專利名稱：中華蜜蜂鎮(zhèn)靜肽前體基因及其編碼的多肽和制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種新的蜂毒基因核苷酸序列。更具體地說，本發(fā)明涉及中華蜜蜂蜂毒鎮(zhèn)靜肽前體(Preprosecapin)基因的cDNA序列，該cDNA序列編碼的多肽是意大利蜜蜂Preprosecapin蛋白的同系物，該多肽經(jīng)過翻譯后加工所得到的多肽(成熟肽)是意大利蜜蜂鎮(zhèn)靜肽(Secapin)的同系物。本發(fā)明還涉及有該核苷酸序列編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用，以及所述多核苷酸和所述多肽的制備方法。
背景技術(shù)：
意大利蜜蜂(Apis mellifera)蜂毒鎮(zhèn)靜肽(Bee venomous Secapin)是意大利蜜蜂蜂毒的四個(gè)多肽之一，約占蜂毒干重的1％，由25個(gè)氨基酸組成(Eur.J.Biochem.1978，83405-410；Abstr.15 Eur.Pepetide.Symp.1978，p84)。按來源和生化性質(zhì)，它屬堿性多肽，Secapin其生物活性與溶血肽相似，具有消炎、抗菌、降壓、鎮(zhèn)靜等作用(Eur.T.Biochem.1978，83405-410)。
1984，Vlask和Kreil將意蜂蜂王毒腺cDNA插入pBR322的pst I和Cla I位點(diǎn)，用32P標(biāo)記的cDNA探針篩選出陽性克隆(PUM9/24，PBMC1)，酶切后再亞隆到PUC8，得到了蜂毒Preprosecapin基因，對該基因的測序結(jié)果進(jìn)行氨基酸序列推導(dǎo)，獲77個(gè)氨基酸殘基，其中最后25個(gè)氨基酸殘基與已知Secapin氨基酸序列一致，前32個(gè)氨基酸殘基為信號(hào)肽，中間20個(gè)氨基酸為極性肽前體，Preprosecapin基因經(jīng)過翻譯后加工，即在蜜蜂的毒囊中經(jīng)過蜜蜂體內(nèi)一種水解酶的裂解便得到了活性多肽Secapin(Eur.J.Biochem.1984，145279～242.)。Secapin與其他幾種蜂毒多肽在醫(yī)學(xué)與生物物理學(xué)上有重要的應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供一種中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin基因的多核苷酸，該多核苷酸編碼意大利蜜蜂蜂毒Preprosecapin蛋白的一個(gè)同系物，該前體蛋白經(jīng)加工后得到的活性多肽為意大利蜜蜂Secapin多肽的一個(gè)同系物。
本發(fā)明目的之二是提供一種新的意大利蜜蜂Preprosecapin蛋白的同系物，該多肽為中華蜜蜂Preprosecapin蛋白。
本發(fā)明目的還提供了這種制備中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin核苷酸探針、含中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin核苷酸的重組載體、含重組載體的宿主細(xì)胞，以及多肽抗體的方法。
在本發(fā)明，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin蛋白的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID No.5中從核苷酸1～234位的核苷酸序列有至少70％同源性，或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID No.5中從核苷酸1～234位的核苷酸雜交，較佳地，該多肽具有SEQ ID No.6所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID No.5中從核苷酸1～234位的核苷酸序列。
在本發(fā)明還提供了一種分離的中華蜜蜂蜂毒Secapin蛋白活性多肽，它包括具有SEQ ID No.6中53～77氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID No.6中53～77氨基酸序列的多肽。本發(fā)明還提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA；一種所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了一種制備具有中華蜜蜂蜂毒Secapin活性多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin基因的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID No.5核苷酸1～234位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)中華蜜蜂蜂毒Preproecapin蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有中華蜜蜂蜂毒Secapin蛋白活性的多肽。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種編碼中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin蛋白基因，該基因所編碼的Preprosecapin多肽(中華蜜蜂蜂毒鎮(zhèn)靜肽前體)經(jīng)過中華蜜蜂體內(nèi)一種水解酶的裂解便得到了活性多肽Secapin，此活性多肽是一種生物活性物質(zhì)，可應(yīng)用于醫(yī)學(xué)上的關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)性疾病、吸毒等的輔助治療，可作為抗原用于蜂毒免疫制劑的制備，可作為生物學(xué)研究的工具酶。中華蜜蜂Preprosecapin基因可為研究中華蜜蜂蜂毒免疫的分子機(jī)理，為開發(fā)利用中華蜜蜂蜂毒資源提供新的依據(jù)。
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸全長為234個(gè)核苷酸，其詳細(xì)序列見SEQ ID No.5，開放讀框位于1～234位核苷酸。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來；還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin蛋白(或多肽)的核苷酸序列，如SEQ IDNo.5中1～234位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指位于SEQ ID No.5序列的編碼框1～234位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID No.5中1～234位核苷酸序列同源性低至約70％簡并序列也能編碼出SEQ ID No.6所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳地在高度嚴(yán)緊條件下，與SEQ ID No.5中從核苷酸1～234位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與SEQ ID No.5中從核苷酸1～234位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin相同功能的蛋白的、SEQ ID No.6序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)核苷酸的缺失、插入和或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計(jì))。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測量，如用柱層折、PAGE或HPLC法測量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語“中華蜜蜂蜂毒Secapin蛋白多肽”指具有中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin蛋白活性的SEQ ID No.6序列53-77的多肽。該術(shù)語還包括具有與中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin蛋白相同功能的、SEQ ID No.6序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體，誘導(dǎo)突變體，在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)度條件下能與中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin多肽的可溶性片段。
發(fā)明還提供中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin蛋白或多肽的類似物，這些類似物與天然中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括；體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
本發(fā)明還包括中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin多肽編碼序列及其片段的反義序列，這種反義序列可用于抑制細(xì)胞內(nèi)中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin的表達(dá)。
本發(fā)明還包括一種探針分子，該分子通常具有中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin多肽編碼序列的8～100個(gè)，較佳地1～50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin核苷酸分子。
本發(fā)明還包括檢測中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合，較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對應(yīng)于中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin多肽的編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間，引物長度一般為15-50個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌，枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如Tn細(xì)胞、CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin蛋白的分子，也包括那些并不影響中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自中華蜜蜂的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備，例如，純化的中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來制備抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol，6511，1976；Kohler等人，EurJJmmunol，6292，1976；Hammerling等人，In MonoclonalAntibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin功能的抗體以及不影響中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)而獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.coli)中制備的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而獲得。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin基因的cDNA核苷酸序列是如此獲得的，以中華蜜蜂毒腺和毒囊總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用一對寡核苷酸為引物-A5’-GCTCGAGATGAAGAACTATTCAAAAAATGCA-3’為正向向引物，寡核苷酸B5’-GAAGCTTTTAAGGCACTATGACTCTACTACA-3’為反向引物，進(jìn)行PCR。對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序后得到SEQ ID No.5的全長cDNA序列。
中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin為中華蜜蜂毒腺表達(dá)的蛋白，本發(fā)明的中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin為研究中華蜜蜂蜂毒相關(guān)的分子機(jī)理提供了基礎(chǔ)。
下面結(jié)合具體實(shí)例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明范圍。
實(shí)施例1，中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin的cDNA的克隆和測定1.引物擴(kuò)增以中華蜜蜂毒腺、毒囊總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用一對寡核苷酸為引物—A5’-GCTCGAGATGAAGAACTATTCAAAAAATGCA-3’(SEQ IDNo.1)為正向引物，寡核苷酸B5’-GAAGCTTTTAAGGCACTATGACTCTACTACA-3’(SEQ ID No.2)為反向引物，進(jìn)行PCR。A/B的PCR條件為94℃ 1分鐘，隨之以94℃40秒鐘，54℃40秒鐘和72℃60秒鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘，電泳檢測得到約250bp的目的片段。
2.PCR產(chǎn)物的測序?qū)⑸鲜鯬CR擴(kuò)增產(chǎn)物A/B與pGEM-T Easy載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，用堿法提取質(zhì)粒，用BigDye terminator v2.0。測序試劑盒(Epicentre Teclnologies)對抽提的質(zhì)粒進(jìn)行測序，獲得cDNA序列，全長共234bp，詳細(xì)序列見SEQ ID No.5，其中開放讀框位于1～234位核苷酸。
根據(jù)得到的全長cDNA序列推導(dǎo)出中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin蛋白的氨基酸序列，共77個(gè)氨基酸殘基(包括25個(gè)氨基酸的成熟肽、32個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和20個(gè)氨基酸的前體肽)，其氨基酸序列詳見SEQ ID No.6。
實(shí)施例2，同源比較用本發(fā)明的中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin的全長cDNA序列及其編碼蛋白，在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫及Non-redundantGenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫中，用Blast程序進(jìn)行核酸和蛋白同源檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它與意大利蜜蜂蜂毒Preprosecapin有顯著的同源性。用Blast軟件分析可以看出，它們蛋白的同源性為85％(見附表1)。因此，可以推測本發(fā)明的中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin蛋白為意大利蜜蜂蜂毒Preprosecapin的同系物，并具有類似的功能。
1984，Vlask和Kreil將意蜂蜂王毒腺cDNA插入pBR322的pst I和Cla I位點(diǎn)，用32p標(biāo)記的cDNA探針篩選出陽性克隆(PUM9/24，PBMC1)，酶切后再亞隆到PUC8，對測序結(jié)果進(jìn)行氨基酸序列推導(dǎo)，獲得了編碼意大利蜜蜂蜂毒Preprosecapin蛋白的新基因。該cDNA所編碼的Preprosecapin成熟肽Secapin、信號(hào)肽和前原肽為77個(gè)氨基酸殘基。Secapin和另外的幾種蜂毒肽混合物，目前在醫(yī)學(xué)上應(yīng)用于心血管、支氣管、腫瘤等輔助治療的生物活性物質(zhì)，也是一類抗菌抗輻射生物活性物質(zhì)。另外Secapin和另外的幾種蜂毒肽還是一類提高人免疫功能的生物活性物質(zhì)。本發(fā)明人的中華蜜蜂Preprosecapin基因?yàn)檠芯恐腥A蜜蜂蜂毒過敏、免疫的分子機(jī)理，為開發(fā)利用中華蜜蜂蜂毒資源提供了新的依據(jù)。
實(shí)施例3，中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin成熟肽Secapin在真核細(xì)胞(Tn細(xì)胞株，即粉紋野蛾細(xì)胞株)中的表達(dá)在該實(shí)施例中，以實(shí)施例1中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5’寡核苷酸引物序列為5’-GCTCGAGATGAAGAACTATTCAAAAAATGCA-3’(SEQ ID No.1)，該引物含有Xhol I限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是起始密碼子開始的中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin編碼序列的24個(gè)核苷酸；3’端引物序列為5’-GAAGCTTTTAAGGCACTATGACTCTACTACA-3’(SEQ ID No.2)，該引物含有Hind III限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，翻譯終止子和中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin的部分編碼序列。
引物上限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)對應(yīng)于Tn細(xì)胞表達(dá)載體pBacFastHTb上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Gmr)，一個(gè)噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(Ori)、一個(gè)病毒復(fù)制起點(diǎn)(SV40)、一個(gè)T7啟動(dòng)子、一個(gè)病毒啟動(dòng)子(P-CMV)，一個(gè)SV40啟動(dòng)子、一個(gè)SV40加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA順序、一個(gè)BGH加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA順序。
用Xhol I和Hind III消化pBacFastHTa載體及插入片段，隨后用連結(jié)混合物轉(zhuǎn)化E.coli TG I菌株，在含有Ampr和Gmr的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，補(bǔ)加Ampr和Gmr的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆，抽提質(zhì)粒，測序驗(yàn)證中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin的cDNA片段已正確插入了載體。隨后用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli DH10Bac菌株，在含有Ampr、Gmr、四環(huán)素的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補(bǔ)加Ampr、Gmr、四環(huán)素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆，抽提質(zhì)粒，經(jīng)Sepharose 2B柱純化，回收質(zhì)粒-70℃保存。2B柱純化，回收質(zhì)粒-70℃保存。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Tn細(xì)胞是采用脂轉(zhuǎn)染法，用Lipofectin(GiBco Life)進(jìn)行的。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清，含重組病毒粒子的細(xì)胞上清用于下一輪感染。經(jīng)2-3周的TC-100連續(xù)傳代培養(yǎng)，收集細(xì)胞，用超聲裂解法破碎細(xì)胞，以含NaCl0.5mM、imidazola 5mM、PMSF 1mM的20mM Tris-CI(PH8.0)溶液為平衡液及洗脫液，蛋白液用經(jīng)預(yù)平衡的Ni2+Sepharose 6B柱過柱；再用含imdazola50mM、NaCl 0.5mM、PMSF 1mM的20mM Tris-CI(PH8.0)的溶液，洗去雜蛋白，專一性的吸附的6×His的融合蛋白，再用含imdazola 500mM、NaCl 0.5mM、PMSF 1mM的20mM Tris-CI(PH8.0)的溶液進(jìn)行洗脫，然后以PBS(PH7.4)為透析液對表達(dá)蛋白溶液進(jìn)行透析。最后凍干保存。
用10％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小約為2.8KDa。
此外，用常規(guī)方法對表達(dá)蛋白的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID No.6序列的53～77(成熟肽)一致。實(shí)施例4，中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin蛋白的成熟肽Secapin在大腸桿菌中的表達(dá)在該實(shí)施例中，以SEQ ID No.5中的核苷酸1～234位的核苷酸雜交PCR反應(yīng)中使用的5’寡核苷酸引物序列為5’-GGATCCTTACATTATTGATGTTCCT-3’(SEQ ID No.5)，該引物含有BamH I限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin編碼的成熟肽序列的18個(gè)核苷酸；3’端引物序列為5’-CGGGAATTAAGGCACTATGACTCT-3’(SEQ ID No.6)該引物含有EcoR I限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，翻譯終止子和中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pGEX-4T-3上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個(gè)細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(Ori)、一個(gè)IPTG可調(diào)啟動(dòng)子/操縱子(P/O)，一個(gè)凝血酶識(shí)別位點(diǎn)，一個(gè)谷光甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)融和蛋白標(biāo)記物以及限制性內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)。
用BamH I和EcoR I消化pGEX-4T-3載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pGEX-4T-3載體并保持開放讀框在凝血酶識(shí)別位點(diǎn)起始。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化商品名為JM105的E.coli菌株，JM105含有多拷貝的重組質(zhì)粒，其表達(dá)lacIq阻遏物并攜帶抗性(Ampr)，在含有Ampr的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，測序驗(yàn)證中華蜜蜂蜂毒Secapin的cDNA片段，該序列為SEQ ID No.5序列的160～234，與已正確插入了載體。
在補(bǔ)加Ampr(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的陽性轉(zhuǎn)化子克隆。過夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶10的稀釋率稀釋，然后接種到大體積LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細(xì)胞生長至600光密度(OD600)為0.6-1.0時(shí)，加IPTG(“異丙基硫代-β-D半乳糖苷”)至終濃度為1.0mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)啟動(dòng)P/O導(dǎo)致基因表達(dá)水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3-5小時(shí)，離心收集細(xì)胞沉淀，重懸于1/20體積比的PBS中，通過超聲波裂解細(xì)胞，加入TritonX-100到終濃度1％30min溶解蛋白。低溫離心粗提物(10000g)5min，上清物用谷光甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)純化單元從溶液中純化溶解的谷光甘肽-中華蜜蜂蜂毒Secapin融合蛋白，并將中華蜜蜂蜂毒Secapin從融和蛋白上切割下來。中華蜜蜂蜂毒Secapin蛋白用15％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)該蛋白的分子量大小為約2.8KDa。
此外，用常規(guī)方法對表達(dá)蛋白的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID No.6序列的53～77(成熟肽)一致。
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有中華蜜蜂蜂毒鎮(zhèn)靜肽前體蛋白的核苷酸序列；所述的核苷酸序列與SEQ ID No.5中從核苷酸1～234位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID No.5中從核苷酸1～234的核苷酸序列雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ No.6所示的序列；該序列具有SEQ ID No.5中從核苷酸1～234位的核苷酸序列。
3.一種分離的中華蜜蜂蜂毒鎮(zhèn)靜肽前體蛋白，其特征在于，它具有SEQ IDNo.6氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物，該多肽具有SEQ IDNo.6序列。
4.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
5.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它是用權(quán)利要求4所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
6.一種具有中華蜜蜂蜂毒鎮(zhèn)靜肽前體基因產(chǎn)物活性多肽的制備方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有中華蜜蜂蜂毒鎮(zhèn)靜肽前體蛋白的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成中華蜜蜂蜂毒鎮(zhèn)靜肽前體蛋白多肽表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID No.5中從核苷酸1～234位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中表達(dá)的載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成中華蜜蜂蜂毒鎮(zhèn)靜肽前體蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)中華蜜蜂蜂毒鎮(zhèn)靜肽前體基因產(chǎn)物多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有中華蜜蜂蜂毒鎮(zhèn)靜肽前體蛋白基因產(chǎn)物活性多肽鎮(zhèn)靜肽。
7.一種抗體，其特征在于，它是能與權(quán)利要求3所述的中華蜜蜂蜂毒鎮(zhèn)靜肽前體蛋白特異性結(jié)合的抗體。
8.一種探針分子，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA分子中8～100個(gè)連續(xù)核苷酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的探針分子；其特征在于是指能與中華蜜蜂蜂毒鎮(zhèn)靜肽前體基因產(chǎn)物或片斷結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合與其它不相關(guān)抗原分子的抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的探針分子，其特征在于，它具有中華蜜蜂蜂毒鎮(zhèn)靜肽前體多肽編碼序列中15～20個(gè)連續(xù)的核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種中華蜜蜂蜂毒鎮(zhèn)靜肽前體(Preprosecapin)基因序列及其編碼的多肽和該基因經(jīng)過翻譯后加工產(chǎn)物鎮(zhèn)靜肽(Secapin)的制備方法。該cDNA序列編碼的蛋白是意大利蜜蜂蜂毒Preprosecapin的一個(gè)同系物,它與SEQ ID No.5中從核苷酸1～234位的核苷酸序列有至少70%的同源性。所述序列編碼—具有SEQ ID No.6所示序列的多肽。此外,還提出了含中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin基因的載體、宿主細(xì)胞,與中華蜜蜂蜂毒Preprosecapin基因相關(guān)的抗體,具有蛋白活性中華蜜蜂蜂毒Secapin的多肽、相關(guān)抗體的制備方法。本發(fā)明為進(jìn)一步研究Secapin相關(guān)的多肽活性分子機(jī)理,開發(fā)與Secapin相關(guān)的生物醫(yī)藥、診斷試劑及生物試劑打下了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12P19/34GK1377963SQ0211074
公開日2002年11月6日 申請日期2002年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月1日
發(fā)明者張素方, 張傳溪, 施婉君, 程家安 申請人:浙江大學(xué)