專利名稱：抑制abhd2基因表達(dá)的反義寡核苷酸的結(jié)構(gòu)和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程藥物領(lǐng)域，具體地說是一種靶向ABHD2(abhydrolase domaincontaining 2)治療乙型肝炎病毒(HBV)感染的反義寡核苷酸(ASODN，antisenseoligodexynucleotide)的序列、結(jié)構(gòu)及其治療藥物。
背景技術(shù)：
病毒性肝炎是嚴(yán)重威脅人類健康的世界性傳染病。其中，HBV感染造成的乙型肝炎是一種會(huì)引起慢性感染的嚴(yán)重病毒性肝炎類型，轉(zhuǎn)為慢性乙肝的患者存在著極高的患肝硬化及肝癌的危險(xiǎn)。目前，人類仍然沒有找到有效的藥物能徹底清除體內(nèi)HBV并最終治愈乙型肝炎，因此新型抗HBV藥物具有重大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。
本實(shí)驗(yàn)室通過篩選和驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)ABHD2在抗HBV感染中具有很好的特異性和可藥性，可發(fā)展成為抗HBV治療的潛在作用靶點(diǎn)。
ASODN是一類經(jīng)過人工合成的寡核苷酸片段，長度多為15～30個(gè)核苷酸。通過堿基互補(bǔ)的原理，干擾相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，或者整個(gè)基因組的復(fù)制，其優(yōu)點(diǎn)在于其理論上的高度靶特異性，是一種理想的具有精確選擇性的基因靶向治療藥物。由于ASODN作用的高度特異性，因此被認(rèn)為是極具潛力的抗腫瘤和抗病毒新藥。國外已有一些著名制藥企業(yè)已將反義藥物作為其新藥研究開發(fā)的重點(diǎn)方向之一。
本發(fā)明的目的是，根據(jù)已公開的ABHD2基因mRNA序列，設(shè)計(jì)針對(duì)ABHD2的ASODN，通過抑制ABHD2的表達(dá)，阻止HBV感染，抑制HBV復(fù)制和表達(dá)，為治療慢性HBV感染提供新的特效的藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要內(nèi)容是通過檢索GeneBank中的核酸序列數(shù)據(jù)庫，選擇NCBI公布的ABHD2 mRNA參考序列NM_007011，采用本實(shí)驗(yàn)室專利的，基于靶基因多能級(jí)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)算法及本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的反義在線設(shè)計(jì)軟件AODesigner(軟件著作權(quán)號(hào)2005SR12155)設(shè)計(jì)了5條靶向ABHD2的ASODN序列。通過與GeneBank聯(lián)機(jī)blast序列比對(duì)，所選擇的靶序列均具有很好的特異性，不會(huì)干擾人類其它正常基因的表達(dá)。在自動(dòng)DNA合成儀上合成硫代反義寡核苷酸序列(S-ASODN)。采用轉(zhuǎn)染有HBV DNA，可穩(wěn)定表達(dá)HBV蛋白和完整Dane氏顆粒的HepG2.2.15細(xì)胞模型，對(duì)上述ASODNs進(jìn)行活性篩選和評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示5條ASODNs中，AB3在0.8μmol/L時(shí)對(duì)HBV DNA，HBsAg，HBeAg，ABHD2蛋白具有明顯的抑制作用，且對(duì)HBV DNA，HBsAg，HBeAg的抑制活性大于拉米夫定的抑制活性。在0.2-0.8μmol/L濃度范圍內(nèi)，AB3對(duì)HBV DNA，HBsAg，HBeAg以及ABHD2蛋白具有特異性的劑量依賴性抑制活性。
硫代反義寡核苷酸序列及性質(zhì)

A反義；S正義根據(jù)本發(fā)明，抑制ABHD2的表達(dá)可特異性抑制乙肝病毒的復(fù)制和表達(dá)，ABHD2有可能成為治療及預(yù)防HBV相關(guān)疾病的新型藥物作用靶點(diǎn)。
根據(jù)本發(fā)明，針對(duì)ABHD2 mRNA的ASODNs能特異性抑制乙肝病毒的復(fù)制和表達(dá)，有可能成為治療及預(yù)防HBV相關(guān)疾病的新型生物工程藥物。
根據(jù)本發(fā)明，反義寡核苷酸的長度與其細(xì)胞通透性，與靶序列結(jié)合親和性及作用特異性等因素相關(guān)，AB3的長度根據(jù)實(shí)驗(yàn)確定，本發(fā)明包含了與AB3具有相同序列的任何長度寡核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明，為增強(qiáng)反義寡核苷酸的核酸酶抗性、生物利用度及組織靶向性等，本發(fā)明包含了AB3的硫代修飾。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的寡核苷酸及其修飾物可按本領(lǐng)域已知方法配成非腸道給藥的制劑。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的寡核苷酸及其修飾物治療組成可應(yīng)用單獨(dú)的有效成分或組合物形式包括聯(lián)合其他反義寡核苷酸及其衍生物形式。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的治療組成，依不同情況包括特定藥物的藥物動(dòng)力學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)、給藥模式、給藥途徑、受者的年齡、體重、肝腎功能狀態(tài)、疾病的性質(zhì)、程度及治療時(shí)限等，以適宜的劑量給藥。
本發(fā)明的實(shí)施對(duì)嚴(yán)重危害人類健康的乙型肝炎及其相關(guān)疾病的治療具有重要的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。


圖1ABHD2 mRNA在HepG2細(xì)胞、HepG2.2.15細(xì)胞以及HepG2.2.15細(xì)胞經(jīng)藥物處理前后的表達(dá)變化情況圖2ABHD2蛋白在HepG2細(xì)胞、HepG2.2.15細(xì)胞以及HepG2.2.15細(xì)胞經(jīng)藥物處理前后的表達(dá)變化情況圖3硫代ABHD2反義寡核苷酸序列對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞中HBV DNA的抑制作用圖4硫代ABHD2反義寡核苷酸序列對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞中HBsAg的抑制作用圖5硫代ABHD2反義寡核苷酸序列對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞中HBeAg的抑制作用圖6硫代ABHD2反義寡核苷酸序列對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞中ABHD2蛋白的抑制作用圖7硫代ABHD2反義寡核苷酸序列AB3對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞增殖的影響圖8硫代ABHD2反義寡核苷酸序列AB3對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞中ABHD2蛋白的抑制作用呈劑量依賴性及其正義序列AB3s對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞中ABHD2蛋白的抑制作用圖9硫代ABHD2反義寡核苷酸序列AB3及其正義序列對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg、HBeAg、HBV DNA的抑制作用圖10硫代ABHD2反義寡核苷酸序列AB3對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg、HBeAg、HBV DNA的抑制作用呈劑量依賴性
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一材料與方法1.藥物配制拉米夫定用PBS溶解至終濃度為10mmol/L。
2.細(xì)胞培養(yǎng)所用細(xì)胞為肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞株以及轉(zhuǎn)染有HBV DNA的HepG2.2.15細(xì)胞株。HepG2.2.15細(xì)胞來源于HepG2細(xì)胞，含有整合的HBV DNA，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中可持續(xù)穩(wěn)定地向培養(yǎng)液中分泌Dane氏顆粒以及HBsAg，HBV DNA等。HepG2細(xì)胞用含有10％胎牛血清(FBS，Gibco)的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，HepG2.2.15細(xì)胞用含有10％胎牛血清，380μg/mlG418(Promega)的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。
3.細(xì)胞加藥待HepG2.2.15細(xì)胞長滿后1∶3傳代，48小時(shí)后換用含2％FBS的MEM培養(yǎng)液，加入拉米夫定。拉米夫定終濃度為25μmol/L，同時(shí)設(shè)立相應(yīng)的對(duì)照組細(xì)胞。加藥后4天換含有等濃度藥物的細(xì)胞培養(yǎng)液，第8天收集細(xì)胞。
4.RT-PCR檢測(cè)ABHD2 mRNA在HepG2、HepG2.2.15細(xì)胞以及經(jīng)藥物處理的HepG2.2.15細(xì)胞中的表達(dá)情況待HepG2細(xì)胞、HepG2.2.15細(xì)胞長滿或HepG2.2.15細(xì)胞加藥后第8天，吸去培養(yǎng)液，用PBS清洗兩遍后，按照Trizol試劑盒(Invitrogen)說明書提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)定量，OD260/280在1.8-2.0之間，RNA甲醛變性電泳顯示無降解。然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，具體方法如下各取總RNA 1μg，OligodT(15)0.5μg，RNA酶抑制劑(40U)0.1μl，共10.3μl，混勻，70℃溫育10min，立即冰上冷卻。加入第一鏈反應(yīng)緩沖液5μl，DTT 2.5μl，RNA酶抑制劑0.7μl，dNTP(A、G、C、T10mM)1.0μl，混勻，42℃反應(yīng)2min，加入逆轉(zhuǎn)錄酶superscriptII0.5μl，42℃溫育1h，最后70℃變性15min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物取0.5μl作為PCR擴(kuò)增的模板，以看家基因GAPDH作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行雙重PCR。靶基因ABHD2上游引物為5′-GCCCCACCTGACCTCTACT-3′，下游引物為5′-AACGAAAGTGCGGATGTATT-3′，擴(kuò)增片斷長度為324bp。GAPDH的上游引物為5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物為5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’，擴(kuò)增片斷452bp。PCR反應(yīng)體系總體積20μl，上下游引物終濃度為1μM，Mg2+濃度1.5mM，加入反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物0.5μl，Taq 1U。PCR循環(huán)參數(shù)為94℃預(yù)變性2min，94℃30s，55℃30s，72℃30s，循環(huán)30次，最后72℃延伸2min。2％瓊脂糖凝膠(Sigma)電泳檢測(cè)。
5.Western印跡方法檢測(cè)ABHD2在HepG2細(xì)胞、HepG2.2.15細(xì)胞以及經(jīng)藥物處理的HepG2.2.15細(xì)胞中的表達(dá)情況待HepG2細(xì)胞、HepG2.2.15細(xì)胞長滿或HepG2.2.15細(xì)胞加藥后第8天，吸去培養(yǎng)液，用PBS清洗兩遍后，RIPA-PICT(Pharmacia)法提取細(xì)胞總蛋白，蛋白定量后將各提取物調(diào)至相同濃度。每孔30-50μg總蛋白，12％聚丙烯酰胺凝膠電泳后，采用半干轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜(PROTRANBA-S 83Reinforced NC，Schleicher & Schuell)上。4℃封閉過夜，封閉液組成5％脫脂奶粉，1×TBST。然后與兔抗人ABHD2抗體(薛言寧教授提供)或兔抗人β-actin抗體(Sigma)結(jié)合1h，TBST洗膜3次，每次10min，再與辣根過氧化酶標(biāo)記的抗兔二抗(中山)結(jié)合1h，TBST洗膜3次，每次10min，ECL(Pharmacia)顯色系統(tǒng)顯色，X光片曝光。
結(jié)果1.ABHD2 mRNA在HepG2細(xì)胞、HepG2.2.15細(xì)胞以及經(jīng)藥物處理的HepG2.2.15細(xì)胞中的表達(dá)情況等量的HepG2細(xì)胞、HepG2.2.15細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄PCR后，2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)表達(dá)情況，看家基因GAPDH作為內(nèi)標(biāo)。結(jié)果如圖1中所示，在HepG2細(xì)胞中幾乎檢測(cè)不到ABHD2 mRNA的表達(dá)，而在HepG2.2.15細(xì)胞中其表達(dá)水平較高。在25μmol/L拉米夫定處理后，HepG2.2.15細(xì)胞中ABHD2 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)。圖1中control代表ABHD2 mRNA在對(duì)照組細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)情況；lamivudine代表ABHD2 mRNA在拉米夫定處理組細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)情況；HepG2、HepG2.2.15代表ABHD2 mRNA在HepG2、HepG2.2.15細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)情況。
2.ABHD2蛋白在HepG2細(xì)胞、HepG2.2.15細(xì)胞以及經(jīng)藥物處理的HepG2.2.15細(xì)胞中的表達(dá)情況圖2中顯示，ABHD2蛋白在HepG2.2.15細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)量較高，而在HepG2細(xì)胞中幾乎檢測(cè)不到ABHD2蛋白的表達(dá)。25μmol/L拉米夫定處理HepG2.2.15細(xì)胞后ABHD2蛋白明顯下調(diào)。
結(jié)論ABHD2在HBV感染后表達(dá)上調(diào)，而在藥物干預(yù)后表達(dá)明顯下調(diào)，因此可能成為治療及預(yù)防HBV相關(guān)疾病的新型藥物作用靶點(diǎn)。
實(shí)施例二材料與方法1.S-ASODN的設(shè)計(jì)和合成檢索GeneBank中的核酸序列數(shù)據(jù)庫，選擇NCBI公布的ABHD2 mRNA參考序列NM_007011，采用本實(shí)驗(yàn)室專利的，基于靶基因多能級(jí)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)算法及本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的反義在線設(shè)計(jì)軟件AODesigner(軟件著作權(quán)號(hào)2005SR12155)設(shè)計(jì)5條靶向ABHD2的ASODN序列。通過與GeneBank聯(lián)機(jī)blast序列比對(duì)，所選擇的靶序列均具有很好的特異性，不會(huì)干擾人類其它正?；虻谋磉_(dá)(見序列表1-5)。所有寡核苷酸均采用ABI8909型自動(dòng)DNA合成儀合成并在合成時(shí)進(jìn)行硫代修飾，過程如下將硫代試劑(Beaucage regent，Transgenomic)溶于無水乙腈中使其終濃度為1g/100ml，置于DNA合成儀的AUX位置處，采用合成儀上提供的DNA硫化程序進(jìn)行自動(dòng)合成硫代寡核苷酸。合成完畢濃氨水55℃切割并脫保護(hù)15小時(shí)后，經(jīng)Micro PureII反相純化柱(Oligo Prep OP120，SAVANT)純化，紫外定量后真空干燥，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.ASODN轉(zhuǎn)染Hep2.2.15細(xì)胞在含10％胎牛血清(Gibco)及380μg/ml的MEM培養(yǎng)液中，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞生長狀態(tài)良好，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期后，將Hep2.2.15細(xì)胞接種6孔板，1.5×105細(xì)胞/孔，37℃，5％CO2孵育48-72小時(shí)，待長至40-60％細(xì)胞匯合后，在無血清狀態(tài)下，采用脂質(zhì)體Lipofectin(Invitrogen，1mg/ml)試劑并參照說明書操作進(jìn)行轉(zhuǎn)染。反義寡核苷酸的濃度分別為0.2μM、0.4μM、0.8μM并設(shè)細(xì)胞對(duì)照、脂質(zhì)體對(duì)照。轉(zhuǎn)染22小時(shí)后，換正常細(xì)胞培養(yǎng)液(含10％FBS的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液)，37℃，5％CO2孵育72小時(shí)。收集細(xì)胞培養(yǎng)液，-20℃保存?zhèn)溆?。提取Hep2.2.15細(xì)胞總RNA(Trizol RNA提取試劑盒，Invitrogen)以及Hep2.2.15細(xì)胞總蛋白，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 3.ASODN對(duì)Hep2.2.15細(xì)胞分泌HBV DNA的抑制作用檢測(cè)取細(xì)胞培養(yǎng)液，100℃煮沸15min，12000r/min離心10min，取上清作為熒光定量PCR的模板，實(shí)驗(yàn)過程按本實(shí)驗(yàn)室建立的復(fù)合探針PCR定量檢測(cè)HBV的方法操作(何云燕，王升啟等，中華肝臟病雜志，2001，V9N6376-377)。定量檢測(cè)HBV DNA的引物序列為P15’-GGAGTA TGG ATT CGC ACT CCT C-3’；P25’-TTG TTG TTG TAG GGG ACC TGC CT-3’；熒光探針序列F5’-ACT TCC GGA AAC TAC TGT TAG ACG A-3’；淬滅探針序列Q5’-GTA GTTTCC GGA AGT-3’。20μl反應(yīng)體系含200nmol/L引物，670nmol/L熒光探針F，180nmol/L淬滅探針，200μmol/LdNTP，4.0mmol/L的Mg2+，2μl模板，混勻后將各反應(yīng)管與標(biāo)準(zhǔn)曲線反應(yīng)管一起放入iCycle自動(dòng)PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃30s，55℃30s，72℃30s，共40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后由電腦自動(dòng)計(jì)算出定量結(jié)果。
4.ASODN對(duì)Hep2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg，HBeAg的抑制作用檢測(cè)取收集好的細(xì)胞培養(yǎng)液，按照HBsAg，HBeAg ELISA檢測(cè)試劑盒(華美公司)說明書操作步驟檢測(cè)。取50μl細(xì)胞培養(yǎng)液加入乙肝表面抗原或e抗原包被的96孔板中，每孔加入50μl表面抗原或e抗原對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)結(jié)合物，37℃孵育1h后，用洗液洗板5次，加入顯色液A50μl，再加入顯色液B50μl，37℃孵育15min，加入終止液50μl，在多標(biāo)記檢酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(VICTORTMWallac 1420 Multilabel Counter，Wallac)上測(cè)定450nm處1s吸光值A(chǔ)。根據(jù)IR＝(A450對(duì)照-A450給藥)/A450對(duì)照計(jì)算抑制率。
5.ASODN對(duì)Hep2.2.15細(xì)胞中ABHD2蛋白的抑制作用檢測(cè)
RIPA-PICT(Pharmacia)提取細(xì)胞總蛋白，蛋白定量后將各提取物調(diào)至相同濃度。然后進(jìn)行western印跡實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方法參考實(shí)施例一。
結(jié)果1.ASODN對(duì)Hep2.2.15細(xì)胞分泌HBV DNA的抑制作用靶向ABHD2 mRNA的五條反義序列AB1-AB5，分別以0.8μmol/L給藥處理Hep2.2.15細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立細(xì)胞對(duì)照，脂質(zhì)體對(duì)照以及陽性藥拉米夫定對(duì)照組，72小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中分泌的HBV DNA拷貝數(shù)，按照公式IR＝(C加藥組-C細(xì)胞對(duì)照組)/C細(xì)胞對(duì)照組計(jì)算抑制率，公式中IR代表抑制率，C代表檢測(cè)出的細(xì)胞培養(yǎng)液中HBV DNA拷貝數(shù)。重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算抑制率的平均值。圖3中C代表細(xì)胞對(duì)照組，LIP代表脂質(zhì)體對(duì)照組，其對(duì)HBV DNA的抑制率接近0，沒有明顯的抑制作用。LAM25分別代表25μmol/L拉米夫定對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBV DNA的抑制作用。AB1-AB5代表五條反義序列在0.8μmol/L時(shí)對(duì)HBV DNA的抑制作用，從圖中可顯示，AB3對(duì)HBV DNA的抑制作用與25μmol/L拉米夫定對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中HBV DNA的抑制作用相近。
2.ASODN對(duì)Hep2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg的抑制作用靶向ABHD2mRNA的五條反義序列AB1-AB5，分別以0.8μmol/L加藥處理HepG2.2.15細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立細(xì)胞對(duì)照、脂質(zhì)體對(duì)照以及陽性藥拉米夫定對(duì)照組，72小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，HBsAg ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)Hep2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)液中HBsAg的表達(dá)情況，根據(jù)公式IR＝(A加藥組-A細(xì)胞對(duì)照組)/A細(xì)胞對(duì)照組計(jì)算抑制率，公式中IR代表抑制率，A代表各檢測(cè)孔在450nm的吸光度。重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算抑制率的平均值，見圖4。圖中LIP代表脂質(zhì)體對(duì)照組對(duì)細(xì)胞分泌HBsAg的抑制作用，顯示沒有明顯抑制作用。LAM25代表25μmol/L拉米夫定對(duì)細(xì)胞分泌HBsAg的抑制作用，抑制率小于25％。AB1-AB5代表五條反義序列對(duì)細(xì)胞分泌HBsAg的抑制作用，其中AB3的平均抑制率大于50％，且大于25μmol/L拉米夫定對(duì)細(xì)胞分泌HBsAg的抑制作用。
3.ASODN對(duì)Hep2.2.15細(xì)胞分泌HBeAg的抑制作用靶向ABHD2mRNA的五條反義序列AB1-AB5，分別以0.8μmol/L給藥處理Hep2.2.15細(xì)胞，72小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，HBeAg ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)Hep2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)液中HBeAg的表達(dá)情況，根據(jù)公式IR＝(A加藥組-A細(xì)胞對(duì)照組)/A細(xì)胞對(duì)照組計(jì)算抑制率，公式中IR代表抑制率，A代表各檢測(cè)孔在450nm的吸光度。重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算抑制率的平均值，見圖5。圖中，LIP代表脂質(zhì)體對(duì)照組對(duì)細(xì)胞分泌HBeAg的抑制作用，顯示沒有明顯抑制作用。LAM25代表25μmol/L拉米夫定對(duì)細(xì)胞分泌HBeAg的抑制作用，抑制率小于25％。AB1-AB5代表五條反義序列對(duì)細(xì)胞分泌HBeAg的抑制作用，其中AB3的平均抑制率大于50％，且大于25μmol/L拉米夫定對(duì)細(xì)胞分泌HBeAg的抑制作用。
4.ASODN對(duì)細(xì)胞ABHD2蛋白的抑制作用靶向ABHD2 mRNA的五條反義序列AB1-AB5，分別以0.8μmol/L給藥處理Hep2.2.15細(xì)胞，72h后提取總蛋白，12％聚丙烯酰胺凝膠電泳后，采用半干轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，以β-actin(43kD)為對(duì)照，通過Western Blot方法檢測(cè)硫代反義寡核苷酸對(duì)靶蛋白ABHD2表達(dá)量的影響。由圖6可見，AB3可顯著抑制ABHD2蛋白的表達(dá)，AB5對(duì)ABHD2蛋白抑制作用較弱，AB1，AB2，AB4對(duì)ABHD2蛋白無明顯抑制作用。
結(jié)論1.抑制ABHD2的表達(dá)可以抑制HepG2.2.15細(xì)胞中HBV的復(fù)制和表達(dá)2.五條硫代ABHD2反義寡核苷酸序列中，AB3具有明顯的抑制HepG2.2.15細(xì)胞中HBV復(fù)制和表達(dá)的作用。
實(shí)施例三材料與方法1.ASODN的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)實(shí)施例二結(jié)果，選擇效果較好的反義寡核苷酸序列AB3，合成其正義寡核苷酸(見序列表6)。所有硫代寡核苷酸的合成同實(shí)施例二。
2.硫代反義寡核苷酸序列AB3的細(xì)胞毒性檢測(cè)Hep2.2.15細(xì)胞在含10％胎牛血清(Gibco)及380μg/ml的MEM培養(yǎng)基中，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞生長狀態(tài)良好，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期后，接種96孔板，0.75×105細(xì)胞/孔，37℃，5％CO2孵育48-72小時(shí)，待長至40-60％細(xì)胞匯合后，在無血清狀態(tài)下，采用脂質(zhì)體Lipofectin(Invitrogen，1mg/ml)試劑并參照說明書操作進(jìn)行轉(zhuǎn)染。反義寡核苷酸AB3的濃度為0.2μM、0.4μM、0.8μM、1.6μM、5μM并設(shè)細(xì)胞對(duì)照，每濃度重復(fù)三孔。轉(zhuǎn)染22小時(shí)后，換正常細(xì)胞培養(yǎng)液(含10％FBS的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液)，37℃，5％CO2孵育72小時(shí)后，參照MTS(Promega)使用說明書，每孔加入MTS20μl/100μl培養(yǎng)液，37℃避光孵育1.5小時(shí)，在多標(biāo)記檢酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm檢測(cè)吸光度。同時(shí)，轉(zhuǎn)染ASODN后每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。
3.硫代反義寡核苷酸序列AB3的特異性考察硫代反義寡核苷酸序列AB3及其正義序列AB3s分別以0.8μmol/L轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法同實(shí)施例二。收集培養(yǎng)液，提取總RNA和總蛋白，參照實(shí)施例一、例二的方法，檢測(cè)AB3及其正義序列對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中HBsAg、HBeAg、HBV DNA的抑制作用，AB3及其正義序列對(duì)ABHD2蛋白的抑制作用。
4.硫代反義寡核苷酸序列AB3的劑量依賴性檢測(cè)硫代反義寡核苷酸序列AB3以0.2μM、0.4μM、0.8μM轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法同實(shí)施例一。收集培養(yǎng)液，提取總蛋白，參照實(shí)施例一、例二的方法，檢測(cè)AB3不同濃度對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中HBsAg，HBeAg，HBV DNA的抑制作用以及對(duì)ABHD2蛋白的抑制作用。
結(jié)果1.硫代反義寡核苷酸AB3對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞增殖的影響硫代反義寡核苷酸AB3以0.2μM、0.4μM、0.8μM、1.6μM、5μM處理細(xì)胞過程中，每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，加藥組細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)沒有顯著變化。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果見圖7。圖中顯示，在0.2μM-5μM范圍內(nèi)，AB3各劑量組OD值與正常細(xì)胞對(duì)照基本相同。
2.硫代反義寡核苷酸序列AB3的特異性硫代反義寡核苷酸序列AB3及其正義序列AB3s分別以0.8μmol/L轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞，收集培養(yǎng)液，ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)液中HBsAg、HBeAg的表達(dá)情況，熒光定量PCR檢測(cè)培養(yǎng)液中HBV DNA的拷貝數(shù)。設(shè)對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)液中HBsAg、HBeAg、HBV DNA的含量為100％，實(shí)驗(yàn)組中HBsAg、HBeAg的含量則為A實(shí)驗(yàn)組/A細(xì)胞對(duì)照組×100％，其中A表示在450nm的吸光度。實(shí)驗(yàn)組中HBV DNA的含量則為C實(shí)驗(yàn)組/C細(xì)胞對(duì)照組×100％，其中C表示細(xì)胞培養(yǎng)液中HBV DNA的拷貝數(shù)，結(jié)果見圖9。圖中顯示AB3的正義硫代寡核苷酸序列(AB3s)處理組細(xì)胞培養(yǎng)液中HBsAg、HBeAg、HBV DNA與正常細(xì)胞對(duì)照無顯著差異(P≥0.05)。而硫代反義寡核苷酸序列AB3具有很好的抑制作用(HBsAg、HBeAg、HBV DNA抑制率≥50％)。同樣，在硫代反義寡核苷酸序列AB3及其正義序列AB3s分別以0.8μmol/L轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞后72小時(shí)，提取總蛋白，western檢測(cè)結(jié)果顯示AB3s處理細(xì)胞組ABHD2蛋白表達(dá)與對(duì)照組基本一致，而AB3顯示出很好的抑制ABHD2蛋白表達(dá)的作用(見圖8)。
3.硫代反義寡核苷酸序列AB3對(duì)HBV復(fù)制和表達(dá)影響的劑量依賴性。
硫代反義寡核苷酸序列AB3以0μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.8μmol/L給藥處理HepG2.2.15細(xì)胞后，收集培養(yǎng)液，熒光定量PCR檢測(cè)培養(yǎng)液中HBV DNA的拷貝數(shù)，ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)液中HBsAg、HBeAg的表達(dá)情況，根據(jù)實(shí)施例二中的公式分別計(jì)算抑制率。重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算抑制率的平均值。如圖10，AB3對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中HBsAg，HBeAg，HBV DNA的抑制作用隨著硫代反義寡核苷酸序列AB3濃度的增加而遞減，顯示出很明顯的劑量依賴關(guān)系。同樣，在0μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.8μmol/L AB3處理細(xì)胞后72小時(shí)，提取總蛋白，western印跡技術(shù)檢測(cè)ABHD2蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果如圖8所示，隨著AB3濃度的增加，ABHD2蛋白表達(dá)量逐漸減少，0.8μmol/L時(shí)，AB3處理細(xì)胞組幾乎檢測(cè)不到ABHD2蛋白的表達(dá)。
結(jié)論1.硫代反義寡核苷酸序列AB3對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的增殖沒有明顯的影響2.硫代反義寡核苷酸序列AB3具有序列特異的抑制HepG2.2.15細(xì)胞中HBV的復(fù)制和表達(dá)的作用3.在0.2-0.8μmol/L濃度范圍內(nèi)，AB3對(duì)HBV DNA，HBsAg，HBeAg以及ABHD2蛋白具有特異性的劑量依賴性抑制活性。
序列表<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所<120>抑制ABHD2基因表達(dá)的反義寡核苷酸的結(jié)構(gòu)和用途<130>
<160>6<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>20<212>DNA<213>
<400>1cgtgcagcca taggtgaaca 20<210>2<211>20<212>DNA<213>
<400>2taggtgaaca tgcgtggcga 20<210>3<211>20<212>DNA<213>
<400>3taaaatcccc aggctccttc 20<210>4<211>20<212>DNA<213>
<400>4tcccacgtgc agccataggt 20<210>5<211>20<212>DNA<213>
<400>5tttcatgcac caacggatcg 20<210>6<211>20<212>DNA<213>
<400>6gaaggagcct ggggatttta 20
權(quán)利要求
1.一種作為抗乙型肝炎病毒感染的藥物作用靶標(biāo)的ABHD2。
2.與權(quán)利要求1所述的靶標(biāo)ABHD2非編碼區(qū)和編碼區(qū)互補(bǔ)的寡核苷酸，及其抗乙型肝炎病毒的用途。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的寡核苷酸長度應(yīng)為15-25個(gè)堿基。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的反義寡核苷酸的序列是選自下列之一1)AB15’-CGT GCA GCC ATA GGT GAA CA-3’；2)AB25’-TAG GTG AAC ATG CGT GGC GA-3’；3)AB35’-TAA AAT CCC CAG GCT CCT TC-3’；4)AB45’-TCC CAC GTG CAG CCA TAG GT-3’；5)AB55’-TTT CAT GCA CCA ACG GAT CG-3’。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的反義寡核苷酸，其特征是所述的反義寡核苷酸序列結(jié)構(gòu)如下1)AB35’-TAA AAT CCC CAG GCT CCT TC-3’；
6.根據(jù)權(quán)利要求2、3、4、5所述的反義寡核苷酸，其特征是該反義寡核苷酸經(jīng)過不同化學(xué)修飾。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的反義寡核苷酸，其化學(xué)修飾為硫代修飾。
8.權(quán)利要求2、3、4、5、6、7中所述的任一反義寡核苷酸在制備治療乙型肝炎及其相關(guān)性疾病的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗乙型肝炎病毒靶標(biāo)及相應(yīng)的反義寡核苷酸藥物。具體說是一種作為抗乙型肝炎病毒感染的藥物作用靶標(biāo)的ABHD2及靶向該ABHD2的抗乙型肝炎病毒的反義寡核苷酸的結(jié)構(gòu)以及這些反義寡核苷酸在制備治療乙型肝炎及其相關(guān)性疾病的藥物中的用途。
文檔編號(hào)A61P1/00GK101063129SQ20061007597
公開日2007年10月31日 申請(qǐng)日期2006年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月26日
發(fā)明者王升啟, 丁曉然, 楊靜, 婁紹科 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所