專利名稱：一種從動物肝臟中提取過氧化氫酶的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種提取過氧化氫酶的方法，特別是涉及一種從動物肝臟中提取過氧化氫酶的方法。
1892年Jacobson發(fā)現(xiàn)在動植物組織中有專一分解過氧化氫的酶存在，該酶被稱為過氧化氫酶，其作用如下。過氧化氫酶廣泛存在于動植物組織和微生物中，其特性也隨來源不同而有很大差別。過氧化氫酶主要用于橡膠成型、塑料及多泡性粘合劑，紡織品的漂白和染色，食品的殺菌和保鮮等。
生產過氧化氫酶的方法主要有兩類用微生物發(fā)酵來生產和從動植物組織中提取。目前，在國外，以前有從動物肝臟中制取過氧化氫酶的報道，見US2992167，GB740299，昭63-63384。但這些方法工藝復雜，或需用有機溶劑。現(xiàn)在一般都是采用微生物發(fā)酵的方法來生產過氧化氫酶。該方法的優(yōu)點是過氧化氫酶易于被分離純化，可以通過突變和選育微生物來得到適用pH和熱穩(wěn)定性更好的過氧化氫酶；缺點是生產工藝復雜，對生產條件要求高和嚴格。在國內，有廠家用有機溶劑抽提、沉淀和結晶的方法從牛肝臟中生產固體過氧化氫酶產品，見化工產品手冊—生物化工產品，化學工業(yè)出版社，1999年1月，第3版。但是，該方法的生產成本高，產品使用不方便，不適用于工業(yè)。目前，在國內還未見用動物肝臟來生產過氧化氫酶液體酶制劑的報道，而且，也未見用微生物發(fā)酵方法來生產液體過氧化氫酶產品的報道。
本發(fā)明的目的就是提供一種生產工藝簡單、對生產條件要求低、生產成本低的從動物肝臟中提取過氧化氫酶的方法。
本方法的步驟如下1、抽提將新鮮動物肝臟剪去白色組織并切成小塊后絞碎或勻漿。加入3-5倍重量的水，攪勻，調節(jié)pH5.0-5.3，低溫(4-8℃)抽提24小時；或者在加有0.1-0.2％的苯甲酸鈉或山梨酸鉀的情況下，室溫抽提8-24小時。過濾或離心除去沉淀。
2、鹽析加入硫酸銨至飽和度達45％，充分攪拌溶解。低溫(4-8℃)放置12小時；或者在鹽析液中含有0.1-0.2％苯甲酸鈉或山梨酸鉀的情況下，室溫放置2-12小時。G4磨砂漏斗抽濾，收集沉淀。
3、熱變性將沉淀溶于pH5.3，0.2％苯甲酸鈉或山梨酸鉀，5-10％硫酸銨溶液中，50℃保溫36小時，過濾或離心除去沉淀后得到清的濾液。
4、向以上濾液中按1/100000(重量比)加入有機硅或聚醚類消泡劑而得到過氧化氫酶液體酶制劑產品。
以下實驗數(shù)據(jù)的原料是豬肝臟。采用萃取化學公司法測定過氧化氫酶的活性，具體測定方法見文獻Bruno Stellmach著，錢嘉淵譯，酶的測定方法，中國輕工業(yè)出版社，1992年2月，第1版。
經(jīng)試驗表明，本發(fā)明制得的過氧化氫酶產品呈淺褐黃色的清的液體，無異味，置50℃下6小時內不渾濁，40℃以下可長期保存。
綜上所述，本發(fā)明所述的從動物肝臟中提取過氧化氫酶的方法具有生產工藝簡單、生產成本低、對生產條件要求低等優(yōu)點。
下面結合具體實施例來進一步闡述本發(fā)明所述及的制備方法實施例11、將5000g新鮮豬肝臟剪去白色組織并切成小塊后，加1000ml冷水勻漿，再加14000ml冷水，攪勻。用10％HAc調節(jié)pH5.1，低溫(6℃)攪拌抽提24小時。4000轉/分鐘離心15分鐘后除去沉淀，得12600ml上清液，酶濃度＝19600u/ml，總活力＝2.47×108u。
2、上清液中加入硫酸銨使飽和度達45％，充分攪拌使硫酸銨完全溶解，低溫(6℃)放置12小時后用G4磨砂漏斗抽濾，收集沉淀。
3、將沉淀溶于7600ml pH5.3，0.2％山梨酸鉀，9.5％硫酸銨溶液中，所得溶液的酶濃度＝29737u/ml，總活力＝2.26×108u，酶的收率＝91.5％。
4、將以上溶液置50℃保溫36小時后，冷至室溫，過濾后得到7250ml濾液。取200ml濾液，加入7.25ml 100倍稀釋的有機硅消泡劑，混勻后加入剩余的濾液中，攪勻而成產品。所得產品的酶濃度＝27310u/ml，總活力＝1.98×108u，酶的產率＝80.2％。
實施例21、將5000g新鮮豬肝臟剪去白色組織并切成小塊后，加入1000ml冷水勻漿，再加14000ml含有40g山梨酸鉀的水攪勻，用10％HAc調pH5.1，室溫(13℃)攪拌抽提24小時。4000轉/分鐘離心1 5分鐘后除去沉淀，得12000ml上清液，酶濃度＝20800u/ml，總活力＝2.50×108u。
2、上清液中加入硫酸銨使飽和度達45％，充分攪拌使硫酸銨安全溶解，室溫(13℃)放置12小時后用G4磨砂漏斗抽濾，收集沉淀。
3、將沉淀溶于7600ml pH5.3，0.2％山梨酸鉀，9.5％硫酸銨溶液中，所得溶液的酶濃度＝30789u/ml，總活力＝2.34×108u，酶的收率＝93.6％。
4、將以上溶液置50℃保溫36小時后，冷至室溫，過濾后得到7280ml濾液。取200ml濾液，加入7.28ml 100倍稀釋的有機硅消泡劑，混勻后加入剩余的濾液中，攪勻而成產品。所得產品的酶濃渡＝28571u/ml，總活力＝2.08×108u，酶的產率＝83.2％。
權利要求
一、一種從動物肝臟中提取過氧化氫酶的方法，步驟如下1、抽提將新鮮動物肝臟剪去白色組織并切成小塊后絞碎或勻漿，加入3-5倍重量的水，攪勻，調節(jié)pH5.0-5.3，低溫4-8℃抽提24小時，或者在加有0.1-0.2％苯甲酸鈉或山梨酸鉀的情況下，室溫抽提8-24小時，過濾或離心除去沉淀；2、鹽析加入硫酸銨至飽和度達45％，充分攪拌溶解，低溫4-8℃放置12小時，或者在鹽析液中含有0.1-0.2％苯甲酸鈉或山梨酸鉀的情況下，室溫放置2-12小時，G4磨砂漏斗抽濾，收集沉淀；3、熱變性將沉淀溶于pH5.3，0.2％苯甲酸鈉或山梨酸鉀，5-10％硫酸銨或氯化鈉或檸檬酸鈉溶液中，50℃保溫36小時，過濾或離心除去沉淀后得到清的濾液。4、向以上濾液中按1/100000(重量比)加入有機硅或聚醚類消泡劑而得到過氧化氫酶液體酶制劑產品。
二、如權利要求一所述的一種從動物肝臟中提取過氧化氫酶的方法，其特征在于所述的動物肝臟可以來自豬、牛、羊等動物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從動物肝臟中提取過氧化氫酶的方法，本方法包括如下步驟將動物肝臟絞碎后抽提，除去沉淀后用硫酸銨鹽析得到沉淀；然后將沉淀溶于含防腐劑的硫酸銨溶液中，再熱變性除去雜蛋白；最后加入消泡劑而得到外觀和熱穩(wěn)定性均好的過氧化氫酶產品。本發(fā)明具有操作簡單、成本低和對生產條件要求低的優(yōu)點。
文檔編號C12N9/68GK1436846SQ0211079
公開日2003年8月20日 申請日期2002年2月6日 優(yōu)先權日2002年2月6日
發(fā)明者汪成富, 阮中中 申請人:汪成富, 阮中中