促進(jìn)成骨細(xì)胞黏附和成骨分化的融合肽及制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種能促進(jìn)成骨相關(guān)細(xì)胞黏 附及成骨分化的新型多肽及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨移植是修復(fù)脊柱融合、骨損傷和骨腫瘤等原因造成的骨缺損的常用臨床治療方 法。自體骨移植一直以來(lái)被作為骨移植的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于存在取材有限、術(shù)區(qū)疼痛、增加出 血感染風(fēng)險(xiǎn)等原因限制了其在臨床上的應(yīng)用。科學(xué)家們一直試圖尋找各種具有骨傳導(dǎo)性、 成骨活性和骨誘導(dǎo)性的替代材料。目前，多種合成骨替代材料已經(jīng)被運(yùn)用于臨床，如羥基磷 灰石、陶瓷材料等，但是合成骨替代材料存在不利于細(xì)胞黏附以及生物相容性差等缺點(diǎn)。為 了解決上述的問(wèn)題，需要新的材料來(lái)對(duì)其表面進(jìn)行修飾或是替換，水凝膠材料是很好的選 擇。
[0003] RADA16-I (AcN-RADARADARADARADA-COMfe)由16肽氨基酸組成，是自組裝多肽水凝 膠的代表，首先由Zhang S等于1993年報(bào)道，其能在水相離子或生理鹽溶液觸發(fā)下，分子水 平組裝成β折疊，并往復(fù)形成互補(bǔ)離子鍵，最終組裝成納米纖維，其纖維直徑10_20nm，孔徑 5-200nm，含水量大于99%。研究表明，水凝膠結(jié)構(gòu)能夠模擬細(xì)胞外基質(zhì)（extraceIlular matrix，ECM)及其微環(huán)境，為細(xì)胞提供良好的體外生長(zhǎng)環(huán)境，有利于細(xì)胞的黏附、增殖和分 化;但是，目前作為支架材料的水凝膠缺乏促進(jìn)成骨分化的能力。
[0004] Osteostatin(Thr-Arg-Ser-Ala-Trp)是PTHrP C末端結(jié)構(gòu)域PTHrP( 107-111)五肽 片段，能夠介導(dǎo)PTH/PTHrP受體非相關(guān)性受體，Lozano D等的研究表明在體外促進(jìn)成骨細(xì)胞 生長(zhǎng)和分化。此外，Trejo C G等的研究表明osteostatin在骨缺損兔體內(nèi)能促進(jìn)骨再生。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供了一種融合肽，該融合肽不僅能夠促進(jìn)MC3T3-E1骨細(xì)胞黏 附、增殖，同時(shí)還能促進(jìn)成骨分化。所述融合肽包含RADA16-I肽和偶聯(lián)于RADA16-I肽序列的 C端的osteostatin肽(TRSAW);其中所述RADA16-I肽的氨基酸序列為SEQ ID NO: 1。
[0006] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合肽的氨基酸序列為SEQ ID NO: 2RADARADARADARADAGGTRSAW 〇
[0007] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合肽是由RADA16-I肽序列的C端經(jīng)由氨 基酸殘基GG與osteostatin肽(TRSAW)偶聯(lián)形成。
[0008] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合肽的氨基酸序列為SEQ ID NO: 3RADARADARADARADAGGWASRT 〇
[0009] 本發(fā)明還提供了一種制備上述融合肽的方法，所述方法是固相合成法。
[0010] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了上述融合肽在制備促進(jìn)細(xì)胞黏附和/或成骨分化的藥物 中的應(yīng)用。
[0011] 進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了一種促進(jìn)細(xì)胞黏附和/或成骨分化的藥物組合物，所述 藥物組合物包含上述的融合肽，以及任選地加入藥學(xué)上可接受的輔料。
[0012] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含RADA16-I肽和如權(quán)利要求 1~4中的任一項(xiàng)所述的融合肽。
[0013] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述RADA16-I肽和所述融合肽的混合比例為1: 1〇
[0014] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物為水凝膠。
[0015] 本發(fā)明的融合肽具有以下有益效果：
[0016] 本發(fā)明所述序列為SEQ ID N0:2的融合肽，因 RADA16-I由帶不同電荷的極性氨基 酸與非極性氨基酸交替排列組成，能夠形成穩(wěn)定的β折疊結(jié)構(gòu)，功能短肽基團(tuán)（TRSAW)通過(guò) 兩個(gè)甘氨酸序列與RADA16-I相接，甘氨酸為極性不帶電荷氨基酸，具有較強(qiáng)親水性，同時(shí)不 帶電荷的特性，能夠減少對(duì)RADA16-I自組裝能力的影響；序列為SEQ ID NO: 3的融合肽，因 功能基團(tuán)通過(guò)兩個(gè)甘氨酸(GG)與RADA16-I連接，能夠功能基團(tuán)作為側(cè)鏈突出于β折疊之外， 行使獨(dú)立的生物學(xué)功能。
[0017] 本發(fā)明所述融合肽是自組裝納米水凝膠融合肽，通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，所述融合肽在體 外試驗(yàn)中顯示了良好的促進(jìn)骨細(xì)胞(MC3T3-E1)粘附、增殖以及促進(jìn)成骨分化的性能，具有 良好的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1為原子力顯微鏡觀察(AFM)觀察不同多肽纖維結(jié)構(gòu);其中411?41;8 :1^0416-TRSAff；C:RADAl6；D:TRSAffmx 〇
[0019] 圖2為不同時(shí)相點(diǎn)對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，觀察材料表面的細(xì)胞粘附情況;其中，a表示實(shí)驗(yàn)組 與空白組對(duì)照有顯著差異，P〈〇. 05。
[0020] 圖3為CCK-8法檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)在材料表面的增殖情況;培養(yǎng)1天時(shí) 空白組與RADA16和TRSAWmx組有顯著差異0〈〇.〇5)，1^〇416組與了1?41組無(wú)顯著差異（？> 0.05);第3、5和7天各組間有顯著差異(P〈0.05)。
[0021] 圖4為MC3T3-E1細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)在材料表面的ALP活性;其中，a表示實(shí)驗(yàn)組與空白 組比較有顯著差異(？〈0.05);13 :與1^0416-1組比較有顯著差異(？〈0.05)。
[0022] 圖5為MC3T3-E1細(xì)胞在3組材料培養(yǎng)14天后的茜素紅-S染色情況（X40);A組（空 白）細(xì)胞密度較小，僅有少量鈣結(jié)節(jié)形成;B組(RADA16-I)細(xì)胞密度較大，可見數(shù)個(gè)鈣結(jié)節(jié)形 成;C組(TRSAWmx)可見大量橘紅色鈣結(jié)節(jié)著色。
[0023] 圖6為Real-time PCR檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞在3種材料上培養(yǎng)14天時(shí)ALP、0CN和VEGF 基因的表達(dá);a表示實(shí)驗(yàn)組與空白組比較有顯著差異斤〈0.05);13:與1^0416-1組比較有顯著 差異(P〈0.05)。
[0024] 圖7為激光共聚焦顯微鏡分別觀察MC3T3-E1細(xì)胞在三組材料三個(gè)不同時(shí)相點(diǎn)的生 長(zhǎng)狀態(tài)（X400)。
[0025] 圖8為多肽結(jié)構(gòu)圖，其中，A為I-TASSER模擬SEQ ID NO:2多肽結(jié)構(gòu)圖；B為I-TASSER 模擬SEQ ID NO:3多肽結(jié)構(gòu)圖
【具體實(shí)施方式】
[0026]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì) 本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處說(shuō)描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0027]實(shí)施例1多肽的設(shè)計(jì)
[0028] 以RADA16-I肽，序列為SEQ ID N0:1(AcN-RADARADARADARADA-C0NH2)作為基礎(chǔ)，在 其C末端借肽鍵直接偶聯(lián)一段osteostatin肽(TRSAW)，該多肽(融合肽)氨基酸序列為SEQ ID N0:2(RADARADARADARADAGGTRSAW)，分子量為2387.54;或者在1^0416-1肽的(：端經(jīng)兩個(gè) 氨基酸殘基GG與osteostatin肽(TRSAW)偶聯(lián)，該多肽(融合肽)氨基酸序列為SEQ ID NO: 3 (RADARADARADARADAGGWASRT)，上述多肽均由蘇州強(qiáng)耀生物科技有限公司合成。
[0029] 實(shí)施例2多肽可促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖及分化性能
[0030] 1.自組裝多肽母液的制備
[0031] 向肽粉(每IOmg分裝）內(nèi)加入1ml無(wú)菌超純水，移液槍吹打混勻后，超聲波清洗機(jī)室 溫超聲處理30min去除溶液粘性，得到1 % (m/v)的多肽母液。取RADA16-I和RADA16-TRSAW母 液等體積混合，得到1 % (m/v) TRSAWmx母液。
[0032] 2.原子力顯微鏡(AFM)觀察自組裝多肽的纖維結(jié)構(gòu)
[0033]用超純水分別稀釋 TRSAW、RADA16-I、RADA16-TRSAW 和 TRSAWmx 母液，得到 0.5%〇(m/ v)的稀釋液，超聲波清洗機(jī)室溫超聲處理30min。取不同多肽稀釋液各5iL分別滴加到清潔 的圓形云母片上，靜置15s后，用IOOyL超純水沿液滴邊緣沖洗3次。30°C室溫靜置，待云母片 自然干燥后，AFM進(jìn)行觀察。AFM參數(shù)設(shè)置為輕敲模式，掃描區(qū)域?yàn)?μπι X 2μπι，掃描頻率是 1.0 Hz ;掃描探針(ModeI: Arrow UHFAuD)參數(shù):彈性系數(shù)(k)為6(1.5-21.0)N/m，材質(zhì)Si，無(wú) 涂層，尖端半徑為l〇±2nm。結(jié)果顯示，原子力顯微鏡下分別觀察RADA16-I、RADA16-TRSAW、 TRSAW和TRASWmx四組短肽的納米結(jié)構(gòu)。如圖1所示，TRSAW呈云絮狀，無(wú)法形成納米纖維狀結(jié) 構(gòu)。RADA16-TRSAW自組裝成粗細(xì)不規(guī)則的斑片狀納米纖維，纖維之間未連接搭載，表明功能 片段的加入會(huì)影響RADA16-Ii3折疊形成，從而影響多肽自組裝成長(zhǎng)的納米纖維。但是，將 RADA16-I與RADA16-TRSAW按1:1比例混合后得到的TRSAWmx能形成長(zhǎng)納米纖維