromazan)，并沉淀在細(xì)胞中，死細(xì)胞沒有這種功能，二甲基亞芬可以溶解這種藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色的深淺與所含晶體量成正比，再用酶標(biāo)儀比色測定OD值，該值反應(yīng)線粒體的活動。消化后的第4代成骨細(xì)胞，用臺盼藍(lán)染色計算活細(xì)胞≥95％，按1×104/ml制備細(xì)胞混懸液，分別加于5塊96孔板內(nèi)，每孔200μL。培養(yǎng)24小時觀察細(xì)胞貼壁后，換含不同濃度硫酸鈣溶解液(100％濃度、25％濃度、6.25％濃度、空白對照)的培養(yǎng)液，培養(yǎng)1天、2天、3天、4天和5天，MTT法測定各孔OD值。細(xì)胞相對增殖率用于細(xì)胞毒性評價(表1)，細(xì)胞相對增殖率＝實驗組吸光值/對照組吸光值。0-1級被認(rèn)為對細(xì)胞沒有毒性作用。
1.4核仁區(qū)嗜銀蛋白顆粒染色分析消化后的第4代成骨細(xì)胞(1×104cells/200μl)，傳入含有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞爬片后，換含不同濃度硫酸鈣溶解液的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)72小時，取出長有細(xì)胞的蓋片，進行AgNORs染色(將新鮮配制的1份2％明膠和2份50％硝酸銀溶液均勻混合，滴加在樣品上，室溫避光染色40分鐘，蒸餾水沖洗，5％NaS2O3浸染1分鐘，蒸餾水沖洗，梯度酒精脫水和二甲苯透明，用樹脂封片)。隨機選取100個細(xì)胞，用油鏡觀察并計數(shù)AgNORs顆粒的數(shù)量，計算每個細(xì)胞核中所含該顆粒的平均數(shù)。
1.5硫酸鈣對成骨細(xì)胞分化功能的影響消化后的第四代成骨細(xì)胞(1×104cells/200μl)接種24孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞近鋪滿時加入含不同濃度硫酸鈣溶解液的培養(yǎng)液培養(yǎng)3天，取上清液1備用。三蒸水洗滌，加入0.1％Triton x-100，4℃過夜，取上清液2。分別測定上清液2中的細(xì)胞堿性磷酸酶活性和上清液1中骨鈣素含量。
1.6統(tǒng)計學(xué)方法
數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(MEAN±SD)表示，單因素方差分析，兩兩比較用t檢驗，p＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.結(jié)果2.1成骨細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定成骨細(xì)胞原代培養(yǎng)時形態(tài)呈梭形，胞核呈橢圓形。隨著時間延長，胞體膨大，細(xì)胞變成長梭形或不規(guī)則形，并伸出數(shù)量、長短和形狀各異的突起，顯示出集落樣生長趨勢。集落中心相互重疊而致細(xì)胞輪廓不清晰，隨著集落不斷擴大，各集落間的外圍細(xì)胞呈雜亂網(wǎng)絡(luò)相互交織連接。堿性磷酸酶特異染色見細(xì)胞質(zhì)中紅色堿性磷酸酶陽性顆粒(圖1)。
不同濃度硫酸鈣溶解液中培養(yǎng)的成骨細(xì)胞緩慢增殖(圖2)，其中4倍稀釋100％濃度硫酸鈣溶解液對成骨細(xì)胞的增殖具有一定促進作用(Compared to control，P＜0.01＝。100％濃度硫酸鈣溶解液中培養(yǎng)的成骨細(xì)胞增殖相對緩慢，但相對增殖率＞90％，根據(jù)10993-5細(xì)胞毒性評價標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞毒性評價為1級。
2.2核仁區(qū)嗜銀蛋白顆粒分析長滿細(xì)胞的蓋玻片經(jīng)Ag-NOR顆粒染色后，光學(xué)顯微鏡下可見細(xì)胞核內(nèi)分布大小不等的散在棕黑色顆粒(圖3)。4倍稀釋硫酸鈣溶解液培養(yǎng)的成骨細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)Ag-NOR顆粒數(shù)量與對照組相比顯著增多(P＜0.01)，100％濃度組和16倍稀釋組則無差異(P＞0.05)(表2)。
2.3硫酸鈣對大鼠成骨細(xì)胞ALP活性的影響100％濃度硫酸鈣溶解液中培養(yǎng)的成骨細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶含量顯著高于空白對照組(P＜0.01)，而4倍和16倍稀釋組相對空白對照組無顯著性差異(P＞0.05)(表2)。
2.4硫酸鈣對成骨細(xì)胞分泌骨鈣素的影響表2 硫酸鈣對成骨細(xì)胞功能的影響

單因素方差分析.*P＜0.05，**p＜0.01，vs..Control group.
100％濃度硫酸鈣溶解液和4倍稀釋溶解液中培養(yǎng)的成骨細(xì)胞分泌的骨鈣素含量顯著高于空白對照組(p＜0.01)，而16倍稀釋組與空白對照組相比無顯著性差異(p＞0.05)(表2)。
三、結(jié)論我們在實驗中發(fā)現(xiàn)硫酸鈣這種溶解性對成骨細(xì)胞功能活動無毒性作用、并且一定程度上刺激成骨細(xì)胞的增殖和分化。
試驗2檸檬酸化半水硫酸鈣作為骨移植替代材料的安全性及其生物相容性評價1.材料和方法1.1材料實施例1制備的檸檬酸化半水硫酸鈣粉末，經(jīng)Co60照射消毒備用，照射劑量為2.5兆拉得。
1.2方法紅細(xì)胞溶血試驗取材料粉末按照0.1kg/L浸于生理鹽水中37℃恒溫預(yù)熱30min制備浸提液。浸提液(100％原液、50％稀釋液、25％稀釋液及陽性對照蒸餾水和陰性對照生理鹽水)中加制備好的稀釋抗凝兔血，振蕩器混勻，恒溫水浴60min，2000r/min離心5min，吸取上清液，用分光光度計在波長545nm處測定吸光度。按下式計算溶血率。標(biāo)準(zhǔn)≤5％為正常。紅細(xì)胞溶血率(％)＝(實驗組吸光度-陰性對照組吸光度)/(陽性對照組吸光度-陰性對照組吸光度)×100％1.3細(xì)胞毒性試驗采用四甲基偶氮唑鹽比色法。取材料粉末按照0.1kg/L浸于DMEM培養(yǎng)液中37℃恒溫保存10d制備浸提液。將兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇、傳代后，于對數(shù)生長期經(jīng)胰蛋白酶消化制成10×106L-1的細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，37℃體積分?jǐn)?shù)為0.05CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24h后進行浸提液交換(100％浸提液、50％浸提液、25％浸提液、DMEM空白培養(yǎng)液)。分別在第1，3，5，7天取出1塊培養(yǎng)板，加入10μL CCK-8試劑(Cell countingkit-8，CCK-8，DOJINDO Laboratories)培養(yǎng)4 h后，用酶標(biāo)儀在波長500nm處測定吸光度。計算相對增殖率。相對增殖率＝實驗組吸光度/對照組吸光度。
1.4細(xì)胞粘附和生長形態(tài)觀察骨髓基質(zhì)干細(xì)胞加入含體積分?jǐn)?shù)為0.1胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，稀釋成10×106L-1密度。將直徑3mm高2mm的材料放入48孔培養(yǎng)板內(nèi)，細(xì)胞懸液滴在材料表面，1h后加入培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)3d，倒置相差顯微鏡下觀察材料邊緣細(xì)胞貼壁生長情況。其中第3天倒掉培養(yǎng)基后，用體積分?jǐn)?shù)為0.95乙醇固定，于環(huán)境掃描電鏡鏡下觀察材料表面的細(xì)胞貼附情況。
1.5熱原試驗經(jīng)體溫試驗篩選合格的3只普通級新西蘭家兔，[解放軍總醫(yī)院動物實驗中心提供，許可證號SCXK-(京)2002-0005]，實驗前測體溫3次，確定其正常體溫。自耳緣靜脈緩慢注入浸提液后，定時測兔體溫3次，確定其升高度數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)每只體溫升高在0.6℃以下，3只體溫升高總度數(shù)小于1.4℃。
1.6皮內(nèi)注射實驗按照0.1kg/L制備材料的花生油、DMEM浸提液，高溫消毒備用。選健康新西蘭家兔3只，沿脊柱兩側(cè)剃毛，清潔暴露皮膚，酒精消毒。一側(cè)選擇10個點。每點間隔2cm，5個點注射DMEM浸提液，另外5個點注射DMEM空白對照液。同法在另一側(cè)選擇10個點，5點注射植物油浸提液，另外5個點注射植物油空白對照液。每個點注射0.2mL。參照標(biāo)準(zhǔn)進行評價。
1.7致敏實驗浸提液制備同前，將浸提液與完全氟氏佐劑等體積混合，用力攪拌數(shù)分鐘至完全乳化，陽性對照采用40g/L甲醛溶液，陰性對照采用生理鹽水。豚鼠背脊柱兩側(cè)6點對稱皮內(nèi)注射相應(yīng)劑型試劑，1周后注射部位以石蠟液涂布，24h后貼敷相應(yīng)劑型的飽和濾紙片固定并留置48h。14d后在豚鼠一側(cè)腹部貼敷同前濾紙片并固定留置24h。除去貼敷物24h后觀察腹部激發(fā)部位皮膚反應(yīng)，并按標(biāo)準(zhǔn)分級。
2結(jié)果2.1描述性統(tǒng)計2.1.1材料特性制備材料2h固化抗壓縮強度達到26MPa，初凝時間5min，終凝時間20min。掃描電鏡觀察為晶體形態(tài)均一、為規(guī)則的六面體結(jié)構(gòu)，見圖4a，圖4b，，圖4c。煅燒石膏晶體結(jié)構(gòu)不勻一，呈雪花狀、粒狀、塊狀，見圖5。
2.1.2細(xì)胞粘附與生長形態(tài)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞圍繞材料邊緣生長，隨著時間遞增，鏡下統(tǒng)計細(xì)胞數(shù)目逐漸增加。整個實驗觀察過程中未見細(xì)胞變形或壞死，材料組與空白對照組的細(xì)胞形態(tài)及粗略計數(shù)無顯著性差異。環(huán)境掃描電鏡觀察見細(xì)胞貼附材料表面生長，呈不規(guī)則的梭形、多角形，胞體伸出偽足長短不等，見圖6。
2.1.3紅細(xì)胞溶解實驗紅細(xì)胞溶血率為0.34％，遠(yuǎn)小于5％的陽性標(biāo)準(zhǔn)，說明材料植入體內(nèi)后不會引起機體本身的溶血反應(yīng)。
2.1.4熱源反應(yīng)家兔平均體溫升高為0.1℃，＜1.4℃，符合醫(yī)用材料的熱源反應(yīng)要求，說明本材料本身不具有致熱源作用。
2.1.5皮內(nèi)注射兩組浸提液皮內(nèi)注射后均未引起家兔實驗區(qū)的紅斑，水腫反應(yīng)，提示材料對動物機體沒有刺激性。
2.1.6致敏實驗致敏率為0，與陰性對照沒有差別，說明材料沒有致敏性。
2.2統(tǒng)計推斷2.2.1細(xì)胞毒性實驗細(xì)胞毒性實驗的檢測結(jié)果相對增值率，見表3。
表3 不同濃度材料浸提液對細(xì)胞增殖毒性實驗結(jié)果

細(xì)胞毒性實驗的檢測結(jié)果提示實驗組相對增殖率和對照組無顯著性差別，評分為0～1級，說明材料本身不具有細(xì)胞毒性。
3.結(jié)論制備的檸檬酸化半水硫酸鈣材料無細(xì)胞毒性、不溶血、不致熱、不致敏、生物相容性良好，能滿足作為骨移植替代材料的基本要求。
試驗3與美國Wright公司半水硫酸鈣骨移植替材料(商品名OsteosetR)動物體內(nèi)植入對比試驗下面對比本方法的得到的半水檸檬酸化硫酸鈣(英文縮寫為CcaS)和美國Wright公司半水硫酸鈣骨移植替材料(OsteosetR)動物體內(nèi)植入對比試驗。OsteosetR是美國FDA批準(zhǔn)使用的骨移植替代物，本試驗將CCaS和OsteosetR植入兔股骨遠(yuǎn)端包容性骨缺損內(nèi)、觀察比較它們對骨缺損區(qū)周圍組織作用以及對骨修復(fù)活動的影響。試驗的目的是對比實施例1檸檬酸化硫酸鈣和OsteosetR對周圍組織作用及對骨修復(fù)活動的影響。
1.材料與方法1.1實驗動物成年雄性新西蘭大白兔，體重3.5-4Kg，由解放軍總醫(yī)院動物實驗中心提供。
1.2包容性骨缺損模型的制備實驗用新西蘭兔，氯氨酮與速眠新II肌肉注射麻醉，仰臥位，常規(guī)消毒鋪巾，選膝關(guān)節(jié)外側(cè)切口，切開皮膚、皮下、關(guān)節(jié)外側(cè)支持帶，顯露股骨遠(yuǎn)端，于側(cè)副韌帶與兔腓側(cè)韌帶起點之間中點處平行膝關(guān)節(jié)橫軸鉆一直徑5mm、長12mm的圓柱形骨缺損。生理鹽水沖洗，填塞干紗布徹底止血。
1.3實驗分組新西蘭兔18只，隨機分為3組(見圖7)。A組(12只)左側(cè)植入實施例1制備的檸檬酸化硫酸鈣(直徑5mm，長10mm圓柱體)，右側(cè)植入OsteosetR(直徑4.8mm，高3.2mm小藥片×3片)，B組(3只)左側(cè)植入實施例1制備的檸檬酸化硫酸鈣，右側(cè)不植入材料作為對照。C組(3只)右側(cè)植入OsteosetR，左側(cè)不植入材料作為對照，術(shù)后3w(周)、6w、13w處死動物。
1.4觀察內(nèi)容(1)一般觀察術(shù)后每天觀察動物的活動、精神、飲食。觀察手術(shù)部位有無皮膚紅腫、感染、滲液以及膿腫情況。取材時詳細(xì)觀察周圍組織的炎癥反應(yīng)。(2)普通X線檢查大體觀察材料降解以及骨缺損修復(fù)情況。(3)組織學(xué)分析動物處死后，剔除軟組織進行塑料包埋，用低速金剛砂鉆石切片機切成矢狀位100微米厚度原位不脫鈣薄片，流水反復(fù)沖洗，表面超凈，Giemsa染色，用Imageplus CCD系統(tǒng)做骨組織計量學(xué)分析。
2.結(jié)果術(shù)后兔運動自如，無跛行，精神及飲食正常。術(shù)后1周，切口局部無紅腫、流膿、裂開。術(shù)后2周切口完全愈合，切口縫線自動脫落。組織取材未見關(guān)節(jié)腔積液及周圍組織炎癥反應(yīng)。
空白對照組僅在缺損區(qū)邊緣有少量的新生骨組織，中央被骨髓組織填充替代。6周時缺損區(qū)內(nèi)新生骨小梁面積占缺損區(qū)面積僅為16.1±1.3％，13周時為18.6±2.3％。(見圖8)缺損區(qū)內(nèi)CCaS和OsteosetR逐漸降解吸收，并被新生的骨組織替代，新生骨組織隨時間逐漸成熟，骨小梁逐漸增粗，與正常骨小梁形態(tài)相似。不同時間點3周、6周、13周CCaS和OsteosetR缺損區(qū)內(nèi)新生骨組織量及骨小梁粗度兩者無顯著性差異(見表4、表5、表6，圖9、圖10)。3周時，缺損區(qū)內(nèi)CCaS和OsteosetR逐漸降解吸收，缺損區(qū)邊緣可以見到新生骨組織，材料周邊組織未見淋巴細(xì)胞浸潤及異物巨細(xì)胞反應(yīng)，材料剩余量CCaS組明顯多于OsteosetR組(t＝21.2，p＝0)。6周時，缺損區(qū)填充的材料基本降解、被新生的骨組織替代，骨小梁相對正常骨小梁纖細(xì)，其中CCaS在缺損中心仍然有少量的材料未完全降解吸收、繼續(xù)發(fā)揮材料引導(dǎo)新骨再生的作用，而OsteosetR組材料完全降解吸收。13周時，缺損區(qū)內(nèi)未見材料殘余，骨小梁與正常骨小梁厚度(14.01±3.1μm)接近。
表4 不同時間新骨形成占缺損區(qū)面積比

表5 不同時間剩余材料占缺損區(qū)面積比

CCaS vs.Osteoset*p＜0.01表6 不同時間缺損區(qū)內(nèi)新生骨小梁厚度

3、結(jié)論本實驗證明CCaS降解速度慢于OsteosetR，降解產(chǎn)物不干擾新骨的形成，缺損區(qū)內(nèi)新骨的形成量以及骨小梁的成熟程度在同一時間點兩種材料無顯著性差異，高倍鏡下材料周圍組織中未發(fā)現(xiàn)炎癥刺激及異物排斥反應(yīng)。本發(fā)明CCaS不僅避免了普通硫酸鈣吸收速度過快、不能為新生骨再生提供引導(dǎo)性支架的缺點，同時也避免了羥基磷灰石因降解吸收速度過慢而抑制新骨再生的缺點。本發(fā)明CCaS和OsteosetR性質(zhì)相似、修復(fù)骨缺損能力相當(dāng)，其降解速度緩慢、更有利于發(fā)揮材料骨傳導(dǎo)作用。CCaS制備工藝簡單、原料來源廣泛、費用低。因此，CCaS是一種非常有前途的骨移植替代材料。
試驗4與傳統(tǒng)煅燒方法制備煅燒石膏的比較將實施例1制備的5g檸檬酸化半水硫酸鈣材料和煅燒石膏進行晶體衍射分析，顯示兩種材料均為半水硫酸鈣，兩者特征峰一樣，具備自固化特性，但是制備材料的峰值明顯高于煅燒制備的半水硫酸鈣(見圖11)。
將實施例1制備的5g檸檬酸化半水硫酸鈣材料與1.5ml生理鹽水，攪拌成糊狀，注射入模具內(nèi)固化；在100％濕度，37℃保持20分鐘脫模，測量3小時抗壓縮強度，達26Mpa。晶體衍射分析為半水硫酸鈣。相比較，傳統(tǒng)煅燒方法制備煅燒石膏抗壓強度只有4Mpa。
試驗5將實施例1制備的檸檬酸化半水硫酸鈣與煅燒石膏按各自膏水比與生理鹽水?dāng)嚢杈鶆?，體外成型制成標(biāo)準(zhǔn)試件，直徑2cm，高2.2cm，各自置于200ml生理鹽水(恒溫37℃)內(nèi)，每日更換生理鹽水并測量標(biāo)準(zhǔn)試件重量，材料80％降解的時間不同，制備材料約50天，而煅燒石膏只有30天，延緩了降解速度，每天的降解量降低了40％。


圖1為成骨細(xì)胞成集落樣生長，堿性磷酸酶染色見成骨細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)紅色顆粒×40。
圖2為在不同濃度硫酸鈣溶解液中成骨細(xì)胞增殖曲線(MTT法)。
圖3.為成骨細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)散在分布棕黑色顆?！?00圖4為檸檬酸化半水硫酸鈣粉末掃描電鏡觀察a晶體結(jié)構(gòu)大小均一(×350)，b(×1500)、c(×1000)單晶體放大，呈短柱狀規(guī)則的六面體結(jié)構(gòu)。
圖5為普通煅燒石膏粉末掃描電鏡觀察晶體結(jié)構(gòu)大小不一，形態(tài)各異(×700)圖6為環(huán)境掃描電鏡觀察骨髓基質(zhì)干細(xì)胞粘附在硫酸鈣材料表面生長，呈多角形，胞體伸出偽足粘附在材料表面(×500)圖7為術(shù)后即刻X線正位像，股骨遠(yuǎn)端平行膝關(guān)節(jié)橫軸圓柱形骨缺損(直徑5mm，深10mm)a，OsteosetR組 b，CCaS組 c，空白對照，未植入材料。
圖8為空白對照術(shù)后6周觀察a正位X像 b矢狀位不脫鈣骨組織切片Giemsa染色1×3.3缺損區(qū)邊緣少量新生的骨組織，中央被骨髓組織替代。
圖9為股骨遠(yuǎn)端正位X像a～c OsteosetR組，a，術(shù)后3周。b，術(shù)后6周。c，術(shù)后13周。d～f CCaS組d，術(shù)后3周。e，術(shù)后6周。f，術(shù)后13周。X像提示兩種材料逐漸被降解吸收，被新生的骨組織替代。
圖10為股骨遠(yuǎn)端矢狀位不脫鈣骨組織切片Giemsa染色1×3.3a～c OsteosetR組，a，術(shù)后3周。b，術(shù)后6周。c，術(shù)后13周。
d～f CCaS組d，術(shù)后3周。e，術(shù)后6周。f，術(shù)后13周。組織學(xué)提示兩種材料逐漸被降解吸收，被新生的骨組織替代，骨小梁逐漸成熟，厚度逐漸增厚，其中CCaS被降解吸收速度慢于OsteosetR藥片，結(jié)果與X線一致。
圖11為煅燒石膏與本發(fā)明檸檬酸化硫酸鈣晶體衍射圖比較圖。
具體實施例方式
實施例1檸檬酸化半水硫酸鈣骨移植替材料及其制備方法將分析純二水硫酸鈣500克，添加5‰檸檬酸500ml，放入蒸壓釜內(nèi)，加熱至127℃，加壓至0.15Mpa，反應(yīng)7小時，立即取出，放入鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，130℃干燥3小時，研磨，過篩180目，得到檸檬酸化半水硫酸鈣骨移植替材料。
實施例2檸檬酸化半水硫酸鈣骨移植替材料及其制備方法將分析純二水硫酸鈣750克，添加2‰檸檬酸500ml，放入蒸壓釜內(nèi)，加熱至110℃，加壓至0.09Mpa，反應(yīng)4小時，立即取出，干燥，研磨，過篩140目，得到檸檬酸化半水硫酸鈣骨移植替材料。
實施例3檸檬酸化半水硫酸鈣骨移植替材料及其制備方法將分析純二水硫酸鈣500克，添加10‰檸檬酸500ml，放入蒸壓釜內(nèi)，加熱至140℃，加壓至0.3Mpa，反應(yīng)8小時，立即取出，干燥，研磨，過篩200目，得到檸檬酸化半水硫酸鈣骨移植替材料。
實施例4檸檬酸化半水硫酸鈣骨移植替材料及其制備方法將分析純二水硫酸鈣700克，添加6‰檸檬酸500ml，放入蒸壓釜內(nèi)，加熱至140℃，加壓至0.3Mpa，反應(yīng)8小時，立即取出，干燥，研磨，過篩200目，得到檸檬酸化半水硫酸鈣骨移植替材料。
實施例5檸檬酸化半水硫酸鈣骨移植替材料及其制備方法同實施例1，不同做將分析純二水硫酸鈣500克，添加4‰檸檬酸500ml。
實施例6檸檬酸化半水硫酸鈣骨移植替材料及其制備方法同實施例1，不同在于，還加入適量硫酸鋁或硫酸鐵0.5‰)。
實施例7檸檬酸化半水硫酸鈣骨移植替材料及其制備方法同實施例1，不同在于，還加入適量硫酸鋁或硫酸鐵0.1‰。
實施例8檸檬酸化半水硫酸鈣骨移植替材料及其制備方法同實施例1，不同在于，還加入適量硫酸鋁或硫酸鐵1‰。
實施例9本發(fā)明提供了實施例1-8之一的檸檬酸化半水硫酸鈣骨移植替代材料在修復(fù)人體骨組織中的應(yīng)用，是將權(quán)利要求1的檸檬酸化半水硫酸和已知的固化液混合均勻后，體外自固化預(yù)制成型、或注射、或直接填充到骨損部位，所述固化液選自生理鹽水、去離子水、乳酸林格氏液之一或其組合。
實施例10本發(fā)明還提供了一種控釋藥物組合，含適量實施例1-8之一的檸檬酸化半水硫酸鈣骨移植替代材料和已知治療骨腫瘤、骨結(jié)核、骨感染及骨缺損、骨不連疾病的抗生素、化療藥物或抗結(jié)核藥物，所述藥物為甲氨喋呤、順鉑、妥布霉素或萬古霉素。
實施例11本發(fā)明還提供了一種控釋藥物組合物，含適量實施例1-8之一的檸檬酸化半水硫酸鈣骨移植替代材料和已知治療骨腫瘤、骨結(jié)核、骨感染及骨缺損、骨不連疾病的生物因子；所述生物因子的選自人類重組BMP-2、血小板釋放的血小板衍化生長因子PDGF、轉(zhuǎn)化生長因子β-TGF、金葡液骨折刺激愈合素或堿性成纖維細(xì)胞因子。
實施例12本發(fā)明還提供了實施例10控釋藥物組合物在制備治療骨腫瘤、骨結(jié)核、骨感染及骨缺損、骨不連疾病的控釋藥物方面的應(yīng)用，是將實施例1-8之一的檸檬酸化半水硫酸鈣骨移植替代材料作為藥物或生物因子的控緩釋載體，使藥物和生物因子在植入部位的緩慢釋放。這是因為的具有的降解吸收特性，可實現(xiàn)攜帶物質(zhì)控制釋放，并且檸檬酸化半水硫酸鈣固化過程產(chǎn)熱量小而對所載物質(zhì)活性影響小，因此可作為骨疾病藥物和生物因子的控緩釋載體，實現(xiàn)藥物和生物因子在植入部位的緩慢釋放。
實施例12本發(fā)明還提供了實施例1-8之一的檸檬酸化半水硫酸鈣骨移植替代材料在制備治療長骨干垢端與椎體壓縮骨折后松質(zhì)骨缺損及預(yù)防性治療骨質(zhì)疏松疾病方面的應(yīng)用。是因為檸檬酸化半水硫酸鈣硫酸鈣的可注射性和自固化性、以及優(yōu)良的抗壓縮強度，可實現(xiàn)微創(chuàng)技術(shù)治療長骨干垢端與椎體壓縮骨折后松質(zhì)骨缺損及預(yù)防性治療骨質(zhì)疏松。
實施例13本發(fā)明還提供了實施例1-8之一的檸檬酸化半水硫酸鈣骨移植替代材料在齒科領(lǐng)域治療牙周病、牙髓病、下頜骨缺損、上顎竇擴大等疾病方面的應(yīng)用。
權(quán)利要求
1一種檸檬酸化半水硫酸鈣骨移植替代材料，分子式為CaSO4·H2O，為短柱狀規(guī)則的六面體晶形結(jié)構(gòu)，晶形結(jié)構(gòu)均一，自固化強度為20-30Mpa，降解吸收速度與煅燒硫酸鈣相比可以延緩降解速度30-50％，所述檸檬酸化半水硫酸鈣骨是通過以下制備方法制備得到的骨移植替代材料，所述制備方法包括以下步驟取二水硫酸鈣，加入濃度為2‰-10‰的檸檬酸轉(zhuǎn)晶劑，加入比例為(1-1.5)∶1，或還可進一步加入適量0.1-1‰金屬轉(zhuǎn)晶劑，與檸檬酸配成復(fù)合轉(zhuǎn)晶劑，混勻，放入蒸壓釜內(nèi)，反應(yīng)后，取出，干燥即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的檸檬酸化半水硫酸鈣骨移植替代材料，所述蒸壓釜溫度為110℃-140℃，壓力為0.09-0.3Mpa，反應(yīng)時間為4小時-8小時。
3.權(quán)利要求1或2的檸檬酸化半水硫酸鈣骨移植替代材料在修復(fù)人體骨組織中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的檸檬酸化半水硫酸鈣骨移植替代材料在修復(fù)人體骨組織中的應(yīng)用，是將權(quán)利要求1的檸檬酸化半水硫酸和已知的固化液混合均勻后，體外自固化預(yù)制成型、或注射、或直接填充到骨損部位。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的檸檬酸化半水硫酸鈣骨移植替代材料在修復(fù)人體骨組織中的應(yīng)用，所述固化液選自生理鹽水、去離子水、乳酸林格氏液之一或其組合。
6.權(quán)利要求1或2的檸檬酸化半水硫酸鈣骨移植替代材料在治療長骨干骺端與椎體壓縮骨折后松質(zhì)骨缺損及預(yù)防性治療骨質(zhì)疏松疾病方面的應(yīng)用。
7權(quán)利要求1或2的檸檬酸化半水硫酸鈣骨移植替代材料在治療牙周病、牙髓病、下頜骨缺損、上顎竇擴大疾病方面的應(yīng)用。
8.一種控釋藥物組合物，包括權(quán)利要求1或2的檸檬酸化半水硫酸鈣骨移植替代材料，已知的藥物或生物因子。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的控釋藥物組合物，所述藥物為治療骨腫瘤、骨結(jié)核、骨感染及骨缺損、骨不連疾病的抗生素、化療藥物、抗結(jié)核藥物；所述生物因子為治療骨腫瘤、骨結(jié)核、骨感染及骨缺損、骨不連疾病的選自人類重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2、血小板釋放的血小板衍化生長因子PDGF、轉(zhuǎn)化生長因子β-TGF、金葡液骨折刺激愈合素或堿性成纖維細(xì)胞因子。
10.權(quán)利要求8或9的控釋藥物組合物在制備治療骨腫瘤、骨結(jié)核、骨感染及骨缺損、骨不連疾病的控釋藥物方面的應(yīng)用，是將權(quán)利要求1的檸檬酸化半水硫酸鈣骨移植替代材料作為藥物或生物因子的控緩釋載體，使藥物和生物因子在植入部位的緩慢釋放。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檸檬酸化半水硫酸鈣骨替代材料、其組合物及制備方法和應(yīng)用，是通過以下制備方法制備得到的取二水硫酸鈣，加入檸檬酸，或還進一步加入金屬轉(zhuǎn)晶劑，混勻，放入蒸壓釜內(nèi)，高溫高壓反應(yīng)后，取出，干燥即得?？蓱?yīng)用在修復(fù)人體骨組織、治療長骨干骺端與椎體壓縮骨折后松質(zhì)骨缺損及預(yù)防性治療骨質(zhì)疏松疾病、作為治療骨腫瘤、骨結(jié)核、骨感染及骨缺損、骨不連疾病藥物或生物因子的控緩釋載體，具有制備工藝簡單，降解速度緩慢，材料強度高，生物相容性好，可大幅降低醫(yī)療成本，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號A61L27/50GK1879899SQ20051010326
公開日2006年12月20日 申請日期2005年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月30日
發(fā)明者陳華, 張伯勛, 張巨松, 王巖, 梁雨田, 梁向黨, 王文剛, 高飛 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院