一種制備酶傳感器的過氧化氫的檢測方法
【專利摘要】一種制備酶傳感器的過氧化氫的檢測方法，該方法利用辣根過氧化物酶對過氧化氫的高催化性能，甲苯胺藍(lán)-石墨烯復(fù)合物對電極催化過氧化氫的信號放大作用，石墨烯的優(yōu)良的導(dǎo)電性和大比表面積等特性，將辣根過氧化物酶修飾電極作為工作電極，參比電極為Ag/AgCl電極，輔助電極為鉑電極，組成三電極體系，實(shí)現(xiàn)對過氧化氫的高靈敏檢測；所述方法通過電聚合把酶負(fù)載在有機(jī)染料非共價功能化的石墨烯表面制備酶傳感器。本發(fā)明通過電聚合把酶負(fù)載在有機(jī)染料非共價功能化的石墨烯表面制備酶傳感器，由于功能化的石墨烯具有良好的電化學(xué)性能，將其引入到酶傳感器中顯著地提高了酶傳感器的性能。本發(fā)明適用于酶傳感器測定過氧化氫。
【專利說明】一種制備酶傳感器的過氧化氫的檢測方法
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明涉及一種制備酶傳感器的過氧化氫的檢測方法，尤其是涉及一種基于石墨烯-有機(jī)染料-辣根過氧化物酶電聚合制備酶傳感器的過氧化物的檢測方法，本發(fā)明屬于生物傳感和電分析化學(xué)檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。
[0002]【背景技術(shù)】
石墨烯是由碳原子按六邊形晶格整齊排布而成的二維碳質(zhì)新材料，具有大的比表面積、高的導(dǎo)電性、較好的機(jī)械穩(wěn)定性和良好的生物相容性等特性，使其在電化學(xué)生物傳感領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用。但是由于石墨烯的片層之間的強(qiáng)烈的作用使其在溶液中的分散性受到嚴(yán)重影響，很容易發(fā)生聚集沉淀，限制了其在電化學(xué)生物傳感器中的應(yīng)用，因此有必要對石墨烯進(jìn)行共價功能化或非共價功能化對其改性以實(shí)現(xiàn)石墨烯在溶液中的分散。共價功能化會破壞石墨烯原有的結(jié)構(gòu)特征，使其本征性能受到不同程度的影響。而非共價功能化能較好的保持石墨烯的固有性能，因此近年來受到了廣泛關(guān)注。
[0003]硫堇、甲苯胺藍(lán)和亞甲基藍(lán)等可作為氧化還原電子介體的有機(jī)染料分子非共價修飾石墨稀，一方面可以促進(jìn)石墨稀在溶液中的分散，另一方面將石墨稀大的比表面積、聞的導(dǎo)電性、好的生物相容性和電子介體優(yōu)良的電催化性能和快速的電子傳遞性能結(jié)合起來可以研制高靈敏度的電化學(xué)傳感器。
[0004]在電化學(xué)生物傳感器中，酶傳感器是最具代表性的，具有選擇性好、響應(yīng)速度快和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。酶的固定化技術(shù)是酶傳感器制備的核心部分，多種方法如吸附、共價交聯(lián)、溶膠-凝膠、層層組裝和電聚合等方法已被用于酶的固定化。電聚合具有方法簡單和膜抗干擾性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)在酶傳感器領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。吡咯、苯胺、有機(jī)染料硫堇和甲苯胺藍(lán)已被用于酶傳感器中電聚合固定化酶。
[0005]迄今，有機(jī)染料分子電子介體非共價功能化石墨烯用于酶生物傳感器的研究未見報道，本發(fā)明在有機(jī)染料電子介體非共價功能化的石墨烯修飾基礎(chǔ)電極上通過電聚合有機(jī)染料固定化辣根過氧化物酶構(gòu)建過氧化氫生物傳感器。該方法在石墨烯表面負(fù)載有機(jī)染料電子介體和辣根過氧化物酶，一方面石墨烯的高導(dǎo)電性有利于電子的快速有效傳遞從而提高酶電極的靈敏度；另一方面大表面積的石墨烯可以負(fù)載電子介體和HRP的量較大，這有利于進(jìn)一步提聞酶電極的靈敏度。
[0006]
【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明的目的是，針對目前檢測過氧化氫的酶電極方法的靈敏度較低，提供一種基于石墨烯-有機(jī)染料-辣根過氧化物酶的電聚合制備酶傳感器的檢測過氧化氫的方法；在有機(jī)染料非共價功能化石墨烯的電極表面，通過電聚合方法固定化辣根過氧化物酶制備了生物傳感器用于過氧化氫的檢測，建立一種新的基于辣根過氧化物酶的電化學(xué)方法檢測過氧化氫的方法。
[0007]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是，本發(fā)明方法利用辣根過氧化物酶對過氧化氫的高催化性能，甲苯胺藍(lán)-石墨烯復(fù)合物對電極催化過氧化氫的信號放大作用，石墨烯的優(yōu)良的導(dǎo)電性和大比表面積等特性，將辣根過氧化物酶修飾電極作為工作電極，參比電極為Ag/AgCl電極，輔助電極為鉬電極，組成三電極體系，實(shí)現(xiàn)對過氧化氫的高靈敏檢測；本發(fā)明通過電聚合把酶負(fù)載在有機(jī)染料非共價功能化的石墨烯表面制備酶傳感器。
[0008]本發(fā)明提出一種制備酶傳感器的過氧化氫的檢測方法，所述方法步驟如下:
Cl)以石墨粉為原材料，通過Hummers氧化法制得氧化石墨烯，通過肼還原，制得石墨烯。
[0009](2)將0.5~2.0 mmol/L的石墨烯與0.2~1.0 mmol/L的有機(jī)染料(甲苯胺藍(lán)，硫堇，耐爾藍(lán))混合，超聲10~24 h，制得石墨烯-有機(jī)染料復(fù)合物，離心后用水洗滌，將石墨烯-有機(jī)染料復(fù)合物用水透析12~24 h，除去未反應(yīng)的有機(jī)染料。
[0010](3)取5~20μ I的石墨烯-有機(jī)染料復(fù)合物均勻的滴加在干凈的玻碳電極表面，室溫下自然晾干，用去離子水沖洗干凈，得到石墨烯-有機(jī)染料修飾電極。
[0011](3)將石墨烯-有機(jī)染料修飾電極置于含有0.2~1.0 mmol/L的有機(jī)染料和1.0~4.0 mg/mL的辣根過氧化物酶的溶液中，于-0.7~0.8 V循環(huán)伏安法掃描5~50圈，掃描速率50~200 mV/s，得到電聚合有機(jī)染料/辣根過氧化物酶/石墨烯_有機(jī)染料修飾電極，該酶修飾電極即為目標(biāo)酶傳感器。
[0012]本發(fā)明酶傳感器測定過氧化氫的線性范圍為5.0Χ10-7~1.4X1(T5 mol/L，靈敏度為0.0392 A.L/moL.利用同一根玻碳電極制備五次，測定其對過氧化氫的響應(yīng)電流，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%，利用同一根修飾電極對H2O2十次測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.4%，說明該電極具有良好的重現(xiàn)性。該傳感器置于4 °C的環(huán)境中考察其穩(wěn)定性，四周后，仍保留響應(yīng)電流值的85%以上，表明該電極具有良好的穩(wěn)定性。
[0013]本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明通過電聚合把酶負(fù)載在有機(jī)染料非共價功能化的石墨烯表面制備酶傳感器，由于功能化的石墨烯具有良好的電化學(xué)性能，將其引入到酶傳感器中顯著地提高了酶傳感器的性能。
[0014]本發(fā)明適用于酶傳感器測定過氧化氫。
[0015]【專利附圖】

【附圖說明】
圖1為本發(fā)明中酶傳感器在0.2 mol/L PBS (pH 7.0)的循環(huán)伏安圖，(a)未加過氧化氫，(b)加入1.0 Mmol/L的過氧化氫；
圖2為不同修飾電極對連續(xù)滴加0.50Mmol/L的過氧化氫的計時電流曲線，Ca)電聚合甲苯胺藍(lán)修飾電極，(b)電聚合甲苯胺藍(lán)/石墨烯-甲苯胺藍(lán)修飾電極，(c)電聚合甲苯胺藍(lán)/辣根過氧化物酶/石墨烯修飾電極，(d)電聚合甲苯胺藍(lán)/辣根過氧化物酶/石墨烯-甲苯胺藍(lán)修飾電極；
圖3為酶傳感器對過氧化氫的計時電流曲線；
圖4為酶傳感器的響應(yīng)電流對過氧化氫濃度的校準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，以下實(shí)施例有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0017]實(shí)施例1
基于石墨烯-有機(jī)染料-辣根過氧化物酶電聚合制備傳感器。
[0018] (I)以石墨粉為原材料，通過Hmnmers氧化法制得氧化石墨烯，通過肼還原，制得石墨烯。
[0019](2)將1.5 mmol/L的石墨烯與1.0 mmol/L的有機(jī)染料耐爾藍(lán)混合，超聲10 h,制得石墨烯-耐爾藍(lán)復(fù)合物，離心后用水洗滌，將石墨烯-耐爾藍(lán)復(fù)合物用水透析24 h，除去未反應(yīng)的耐爾藍(lán)。
[0020](3)取10 μ I的石墨烯-耐爾藍(lán)復(fù)合物均勻的滴加在干凈的玻碳電極表面，室溫下自然晾干，用去離子水沖洗干凈，得到石墨烯-耐爾藍(lán)修飾電極。
[0021](4)將石墨烯-耐爾藍(lán)修飾電極置于含有1.0 mmol/L的耐爾藍(lán)和2.0 mg/mL的辣根過氧化物酶的溶液中，于-0.7?0.8 V循環(huán)伏安法掃描5圈，掃描速率50 mV/s，得到電聚合耐爾藍(lán)/辣根過氧化物酶/石墨烯-耐爾藍(lán)修飾電極，該酶修飾電極即為目標(biāo)酶傳感器。
[0022]實(shí)施例2
基于石墨烯-有機(jī)染料-辣根過氧化物酶電聚合制備傳感器。
[0023](I)以石墨粉為原材料，通過Hmnmers氧化法制得氧化石墨烯，通過肼還原，制得
石墨烯。
[0024](2)將1.5 mmol/L的石墨烯與1.0 mmol/L的有機(jī)染料甲苯胺藍(lán)混合,超聲10 h,制得石墨烯-甲苯胺藍(lán)復(fù)合物，離心后用水洗滌，將石墨烯甲苯胺藍(lán)復(fù)合物用水透析24 h，除去未反應(yīng)的甲苯胺藍(lán)。
[0025](3)取10 μ I的石墨烯-甲苯胺藍(lán)復(fù)合物均勻的滴加在干凈的玻碳電極表面，室溫下自然晾干，用去離子水沖洗干凈，得到石墨烯-甲苯胺藍(lán)修飾電極。
[0026](4)將石墨烯-甲苯胺藍(lán)修飾電極置于含有1.0 mmol/L的甲苯胺藍(lán)和2.0 mg/mL的辣根過氧化物酶的溶液中，于-0.7?0.8 V循環(huán)伏安法掃描5圈，掃描速率50 mV/s，得到電聚合甲苯胺藍(lán)/辣根過氧化物酶/石墨烯-甲苯胺藍(lán)修飾電極，該酶修飾電極即為目標(biāo)酶傳感器。
[0027]實(shí)施例3
基于石墨烯-有機(jī)染料-辣根過氧化物酶電聚合制備傳感器。
[0028](I)以石墨粉為原材料，通過Hmnmers氧化法制得氧化石墨烯，通過肼還原，制得石墨烯。
[0029](2)將1.0 mmol/L的石墨烯與0.5 mmol/L的有機(jī)染料甲苯胺藍(lán)混合,超聲12 h,制得石墨烯-甲苯胺藍(lán)復(fù)合物，離心后用水洗滌，將石墨烯甲苯胺藍(lán)復(fù)合物用水透析24 h，除去未反應(yīng)的甲苯胺藍(lán)。
[0030](3)取5μ I的石墨烯-甲苯胺藍(lán)復(fù)合物均勻的滴加在干凈的玻碳電極表面，室溫下自然晾干，用去離子水沖洗干凈，得到石墨烯-甲苯胺藍(lán)修飾電極。
[0031](4)將石墨烯-甲苯胺藍(lán)修飾電極置于含有0.5 mmol/L的甲苯胺藍(lán)和3.0 mg/mL的辣根過氧化物酶的溶液中，于-0.7?0.8 V循環(huán)伏安法掃描20圈，掃描速率100 mV/s,得到電聚合甲苯胺藍(lán)/辣根過氧化物酶/石墨烯-甲苯胺藍(lán)修飾電極，該酶修飾電極即為目標(biāo)酶傳感器。
[0032]實(shí)施例4
將實(shí)施例3得到的酶傳感器用于電化學(xué)測試:
(O酶傳感器的循環(huán)伏安測試。[0033]將酶修飾電極為工作電極，參比電極為Ag/AgCl電極，輔助電極為鉬電極；底液為
0.2 mol/L PBS (pH 7.0)和加了 1.0Mmol/L的過氧化氫；掃描速度為0.1 V/s。循環(huán)伏安圖見圖1，從圖1可見，加入過氧化氫后，甲苯胺藍(lán)的還原峰的峰電流增大，氧化峰的峰電流減小，說明酶修飾電極對過氧化氫產(chǎn)生了催化還原，催化電流主要是由辣根過氧化物酶催化還原過氧化氫產(chǎn)生的。
[0034](2)不同修飾電極催化還原過氧化氫的比較。采用計時電流法，分別將電聚合甲苯胺藍(lán)修飾電極、電聚合甲苯胺藍(lán)/石墨烯-甲苯胺藍(lán)修飾電極、電聚合甲苯胺藍(lán)/辣根過氧化物酶/石墨烯修飾電極和電聚合甲苯胺藍(lán)/辣根過氧化物酶/石墨烯-甲苯胺藍(lán)修飾電極為工作電極，參比電極為Ag/AgCl電極，輔助電極為鉬電極；底液為0.2 mol/L PBS (pH7.0);測定電位為-0.30 V,在磁力攪拌下,連續(xù)加入0.50Mmol/L的過氧化氫,測定結(jié)果見圖2。從圖2可見，電聚合甲苯胺藍(lán)/辣根過氧化物酶/石墨烯-甲苯胺藍(lán)修飾電極對過氧化氫的催化效果最佳，甲苯胺藍(lán)-石墨烯復(fù)合物對電極催化過氧化氫具有信號放大作用。
[0035](3)酶傳感器對過氧化氫的計時電流測試。將酶修飾電極為工作電極，參比電極為Ag/AgCl電極，輔助電極為鉬電極；底液為0.2 mol/L PBS (pH 7.0);測定電位為-0.30V，在磁力攪拌下，連續(xù)滴加0.50Mfflol/L的過氧化氫，測定結(jié)果見圖3。測定過氧化氫的線性范圍為5X10 — 7 mol/L~3.22X 10-4 mol/L，靈敏度為0.0392 A.L/mol。該傳感器置于4°C的環(huán)境中，四周后，仍保 留響應(yīng)電流值的85%以上。
【權(quán)利要求】
1.一種制備酶傳感器的過氧化氫的檢測方法，其特征在于，所述方法利用辣根過氧化物酶對過氧化氫的高催化性能，甲苯胺藍(lán)-石墨烯復(fù)合物對電極催化過氧化氫的信號放大作用，石墨烯的優(yōu)良的導(dǎo)電性和大比表面積等特性，將辣根過氧化物酶修飾電極作為工作電極，參比電極為Ag/AgCl電極，輔助電極為鉬電極，組成三電極體系，實(shí)現(xiàn)對過氧化氫的高靈敏檢測；所述方法通過電聚合把酶負(fù)載在有機(jī)染料非共價功能化的石墨烯表面制備酶傳感器。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備酶傳感器的過氧化氫的檢測方法，其特征在于，所述方法的具體步驟為: (1)以石墨粉為原材料，通過Hummers氧化法制得氧化石墨烯，通過肼還原，制得石墨烯； (2)將0.5?2.0 mmol/L的石墨烯與0.2?1.0 mmol/L的有機(jī)染料混合，超聲10?24 h，制得石墨烯-有機(jī)染料復(fù)合物，離心后用水洗滌，將石墨烯-有機(jī)染料復(fù)合物用水透析12?24 h，除去未反應(yīng)的有機(jī)染料； (3)取5?20μI的石墨烯-有機(jī)染料復(fù)合物均勻的滴加在干凈的玻碳電極表面，室溫下自然晾干，用去離子水沖洗干凈，得到石墨烯-有機(jī)染料修飾電極； (4)將石墨烯-有機(jī)染料修飾電極置于有機(jī)染料和辣根過氧化物酶的溶液中，進(jìn)行循環(huán)伏安法掃描，得到電聚合有機(jī)染料/辣根過氧化物酶/石墨烯-有機(jī)染料修飾電極，該酶修飾電極即為目標(biāo)酶傳感器。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種制備酶傳感器的過氧化氫的檢測方法，其特征在于，所述有機(jī)染料為甲苯胺藍(lán)、硫堇或耐爾藍(lán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種制備酶傳感器的過氧化氫的檢測方法，其特征在于，所述循環(huán)伏安法掃描電壓為-0.7?0.8 V ;循環(huán)伏安法掃描5?50圈，掃描速率50?200mV/s0
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種制備酶傳感器的過氧化氫的檢測方法，其特征在于，所述有機(jī)染料溶液濃度為0.2?1.0 mmol/L ;辣根過氧化物酶的溶液濃度為1.0?4.0 mg/mLo
【文檔編號】G01N27/26GK103926282SQ201410189029
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年5月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月7日
【發(fā)明者】楊紹明, 陳愛喜, 孫清, 李瑞琴, 尚培玲 申請人:華東交通大學(xué)