專利名稱：基因靶向方法和載體的制作方法
本申請聲明，在35U.S.C.§119(e)條款下，對2001年12月4日歸檔的美國系列號第60/338,768擁有優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容在此合并為參考文獻。
發(fā)明的背景發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總體上涉及為了修飾遺傳位點而進行的細胞操作，更特殊的是涉及基因靶向載體和在細胞中產(chǎn)生遺傳修飾的方法。
背景資料外源遺傳物質(zhì)被穩(wěn)定地導(dǎo)入真核細胞和原核細胞的基因組中，這已經(jīng)在很多情況下為了各種目的而成功實現(xiàn)了，如為了表達外源基因或破壞內(nèi)源性位點。主要是通過隨機的基因組插入或位點特異性同源重組而實現(xiàn)。隨機整合涉及將線性化的DNA片段插入宿主細胞的基因組中，插入的位置大部分地是非位點特異的。這些插入趨向于以多聚體(multimer)或多聯(lián)體(concatemer)存在，大多數(shù)往往不引起特異位點的破壞或失活。也存在內(nèi)源性位點被隨機插入事件破壞的可能性，從而經(jīng)常使分析外源基因?qū)毎騺碜赞D(zhuǎn)化細胞的生物體的作用變得很困難。另外，可以觀察到外源啟動子活性的有效范圍有賴于整合的區(qū)域。
經(jīng)位點特異性同源重組將DNA插入宿主基因組中，可使外源DNA分子的單拷貝整合作用靶向宿主基因組的特異區(qū)域。同源重組涉及明顯相似的核苷酸序列通過特異重組酶的作用而交換。早期的實驗試圖用外源DNA以位點特異的方式操控細胞內(nèi)源性基因組DNA序列，集中于酵母作為模型系統(tǒng)。重組作用以酵母基因組和經(jīng)leu2.sup位點轉(zhuǎn)化作用導(dǎo)入的外源質(zhì)粒為示范(Hinnen等人(1978)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，75，1929)。最近使用哺乳動物細胞的同源重組能力使細胞內(nèi)源基因組DNA中產(chǎn)生了特異突變的DNA序列。獲得功能和喪失功能的等位基因都已經(jīng)在干細胞和這些細胞產(chǎn)生的動物中產(chǎn)生(見下文)。另外，應(yīng)用陽性-陰性選擇載體和方法促進了含突變DNA序列的細胞和動物的產(chǎn)生和研究(Capecchi等人，(1997)美國專利第5,631,153號)。
已經(jīng)從胚胎干細胞培育成許多動物，這些干細胞含有經(jīng)位點特異同源作用而突變的特異位點。這些動物包括來源于嵌合體的小鼠，是通過向胚泡中注射經(jīng)特異位點同源重組作用靶向的胚胎干細胞而產(chǎn)生的。一些實例包括p53和paraxis位點(Donehower等人，(1992)，Nature，356,215；Burgess等人，(1996)，Nature，384，570)。豬也已經(jīng)從包括豬的同源重組修飾胚胎干細胞中培育出來(Butler等人，(2002)，Nature，415，103)。
至今，已經(jīng)設(shè)計了主要的兩型載體可以靶向基因組的特異區(qū)域，以便用外源DNA序列取代內(nèi)源序列。這些載體已經(jīng)證明足以在許多不同的細胞類型中產(chǎn)生多種靶向的等位基因。插入型載體含有側(cè)向于編碼選擇性標(biāo)記物的內(nèi)部核苷酸序列的兩個同源區(qū)域。載體在一個同源區(qū)域內(nèi)被線性化。一個遺傳交叉事件和同源重組引起基因組序列的部分復(fù)制。染色體內(nèi)重組經(jīng)常引起內(nèi)源復(fù)制序列被去除。這種類型靶向載體的缺點是缺少陰性選擇標(biāo)記物，后者可通過去除含有主鏈或載體序列的細胞而有效地富集正確的靶向作用。另外，在同源區(qū)域內(nèi)的線性化減少了可進行同源重組的DNA序列的數(shù)量，因此減少了鏈交換的機率(Thomas等人，(1986)，Cell，44，49)。最終，染色體內(nèi)重組必須發(fā)生在規(guī)定的區(qū)域內(nèi)，否則可發(fā)生位點野生型結(jié)構(gòu)的再生。
置換型載體含有兩個同源區(qū)域，通常側(cè)向于陽性選擇性標(biāo)記物，如編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因。陰性選擇性標(biāo)記物通常位于外側(cè)并與其中一個同源區(qū)域相鄰，以便通過去除含有陰性選擇性序列盒的細胞而在總?cè)郝渲懈患_靶向的細胞。置換型載體導(dǎo)入細胞后，同時或逐步進行陽性和陰性的選擇得到了分離的細胞，由于使用陰性選擇性標(biāo)記物，接受位點特異性同源重組的分離細胞具有大約8至12倍富集的機率。在可能是第一個成功的哺乳動物細胞基因靶向?qū)嶒炛?，Capecchi等人顯示通過使用置換型載體靶向小鼠HPRT和int-2位點(美國專利第5,631,153號)。從此大量位點被成功的靶向，一些通過插入型載體，大多數(shù)通過置換型載體。這些載體中的許多包括陰性選擇性標(biāo)記物，位于同源區(qū)域之一或兩者的外側(cè)，這往往導(dǎo)致靶向的等位基因的鑒定效率增加。
關(guān)于這種方法和置換型載體的應(yīng)用和陽性-陰性選擇仍然存在許多缺點。使用許多陰性選擇性序列盒如HSV胸苷激酶需要添加抗生素或選擇劑如更昔洛韋，它們可對細胞產(chǎn)生不適當(dāng)?shù)膽?yīng)激，以及引起不必要或不成熟的分化作用。另外，選擇富集陰性選擇性標(biāo)記物的細胞要花費相當(dāng)多的時間，以回收由于缺乏選擇性標(biāo)記物而對藥物具有抵抗性的細胞。同樣，典型地通過這種方法獲得的富集因子最多為大約8至12倍。同樣，陽性-陰性選擇載體的建立常常在戰(zhàn)略上是困難的和費時間的。因此需要可以將外源性核酸分子位點特異性地插入細胞基因組中的靶向載體。本發(fā)明滿足了這種需求，并提供了其他的優(yōu)點。
發(fā)明簡述提供了通過載體DNA與靶DNA的同源重組作用在真核細胞中修飾基因組DNA序列的方法(

圖1)。該方法首先需要轉(zhuǎn)化能夠與載體進行同源重組的細胞，該載體在此是指FPIC基因靶向載體，含有與在細胞基因組中存在的序列實質(zhì)上相似的序列。盡管載體可以基本上以隨機的方式整合進宿主細胞基因組，對基因組的特異區(qū)域沒有優(yōu)先選擇，但一定比例的細胞中還是含有通過位點特異性同源重組作用被整合進基因組的基因靶向載體。隨后選擇轉(zhuǎn)化的宿主細胞以分離和鑒定已成功接受了位點特異同源重組的細胞。根據(jù)檢測存在特異的轉(zhuǎn)錄核苷酸序列的能力進行選擇，該序列呈現(xiàn)基因靶向載體中存在的序列。
本發(fā)明的FPIC載體包括與宿主細胞基因組中存在的序列實質(zhì)上同源的第一條DNA序列，以及與宿主細胞基因組中第一條序列的下游或上游的其他序列實質(zhì)上同源的第三條DNA序列。載體進一步在第一條和第三條DNA序列之間含有第二條DNA序列，它與宿主基因組中存在的序列很少或沒有同源性，并使之能夠鑒定基因組中被整合進載體序列的細胞。載體也含有第四條DNA序列，可以位于第一條或第二條序列的5’或3’端，與宿主基因組中存在的序列很少或沒有同源性，并賦予單獨的獨特方式來鑒定含有被整合進宿主細胞基因組的序列的細胞。第二條和第四條序列的聯(lián)合應(yīng)用可以鑒定已經(jīng)接受了載體與內(nèi)源序列同源重組的細胞。相應(yīng)地，本發(fā)明也提供了用這種載體轉(zhuǎn)化的細胞，特別是已經(jīng)被這種載體介導(dǎo)了同源重組的細胞，以及由這樣轉(zhuǎn)化的細胞產(chǎn)生的生物體，其中同源重組賦予了特殊的遺傳改變。
在一個實施例中，本發(fā)明提供了鑒定已經(jīng)接受使用FPIC基因靶向載體的位點特異性同源重組的轉(zhuǎn)化細胞的方法。這種方法可以通過，例如，以下步驟來實施，a)采用設(shè)計用來進行位點特異性同源重組的FPIC基因靶向載體來轉(zhuǎn)化細胞，其中所述的載體包含，第一條DNA序列與宿主基因組中存在的內(nèi)源性基因組序列實質(zhì)上同源；第二條DNA序列編碼所述細胞中的陽性選擇特征，與細胞內(nèi)源性基因組序列沒有同源性，因此不能接受位點特異性同源重組；第三條DNA序列與宿主基因組中存在的內(nèi)源性基因組序列實質(zhì)上同源，并與第一條DNA序列不同；以及第四條DNA序列代表所述細胞中的特異轉(zhuǎn)錄序列，不編碼功能性蛋白產(chǎn)物并與細胞內(nèi)源性基因組序列非同源，因此不能接受位點特異性同源重組；其中所述的載體能夠在細胞中通過具有內(nèi)源性靶序列的第一條DNA序列和具有內(nèi)源性靶DNA序列的第三條DNA序列之間的鏈交換進行位點特異性同源重組；其中所述的FPIC基因靶向載體中的DNA序列的組成形式是，與靶DNA序列實質(zhì)上同源的第一條DNA序列，編碼陽性選擇標(biāo)記物的第二條DNA序列，與靶DNA序列實質(zhì)上同源的第三條DNA序列，被轉(zhuǎn)錄但不編碼功能性蛋白產(chǎn)物的第四條DNA序列；b)繁殖細胞以選擇或富集已經(jīng)成功地用所述FPIC基因靶向載體轉(zhuǎn)化的細胞，通過存在所述第二個DNA序列的陽性可選擇標(biāo)記物基因產(chǎn)物和缺少所述第四條DNA序列轉(zhuǎn)錄的無功能序列而選擇，和c)從含有所述表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄序列不編碼功能蛋白的第四條序列的細胞中分離含有所述編碼陽性可選擇標(biāo)記物的第二條DNA序列的細胞。這種方法可進一步包括對所述細胞的基因組DNA進行定性的步驟，該細胞攜帶編碼陽性可選擇標(biāo)記物的第二條DNA序列，但不攜帶第四條DNA序列，該序列編碼轉(zhuǎn)錄序列但不編碼位點特異同源重組事件的功能性蛋白產(chǎn)物，該事件可進行細胞靶DNA的修飾。
在另一個實施例中，本發(fā)明提供了鑒定已經(jīng)接受使用FPIC基因靶向載體的位點特異性同源重組的轉(zhuǎn)化細胞的方法。這種方法可以通過例如以下步驟來實施，a)采用設(shè)計用來進行位點特異性同源重組的FPIC基因靶向載體來轉(zhuǎn)化細胞，其中所述的載體包含，第一條DNA序列與宿主基因組中存在的內(nèi)源性基因組序列實質(zhì)上同源；第二條DNA序列編碼轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列，不編碼功能蛋白產(chǎn)物并與細胞內(nèi)源性基因組序列非同源，因此不能接受位點特異性同源重組；第三條DNA序列與宿主基因組中存在的內(nèi)源性基因組序列實質(zhì)上同源，并與第一條DNA序列不同；以及第四條DNA編碼陰性可選擇標(biāo)記物，與細胞內(nèi)源性基因組序列非同源，因此不能接受位點特異性同源重組；其中所述的載體能夠在細胞中通過具有內(nèi)源性靶序列的第一條DNA序列和具有內(nèi)源性靶DNA序列的第三條DNA序列之間的鏈交換進行位點特異性同源重組；其中所述的FPIC基因靶向載體中的DNA序列的組成形式是，與靶DNA序列實質(zhì)上同源的第一條DNA序列，編碼轉(zhuǎn)錄的序列但不編碼功能蛋白產(chǎn)物的第二條DNA序列，與靶DNA序列實質(zhì)上同源的第三條DNA序列，編碼陰性可選擇標(biāo)記物的第四條DNA序列；b)繁殖細胞以選擇或富集已經(jīng)成功地用所述FPIC基因靶向載體轉(zhuǎn)化的細胞，通過存在所述的第二條DNA序列而選擇，和c)從含有所述編碼陰性可選擇標(biāo)記物的第四條序列的細胞中分離含有所述編碼轉(zhuǎn)錄序列的第二條DNA序列的細胞。這種方法可進一步包括對所述細胞的基因組DNA進行定性的步驟，所述細胞攜帶表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄序列但不編碼功能蛋白產(chǎn)物的第二條DNA序列，但不攜帶位點特異同源重組事件中的第四條DNA序列，該事件可進行細胞靶DNA的修飾。
也在另一個實施例中，本發(fā)明提供了鑒定已經(jīng)接受使用FPIC基因靶向載體的位點特異性同源重組的轉(zhuǎn)化細胞的方法。這種方法可以通過例如以下步驟來實施，a)采用設(shè)計用來進行位點特異性同源重組的FPIC基因靶向載體來轉(zhuǎn)化細胞，其中所述的載體包含，第一條DNA序列與宿主基因組中存在的內(nèi)源性基因組序列實質(zhì)上同源；第二條DNA序列編碼轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列，不編碼功能蛋白產(chǎn)物并與細胞內(nèi)源性基因組序列非同源，因此不能接受位點特異性同源重組；第三條DNA序列與宿主基因組中存在的內(nèi)源性基因組序列實質(zhì)上同源，并與第一條DNA序列不同；以及第四條DNA序列表現(xiàn)為所述細胞中的一條特異轉(zhuǎn)錄序列，它不編碼功能蛋白產(chǎn)物并與細胞內(nèi)源性基因組序列非同源，因此不能進行位點特異性同源重組；其中所述的載體能夠在細胞中通過具有內(nèi)源性靶序列的第一條DNA序列和具有內(nèi)源性靶DNA序列的第三條DNA序列之間的鏈交換進行位點特異性同源重組；其中所述的FPIC基因靶向載體中的DNA序列的組成形式是，與靶DNA序列實質(zhì)上同源的第一條DNA序列，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄序列但不編碼功能蛋白產(chǎn)物的第二條DNA序列，與靶DNA序列實質(zhì)上同源的第三條DNA序列，被轉(zhuǎn)錄但不編碼功能蛋白產(chǎn)物的第四條DNA序列；b)繁殖細胞以選擇或富集已經(jīng)成功的被所述FPIC基因靶向載體轉(zhuǎn)化的細胞，通過存在表現(xiàn)為不編碼功能蛋白產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄序列的第二條DNA序列而選擇，并以缺少所述第四條DNA序列的不編碼功能蛋白產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄序列而選擇，和c)從含有所述表現(xiàn)為不編碼功能蛋白的轉(zhuǎn)錄序列的第四條序列的細胞中分離含有所述表現(xiàn)為不編碼功能蛋白產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄序列的第二條DNA序列的細胞。這種方法可進一步包括對所述細胞的基因組DNA進行定性的步驟，所述細胞攜帶表現(xiàn)為不編碼功能蛋白產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄序列的第二條DNA序列，但不攜帶編碼轉(zhuǎn)錄序列但不編碼位點特異同源重組事件中功能蛋白產(chǎn)物的第四條DNA序列，該事件可進行細胞靶DNA的修飾。
仍然在另一個實施例中，本發(fā)明提供了鑒定已經(jīng)接受使用FPIC基因靶向載體的位點特異性同源重組的轉(zhuǎn)化細胞的方法。這種方法可以通過例如以下步驟來實施，a)采用設(shè)計用來進行位點特異性同源重組的FPIC基因靶向載體來轉(zhuǎn)化細胞，其中所述的載體包含，第一條DNA序列與宿主基因組中存在的內(nèi)源性基因組序列實質(zhì)上同源；第二條DNA序列編碼轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列，不編碼功能蛋白產(chǎn)物并與細胞內(nèi)源性基因組序列非同源，因此不能接受位點特異性同源重組；第三條DNA序列與宿主基因組中存在的內(nèi)源性基因組序列實質(zhì)上同源，并與第一條DNA序列不同；以及第四條DNA編碼陽性可選擇標(biāo)記物，與細胞內(nèi)源性基因組序列非同源，因此不能接受位點特異性同源重組；其中所述的載體能夠在細胞中通過具有內(nèi)源性靶序列的第一條DNA序列和具有內(nèi)源性靶DNA序列的第三條DNA序列之間的鏈交換進行位點特異性同源重組；其中所述的FPIC基因靶向載體中的DNA序列的組成形式是，與靶DNA序列實質(zhì)上同源的第一條DNA序列，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄序列但不編碼功能蛋白產(chǎn)物的第二條DNA序列，與靶DNA序列實質(zhì)上同源的第三條DNA序列，編碼陽性可選擇標(biāo)記物的第四條DNA序列；b)繁殖細胞以選擇或富集已經(jīng)成功地用所述FPIC基因靶向載體轉(zhuǎn)化的細胞，通過存在表現(xiàn)為不編碼功能蛋白產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄序列的第二條DNA序列而選擇，并以缺少由所述第四條DNA序列轉(zhuǎn)錄的陽性可選擇蛋白產(chǎn)物而選擇，和c)從含有所述編碼陽性可選擇標(biāo)記物的第四條DNA序列的細胞中分離含有所述表現(xiàn)為不編碼功能蛋白產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄序列的第二條DNA序列的細胞。這種方法可進一步包括對所述細胞的基因組DNA進行定性，所述細胞攜帶表現(xiàn)為不編碼功能蛋白產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄序列的第二條DNA序列，但不攜帶編碼位點特異同源重組事件中的陽性可選擇標(biāo)記物的第四條DNA序列，該事件可進行細胞靶DNA的修飾。
本發(fā)明的一個目的是提供為修飾內(nèi)源性核苷酸序列而靶向真核細胞基因組特異區(qū)域的位點特異同源重組方法，和組合物，包括以這種位點特異同源重組為特征的細胞和含有這種細胞的非人生物體。相應(yīng)地，本發(fā)明的另一個目的是提供選擇和檢測接受位點特異同源重組的細胞的方法。本發(fā)明的進一步目的是提供應(yīng)用所述方法的載體。也是本發(fā)明的另一個目的，即提供核酸和肽核酸((peptide nucleic acid)(PNA))分子信標(biāo)探針以鑒定細胞中是否存在特異的非同源基因靶向序列。仍然是本發(fā)明的進一步目的，即提供已經(jīng)通過所述的位點特異同源重組方法修飾的細胞。也是本發(fā)明的另一個目的，即提供已經(jīng)通過所述的位點特異同源重組和檢測方法修飾的轉(zhuǎn)基因動物和植物。
相應(yīng)地，本發(fā)明涉及分離的FPIC基因靶向載體，用于在能夠接受同源重組的細胞中進行位點特異性同源重組。這種FPIC基因靶向載體包括，第一條DNA序列與靶細胞的細胞內(nèi)源性基因組DNA序列實質(zhì)上同源，能夠在靶細胞中進行同源重組；第二條DNA序列與細胞內(nèi)源性基因組序列非同源，不能在靶細胞的基因組中進行同源重組，第二條DNA序列進一步包括能夠鑒定含有所述核苷酸序列的細胞的核苷酸序列；第三條DNA序列與細胞內(nèi)源基因組序列實質(zhì)上同源，能在靶細胞中接受同源重組；和任選地，第四條DNA序列與靶細胞的細胞內(nèi)源基因組序列非同源，不能在細胞中接受同源重組，當(dāng)存在第四條DNA序列時，進一步包括能夠從不含有所述核苷酸序列的細胞中鑒定和分離含有所述DNA序列的細胞的核苷酸序列。優(yōu)選地，F(xiàn)PIC基因靶向載體中的DNA序列組成部分以5’至3’方向連接如下與細胞內(nèi)源基因組DNA序列實質(zhì)上同源的第一條DNA序列，第二條DNA序列，與細胞內(nèi)源基因組DNA序列實質(zhì)上同源的第三條DNA序列，和第四條DNA序列。這樣的載體以能夠進行位點特異性同源重組并導(dǎo)致細胞內(nèi)源性靶基因組DNA序列的修飾為特征。
如此，本發(fā)明也涉及獲取轉(zhuǎn)化細胞的方法，該細胞已使用這種FPIC基因靶向載體進行位點特異同源重組。這種方法可通過，例如，以下的步驟實施在適合載體轉(zhuǎn)化細胞的條件下，將細胞與在此公開的FPIC基因靶向載體接觸；在選擇存在表現(xiàn)所述第二條DNA序列的轉(zhuǎn)錄序列和缺少表現(xiàn)第四條DNA序列的轉(zhuǎn)錄序列的條件下，增殖與載體接觸的細胞，因此選擇或富集用所述FPIC基因靶向載體轉(zhuǎn)化的細胞；和從含有所述第四條DNA的細胞中分離含有所述第二條DNA序列的細胞，從而獲得已經(jīng)使用FPIC基因靶向載體接受位點特異同源重組的轉(zhuǎn)化細胞。
附圖簡述圖1是對在使用FPIC基因靶向載體的位點定向誘變中涉及的過程進行說明的流程解。
圖2是經(jīng)同源重組進行的FPIC基因靶向的分子事件的圖解。
圖3是幾種類型的FPIC基因靶向載體的圖解。
圖4是在ptch2位點進行FPIC基因靶向的圖解。
圖5是在paraxis位點進行FPIC基因靶向的圖解。
發(fā)明詳述本發(fā)明基于基因靶向載體的進展，該載體用于通過位點特異性同源重組將修飾作用導(dǎo)入細胞內(nèi)源基因組靶DNA序列中。相應(yīng)地，提供了基因靶向載體，以及采用這種載體基因修飾細胞的方法。也提供了使用本發(fā)明的基因靶向載體被基因修飾的細胞，以及由這些細胞發(fā)育而成的轉(zhuǎn)基因非人生物體，例如采用本發(fā)明的靶向載體在一個或多個細胞內(nèi)源基因組DNA序列中以位點特異的方式進行基因修飾的胚胎干細胞(ES)，以及由這些修飾的(ES)細胞發(fā)育而成的非人生物體。
術(shù)語“細胞內(nèi)源基因組DNA序列”在此定義為正常存在于細胞基因組中的核苷酸序列。如在此公開的，細胞內(nèi)源基因組DNA序列能夠接受使用本發(fā)明基因靶向載體的序列進行位點特異性同源重組，因此，可以用作所公開的FPIC基因靶向載體的修飾靶標(biāo)。包括在此定義中的序列可代表細胞基因組中存在的特異基因的任何編碼或非編碼區(qū)。編碼如結(jié)構(gòu)蛋白、分泌蛋白、激素、受體、酶類、轉(zhuǎn)錄因子等蛋白產(chǎn)物的基因也包括在此定義中。這些序列也代表調(diào)控元件等同體如啟動子、增強子或阻遏物元件。細胞內(nèi)源基因組靶DNA序列的組成形式一般類似于FPIC基因靶向載體中存在的特異序列。即，它含有與FPIC基因靶向載體中存在的序列實質(zhì)上同源的序列，使得位點特異性同源重組能夠進行。
術(shù)語“位點特異性同源重組”是指在核苷酸組成上實質(zhì)上相似的DNA序列之間發(fā)生的鏈交換遺傳交叉事件。這種遺傳交叉事件可發(fā)生在FPIC基因靶向載體和細胞內(nèi)源基因組DNA序列所包含的序列之間。另外，可能有超過一個位點特異性同源重組事件發(fā)生在FPIC基因靶向載體和細胞內(nèi)源基因組序列中存在的序列之間，可引起置換事件，包含在FPIC基因靶向載體中的DNA序列替代了存在于細胞內(nèi)源基因組序列中的特異序列。同樣，單個位點特異性同源重組事件可發(fā)生在FPIC基因靶向載體和細胞內(nèi)源基因組序列中存在的DNA序列之間，可引起插入事件，其中大部分或整個FPIC基因靶向載體被插入細胞內(nèi)源基因組序列中的特異位點。
術(shù)語“第一條DNA序列”是指存在于FPIC基因靶向載體中DNA序列，它們與細胞內(nèi)源基因組序列實質(zhì)上是同源的。正是這些序列，在它們被導(dǎo)入含有相似序列、能夠接受所述重組作用的細胞中時，預(yù)測可接受位點特異性同源重組。
術(shù)語“第二條DNA序列”是指可根據(jù)特別的特性被檢測其存在的序列，由于缺少啟動子和在陽性可選擇標(biāo)記物的上游存在的調(diào)控元件，它們可以，但不是必須的，獨立于細胞靶向序列而表達。第二條DNA序列定位在第一條和第三條DNA序列之間，后兩者與細胞內(nèi)源基因組DNA序列實質(zhì)上是同源的。第二條DNA序列與細胞內(nèi)源基因組DNA序列是非同源的，因此使用這條序列接受位點特異性同源重組。
術(shù)語“第三條DNA序列”是指在FPIC基因靶向載體中存在的DNA序列，它們與細胞內(nèi)源基因組序列實質(zhì)上是同源的，然而與第一條DNA序列的序列是不同的，但可能是鄰近的，或適當(dāng)接近的。正是這些序列，在它們被導(dǎo)入含有相似序列，能夠接受所述的重組作用的細胞的過程中，預(yù)測可接受位點特異性同源重組。
術(shù)語“第四條DNA序列”是指可根據(jù)特別的特性被檢測其存在的特異序列，它們定位在第一條和第三條DNA序列的外部。第四條DNA序列含有自己的啟動子和調(diào)控元件，因此其表達是獨立于細胞內(nèi)源基因組靶DNA序列中存在的調(diào)控元件。第四條DNA序列與細胞內(nèi)源基因組DNA序列是非同源的，因此不能使用這條序列進行位點特異性同源重組。
在一個置換型FPIC基因靶向載體中，第一條，第二條，第三條和第四條DNA序列可如此組織，即第二條DNA序列位于第一條和第三條DNA序列之間，第四條DNA序列位于第一條或第三條DNA序列的5’或3’端。圖2圖示了用來進行位點特異性同源重組的一個FPIC基因靶向載體的組成形式。
第四條DNA序列可定位在包含在FPIC基因靶向載體中的第一條和第三條序列的上游或下游。上游一般是指載體中第一條和第三條序列的5’，下游一般是指其3’，所述載體含有第一條和第三條DNA序列，在方向上類似于細胞內(nèi)源基因組序列。應(yīng)該闡明的是5’和3’分別是指第一條和第三條DNA序列。這種組成形式代表一個置換型載體。第二條DNA序列可能根據(jù)第一條和第三條DNA序列而被反轉(zhuǎn)，仍保留可表達性，因此可檢測它的存在。另外，與細胞靶DNA中的相似序列比較可能FPIC基因靶向載體中第一條和第三條序列的部分可根據(jù)互相的位置而被反轉(zhuǎn)。插入型載體一般在位點特異性同源重組作用下將大部分載體序列插入細胞基因組中。
其他的選擇特征可由第五條DNA序列來表現(xiàn)，它位于第四條DNA序列相反的位置上。術(shù)語“相反”是指在第一條或第三條DNA序列外部的位置，位于這些序列的另一端，即與編碼陽性標(biāo)記物相關(guān)的第四條DNA序列的5’或3’端。
在一個插入型FPIC基因靶向載體中，第一條，第二條和第三條序列可被如此組織起來，即第三條序列可根據(jù)第一條序列在載體的線性化過程從5’反轉(zhuǎn)至3’端。所述的反轉(zhuǎn)方向可使載體在位點特異性同源重組過程中在位點特異的位置上的插入，該重組作用發(fā)生在FPIC基因靶向載體和細胞內(nèi)源基因組DNA序列之間。在大多數(shù)情況下，整個載體將被插入，實質(zhì)上同源的DNA序列的部分被復(fù)制。第四條DNA的編碼序列可以，但不是必須的包含在FPIC基因靶向載體中。
FPIC基因靶向載體的長度可根據(jù)所選擇的陽性可選擇標(biāo)記物，被轉(zhuǎn)錄但不編碼功能蛋白產(chǎn)物的核苷酸序列，能夠驅(qū)動第二條DNA序列編碼的陽性可選擇標(biāo)記物表達的啟動子存在與否，適當(dāng)?shù)耐粗亟M所需的第一條和第三條DNA序列的長度，基本載體的長度和在細菌中質(zhì)粒載體的選擇作用如氨芐青霉素抗性和質(zhì)粒主鏈復(fù)制起始點的大小等而變化。但基于已知質(zhì)粒和陽性可選擇標(biāo)記物的大小，合理的估計整個載體將在長度上至少為幾千堿基對。
術(shù)語“分子信標(biāo)”在此的定義是指鑒定存在細胞內(nèi)的特異核苷酸序列的探針。分子信標(biāo)可由僅核酸如DNA或RNA組成，或可由肽核酸(PNA)結(jié)合物組成。分子信標(biāo)與特異核苷酸序列的結(jié)合可允許在體外或體內(nèi)鑒定這些序列的存在。
術(shù)語“功能性”在此的定義，就陽性可選擇標(biāo)記物而言，是賦予標(biāo)記物下面所述的能力，可檢測和分離含有編碼陽性可檢測標(biāo)記物的DNA的細胞，可從不含有陽性可選擇標(biāo)記物的或含有被轉(zhuǎn)錄但不編碼功能蛋白的序列的細胞中鑒別出這些細胞。許多選擇試劑可因檢測存在于細胞中的陽性可選擇標(biāo)記物。這些試劑包括，但不限于，例如G418，次黃嘌呤，博來霉素，潮霉素，嘌呤霉素，殺稻瘟素，列于表I。另外，鑒定標(biāo)記物存在不需要添加試劑的陽性可選擇標(biāo)記物被認為是功能性的，如果它們可從含有不同的可選擇標(biāo)記物或不含有可選擇標(biāo)記物的細胞中分離含有所述可選擇標(biāo)記物的細胞。一些實例包括，但不限于，熒光蛋白GFP，CFP，YFP，RFP，dsRED和HcRED，也列于表I。
表I.在FPIC基因靶向載體中應(yīng)用的陽性可選擇標(biāo)記物
FPIC基因靶向載體包括兩個同源區(qū)，第一條和第三條DNA序列，它們與宿主基因組的區(qū)域?qū)嵸|(zhì)上是同源的。典型地，載體含有的第一條和第三條DNA序列的同源性長度為大約50個堿基對和50,000個堿基對之間。也包括第二條和第四條DNA序列，它們編碼陽性可選擇標(biāo)記物，陰性可選擇標(biāo)記物，或被轉(zhuǎn)錄但不編碼功能蛋白的序列，可鑒定FPIC靶向載體整體和其部分在宿主基因組中的存在與否。第二條DNA序列可編碼陽性可選擇標(biāo)記物，如，但不限于，例如藍綠熒光蛋白(cyan fluorescent protein)(CFP)，它定位在兩個同源區(qū)之間，因此可被包含在位點特異性同源重組應(yīng)該發(fā)生的宿主基因組整合體中。理想地，如果第四條DNA序列被轉(zhuǎn)錄但不編碼功能蛋白，第二條DNA序列將編碼陽性可選擇標(biāo)記物。如果第二條DNA序列編碼陽性可選擇標(biāo)記物，第四條DNA序列表現(xiàn)為不編碼功能蛋白的轉(zhuǎn)錄序列，它定位在同源區(qū)之外，因此將不會在同源重組作用下被加入宿主基因組中?？蛇x擇地，如果第二條DNA序列表現(xiàn)為不編碼功能蛋白的轉(zhuǎn)錄序列，第四條DNA序列則編碼陽性的可選擇標(biāo)記物。另外，可能第二條DNA序列表現(xiàn)為不編碼功能蛋白的轉(zhuǎn)錄序列，第四條DNA序列表現(xiàn)為陰性可選擇標(biāo)記物。另外，也可能第二條和第四條DNA序列均表現(xiàn)為不編碼功能蛋白的轉(zhuǎn)錄序列。選擇過程涉及在顯微鏡下或通過熒光激活細胞分類術(shù)(FACS)細胞分選儀分選細胞，這將可以同時和單獨的從含有第四條DNA序列的細胞中分離出含有第二條DNA序列的細胞。這些細胞的鑒定涉及采用熒光或其他方法檢測陽性可選擇標(biāo)記物，通過應(yīng)用分子信標(biāo)技術(shù)檢測不編碼功能蛋白的轉(zhuǎn)錄序列，分子信標(biāo)技術(shù)可鑒定細胞中特異的已轉(zhuǎn)錄序列。然后細胞可在組織培養(yǎng)中增殖，確定正確位點特異同源重組的基因靶向事件的基因型。應(yīng)用陽性可選擇標(biāo)記物與可適用于分子信標(biāo)技術(shù)的已轉(zhuǎn)錄序列的組合可鑒定已接受位點特異同源重組的細胞，對已有的基因靶向方法學(xué)是一個實質(zhì)上的改良。
在本發(fā)明中描述的方法中使用的FPIC基因靶向載體可被如此組織，即第二條DNA序列可操作的定位在兩個同源區(qū)之間，第四條DNA序列可操作的定位在兩個同源區(qū)的外部和外側(cè)。可能第二條DNA序列可采用這種方式來定位以破壞或置換外顯子或基因組內(nèi)源區(qū)的編碼序列，在此位置上可發(fā)生位點特異性同源重組，因此可使內(nèi)源位點失活并因此喪失功能。
在一個方面，第二條DNA序列可被定位，以便置換或插入不表現(xiàn)為外顯子或編碼序列的基因組區(qū)域，如內(nèi)含子，外顯子的不翻譯區(qū)域或調(diào)控元件區(qū)域如啟動子。在這種情況下，細胞可因在該位點上接受位點特異性同源重組，并不會滅活該特異位點而被選擇。
在另一個方面，第二條DNA序列也可包含該序列獨特的調(diào)控元件，其定位方式為在選擇進行位點特異重組的基因組區(qū)域中可導(dǎo)入新的調(diào)控元件。本發(fā)明包括了為了實施位點特異同源重組的所述FPIC基因靶向載體和隨后對接受所述重組的細胞的鑒定。
現(xiàn)在所描述的本發(fā)明也包括了根據(jù)FPIC基因靶向載體已接受位點特異同源重組的細胞和在此所述的鑒定方法。另外，現(xiàn)在所描述的本發(fā)明包括來自這些細胞的轉(zhuǎn)基因非人動物和在此所描述的方法，所述的這些細胞使用FPIC基因靶向載體已接受了位點特異同源重組。
也包括來自這些細胞的轉(zhuǎn)基因植物和在此所描述的方法，所述的這些細胞使用FPIC基因靶向載體已接受了位點特異性同源重組。以往已經(jīng)證實了植物通過陽性-陰性選擇可接受位點特異性同源重組以及基因靶向，因此可接受FPIC基因靶向載體和在此所描述的方法(Siebert等人，(2002)，Plant Cell，14，1121；Hanin等人，(2001)，Plant J.，28，671；Xiaohui等人，(2001)，Gene，272，249)。
在本發(fā)明中所描述的方法中，大多數(shù)被整合進宿主細胞中的載體可以基本上隨機的方式進行，不需優(yōu)選基因組的特異區(qū)域。但合理的建議是一定比例的第一條DNA載體通過位點特異性同源重組作用整合進宿主細胞基因組中。隨后的細胞選擇可分離和鑒定成功接受位點特異性同源重組作用的細胞。選擇作用是基于FPIC基因靶向載體的組成形式和組成成分。FPIC基因靶向載體包括兩個同源區(qū)，第一條和第三條DNA序列，它們與宿主基因組區(qū)域?qū)嵸|(zhì)上是同源的。也包括第二條DNA序列和可選擇的第四條DNA序列，它們可鑒定FPIC基因靶向載體整體和其部分在宿主基因組中存在與否。第二條DNA序列定位在兩個同源區(qū)之間，因此可被包含在位點特異性同源重組應(yīng)該發(fā)生的宿主基因組整體中。選擇過程涉及顯微鏡下或通過FACS細胞分選儀來進行細胞分選，這樣可同時和單獨的從含有第四條DNA序列的細胞中分離含有第二條DNA序列的細胞。然后細胞在組織培養(yǎng)中增殖，并確定正確位點特異同源重組的基因靶向事件的基因型。
現(xiàn)在所描述的本發(fā)明的FPIC基因靶向載體方法可如此組織起來，即第二條DNA序列被可操作性的定位在兩個同源區(qū)之間。可能第二條DNA序列可以此模式被定位以破環(huán)或置換基因組內(nèi)源區(qū)域的外顯子或編碼序列，其位置可發(fā)生位點特異性同源重組，可使內(nèi)源位點失活并喪失功能。
第二條DNA序列可被定位，即它可置換或插入不表現(xiàn)為外顯子或編碼序列的基因組區(qū)域中，如內(nèi)含子，外顯子的不翻譯區(qū)域或調(diào)控元件區(qū)域如啟動子。在這種情況下，細胞可因在該位點上接受位點特異性同源重組，并不會滅活該特異位點而被選擇。
在第三種情況下，可能第二條DNA序列也包含該序列獨特的調(diào)控元件，其定位方式為在選擇進行位點特異重組的基因組區(qū)域中可導(dǎo)入新的調(diào)控元件。
第二條和第四條DNA序列的序列組成一般與細胞內(nèi)源基因組DNA序列是非同源的，因此不能接受位點特異性同源重組。因此所有的位點特異同源重組是編碼與細胞內(nèi)源基因組DNA序列實質(zhì)上同源的區(qū)域的第一條和第三條DNA序列的結(jié)果，因此能夠接受鏈交換的遺傳交叉過程。另外，第二條和第四條DNA序列可根據(jù)相互的位置和根據(jù)細胞內(nèi)源基因組DNA序列以方向獨立的方式被定位。但第二條DNA序列的這種定位，需要不依賴細胞內(nèi)源基因組DNA調(diào)控元件的這些序列的轉(zhuǎn)錄。
許多優(yōu)選的陽性可選擇標(biāo)記物可用于FPIC基因靶向載體中(見表I)。這些序列可選擇含有陽性可選擇標(biāo)記物的細胞，以便將所述細胞區(qū)分于那些不含有陽性可選擇標(biāo)記物的細胞。用作第二條DNA序列的最廣泛使用的陽性可選擇標(biāo)記物可能編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因產(chǎn)物。其他適合第二條DNA序列的陽性可選擇標(biāo)記物包括，但不限于，編碼殺稻瘟素抗性，嘌呤霉素抗性，博來霉素抗性和潮霉素抗性的序列。這些陽性可選擇標(biāo)記物的幾種也可適用于使用FPIC基因靶向載體在植物中進行位點特異性同源重組。
術(shù)語“陰性可選擇標(biāo)記物”包括任何特異的基因，DNA序列，蛋白，肽或氨基酸序列，當(dāng)導(dǎo)入細胞中或接近細胞時，可具有通過細胞殺傷的作用將細胞從一個總的群體中消除的能力。術(shù)語“陰性選擇作用”是指通過實現(xiàn)可殺死所述細胞的方法學(xué)而對細胞進行選擇的作用。為了，許多陰性可選擇標(biāo)記物可用來增強或補充鑒定已接受位點特異同源重組的細胞的可能性。這些標(biāo)記物包括，但不限于，胸苷激酶，白喉毒素A鏈，次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(hprt)和黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(gpt)，見表II。
表II.用于共轉(zhuǎn)化方法中的陰性可選擇標(biāo)記物
“突變中DNA序列”在此是指任何改變了細胞內(nèi)源基因組DNA序列的序列。這樣的改變可導(dǎo)致細胞DNA序列功能容量的失活。這樣的改變也可增強細胞序列DNA的功能容量或?qū)毎鸇NA序列的功能容量無影響。
“突變的DNA序列”在此是指任何可在使用FPIC基因靶向載體的過程中接受改變的細胞內(nèi)源基因組DNA序列。一般預(yù)測突變的DNA序列將在FPIC基因靶向載體和細胞內(nèi)源基因組DNA序列之間的位點特異重組作用下而產(chǎn)生?！巴蛔兊陌屑毎笔悄軌蚪邮芪稽c特異性同源重組的細胞，它含有通過使用如在此所公開的存在于FPIC基因靶向載體中的突變DNA序列在細胞基因組內(nèi)建立的突變DNA序列。
術(shù)語“實質(zhì)上非同源的DNA”或“實質(zhì)上不同源的DNA”是指不含有與靶DNA序列相似并足以發(fā)生位點特異同源重組過程的核苷酸序列的DNA序列。不相似序列的這種不能接受與靶DNA序列的位點特異同源重組的能力的原因是兩條序列之間堿基對組成的不匹配。
在細胞基因組中建立突變的DNA序列具有許多應(yīng)用上的益處。例如X-連鎖基因可用來分析組織培養(yǎng)中的功能關(guān)系，如果由FPIC基因靶向載體靶向的特定細胞類型是雄性來源的話。另外，采用FPIC基因靶向載體對胚胎干細胞的操作可建立研究人類疾病的動物模型。例如p53位點，已經(jīng)成功的采用陽性-陰性選擇技術(shù)在鼠胚胎干細胞中被滅活，這些細胞已被用于建立這個位點編碼的蛋白產(chǎn)物缺陷的小鼠(Donehower等人，(1992)，Nature，356，215)。這些小鼠在發(fā)育上是正常的，但易于發(fā)生特發(fā)性腫瘤。FPIC基因靶向載體和技術(shù)可在胚胎干細胞和由所述細胞建立的動物中產(chǎn)生相似的基因修飾。FPIC基因靶向載體和技術(shù)的其他應(yīng)用包括產(chǎn)生獲取功能的等位基因，可研究許多細胞和生理現(xiàn)象。許多原癌基因已經(jīng)被當(dāng)作獲取功能的等位基因來分析，包括c-myc，細胞周期蛋白D1和ErbB-2(綜述見Hutchinson等人，(2000)，Oncogene，19，130)。使用FPIC基因靶向載體和在此所描述的方法可有效地進行胚胎干細胞和來自這些細胞的轉(zhuǎn)基因動物的喪失和獲取功能的研究。
FPIC基因靶向載體和方法可用于建立和鑒定已接受載體和細胞內(nèi)源基因組靶序列之間位點特異同源重組的細胞。載體實質(zhì)上可富集鑒定接受所述過程的細胞?！皩嵸|(zhì)上富集”是指明顯增加鑒定接受載體和細胞DNA序列之間位點特異同源重組的細胞可能性的能力。可能性的明顯增加是當(dāng)與非特異插入或整合事件相比，至少兩倍的同源重組事件，優(yōu)選至少10倍，更優(yōu)選至少100倍，甚至更優(yōu)選10,000倍。使用FPIC基因靶向載體獲得的實質(zhì)上富集的細胞群包括大約1％，更優(yōu)選10％，甚至更優(yōu)選99％的分離細胞接受了在FPIC基因靶向載體序列與細胞內(nèi)源基因組靶序列之間的位點特異同源重組。
FPIC基因靶向載體可能被設(shè)計成可在內(nèi)源調(diào)控元件的控制下驅(qū)動第二條DNA序列的轉(zhuǎn)錄為FPIC基因靶向載體靶向的特異基因。在這種情況下，載體被構(gòu)建，這樣第二條DNA序列足以缺少驅(qū)動這些序列轉(zhuǎn)錄的上游元件。在FPIC基因靶向載體和細胞內(nèi)源基因組靶序列之間的同源重組提供了隨后要驅(qū)動第二條DNA序列轉(zhuǎn)錄的靶基因的特異調(diào)控元件。如果不發(fā)生位點特異性同源重組，第二條DNA序列大多數(shù)經(jīng)常不被轉(zhuǎn)錄，因此對足以驅(qū)動這些序列的轉(zhuǎn)錄提供了內(nèi)源性的細胞調(diào)控元件。這樣一個載體組成形式的實例是將第二條DNA序列定位在第一條DNA序列和第三條DNA序列之間，其中第一條DNA序列與細胞內(nèi)源基因組靶DNA是實質(zhì)上同源的，并含有一個啟動子和部分5’未翻譯區(qū)，第三條DNA序列與細胞內(nèi)源基因組靶DNA實質(zhì)上是同源的，并含有內(nèi)含子和下游外顯子的一部分。FPIC基因靶向載體和細胞內(nèi)源基因組靶序列之間的位點特異同源重組可在內(nèi)源調(diào)控元件的控制下對第二條DNA序列進行定位。
就靶向修飾的基因功能而言，對于第二條DNA序列的定位可有許多種情況，可產(chǎn)生許多表現(xiàn)型。例如，可能不需要破壞內(nèi)源位點就可能在FPIC基因靶向載體和細胞內(nèi)源基因組靶序列之間實現(xiàn)位點特異同源重組。這可以通過將第二條DNA序列定位在一個內(nèi)含子或非編碼區(qū)內(nèi)而實現(xiàn)，這樣將所述的第二條DNA序列導(dǎo)入宿主細胞的基因組中不會破壞調(diào)控，外顯或編碼序列。這樣一個載體的組成形式的實例是將第二條DNA序列定位在第一條DNA序列和第三條DNA序列之間，其中第一條DNA序列與細胞內(nèi)源基因組靶DNA實質(zhì)上是同源的，并含有一個外顯子和一個內(nèi)含子的一部分，第三條DNA序列與細胞內(nèi)源基因組靶DNA實質(zhì)上是同源的，并含有一個內(nèi)含子的一部分和一個下游的外顯子。在FPIC基因靶向載體和細胞內(nèi)源基因組靶序列之間的位點特異同源重組可在內(nèi)含子中定位陽性可選擇標(biāo)記物，因此不會破壞重要的外顯編碼序列。一個要求是第二條DNA序列必須由存在于FPIC基因靶向載體中的調(diào)控元件控制。
將突變的DNA序列導(dǎo)入能夠接受位點特異同源重組的靶細胞基因組中，并不限制于建立喪失功能或獲得功能的等位基因。例如，可能為了驅(qū)動由位點特異同源重組靶向的特異細胞內(nèi)源位點的表達，將外源調(diào)控序列導(dǎo)入細胞或轉(zhuǎn)基因動物或植物中新的組織-和/或細胞類型特異的區(qū)域，所述的動物或植物是從由FPIC基因靶向載體靶向的細胞建立的。為此目的使用的FPIC基因靶向載體和方法學(xué)可指導(dǎo)或控制任何基因?qū)嵸|(zhì)上空間和時間上的表達模式，這些基因能夠接受位點特異性同源重組。在此所述為此目的所述技術(shù)的應(yīng)用實例是導(dǎo)入來自原癌基因c-myc編碼序列的上游Pit-1位點的啟動子和調(diào)控元件。這種情況可使c-myc在發(fā)育中和成體垂體的促生長激素細胞，垂體催乳素細胞(lactotrope)和促甲狀腺素細胞中異位表達，并提供了一種垂體腫瘤發(fā)生的模型(Rhodes等人，(1996)，Mol.Cell Endocrinol.，124，163；Baxter等人，(2001)，75，9790)。表III列舉了許多已定性的調(diào)控序列，它們可通過FPIC基因靶向方法被用來驅(qū)動內(nèi)源位點的表達。
表III.調(diào)控元件的實例.
可以理解的是，可以接受位點特異同源重組的任何類型細胞可被FPIC基因靶向載體和方法處理以對細胞內(nèi)源基因組DNA序列進行突變。能夠接受位點特異同源重組的細胞可來自許多生物體和物種，包括但不限于，人，鼠，綿羊，豬，牛，猿，犬和貓。一般，任何能夠接受位點特異同源重組的真核細胞可成功地被FPIC基因靶向載體和方法靶向，在細胞內(nèi)源基因組DNA中中產(chǎn)生突變的DNA序列。
當(dāng)建立含有需要通過使用FPIC基因靶向載體和方法或共轉(zhuǎn)化方法產(chǎn)生的修飾作用的轉(zhuǎn)基因非人動物時，優(yōu)選的細胞類型是胚胎干細胞。這些細胞一般來自植入之前的胚胎內(nèi)細胞群，并在組織培養(yǎng)中增殖進行基因操作。在通過使用FPIC基因靶向載體和方法突變細胞內(nèi)源基因組DNA序列的過程中，細胞經(jīng)微注射技術(shù)被導(dǎo)入胚泡中，所述的胚泡被植入至假孕的雌性宿主中(Hogan等人，(編者)(1994)，鼠胚的操作，實驗室手冊，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)。司選擇地，桑椹胚聚集方法可用于建立含有基因修飾干細胞的胚胎(Kong等人，(2000)，Lab Anim.，29，25)。在出生后階段仍然存活的胚胎經(jīng)常表現(xiàn)嵌合的細胞成分，其中一定比例的細胞來自胚泡來源，一定比例的細胞來自那些通過FPIC基因靶向載體和技術(shù)突變的起源。嵌合的動物隨后被繁殖成為對FPIC基因靶向載體和技術(shù)突變的等位基因來說是雜合性和純合性的。
在此所述的FPIC基因靶向技術(shù)被用于糾正人體中的特異基因缺陷。例如，可能通過FPIC基因靶向載體和細胞內(nèi)源基因組DNA序列之間的位點特異同源重組在人干細胞中產(chǎn)生突變的DNA序列，隨后將這些細胞移植到病人體內(nèi)，以糾正特異的基因疾患或補充特異基因產(chǎn)物。基因滅活的其他潛在應(yīng)用是細胞表面上蛋白受體的破壞。例如其中已經(jīng)采用適當(dāng)?shù)腇PIC基因靶向載體破壞了假定病毒受體表達的細胞系或生物體進行病毒檢測，以證實受體實際上參與了病毒的感染。進一步，適當(dāng)?shù)腇PIC基因靶向載體被用于產(chǎn)生特異基因缺陷的轉(zhuǎn)基因動物模型。例如，許多基因缺陷已經(jīng)通過特異基因不能表達功能基因產(chǎn)物而被定性，如α和β地中海貧血，血友病，高歇病(Gaucher’s disease)和影響α1-抗胰蛋白酶，ADA，PNP，苯丙酮尿癥，家族性高膽固醇血癥和視網(wǎng)膜母細胞瘤產(chǎn)生的缺陷。含有一個或多個與這些疾病狀態(tài)或編碼特異基因缺陷的修飾作用有關(guān)的等位基因被破壞的轉(zhuǎn)基因動物可用作治療的模型。對于出生時成活的這些動物，可以進行實驗性治療。但當(dāng)基因缺陷影響生存時，轉(zhuǎn)基因動物的適當(dāng)后代(如F0，F(xiàn)1)可用于研究基因治療的體內(nèi)技術(shù)。
FPIC基因靶向載體被設(shè)計特別用來在細胞的內(nèi)源基因組DNA中突變DNA序列，所述細胞能夠接受位點特異性同源重組。FPIC基因靶向載體的成分包括至少一個與細胞內(nèi)源基因組DNA序列實質(zhì)上同源的DNA區(qū)，一個使人能夠從不含有這些序列的細胞中鑒別含有這些序列的細胞的DNA序列，至少一個其他的DNA序列，它可使人從不含有這些序列的細胞中鑒別和分離出含有這些序列的細胞。(圖3)另外，優(yōu)選的是，F(xiàn)PIC基因靶向載體在被導(dǎo)入細胞中突變細胞內(nèi)源基因組DNA序列之前被線性化，因為線性化載體可較環(huán)狀載體表現(xiàn)明顯更高的靶向頻率(Thomas等人，(1986)，Cell，44，49)。但是，可能不需要線性化就可使用FPIC基因靶向載體達到這些目的。
為了靶向不同的等位基因，不同的調(diào)控元件可以，但不是必須的，用于轉(zhuǎn)錄第二條和第四條DNA序列，特別是第二條DNA序列，它可被定位在置換載體中實質(zhì)上同源的兩個區(qū)域之間。通過操縱第二條和第四條DNA序列的轉(zhuǎn)錄水平，可成功地進行靶向，其中這些序列由于異染色質(zhì)的組成或鄰近的調(diào)控元件對這些水平是很敏感的，所述的水平可影響陽性標(biāo)記物的表達或可影響位點特異性同源重組的過程。表IV列出了可用于現(xiàn)在所描述的本發(fā)明中的更普遍的調(diào)控區(qū)域。
表IV.用來驅(qū)動可選擇標(biāo)記物表達的調(diào)控區(qū)R
成功進行位點特異同源重組所需要的FPIC基因靶向載體的長度是重要的參數(shù)，經(jīng)常依賴于建立突變DNA序列所要靶向的特異基因。載體的長度也依賴于幾種因素。代表第二條和第四條DNA序列的DNA序列的選擇將影響總的載體長度，因為序列組成是根據(jù)不同的轉(zhuǎn)錄的或表達的DNA序列，陽性或陰性可選擇標(biāo)記物而變化的。另外，在置換型載體中，第一條和第三條DNA序列的長度是重要的參數(shù)，為了進行成功的基因靶向必須被正確確定，兩條序列與細胞內(nèi)源基因組靶DNA序列實質(zhì)上是同源的。一般來說，一個同源區(qū)可小至25bp(Ayares等人，(1986)，Genetics，83，5199)，盡管推薦使用明顯更大的區(qū)域。直至一個特定的長度，在FPIC基因靶向載體同源性數(shù)量的增加可增加靶向的效率(Zhang等人，(1994)，Mol.Cell Biol.，14，2404)。在大多數(shù)情況下，整個載體的長度最小為1kb，通常最大不超過500kb，盡管載體長度也可依賴于用來構(gòu)建載體的技術(shù)。例如，可能用粘粒，細菌人工染色體(BAC)，或酵母人工染色體(YAC)構(gòu)建FPIC基因靶向載體，作為兩個實質(zhì)上的同源區(qū)的供給者，因此產(chǎn)生了一個明顯很大的載體(Ananvoranich等人，(1997)，BioTechniques，23，812；Cocchia等人.，(2000)，Nucleic Acids Res.，28，E81)。載體的長度也包括質(zhì)粒主鏈序列，如編碼復(fù)制起始點的序列，以及細菌藥物抗性產(chǎn)物如氨芐青霉素，如果它們在用載體轉(zhuǎn)化細胞前沒有被移除的話。
與細胞內(nèi)源基因組DNA序列實質(zhì)上同源的，并接受位點特異同源重組以在細胞靶標(biāo)中建立突變DNA序列的FPIC基因靶向載體DNA序列優(yōu)選與細胞的對應(yīng)部分具有明顯高的同源性。在位點特異性同源重組的遺傳交叉和鏈交換過程中，高同源性可進行有效的堿基配對。在FPIC基因靶向和細胞DNA序列之間的堿基配對不匹配都可影響重組反應(yīng)。例如，優(yōu)選在FPIC基因靶向置換載體中的第一條和第三條DNA序列與細胞內(nèi)源基因組DNA序列是100％同源的，次優(yōu)選的是80％的同源，更次優(yōu)選的是50％的同源。第二條和第四條DNA序列一般對細胞內(nèi)源基因組DNA序列是非同源的，因此含有這些序列就不能接受位點特異性同源重組。
在特定的情況下，在發(fā)生在FPIC基因靶向載體和細胞內(nèi)源基因組靶DNA序列之間的位點特異同源重組過程中，去除已經(jīng)摻入至細胞基因組中的DNA序列是有益的。這是由于這些序列的表達可潛在的負面影響細胞或生物體的活力和生存?？蛇x擇地，導(dǎo)入宿主細胞基因組中的調(diào)控元件反過來可影響與這些元件并排的內(nèi)源位點的表達。從宿主基因組中去除序列可能通過許多方法。Cre-Lox技術(shù)可成功地用于經(jīng)FPIC基因靶向載體和技術(shù)去除已導(dǎo)入細胞內(nèi)源基因組DNA中的特異序列(Cre-Lox的綜述見Ryding等人，(2001)，J.Endocrinol.，171，1)。例如，編碼陽性可選擇標(biāo)記物的序列和相應(yīng)的調(diào)控元件在細胞轉(zhuǎn)化前可側(cè)向位于FPIC基因靶向載體的Lox P重組位點。將這些序列導(dǎo)入宿主細胞基因組中后，Cre重組酶的暫時或穩(wěn)定表達將可以去除一個Lox P位點和所有定位在Lox P位點之間的所有序列。存在許多去除序列的Cre-Lox技術(shù)的應(yīng)用實例。Kaartinen等人已經(jīng)證明經(jīng)腺病毒感染16細胞期桑椹胚通過暫時表達Cre可去除側(cè)向1ox P位點的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因盒(Kaartinen等人，(2001)，Genesis，31，126)。Xu等人通過在Ella啟動子控制下與表達Cre小鼠的雜交以及對含有Cre表達質(zhì)粒的基因盒的細胞進行前核注射，可成功地去除側(cè)向于新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因盒的lox P(Xu等人(2001)，Genesis，30，1)。因此，如果FPIC基因靶向載體被配置以置換或糾正缺陷的細胞外顯序列，如為了進行人體基因治療，轉(zhuǎn)錄的序列和相應(yīng)的第二條DNA序列的調(diào)控元件可在完成FPIC基因靶向載體和宿主DNA之間的位點特異同源重組后被去除。
在此公開的FPIC基因靶向載體和方法可用于在植物中突變DNA序列。實際上，存在有植物譜系中的幾個同源重組的實例(Siebert等人，(2002)，Plant Cell，14，1121，綜述見Schaefer，(2002)，Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol Biol.，53，477)。另外，所述的同源重組已經(jīng)使用陽性-陰性選擇技術(shù)被用來靶向幾種植物位點，包括乙醇脫氫酶和原卟啉原氧化酶(PPO)位點(Xiaohui等人，(2001)，Gene，272，249；Hanin等人，(2001)，Plant J.，28，671)。假定有許多抗性標(biāo)記物，它們可用來實施FPIC基因靶向方法，以經(jīng)位點特異性同源重組產(chǎn)生突變的DNA序列。這些標(biāo)記物包括新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，以及任何除草劑或殺蟲劑抗性位點，其中這些位點在導(dǎo)入植物細胞的過程中可容受陽性可選擇的特征。在使用FPIC基因靶向載體和方法建立的植物中的突變通過導(dǎo)入外源調(diào)控元件，可在內(nèi)源位點表達水平上包括喪失功能，獲得功能或修飾。喪失功能或獲得功能的突變可通過去除特異的內(nèi)源DNA序列或改變序列而產(chǎn)生，所述的序列改變可改變特異植物基因編碼的氨基酸組成。另外，“敲入”(knock-in)實驗可在植物中實施，通過使用FPIC基因靶向載體和方法將外源基因或編碼區(qū)導(dǎo)入到一個內(nèi)源位點中。
FPIC基因靶向載體導(dǎo)入植物細胞中，可通過許多方法實現(xiàn)，包括以前在將外源DNA插入原生質(zhì)體中時所建立的方法(Hain等人，(1985)，Mol.Gen.Genet.，199，161；Negrutiu等人，(1987)，Plant Mol.Biol.，8，363；Paszkowski等人，(1984)，EMBO J.，3，2717)。微注射也可成功地將FPIC基因靶向載體導(dǎo)入植物細胞中(Dela Pena等人，(1987)，Nature，325，274；Crossway等人(1986)，Mol.Gen.Genet.，202，179)。另外，可能經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染將FPIC基因靶向載體導(dǎo)入植物細胞中(Deshayes等人，(1985)，EMBO J.，4，2731)。在成功地將FPIC基因靶向載體導(dǎo)入植物細胞的過程中，位點特異性同源重組可根據(jù)FPIC基因靶向載體的構(gòu)建和組成形式突變細胞內(nèi)源基因組DNA序列。
在本發(fā)明中所述的細胞分離策略包括通過使用FACStar PlusTM細胞分選儀來進行細胞分選，以及人工分離技術(shù)，但本發(fā)明不限于這種儀器或其他分離技術(shù)(圖1)。其他的細胞分選儀器也可用來有效的分離表達特異DNA序列或反之其他獨特DNA序列的表達的細胞。這些包括但不限于FACS Vantage SE I，和FACS Vantage SE 11或能夠基于本發(fā)明中所描述的方法進行分選細胞的任何儀器。
在某些情況下，在細胞內(nèi)檢測特異核苷酸序列存在與否的策略設(shè)計使用分子信標(biāo)。分子信標(biāo)(molecular beacon)是可在體外和/或體內(nèi)與特異核苷酸序列結(jié)合的核酸或肽核酸結(jié)合物。分子信標(biāo)與靶核苷酸序列的結(jié)合經(jīng)?？梢鹛禺惒ㄩL光的發(fā)射，這依賴于分子信標(biāo)的設(shè)計(Tyagi等人，(1996)，Nature Biotechnol.，14，303；Tyagi等人，(1998)，Nature Biotechnol.，16，49；Vet等人，(1999)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96，6394；Kostrikis等人，(1998)，Science，279，1228)。分子信標(biāo)典型地包括一條對兩個互補的臂序列中內(nèi)含的靶核苷酸特異的寡核苷酸序列。其他類型的分子信標(biāo)包括經(jīng)常為了添加的穩(wěn)定性與蛋白或氨基酸序列結(jié)合的序列。熒光基團如EDANS與5’磷酸基團結(jié)合，淬滅劑如DABCYL與3’羥基基團結(jié)合。不同的熒光基團和DABCYL對其的淬滅效率的實例列在表V。在分子信標(biāo)序列與靶序列結(jié)合的過程中，淬滅劑和熒光基團是分離的，因此可使熒光具有特異的波長。熒光可有效的在體外或體內(nèi)鑒定特異靶核苷酸序列的存在與否?？梢允褂门c分子信標(biāo)探針結(jié)合的染料如與SybGreenTM標(biāo)記物結(jié)合的染料。
表V.分子信標(biāo)中DABCYL對不同熒光基團的淬滅作用
分子信標(biāo)技術(shù)可用于在活細胞中鑒定特異的核苷酸序列。電穿孔，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(lipofection)和磷酸鈣沉淀法已經(jīng)成功地用于將分子信標(biāo)導(dǎo)入活細胞內(nèi)(Matsuo，(1998)，Biochim.Biophys.Acta，1379，178；Sazani等人，(2001)，Nucleic Acids Res.，29，3965；Doyle等人，(2001)，40，53；Dirks等人，(2001)，Histochem.Cell BioL，115，3)。FPIC基因靶向策略可以使用所有這些方法或其中之一，成功地將分子信標(biāo)探針導(dǎo)入細胞中以鑒定在這些細胞中存在的特異核苷酸序列。
FPIC基因靶向載體用于FPIC基因靶向法，用來篩選含有第二條DNA序列的轉(zhuǎn)化靶細胞。這樣的篩選步驟實質(zhì)上可富集那些已發(fā)生同源重組的轉(zhuǎn)化靶細胞。如在此所使用的，“實質(zhì)上的富集作用”是指相比于同源轉(zhuǎn)化體與非同源轉(zhuǎn)化體中的比例，至少富集兩倍的轉(zhuǎn)化靶細胞，優(yōu)選10倍的富集，更優(yōu)選的1000倍的富集，最優(yōu)選的10,000倍富集，也就是轉(zhuǎn)化靶細胞與轉(zhuǎn)化細胞的比例。在一些情況下，同源重組與隨機整合相比的頻率是大約1000中出現(xiàn)1次，在某些情況下，低于10,000個轉(zhuǎn)化細胞中出現(xiàn)1次。通過FPIC基因靶向載體和本發(fā)明的方法獲得的實質(zhì)上的富集作用經(jīng)常可產(chǎn)生一些細胞群，其中大約1％，更優(yōu)選大約20％，最優(yōu)選大約95％的收獲細胞群含有轉(zhuǎn)化的靶細胞，其中在轉(zhuǎn)化的靶細胞中FPIC基因靶向載體已經(jīng)被同源整合。這種實質(zhì)上富集的轉(zhuǎn)化靶細胞群然后被用于隨后的基因操作，細胞培養(yǎng)實驗或產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物體，如轉(zhuǎn)基因動物或植物。
下面理論上的實施例作為實施例而被展示，并不能解釋為對本發(fā)明范圍的一種限制。
實施例1采用FPIC基因靶向載體在胚胎干細胞中滅活ptch2位點1.ptch2靶向載體的構(gòu)建ptch2是一個跨膜功能區(qū)受體，據(jù)推測在胚胎發(fā)育和出生后的過程中參與刺猬的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控(Motoyama等人，(1998)，Nat.Genet.，18，104；Carpenter等人，PNAS，95，13630，每一篇在此都合并作為參考文獻)。ptch2靶向載體可從λ噬菌體小鼠基因組DNA文庫中，采用噬菌體克隆而構(gòu)建，所述的噬菌體含有橫跨外顯子5至11的基因組序列，這個區(qū)域包含ptch2受體的跨膜區(qū)2至8(圖4)。簡言之，理論上1.7kb的同源區(qū)3’區(qū)域，在此是指第一條DNA序列，可從ptch2噬菌體克隆中分離的基因組DNA通過PCR擴增，并側(cè)向于Kpn1和Not1位點。該片段可被亞克隆進pPOLYLINKER質(zhì)粒，該質(zhì)粒此后稱為pPolylinkerl.7。理論上同源區(qū)的5’區(qū)域含有外顯子5，6以及外顯子7的大多數(shù)5’區(qū)域，在此稱為第三條DNA序列，可用限制性酶BamHl和Ncol從基因組克隆中去除，用Klenow片段DNA聚合酶填平，并將平端亞克隆進pPolylinkerl.7的Hpa1位點，以產(chǎn)生這里稱為pPolylinkerl.7upper的質(zhì)粒。編碼抗生素抗性標(biāo)記物新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的DNA片段，在磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子的控制下，在此是指第二條DNA序列，隨后被插入同源區(qū)5’和3’區(qū)域之間，以取代跨膜功能區(qū)2、3和4的編碼區(qū)，從而使受體滅活，并產(chǎn)生被稱為P2的質(zhì)粒。在巨細胞病毒(CMV)啟動子控制下，編碼轉(zhuǎn)錄的但無功能序列的DNA片段，在此是指第四條DNA序列，可被亞克隆進同源區(qū)5’區(qū)域上游，因此產(chǎn)生在此稱為P2TV的載體。
2.用ptch2靶向載體轉(zhuǎn)化胚胎干細胞存在于靶向載體的3’末端和同源區(qū)3’端下游的Not1位點可用來在胚胎干細胞(ES)進行細胞轉(zhuǎn)化前進行線性化。100μg P2TVG載體被線性化，苯酚/氯仿提取，乙醇沉淀，并在胚胎干細胞轉(zhuǎn)化前重懸在無菌蒸餾水中，濃度為1μg/μl。干細胞在明膠包被的10cm培養(yǎng)板，于M15培養(yǎng)基中在37℃，5％CO2增殖至大約50％融合，所述的培養(yǎng)基在Dulbecco′s最小限制性培養(yǎng)基(DMEM)中含有15％FCS，0.1mM非必需氨基酸，1mM丙酮酸鈉，10-4Mβ-巰基乙醇，2mM L-谷氨酰胺，50μg/ml青霉素，50μg/ml鏈霉素，1000U/ml LIF。細胞在無血清DMEM中沖洗，并以每個10cm培養(yǎng)板的胚胎干細胞，用8μg線性化載體采用LipofectamineTM試劑通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染技術(shù)根據(jù)生產(chǎn)廠商的說明書(Invitrogen Corp.；Carlsbad CA)轉(zhuǎn)化細胞。在轉(zhuǎn)染后24至48小時，細胞或者被收獲在FACStar PlusTM細胞分選儀中分離，或是如下所述進行抗生素選擇。細胞的收獲包括在無菌蒸餾磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中沖洗兩次，然后用1ml 0.05％胰蛋白酶/EDTA，在每個10cm培養(yǎng)板中胰蛋白酶消化15分鐘。去除剩余的胰蛋白酶，細胞重新懸浮在細胞分選緩沖液中，緩沖液PBS中含有1mM EDTA，25mM HEPES，pH7.0和1％透析的FCS，細胞密度為10×106細胞/毫升。在分選之前細胞在5％CO2中保持在冰上。
3.導(dǎo)入細胞內(nèi)分子信標(biāo)a)用P2TVG轉(zhuǎn)染的胚胎干細胞置于200μg/ml遺傳霉素(geneticin)(G418)中進行選擇，篩選已經(jīng)被穩(wěn)定地摻入陽性可選擇標(biāo)記物新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的細胞。細胞被選擇12天，陽離子脂質(zhì)轉(zhuǎn)染，磷酸鈣，自由攝取或電穿孔步驟被用于實現(xiàn)分子信標(biāo)探針的導(dǎo)入，該探針在第四條DNA序列中包含的結(jié)構(gòu)性啟動子的控制下可特異性地與轉(zhuǎn)錄的無功能序列雜交。分子信標(biāo)探針與這些轉(zhuǎn)錄的無功能序列的雜交可發(fā)出特異波長的熒光發(fā)射光，它是用來檢測的特異分子信標(biāo)的獨特特性。
b)可選擇地，分子信標(biāo)探針可在轉(zhuǎn)染后48小時被導(dǎo)入細胞中，隨后收獲胚胎干細胞用FACS細胞分選儀進行分離。
4.分離ptch2靶向和非靶向的胚胎干細胞如上所述收獲胚胎干細胞，并在FACS細胞分選儀中進行大容量分選，分離由于與含有分子信標(biāo)探針的第四條DNA序列轉(zhuǎn)錄物特異雜交而發(fā)出熒光的細胞。不包括熒光細胞的已分選細胞群和未分選細胞被鋪板，隨后分離DNA并測定基因型。這些細胞的增殖在200μg/ml遺傳霉素(G418)的選擇條件下進行，篩選已經(jīng)穩(wěn)定地摻入了陽性可選擇標(biāo)記物新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的細胞。
5.通過位點特異性同源重組對ptch2突變進行基因型確認基因組DNA可從分選的胚胎干細胞群和/或未分選的陰性對照細胞中通過下面的方法分離。細胞在10cm培養(yǎng)板中生長至大約80％融合，在培養(yǎng)板中直接加入1ml含有100mM氯化鈉，50mM Tris-HCl，pH7.5，10mM EDTA和0.5％十二烷基硫酸鈉(SDS)的裂解緩沖液。細胞在室溫下孵育15分鐘，轉(zhuǎn)移至1.5ml Eppendorf管中，并在55℃輕輕振搖孵育過夜。裂解物用等容積的1∶1苯酚/氯仿提取兩次，用氯仿提取一次。用等容積的異丙醇沉淀基因組DNA。在15000xg離心后，基因組DNA沉淀物重懸浮在300μl無菌蒸餾水中。
每個樣品中的基因組DNA可以通過PCR進行基因定型，采用對PGK啟動子序列特異的寡核苷酸引物和對正在同源區(qū)3’端下游的序列特異的寡核苷酸引物(圖4)。20pmole每種寡核苷酸與100ng基因組DNA在終濃度為200μM的每種dNTP，2.5mM MgCl2，IX PCR緩沖液和1U Taq DNA聚合酶(Invitrogen Corp.)存在下混合在一起。通過使用下列的循環(huán)參數(shù)進行擴增94.0℃ 2分鐘，然后進行35個循環(huán)的96℃30秒，58℃ 30秒和72℃ 2.5分鐘。反應(yīng)產(chǎn)物和1kb的梯度分子量標(biāo)準(zhǔn)品一起在0.8％瓊脂糖凝膠上進行電泳，凝膠用溴化乙錠染色以進行PCR產(chǎn)物的紫外線檢測。檢測到1.7kb PCR產(chǎn)物表明通過實施FPIC基因靶向技術(shù)獲得了正確的基因靶向。
實施例2采用FPIC基因靶向載體滅活胚胎干細胞中的paraxis位點1.paraxis靶向載體的構(gòu)建paraxis是一個堿性的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋轉(zhuǎn)錄因子，涉及控制哺乳動物胚胎發(fā)育過程中的體節(jié)形成(Burgess等人，(1995)，168，296；Burgess等人，(1996)，Nature，384，570；Barnes等人，(1997)，Devel.Biol.，189，95，每一篇在此合并為參考文獻)。陽性-陰性選擇paraxis靶向載體的構(gòu)建以前已經(jīng)有所描述(Burgess等人，見前，1996)。這個載體可被修飾，成功地和有效地實施FPIC靶向技術(shù)。
paraxis基因組組成形式包括被一個5kb內(nèi)含子分隔的兩個外顯子(圖5)。第一個外顯子含有起始蛋氨酸密碼子和可進行DNA結(jié)合和二聚化的堿性螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(bHLH)功能區(qū)。第一個外顯子可選擇被刪除以去除通過bHLH功能區(qū)而包含起始蛋氨酸的序列，因此可滅活paraxis蛋白產(chǎn)物。3.0kb的同源區(qū)5’區(qū)域，在此是指第一條DNA序列，可用于paraxis位點5’末端的同源重組。2.0kb的同源區(qū)3’區(qū)域，在此是指第三條DNA序列，可用于paraxis位點3’末端的同源重組。在PGK啟動子控制下的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，在此是指第二條DNA序列，用于取代外顯子1的大部分，以及內(nèi)含子1的5’區(qū)域(圖5)。FPIC基因靶向載體的第四條DNA序列表現(xiàn)為CMV啟動子，它可驅(qū)動與分子信標(biāo)探針特異雜交的無功能序列的轉(zhuǎn)錄。含有這些序列的載體在所述的順序中是指PTV-1。
2.用paraxis靶向載體轉(zhuǎn)化胚胎干細胞胚胎干細胞生長至大約50％融合，用4μg線性化的PTV-1轉(zhuǎn)染。如上所述根據(jù)生產(chǎn)廠商的說明書(Invitrogen Corp.)經(jīng)脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法完成轉(zhuǎn)染。
3.導(dǎo)入細胞內(nèi)分子信標(biāo)a)用PTV-1轉(zhuǎn)染的胚胎干細胞置于200μg/ml遺傳霉素(G418)的選擇條件下，篩選已穩(wěn)定摻入陽性可選擇標(biāo)記物新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的細胞。細胞被選擇12天，陽離子脂質(zhì)轉(zhuǎn)染，磷酸鈣沉淀，電穿孔或自由攝取的步驟被用于實現(xiàn)分子信標(biāo)探針的導(dǎo)入，該探針在第四條DNA序列中包含的結(jié)構(gòu)性活性啟動子的控制下可特異性地與轉(zhuǎn)錄的無功能序列雜交。分子信標(biāo)探針與這些轉(zhuǎn)錄的無功能序列的雜交可發(fā)出特異波長的熒光發(fā)射光，它是用來檢測的特異分子信標(biāo)的獨特特性。
b)可選擇地，分子信標(biāo)探針在轉(zhuǎn)染后48小時被導(dǎo)入細胞內(nèi)，然后收獲胚胎干細胞經(jīng)FACS細胞分選儀進行分離。
4.從未靶向的胚胎干細胞中分離靶向的paraxis收獲細胞，如上所述進行或不進行抗生素選擇，并在FACS細胞分選儀中進行大容量分選，從不發(fā)生熒光的細胞中分離發(fā)熒光者。分選的無熒光細胞群被以10×106細胞/10cm培養(yǎng)板的密度鋪板，然后增殖至80％融合以分離DNA和基因定型。這些細胞的增殖在200μg/ml遺傳霉素(G418)的選擇條件下進行，篩選已經(jīng)穩(wěn)定地摻入了陽性可選擇標(biāo)記物新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的細胞。
5.通過位點特異性同源重組對paraxis突變進行基因型確認基因組DNA從分選的胚胎干細胞群或未分選的陰性對照細胞如上所述被分離。這些樣品中的基因組DNA，隨后通過PCR使用寡核苷酸引物進行基因定型，所述的引物對neo編碼序列3’端的牛生長激素多腺苷酸化信號和正在同源區(qū)3’端下游的序列特異的寡核苷酸是特異的(圖5)。反應(yīng)體積和條件如上所述，除此之外，引物退火溫度為55℃。反應(yīng)產(chǎn)物與1kb梯度分子量標(biāo)準(zhǔn)品一起在0.8％瓊脂糖凝膠上進行電泳，凝膠用溴化乙錠染色以進行PCR產(chǎn)物的紫外線檢測。使用來自樣品細胞群的DNA檢測到的被分選可使細胞發(fā)熒光的1.5kb PCR產(chǎn)物顯示有位點特異性同源重組和成功的基因靶向作用。
盡管本發(fā)明就以上的實例進行了描述，但可以理解的是各種修飾和變化包含在本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)。相應(yīng)地，本發(fā)明僅通過下面的權(quán)利要求被限制。
權(quán)利要求
1.一種獲得轉(zhuǎn)化細胞的方法，該細胞已經(jīng)使用FPIC基因靶向載體進行了位點特異性同源重組，該方法包括a)在適合載體轉(zhuǎn)化細胞的條件下，將細胞與設(shè)計用來進行位點特異同源重組的FPIC基因靶向載體接觸，其中所述的載體包括第一條DNA序列，與細胞內(nèi)源基因組序列實質(zhì)上同源，并能夠在所述細胞中進行同源重組，第二條DNA序列，與細胞內(nèi)源基因組序列實質(zhì)上不同源，不能在所述細胞中進行同源重組，所述的第二條DNA序列進一步含有核苷酸序列，能夠用于鑒定含所述核苷酸序列的細胞，第三條DNA序列，與細胞內(nèi)源基因組序列實質(zhì)上同源，并能夠在所述細胞中進行同源重組，第四條DNA序列，與細胞內(nèi)源基因組序列實質(zhì)上不同源，不能在所述細胞中進行同源重組，所述的第四條DNA序列進一步含有核苷酸序列，能夠從不含有所述核苷酸序列的細胞中鑒定和分離出含有所述核苷酸序列的細胞；b)在選擇存在代表所述第二條DNA序列的轉(zhuǎn)錄序列和缺少代表第四條DNA序列的轉(zhuǎn)錄序列的條件下增殖細胞，從而選擇或富集用所述FPIC基因靶向載體轉(zhuǎn)化的細胞；和c)從含有所述第四條DNA的細胞中分離含有所述第二條DNA序列的細胞，從而獲得已經(jīng)使用FPIC基因靶向載體接受位點特異同源重組的轉(zhuǎn)化細胞。
2.權(quán)利要求1的方法，進一步包括對所述轉(zhuǎn)化細胞的基因組DNA進行定性，該細胞攜帶有編碼陽性可選擇標(biāo)記物的第二條DNA序列，但不攜帶編碼轉(zhuǎn)錄的選擇特征的第四條DNA序列，該特征是可修飾細胞靶DNA的位點特異同源重組事件所具有的。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述的FPIC基因靶向載體包含陽性可選擇標(biāo)記物，可以通過在抗生素的存在下孵育所述細胞，或通過熒光發(fā)射光檢測到。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述的FPIC基因靶向載體包含陰性可選擇標(biāo)記物，可以通過在抗生素的存在下孵育所述細胞檢測到。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述的FPIC基因靶向載體包含陰性可選擇標(biāo)記物，可以不采用抗生素或藥物而檢測到。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述的細胞是能夠同源重組的。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述的細胞是多細胞生物體的細胞。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述的細胞是植物細胞。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述的細胞已經(jīng)接受了多次位點特異性同源重組，以多次修飾內(nèi)源細胞基因組。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述的轉(zhuǎn)化細胞被用于產(chǎn)生多細胞的生物體。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述的細胞是胚胎干細胞。
12.一種用于在可接受同源重組的細胞中進行位點特異同源重組的分離的細胞內(nèi)熒光探針(FPIC)基因靶向載體，該載體包括第一條DNA序列，與細胞內(nèi)源基因組序列實質(zhì)上同源，并能夠在所述細胞中進行同源重組，第二條DNA序列，與細胞內(nèi)源基因組序列實質(zhì)上不同源，不能在所述細胞中進行同源重組，所述的第二條DNA序列進一步含有核苷酸序列，能夠用于鑒定含所述核苷酸序列的細胞，第三條DNA序列，與細胞內(nèi)源基因組序列實質(zhì)上同源，并能夠在所述細胞中進行同源重組，第四條DNA序列，與細胞內(nèi)源基因組序列實質(zhì)上不同源，不能在所述細胞中進行同源重組，所述的第四條DNA序列進一步含有核苷酸序列，能夠從不含有所述核苷酸序列的細胞中鑒定和分離出含有所述核苷酸序列的細胞，所述的FPIC基因靶向載體按5’至3’的方向，包含與細胞內(nèi)源基因組DNA序列實質(zhì)上同源的第一條DNA序列，第二條DNA序列，與細胞內(nèi)源基因組DNA序列實質(zhì)上同源的第三條DNA序列，和第四條DNA序列；和其中所述的載體能進行位點特異性同源重組，導(dǎo)致細胞內(nèi)源靶基因組DNA序列的修飾。
13.權(quán)利要求12的FPIC基因靶向載體，其中所述的細胞內(nèi)源基因組靶DNA包含外顯子和內(nèi)含子。
14.權(quán)利要求13的FPIC基因靶向載體，其中所述的載體含有所述外顯子和內(nèi)含子的全部或部分，它們與細胞靶基因組DNA序列實質(zhì)上是同源的。
15.權(quán)利要求12的FPIC基因靶向載體，其中所述的載體含有全部或部分的調(diào)控元件，它們與細胞靶基因組DNA序列實質(zhì)上是同源的。
16.權(quán)利要求12的FPIC基因靶向載體，其中所述的載體含有與細胞靶基因組DNA序列實質(zhì)上同源的序列改變，所述的改變包括刪除、取代、添加、點突變或其組合。
17.權(quán)利要求12的FPIC基因靶向載體，其中所述的第二條DNA序列編碼所述細胞中轉(zhuǎn)錄的無功能選擇特征，并與細胞內(nèi)源基因組序列不同源，因此不能進行位點特異性同源重組。
18.權(quán)利要求12的FPIC基因靶向載體，其中所述的第四條DNA序列編碼所述細胞中轉(zhuǎn)錄的無功能選擇特征，與細胞內(nèi)源基因組序列不同源，因此不能進行位點特異性同源重組。
19.權(quán)利要求12的FPIC基因靶向載體，其中所述的第四條DNA序列包含編碼熒光蛋白的核苷酸序列。
20.權(quán)利要求19的FPIC基因靶向載體，其中所述的熒光蛋白是GFP，CFP，YFP，RFP，dsRED，或HcRED。
21.權(quán)利要求12的FPIC基因靶向載體，其中所述的第二條DNA序列包含編碼抗生素抗性標(biāo)記物的核苷酸序列。
22.權(quán)利要求21的FPIC基因靶向載體，其中所述的抗生素抗性標(biāo)記物是新霉素、嘌呤霉素、殺稻瘟素、博來霉素、梅衣靈或潮霉素。
23.權(quán)利要求12的FPIC基因靶向載體，其中所述的第二條DNA序列包含編碼熒光蛋白的核苷酸序列。
24.權(quán)利要求23的FPIC基因靶向載體，其中所述的熒光蛋白是GFP，CFP，YFP，RFP，dsRED，或HcRED。
25.權(quán)利要求12的FPIC基因靶向載體，其中所述的第四條DNA序列包含編碼陰性選擇劑的核苷酸序列。
26.權(quán)利要求25的FPIC基因靶向載體，其中所述的陰性選擇試劑是胸苷激酶或白喉毒素A鏈。
27.權(quán)利要求12的FPIC基因靶向載體，其中所述的載體進一步包含第五條DNA序列，它與細胞內(nèi)源基因組DNA序列不同源，并位于所述第一條和第三條DNA序列的外側(cè)和5’端。
28.權(quán)利要求12的FPIC基因靶向載體，其中每一條所述的第四條和第五條DNA序列均編碼可選擇的轉(zhuǎn)錄序列，它可從不含編碼所述可選擇轉(zhuǎn)錄序列的DNA的細胞中分離含有編碼所述可選擇轉(zhuǎn)錄序列的DNA的細胞。
29.權(quán)利要求12的FPIC基因靶向載體，其中所述的第一條DNA序列和所述的第三條DNA序列的實質(zhì)上同源的序列，每一條大約為50個堿基對至50,000個堿基對。
30.權(quán)利要求12的FPIC基因靶向載體轉(zhuǎn)化的細胞。
31.權(quán)利要求30的細胞，其中所述的載體引起至少一個細胞內(nèi)源基因組靶DNA序列的修飾。
32.權(quán)利要求31的細胞，其中所述的載體將至少一個外源調(diào)控元件導(dǎo)入細胞內(nèi)源基因組靶DNA序列中。
33.權(quán)利要求30的細胞，是胚胎干細胞。
34.一種轉(zhuǎn)基因非人動物，是從權(quán)利要求31所述的細胞產(chǎn)生的。
35.一種富集細胞群，包括權(quán)利要求1所述方法產(chǎn)生的細胞，其中所述的細胞已經(jīng)經(jīng)受了位點特異性同源重組。
35.一種非人轉(zhuǎn)基因動物，從權(quán)利要求35的細胞產(chǎn)生。
37.一種轉(zhuǎn)基因植物，從權(quán)利要求35的細胞產(chǎn)生。
全文摘要
提供了在真核細胞內(nèi)特異地改變特定遺傳位點的方法和載體。一種方法是使用細胞內(nèi)熒光探針(FPIC)基因靶向DNA載體來建立和鑒定細胞，其中的載體序列已經(jīng)通過位點特異性同源重組作用被整合進宿主細胞基因組中。該方法也使用鑒定細胞的體內(nèi)可檢測標(biāo)記物的編碼序列，該細胞含有經(jīng)位點特異性同源重組作用或非同源重組作用或插入作用而被整合進宿主細胞基因組中的外源載體序列。另外，提供了采用FPIC載體修飾的細胞和由該細胞產(chǎn)生的生物體。
文檔編號C12N5/10GK1500141SQ02807496
公開日2004年5月26日 申請日期2002年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月4日
發(fā)明者R·M·小伯吉斯, H·H·治, R M 小伯吉斯, 治 申請人:基因組生物科學(xué)有限公司