專利名稱：具有t細(xì)胞抑制基因活性的肽的合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能刺激抑制基因T細(xì)胞活性的合成肽，本發(fā)明的肽尤其涉及以分子胸腺生成素為基礎(chǔ)的、在羧基末端具有酰胺取代物的四肽。
免疫調(diào)節(jié)蛋白-胸腺生成素(thymopoietin)和脾素(thysplenin)已分別由小牛和人的胸腺和脾臟分離得到。此外，短肽也已化學(xué)合成成功，并且與胸腺生成素具有等效的生物活性，而脾素經(jīng)進(jìn)一步修飾，可提供另外的結(jié)果，例如對酶具有抗性。例見美國專利4505853和共同待批美國專利申請SN196138。
關(guān)于這類蛋白質(zhì)和合成肽已發(fā)表了大量論文和專利。美國專利No.4190646公開了五肽thymopentin，它是胸腺生成素的活性部位，其氨基酸順序?yàn)锳rg-Lys-Asp-Val-Tyr，還公開了肽組合物，其中在該五肽的氨基末端和/或羧基末端上可進(jìn)行各種取代。胸腺生成素和tymopentin在CEM和MOLT-4兩種人體T細(xì)胞系中引起生物學(xué)變化，從而證明其在刺激T細(xì)胞的抑制基因活性和輔助活性中的作用。至今還尚未發(fā)現(xiàn)少于五肽(在氨基酸順序中有5個(gè)氨基酸)的thymopentin的類似物對CEM細(xì)胞具有活性。
申請人的共同待批美國專利No.53186公開了從人體脾臟中分離得到48氨基酸免疫調(diào)節(jié)蛋白脾素。被稱為SP-5的牛脾素的活性部位，其氨基酸殘基32-36具有氨基酸順序?yàn)锳rg-Lys-Glu-Val-Tyr，能刺激老鼠體內(nèi)的T細(xì)胞輔助活性，因此可以期望人脾素在人體內(nèi)也具有類似的生物活性。在上述同一專利申請文件中介紹了人脾素能引起人體T細(xì)胞系MOLT-4細(xì)胞內(nèi)cGMP的增加。在SN56186申請文件中介紹了人體氨基酸的活性部位為Arg-Lys-Ala-Val-Tyr。
與胸腺生成素不同，脾素并不能使CEM細(xì)胞生物活性發(fā)生改變。因此脾素能刺激T細(xì)胞的輔助活性，但不刺激T細(xì)胞抑制基因的活性。例見美國專利4190646，4261886，4361673，4420424和4629723。上述專利、專利申請和討論其他背景材料和生物學(xué)方法的論文均列為本發(fā)明的參考文獻(xiàn)。
1984年1月31日授予Kisfaludy等人的美國專利4428938公開了具有免疫調(diào)節(jié)功能的若干肽，其中有下列四肽Arg-Lys-Asp-ValArg-Lys-Asn-ValArg-Lys-Ala-ValArg-Lys-Asp-AlaArg-Lys-Asp-IleArg-Lys-Glu-ValGlp-Arg-Lys-Asp上述美國專利4428938所用的均是這些氨基酸順序的鹽、酰胺、低級(jí)烷基酯和被護(hù)衍生物，也都能產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用。但是這些順序中沒有一個(gè)酰胺與本申請具有相同的特異性，而且還討論了使用這些順序治療由于胸腺缺失造成的免疫失調(diào)的方法。在這件專利中，采用離體Erosette測定方法測定肽的活性。
申請人的共同待批美國專利申請SN196138公開了能夠引起MOLT-4T細(xì)胞系中生物活性的大量脾素肽類似物。與以前報(bào)告的thymopentin類似物不同，文中介紹了長度短于5個(gè)氨基酸并與脾素有關(guān)的肽都具有刺激MOLT-4細(xì)胞中T細(xì)胞輔助活性的作用以及脾素五肽類似物。其中還介紹了若干四肽，包括
Arg-Pro-Asp-ValArg-Pro-Asp-Val-NH2甲酰-Arg-Pro-Asp-Val乙酰-Arg-Pro-Asp-Val乙酰-Arg-Pro-Asp-Val-NH2乙酰-Arg-Pro-Ala-Val-NH2乙酰-Arg-Pro-D-beta-Asp-Val-NH2乙酰-Arg-Pro-Glu-Val-NH2乙酰-Arg-Pro-Glu-Val乙酰-Arg-Aib-Ala-Val-NH2乙酰-Arg-Aib-Glu-Val-NH2乙酰-Arg-Pro-Asp-Gly-NH2在MOLT-4測定中，發(fā)現(xiàn)這些肽能摸擬脾素的作用，但在CEM細(xì)胞系測定中，卻不能模擬thymopentin的活性。
在技術(shù)上仍然需要其他肽，它們可用于刺激各種T細(xì)胞缺陷癥的人體免疫系統(tǒng)的抑制基因活性和輔助活性。
本發(fā)明出乎意料地發(fā)現(xiàn)，大量含有羧基末端取代物的酰胺的四肽在對CEM細(xì)胞的環(huán)GMP測定中，具有thymopentin的T細(xì)胞抑制基因活性的特征。這個(gè)發(fā)現(xiàn)是驚人的，因?yàn)楹凶杂婶然┒嘶蛴刹煌然┒缩０坊０坊说南嗤碾牟⒉划a(chǎn)生這種T細(xì)胞抑制基因活性。例如在前面提到的美國專利4428938中已經(jīng)鑒定含有自由羧基末端的若干四肽順序并不產(chǎn)生任何T細(xì)胞抑制基因活性。然而根據(jù)本發(fā)明在羧基末端進(jìn)行一定酰胺的取代，則這些無活性的肽顯示T細(xì)胞抑制基因活性，這種活性是任何現(xiàn)有技術(shù)未予預(yù)料到的。
因此，本發(fā)明提供了下式酰胺化肽R-Arg-X-Asp-Y-NR1R2
式中R是H，低級(jí)烷基，乙?；?，甲?；图?jí)鏈烷基;
X是Pro，脫氫Pro，羥基Pro，D-Lys，Aib或Lys;
Y是Gly或選自Val，Ala，Ile，Leu，Asp，Glu，Gln或Lys的D或L氨基酸;
R1是H;
R2是具有1-10個(gè)碳原子的低級(jí)烷基或鏈烯基，具有4-8個(gè)碳原子的環(huán)烷基或鏈烯基，芳基或NHR3(其中R3是具有1-10個(gè)碳原子的低級(jí)烷基，具有4-8個(gè)碳原子的環(huán)烷基或鏈烯基，或芳基);或R1和R2一起構(gòu)成4-7個(gè)碳原子的亞甲基鏈。
這些酰胺化肽和含有這些肽的組合物具有人thymopentin對CEM細(xì)胞的生物活性。因此可以推論出這些肽在人體內(nèi)產(chǎn)生類似體內(nèi)生物活性。大量這種肽的特征在于增加對消化道和血清中肽鏈內(nèi)切酶和肽鏈外切酶和類似胰蛋白酶攻擊的抗性。因此，這些肽在治療免疫缺陷方面具有顯著的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明還包括含有這些肽的治療用組合物以及這些肽在需要治療免疫調(diào)節(jié)的各種病癥時(shí)的使用方法。
本發(fā)明的其他方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面予以詳細(xì)說明。


圖1表示CEM和cGMP測定，給出肽濃度(ug/ml)對cGMP量(微微克/毫升)曲線圖，并且將thymopentin(TP-5)和本發(fā)明肽與對照進(jìn)行對比。
本發(fā)明令人驚奇地提供了具有T細(xì)胞抑制基因活性并以式R-Arg-X-Asp-Y-NR1R2表示的化合物(其中R，X，Y，R1和R2的含義同上)。
為方便起見，本文中的肽的氨基酸組分及其制備所用的某些材料均用簡略符號(hào)表示，極大多數(shù)的氨基酸3字母符號(hào)都是眾所周知的，已知少數(shù)簡略符號(hào)，如Glp表示焦谷氨?；?即p-Glu)，Aib表示氨基異丁酸。除了另有說明外，所有氨基酸均為L異構(gòu)型，如果需要D異構(gòu)型，則會(huì)予以說明。
本發(fā)明的某些優(yōu)擇肽是式中第二個(gè)氨基酸為Pro或Aib的那些肽。含有第二個(gè)氨基酸X為Pro或Aib的羧基末端酰胺的四肽可以期望具有對由消化酶和血清酶引起降解的抗性的增加。這類優(yōu)擇肽包括Arg-Pro-Asp-Val-異丙酰胺Arg-Pro-Asp-Val-甲酰胺乙酰-Arg-Pro-Asp-Val-甲酰胺甲酰-Arg-Pro-Asp-Val-甲酰胺本發(fā)明其他優(yōu)擇肽包括Arg-Lys-Asp-Val-苯胺酰胺Arg-Lys-Asp-Val-甲酰胺Arg-Lys-Asp-Val-2-苯酰肼Arg-Lys-Asp-Val-哌啶酰胺Arg-Lys-Asp-Val-環(huán)己基酰胺Arg-Lys-Asp-Val-異丙酰胺令人驚奇而又未曾預(yù)料的取代四肽的活性提供了新的非顯而易見的化合物，與現(xiàn)有技術(shù)相比更是如此。盡管本發(fā)明的四肽順序以前已被揭示，例如美國專利4428938中的Arg-Lys-Asp-Val順序，但本發(fā)明令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，在這些順序的羧基末端進(jìn)行有選擇的酰胺化就可提供具有T細(xì)胞抑制基因活性的化合物。此外，申請人還發(fā)現(xiàn)，上述若干肽還令人驚奇而又難以解釋地顯示出其類似于T細(xì)胞抑制基因活性和輔助活性。如上所述，這些肽包括Arg-Pro-Asp-Val-異丙酰胺，甲?；?Arg-Pro-Asp-Val-甲酰胺和Arg-Lys-Asp-Val-異丙酰胺。
因此，本發(fā)明還提供了用作藥物的新的化合物。具體酰胺的選擇必須能產(chǎn)生上述四肽順序的活性化合物，它們在現(xiàn)有技術(shù)中既沒有提出過，而且本發(fā)明有選擇地酰胺化是由若干具有自由羧基末端的無生物活性的四肽中產(chǎn)生具有生物活性的化合物。此外，上述四肽順序在其羧基末端進(jìn)行酰胺化時(shí)，并不全都顯示其類似于thymopentin的這種T細(xì)胞抑制基因生物活性。分析測定時(shí)，大量現(xiàn)有技術(shù)中的四肽在酰胺化時(shí)并不能顯示這種T細(xì)胞抑制基因活性。本發(fā)明化合物采用一般方法并不能預(yù)測這類順序的酰胺顯示其作用于免疫系統(tǒng)或刺激T細(xì)胞輔助活性的能力。例如下列肽并不顯示thymopentin的T細(xì)胞抑制基因的刺激活性，但是它們與Kisfaludy的美國專利4428938或申請人的共同待批專利SN196138中所述的肽順序是相同或相似的。所述的這些肽為Arg-Pro-Asp-Val-嗎啉代酰胺Arg-Lys-Asp-Val-二甲基酰胺Arg-Lys-Asp-Val-2-萘酰胺乙?；?Arg-Pro-Giu-Val-乙酰胺。
本發(fā)明的肽一般可采用下述已知方法制備。為方便起見，合成本發(fā)明的肽可采用固相合成法或常規(guī)溶液合成法。例如，Merrifield在J.A.C.S.(85∶2149-2154，1963)中所介紹的固相合成法頗易掌握，而且是制備肽的一般方法。固相合成法包括逐步將被護(hù)氨基酸加到生長的肽鏈上，這種肽鏈?zhǔn)峭ㄟ^共價(jià)鍵與固體樹脂顆粒結(jié)合。采用這種方法，通過過濾去除試劑和副產(chǎn)物，因此可省略純化中間產(chǎn)物的步驟。這種方法的基本原理是將鏈上的第一個(gè)氨基酸通過共價(jià)鍵連接到固體聚合物上。然后每次一個(gè)或分段逐步將被護(hù)氨基酸加上去，直至形成所需的順序。最后，移去固體樹脂載體上的被護(hù)肽，切去保護(hù)基團(tuán)。
氨基酸可以連接到用作樹脂的任何適合的聚合物上。樹脂必須含有通過共價(jià)鍵能與第一被護(hù)氨基酸牢固連接的官能團(tuán)。各種聚合物都適用于該目的，例如纖維素、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸甲酯、N-烷基芐胺、N-烷基二苯甲胺和聚苯乙烯樹脂?？捎糜谶@類合成的適合的保護(hù)基團(tuán)包括叔丁氧羰基(BOC)、芐基(Bzl)、叔戊氧羰基(AOC)、甲苯磺?；?Tos)、O-溴-苯甲氧羰基(BrZ)和苯甲氧羰基(Z或CBZ)。其他的保護(hù)基團(tuán)在前文和J.F.W.McOmie的“ProtectiveGroupsinOrganicChemistry”一書(PlenumPress，NewYork，1973)中均已有介紹，這些書刊也系本申請的參考文獻(xiàn)。
制備本發(fā)明肽的一般方法包括先將被護(hù)羧基末端氨基酸連接到樹脂上，連接后樹脂進(jìn)行過濾、洗滌和除去羧基末端氨基酸的α-氨基上的保護(hù)基團(tuán)(適合的基團(tuán)為BOC)。這些保護(hù)基團(tuán)必須去除，當(dāng)然無需打開氨基酸與樹脂之間的鍵。然后將倒數(shù)第二個(gè)羧基末端被護(hù)氨基酸偶合到生成的樹脂肽上，這種偶合可采用第2氨基酸的自由羧基與樹脂連接的第1氨基酸的氨基之間形成酰胺鍵的方法完成。該順序可用相鄰氨基酸重復(fù)進(jìn)行，直到所有氨基酸都連接到樹脂上。
最后，通過本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的適宜常規(guī)技術(shù)，從樹脂上切下被護(hù)肽，例如采用環(huán)己基酰胺進(jìn)行氨基分解和除去保護(hù)基團(tuán)，以顯示所需的肽。將肽與樹脂分離和除去保護(hù)基團(tuán)所采用的切割方法決定于樹脂和保護(hù)基團(tuán)的選擇，這類方法在肽合成專業(yè)領(lǐng)域中均是眾所周知的。
肽合成的其他方法在由Bodanszky等著的“PeptideSynthesis”(secondedition，JohnWileyandsons，1976)一書中也作了介紹，例如本發(fā)明的肽也可通過常規(guī)的溶液肽合成方法合成，包括采用酰胺鍵形成的化學(xué)方法或酶方法，逐步或分段將氨基酸或肽片段進(jìn)行偶合。這些溶液合成法在本領(lǐng)域中也是眾所周知的。
業(yè)已發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明肽的生物活性與上述美國專利、專利申請和論文中所公開的人thymopentin相似。這種生物活性最初是通過與人thymopentin對比，測定其使人T細(xì)胞系CEM中產(chǎn)生環(huán)GMP得到證實(shí)的。在該測定中，由本發(fā)明的肽使之產(chǎn)生cGMP，證明能使肽在該細(xì)胞上與人thymopentin受體部位相結(jié)合，并且產(chǎn)生類似于人thymopentin的生物活性。
本發(fā)明的許多肽還具有其他顯著的優(yōu)點(diǎn)，其特征在于對由消化道酶或血清酶引起的酶降解的抗性。因此，將其注入到生物體內(nèi)時(shí)，能在體內(nèi)延長半壽期。其中許多肽的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是能夠口服。
由于本發(fā)明肽的免疫調(diào)節(jié)特征，它們可用于治療人和動(dòng)物的疾病，因?yàn)樗鼈兙哂姓T導(dǎo)T細(xì)胞分化和成熟的能力，這種T細(xì)胞能在生物體內(nèi)給予免應(yīng)答。因此，其結(jié)果是本發(fā)明的肽具有多種治療用途。
本發(fā)明的肽可用于提高生物體的集體免疫，它們在體內(nèi)將增加或參與治療性刺激細(xì)胞免疫。本發(fā)明的肽或含有這類肽的藥物組合物通?？捎糜诩?xì)胞免疫有問題的，特別是有免疫缺陷的任何部位，因此可用于治療包括變態(tài)反應(yīng)和自身免疫反應(yīng)等種種疾病。
因此，凡是由于T細(xì)胞不平衡引起產(chǎn)生抗體或細(xì)胞免疫過度，本發(fā)明的肽通過刺激抑制基因T細(xì)胞作用，可調(diào)整這種病癥。所以它們可用于治療某些引起破壞抗體的自身免疫疾病，例如全身性紅斑狼瘡和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。
作為最廣泛的應(yīng)用，本發(fā)明的肽或含有該肽的藥物組合物可用于調(diào)節(jié)需要調(diào)節(jié)的人或動(dòng)物的免疫系統(tǒng)。本文所述“調(diào)節(jié)”意指本發(fā)明化合物可使免疫系統(tǒng)由不正常的病態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檎５钠胶鈶B(tài)。盡管這種調(diào)節(jié)可以在校正免疫缺陷(例如狄喬治綜合癥)方面獲得廣泛的應(yīng)用，而且還可應(yīng)用于校正過量免疫活性(例如自身免疫癥)的種種病癥。
因此，本發(fā)明包括調(diào)節(jié)需要這種調(diào)節(jié)的人或動(dòng)物免疫系統(tǒng)的方法，包括為了實(shí)施這些方法，將至少一種肽及其藥物組合物的免疫調(diào)節(jié)有效量施用于人或動(dòng)物。
本發(fā)明還提供了由人或動(dòng)物免疫系統(tǒng)相對或絕對缺陷，尤其是T細(xì)胞抑制基因功能引起的各種病癥的治療方法，包括將至少一種本發(fā)明肽的有效治療量施用于人或動(dòng)物。
本文所述的“有效治療量”意指可有效地治療上述各種病癥的用量。本發(fā)明還提供了誘導(dǎo)T細(xì)胞分化和成熟的方法，包括將至少一種本發(fā)明的肽的有效誘導(dǎo)量施用于人或動(dòng)物。
本發(fā)明還提供了實(shí)施上述方法的藥物組合物。為了制備本發(fā)明的藥物組合物，可按常規(guī)藥物配制方法，將作為活性成分的本發(fā)明的肽與藥物載體充分混合。這種載體可根據(jù)用藥所需的制劑形式采用各種不同的載體，例如適用于口服、舌下、直腸、鼻腔或非經(jīng)腸道等各種載體。
在制備優(yōu)先用于口服劑量形式的組合物時(shí)，任何常用的藥物介質(zhì)均可使用。水、油、醇、調(diào)味劑、防腐劑和著色劑等介質(zhì)均可用于口服液體制劑(例如懸浮制劑、劑和溶液制劑)。載體中例如淀粉、糖、稀釋劑、制粒劑、潤滑劑、粘結(jié)劑和制粉劑等都可用于制備口服固體制劑(例如粉末、膠囊劑和片劑)。還可采用控釋制劑形式。片劑和膠囊劑最適于用作口服劑量單位，因?yàn)樗鼈兪褂梅奖?，其中固體藥物載體顯然也可使用。如果需要，片劑可按常規(guī)方法包糖衣或腸衣。
用于非經(jīng)腸道的制劑中，載體通常包括無菌水，其他成份例如有助于溶解或防腐的載體也可包含在內(nèi)。還可制備注射用懸浮制劑，在這種情況下，適宜的液體載體和懸浮劑等都可使用。
以大約1ug/kg(體重)的量，優(yōu)擇大約0.001-10ug/kg(體重)的量用藥時(shí)，本發(fā)明的肽一般都有藥效作用，當(dāng)然較低劑量也可使用。一般說來，相同的劑量范圍都可用于上述必須治療的免疫缺陷的各種病癥。較大劑量(例如大約10-100mg/kg(體重)通常用于抑制免疫活性過度。
以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但并非對本發(fā)明進(jìn)行特殊的限制。實(shí)施例和說明書全文中的組分單位均以重量計(jì)，除非另有說明。
實(shí)施例中采用下列簡略符號(hào)的含義為TFA三氟乙酸;
HOAc乙酸;
CH2Cl2二氯甲烷;
CH3CN乙腈;
DMF二甲基甲酰胺;
NH4OAc醋酸銨;
n-BuOH正丁醇;
pyr吡啶;
DCC二環(huán)己基碳二亞胺;
HOBt1-羥基-苯并三唑;
DMAP二甲氨基吡啶;
TCA三氯乙酸;
MeOH甲醇;
TLC薄板層析;
THF四氫呋喃;
EtOAc乙酸乙酯;
NaHCO3碳酸氫鈉;
MgSO4硫酸鎂;
NMMN-甲基嗎啉;
Et2O二乙醚;
HPLC高性能液相色譜;
Pd/C鈀-碳;
DIEA二異丙基乙胺;
iBuOCOCl氯甲酸異丁酯;
i-Pr2O二異丙醚;
ONp對硝基苯酯;
RPMI組織培養(yǎng)基;
PBS磷酸鹽緩沖鹽水。
實(shí)施例1Arg-Pro-Asp-Val-異丙酰胺的合成將2.25g BOC-Pro-(Bzl)Asp-Val溶于40ml CH2Cl2，溶液置于冰浴中冷卻，加入0.67g HOBt和0.90g DCC的DMF(4ml)溶液。攪拌10分鐘后，再加入0.30g異丙酰胺的CH2Cl2(5ml)溶液?；旌衔镌诒≈袛嚢?5分鐘，加溫至室溫。3小時(shí)后過濾沉淀物，用10%檸檬酸溶液、水和飽和NaHCO3溶液提取沉淀物。有機(jī)層經(jīng)MgSO4干燥后，減壓除去溶劑。得到2.32g灰白色固體產(chǎn)物。經(jīng)EtOAc-i-Pr2O結(jié)晶，得到1.64g產(chǎn)物。m.p.179.5-181.5℃。
將50ml的40%TFA的CH2Cl2溶液加入0.84g上述產(chǎn)物，溶液攪拌30分鐘，減壓去除溶劑。再將醚加到殘留固體Pro-(Bzl)Asp-Val-異丙酰胺三氟乙酸鹽中。
將0.93g Boc-精氨酸溶于10ml DMF中，溶液冷卻至-20℃，先后加入0.18ml NMM和0.22g iBuOCOCl?；旌衔镌?15℃下攪拌20分鐘，然后加入0.18ml NMM和上述三氟乙酸鹽的DMF(10ml)冷卻溶液。30分鐘后移去冷卻浴，繼續(xù)攪拌2小時(shí)，減壓除去大部分溶劑。將EtOAc和水加到殘?jiān)校簩臃珠_后，有機(jī)層用檸檬酸提取并用飽和NaHCO3溶液提取兩次。除去溶劑后，得到1.44g無色玻璃狀物。該產(chǎn)物經(jīng)硅膠60快速層析純化，用98∶2CH2Cl2∶MeOH洗脫。先洗脫的組分是所需產(chǎn)物，得到0.53g純產(chǎn)物，還得到含有少量雜質(zhì)的另一部分為0.32g。
0.53g純化過的被護(hù)四肽酰胺用1ml甲酸的MeOH(20ml)和鈀黑氫化，一小時(shí)后混合物經(jīng)硅藻土過濾并用水洗滌，減壓除去MeOH。殘留物用水稀釋后凍干，得到280mg產(chǎn)物，經(jīng)SP-Sephadex層析純化，用0.30M NH4OAc(pH5)洗脫，合并含有主峰中心的部分，凍干得到190mg非晶形固體的Arg-Pro-Asp-Val-異丙酰胺。
氨基酸分析Asp，1.01;Pro，1.03;Val，0.97;Arg，1.00;96%肽。
薄板層析(硅膠60)Rf(Ⅰ)＝0.44(n-BuOH∶HOAc∶H2O∶Pyr/15∶3∶12∶10)Rf(Ⅱ)＝0.65(EtOAc∶pyr∶HOAc∶H2O/5∶5∶1∶3)Rf(Ⅲ)＝0.16(n-BuOH∶HOAc∶H2O/3∶1∶1)實(shí)施例2Arg-Lys-Asp-Val-環(huán)己基酰胺的合成將HOBt(0.27g)加入BOC-(Bzl)Asp-Val-ONp(1.09g，2.00mmol)和環(huán)己胺(0.27ml，1.2當(dāng)量)的THF(10ml)溶液，生成的黃色溶液攪拌24小時(shí)后減壓蒸發(fā)。殘留油用EtOAc稀釋，再用飽和NaHCO3、H2O、10%檸檬酸和飽和鹽水洗滌。有機(jī)相經(jīng)MgSO4干燥、過濾和蒸發(fā)，得到被護(hù)二肽酰胺。
將該被護(hù)二肽(0.71g，1.4mmol)加入經(jīng)過攪拌的4.2MHCl的二噁烷(10ml)溶液，60分鐘后減壓蒸發(fā)反應(yīng)物，得到無色固體的二肽鹽酸鹽。
將NMM(0.18ml)加到經(jīng)過攪拌的二肽鹽酸鹽、(CBZ)3Arg-(CBZ)-Lys-ONp(1.34g，1.4mmol)和HOBt(0.19g，1.0當(dāng)量)的DMF(10ml)溶液中，16小時(shí)后生成膠凝狀沉淀物。反應(yīng)混合物用NaHCO3飽和溶液驟冷、過濾和用水、10%檸檬酸、水及Et2O洗滌。經(jīng)4%HOAc/EtOAc重結(jié)晶后，得到無色固體(CBZ)3Arg-(CBZ)-Lys-(Bzl)-Asp-Val-環(huán)己酰胺1.36g，73%。
在HF/苯甲醚(30ml/8ml)中于0℃下，將四肽(1.33g)進(jìn)行60分鐘的去保護(hù)，殘留物在Et2O中驟冷后過濾。再將收集到的固體溶于10%HOAc，凍干后得到Arg-Lys-Asp-Val-環(huán)己酰胺460mg。
肽經(jīng)HPLC純化M-20 10/50 ODS-3柱，10.0ml/分鐘流速，10%CH3CN，0.01M(pH5)NH4OAc。將150mg三次注射到3ml緩沖液中，并收集35.0-51.6分鐘間的洗脫部分，減壓部分蒸發(fā)后，凍干得到410mg無色固體四肽酰胺Arg-Lys-Asp-Val-環(huán)己酰胺。
氨基酸分析Arg，1.00;Lys，1.00;Asp，1.00;Val，0.85。
薄板層析(250μ硅膠G)Rf(Ⅰ)＝0.39(n-BuOH∶HOAc∶H2O∶EtOAc/1∶1∶1∶1)Rf(Ⅱ)＝0.61(n-BuOH∶HOAc∶H2O∶Pyr/15∶3∶12∶10)Rf(Ⅲ)＝0.90(EtOAc∶HOAc∶H2O∶Pyr/5∶1∶3∶5)實(shí)施例3Arg-Lys-Asp-Val-哌啶酰胺的合成將HOBt(0.68g，1.0當(dāng)量)加入經(jīng)過攪拌的BOC-(Bzl)-Asp-Val-ONp(2.72g，5.00mmol)和哌啶(0.6ml，1.2當(dāng)量)的THF(10ml)溶液中，48小時(shí)后減壓蒸發(fā)黃色溶液。將油狀殘留物溶于EtOAc中，分別用NaHCO3飽和溶液和冷卻的2M NaOH各洗滌1次，再用水洗2次，用10%檸檬酸和飽和鹽水洗滌1次。有機(jī)相經(jīng)MgSO4干燥，得到2.36g無色油BOC-(Bzl)-Asp-Val-哌啶酰胺。
用MeOH/CH2Cl2快速層析純化后，得到無色固體被護(hù)二肽酰胺1.65g，67%。
將被護(hù)二肽酰胺(1.06g，2.17mmol)加到4.2M的HCl-二噁烷(10ml)中，1小時(shí)后減壓蒸發(fā)溶液，再將其溶于CH2Cl2，經(jīng)再蒸發(fā)后得到無色油狀鹽酸鹽。
將NMM(0.29ml)加到經(jīng)過攪拌的(CBZ)3Arg-(CBZ)-Lys-ONp(2.08g，2.17mmol)、上述無色油和HOBt(0.29g)的DMF(10ml)溶液中、1小時(shí)后開始生成沉淀物。16小時(shí)后用水驟冷反應(yīng)混合物，產(chǎn)物用EtOAc提取，再用NaHCO3飽和溶液、H2O、10%檸檬酸、H2O和Et2O洗滌。經(jīng)HOAc/EtOAc/Et2O重結(jié)晶后，得到無色固體(CBZ)3Arg-(CBZ)-Lys-(Bzl)-Asp-Val-哌啶酰胺2.40g，91%。
將被護(hù)四肽(1.87g，1.55mmol)與經(jīng)N2清洗過的10%HOAc(100ml)混合，加入10%Pd/C(0.8g)?；旌衔镌谂翣枤浠?500ml容器，43.5psi)上攪拌，48小時(shí)后反應(yīng)混合物經(jīng)0.45尼龍濾器過濾、部分蒸發(fā)、水稀釋和凍干，得到890mg無色固體四肽粗制品。
用HPLC純化肽Whatman M-20 10/50 ODS-3柱，10.0ml/min流速，10%CH2CN，0.01M，pH5，NH4OAc。用300mg三次注射到3ml緩沖液中收集23.0-44.0分鐘間的洗脫部分。減壓部分蒸發(fā)和凍干后，得到510mg所需無色固體的四肽酰胺Arg-Lys-Asp-Val-哌啶酰胺。
氨基酸分析Arg，0.95;Lys，1.00;Asp，1.02;Val，1.00;肽含量54.2。
薄板層析(250μ，硅膠G)Rf(Ⅰ)＝0.31(n-BuOH∶HOAc∶H2O∶EtOAc/1∶1∶1∶1)Rf(Ⅱ)＝0.53(n＝BuOH∶HOAc∶H2O∶Pyr/15∶3∶12∶10)Rf(Ⅲ)＝0.61(EtOAc∶HOAc∶H2O∶Pyr/5∶1∶3∶5)實(shí)施例4Arg-Pro-Asp-Val-N-甲酰胺的合成將DCC(10.32g，50.0mmol)加到經(jīng)過攪拌的BOC-Val(10.86g，50.0mmol)和DIEA(8.70ml，1.0當(dāng)量)、甲胺·HCl(3.38g，1.0當(dāng)量)和HOBt(7.66g，1.0當(dāng)量)于12∶5CH2Cl2∶DMF(85ml)的溶液中，生成沉淀物。2小時(shí)后，過濾反應(yīng)物，將過濾物蒸發(fā)至干。油狀殘留物溶于EtOAc，用NaHCO3飽和溶液、H2O、10%檸檬酸和飽和鹽水洗滌3次。經(jīng)Na2SO4干燥后，過濾和蒸發(fā)有機(jī)相，得到無色固體。置于熱己烷中研制，得到所需酰胺BOC-Val-甲酰胺7.98g，69%，m.p.120-122℃。
將50%TFA/CH2Cl2(20ml)加到上述酰胺(4.60g，20.0mmol)中，攪拌30分鐘后，在低于30℃溫度下蒸發(fā)溶液，將油狀殘留物溶于CH2Cl2中，用NaHCO3飽和溶液洗滌2次。有機(jī)相經(jīng)Na2SO4干燥、過濾和蒸發(fā)后，得到Val-甲酰胺1.90g，73%。
將DCC(3.01g，14.6mmol)加到經(jīng)過攪拌的BOC-Bzl-Asp(4.72g，14.6mmol)、Val-甲酰胺(1.90g，14.6mmol)、HOBt(2.24g，1.0當(dāng)量)的DMF(20ml)溶液中，5分鐘后生成沉淀物，16小時(shí)后過濾反應(yīng)物，過濾物用半飽和NaHCO3溶液驟冷。
收集生成的固體，用H2O、10%檸檬酸、H2O和Et2O洗滌，風(fēng)干得到無色固體，經(jīng)EtOAc重結(jié)晶后，得到所需二肽酰胺BOC-(Bzl)-Asp-Val-甲酰胺5.85g，92%。
將50%TFA/CH2Cl2(20ml)加到二肽酰胺(3.94g，9.05mmol)中，攪拌30分鐘后，在低于30℃溫度下蒸發(fā)溶液，用Et2O研制，得到無色玻璃狀TFA二肽4.10g，100%。
將DCC(1.87g，9.05mmol)加到經(jīng)過攪拌的BOC-Pro(1.95g，9.05mmol)、TFA二肽(4.10g，9.05mmol)、DIEA(1.73ml，1.1當(dāng)量)、DMAP(0.12g，0.1當(dāng)量)的DMF(20ml)溶液中，5分鐘后生成沉淀物，16小時(shí)后，過濾生成的固體，用H2O、10%檸檬酸、H2O和Et2O洗滌，風(fēng)干得到4.15g所需三肽酰胺，無需純化即可使用。
將50%TFA/CH2Cl2(15ml)加到上述酰胺(4.15g，7.78mmol)中，攪拌30分鐘后，在低于30℃的溫度下蒸發(fā)溶液，用Et2O研制，得到無色固體TFA三肽4.25g，100%。
將DCC(1.61g，7.78mmol)加到經(jīng)過攪拌的86.9%AOC-Tos-Arg(39.7g，7.78mmol)、三肽酰胺(4.25g，7.78mmol)、NMM(0.86ml，1.1當(dāng)量)和HOBt(1.19g，1.0當(dāng)量)的DMF(15ml)溶液中，10分鐘后生成沉淀物，16小時(shí)后過濾反應(yīng)物，過濾物用半飽和NaHCO3溶液驟冷。
收集生成的固體，用H2O、10%檸檬酸、H2O醚洗滌、風(fēng)干得到被護(hù)四肽酰胺4.82g，72%。
將固體的一半在50%TFA/CH2Cl2(10ml)中經(jīng)過30分鐘的去保護(hù)，減壓蒸發(fā)，用Et2O研制，生成的固體在0℃下經(jīng)過60分鐘用HF/苯甲醚(30ml/8ml)裂開，殘留物與EtOAc混合，再用10%HAOc(50ml)提取2次，將水提取物凍干，得到Arg-Pro-Asp-Val-甲酰胺粗制品。
粗制品肽在SPC-25 Sephadex(2.6×83cm柱，0.05-0.3M NH4OAc，pH6.5;梯度100ml/h流速，9.5ml/部分，206nm檢測器)。113-128部分合并后，凍干得到925mg四肽酰胺Arg-Pro-Asp-Val-甲酰胺。
氨基酸分析Arg，1.06;Pro，0.99;Asp，0.95;Val，1.00;肽含量54。
薄板層析(250μ硅膠G)Rf(Ⅰ)＝0.20(n-BuOH∶HOAc∶H2O∶上相/4∶1∶5)Rf(Ⅱ)＝0.26(n-BuOH∶HOAc∶H2O∶Pyr/15∶3∶12∶10)Rf(Ⅲ)＝0.26(EtOAc∶HOAc∶H2O∶Pyr/5∶1∶3∶5)實(shí)施例5N-甲酰-Arg-Pro-Asp-Val-甲酰胺的合成將4.5M HCl二噁烷(10ml)加到AOC-(Tos)-Arg-Pro-(Bzl)-Asp-Val-甲酰胺(1.00g，1.17mmol)中，蒸發(fā)反應(yīng)物，再用H2O稀釋，凍干得到無色粉末固體HCl四肽0.92g，100%。
將該固體溶于DMF(10ml)，加入DIEA(0.93ml，4.0當(dāng)量)、DMAP(0.08g)和甲酸對硝基苯酯(200mg，1.02當(dāng)量)。2小時(shí)后，將反應(yīng)混合物與10%檸檬酸反應(yīng)，生成的固體過濾后，用水洗滌，風(fēng)干得到甲?；孽０?.41g。
在0℃下用HF/苯甲醚(30ml/8ml)分裂60分鐘，殘留物與EtOAc混合，用1%NH4OH(50ml)提取2次，水提取物經(jīng)凍干后，得到肽粗制品N-甲酰-Arg-Pro-Asp-Val-甲酰胺。
肽粗制品在DEAE Sephadex(2.6×90cm柱，0.1M NH4HCO3，非緩沖液;100ml/h流速，10ml/部分，206nm檢測器)上純化，38-43部分合并后，凍干得到80g酰胺化肽。
氨基酸分析Arg，1.00;Pro，1.00;Asp，1.00;Val，1.00;肽含量50%。
薄板層析(250μm硅膠G)Rf(Ⅰ)＝0.32(n-BuOH∶HOAc∶H2O∶上相/4∶1∶5)Rf(Ⅱ)＝0.38(EtOAc∶HOAc∶H2O∶Pyr/5∶1∶3∶5)Rf(Ⅲ)＝0.34(三氟乙醇∶NH4OH/1∶1)實(shí)施例6Arg-Lys-Asp-Val-2-苯酰肼的合成先后將NMM(2.30ml)和iBuOCOCl(2.64ml)加到在-15℃下經(jīng)過攪拌的BOC-Val(4.34g，20.0mmol)的THF(40ml)溶液中，生成的漿液攪拌15分鐘，然后滴加苯酰肼(1.98ml)。在-10℃-0℃下將漿液攪拌1小時(shí)，再加溫到室溫，過濾反應(yīng)混合物，減壓蒸發(fā)過濾物。殘留物溶于EtOAc，用NaHCO3飽和溶液、水和飽和鹽水洗滌。
有機(jī)相經(jīng)Na2SO4干燥、過濾和蒸發(fā)后，得到橙黃色固體，經(jīng)CH2Cl2/石油醚重結(jié)晶，得到無色固體BOC-Val-2-苯酰肼，m.p.140-141℃，4.96g，74%。
將BOC-Val-2-苯酰肼(1.13g，3.68mmol)加到經(jīng)過攪拌的4.2M HCl二噁烷(10ml)中，1小時(shí)后減壓蒸發(fā)反應(yīng)物，在Et2O中研制，過濾得到Val-2-苯酰肼二鹽酸鹽，無色固體，1.03g。
先后將NMM(0.60ml)和DCC(0.56g)加到經(jīng)過攪拌的二鹽酸鹽(1.03g，3.68mmol)、BOC-(Bzl)-Asp(0.88g)和HOBt(0.37g)的THF(10ml)的溶液中，幾乎立即生成沉淀物，16小時(shí)后，過濾反應(yīng)混合物，減壓蒸發(fā)過濾物，將殘留物溶于EtOAc，用NaHCO3飽和和溶液和飽和鹽水洗滌。有機(jī)相經(jīng)Na2SO4干燥、過濾和減壓蒸發(fā)，再用EtOAc/己烷重結(jié)晶，得到無色固體BOC-(Bzl)-Asp-Val-2-苯酰肼1.07g，64%。
將BOC二肽苯酰胺(1.07g，1.75mmol)加到經(jīng)過攪拌的4.2MHCl二噁烷1溶液(10ml)，60分鐘后，減壓蒸發(fā)溶液，得到無色油(Bzl)-Asp-Val-2-苯酰肼鹽酸鹽。
將NMM(0.6ml)加到經(jīng)過攪拌的(CBZ)3Arg-(CBZ)-Lys-ONp(1.68g)、油和HOBt(0.24g)的DMF(6ml)溶液中，16小時(shí)后生成膠凝狀沉淀物，用NaHCO3飽和溶液使反應(yīng)混合物驟冷，收集固體，用水、10%檸檬酸、水和Et2O洗滌，經(jīng)2%HOAc/EtOAc重結(jié)晶，得到無色固體(CBZ)Arg-(CBZ)-Lys-(Bzl)-Asp-Val-2-苯酰肼2.15g，92%。
在0℃下將被護(hù)肽(1.88g)置于HF/苯甲醚(30ml/8ml)中裂解60分鐘，殘留物在Et2O中驟冷，過濾。固體用10%HOAc(100ml)提取1小時(shí)、過濾，提取物凍干后得到890mg無色固體Arg-Lys-Asp-Val-2-苯酰肼。
肽粗制品在CM Sephadex(2.6×88cm柱，0.3M NH4OAc，非緩沖液;100ml/h流速，12.5ml/部分，225nm檢測器)。合并270-310部分，凍干得到390mg最終產(chǎn)物Arg-Lys-Asp-Val-2-苯酰肼。
氨基酸分析Arg，0.98;Lys，1.03;Asp，1.00;Val，0.99，肽含量83。
薄板層板(250μ硅膠G)Rf(Ⅰ)＝0.39(n-BuOH∶HOAc∶H2O∶EtOAc/1∶1∶1∶1)Rf(Ⅱ)＝0.51(n-BuOH∶HOAc∶H2O∶Pyr/15∶3∶12∶10)Rf(Ⅲ)＝0.59(EtOAc∶HOAc∶H2O∶pyr/5∶1∶3∶5)實(shí)施例7Arg-Lys-Asp-Val-苯胺酰胺的合成將DCC(4.12g，20.0mmol)加到在室溫下經(jīng)過攪拌的BOC-Val(4.35g，20.0mmol)、苯胺(3.0ml，1.05當(dāng)量)和HOBt(3.09g，1.0當(dāng)量)的DMF(20ml)溶液中，在5分鐘內(nèi)生成很稠的沉淀物，4小時(shí)后過濾反應(yīng)物，將過濾物倒入半飽和NaHCO3(500ml)溶液中，生成并收集沉淀物，固體用水(1∶1)洗滌，風(fēng)干，經(jīng)已烷/異丙醇重結(jié)晶，得到無色固體N-酰苯胺BOC-Val-苯胺酰胺3.76g，64%。
將BOC-Val-苯胺酰胺(2.50g，8.55mmol)溶于50%TFA/CH2Cl2(10ml)，攪拌30分鐘，室溫下減壓蒸發(fā)反應(yīng)混合物，殘留物溶于CH2Cl2，該溶液用NaHCO3飽和溶液洗滌2次，經(jīng)MgSO4干燥，過濾和蒸發(fā)后，得到淡黃色油Val-苯胺酰胺1.42g，88%。
將DCC(1.52g，1.0當(dāng)量)加到BOC-(Bzl)-Asp(2.38g，1.0當(dāng)量)、Val-苯胺酰胺和HOBt(1.13g)的DMF(7.5ml)溶液中，生成沉淀物，反應(yīng)物攪拌3小時(shí)，過濾混合物，過濾物用NaHCO3飽和溶液驟冷，收集生成的固體，用水洗滌，風(fēng)干，經(jīng)EtOAc/石油醚重結(jié)晶，得到無色的BOC二肽酰胺BOC-(Bzl)-Asp-Val-苯胺酰胺，m.p.121-122℃，1.74g，46%。
將BOC二肽(1.71g，3.44mmol)溶于50%TFA/CH2Cl2(10ml)，攪拌30分鐘，室溫下減壓蒸發(fā)反應(yīng)混合物，殘留物在醚中研制，過濾和風(fēng)干。
將NMM(0.46ml，1.2當(dāng)量)和iBuOCOCl(0.46ml，1.01當(dāng)量)先后加到在-20℃下經(jīng)過攪拌的BOC-(CBZ)-Lys(1.33g，3.50mmol)的DMF(10ml)溶液中，生成的漿料攪拌30分鐘，再先后加二肽TFA鹽和NMM(0.46ml)，攪拌反應(yīng)物，加溫至室溫。1小時(shí)后，將反應(yīng)混合物倒在半飽和的NaHCO溶液(200ml)中，生成無色的固體，收集這些固體后風(fēng)干，經(jīng)EtOAc/i-Pr2O重結(jié)晶，得到BOC三肽酰胺2.05g，78%，m.p.164-167℃。
將BOC三肽酰胺(2.00g，2.63mmol)溶于50%TFA/CH2Cl2(6ml)中，攪拌30分鐘，室溫下減壓蒸發(fā)反應(yīng)混合物，過濾和風(fēng)干后，得到TFA鹽。
將NMM(0.35ml，1.2當(dāng)量)和iBuOCOCl(0.35ml，1.01當(dāng)量)先后加到-20℃下經(jīng)過攪拌的(CBZ)3Arg(1.52g，2.63mmol)的DMF溶液中，生成的漿液攪拌30分鐘，先后加入NMM(0.35ml)和TFA鹽。反應(yīng)物加溫至室溫1小時(shí)，將溫和物倒入NaHCO3飽和溶液中，過濾生成的固體，用水洗滌，風(fēng)干，在熱EtOH中研制，得到被護(hù)四肽BOC-(CBZ)-Lys-(Bzl)-Asp-Val-苯胺酰胺2.55g，78%。
將鈀黑(0.95g)加到四肽(2.30g，1.89mmol)的三氟乙醇(50ml)和甲酸(97%，5ml)攪拌漿液中，劇烈攪拌反應(yīng)物，1小時(shí)后，溶液經(jīng)硅藻土過濾，用水洗滌，過濾物在減壓下部分蒸發(fā)，殘留物風(fēng)干后，得到0.89g無色固體。
肽粗制品在SPC-25 Sephadex(2.6×89cm柱，0.1-0.3M NH4OAc;pH5，梯度100ml/h流速，15ml/部分，206nm檢測器)上純化，合并253-285部分，凍干后得到680mgArg-Lys-Asp-Val-苯胺酰胺。
氨基酸分析Arg，1.00;Lys，0.98;Asp，1.00;Val，1.01;肽含量100%。
薄板層析(250μ硅膠G)Rf(Ⅰ)＝0.42(EtOAc∶HOAc∶H2O∶Pyr/5∶1∶3∶5)Rf(Ⅱ)＝0.32(n-BuOH∶HOAc∶H2O∶EtOAc/1∶1∶1∶1)Rf(Ⅲ)＝0.54(n-BuOH∶HOAc∶H2O∶Pyr/15∶3∶12∶10)實(shí)施例8生物活性∶環(huán)GMP測定此實(shí)施例是測定本發(fā)明肽與完整CEM細(xì)胞的細(xì)胞膜受體的結(jié)合能力，并且如人thymopentin一樣，有選擇地刺激產(chǎn)生環(huán)GMP的能力。
CEM細(xì)胞系由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Rockville，Md.)得到。將CEM細(xì)胞進(jìn)行接種，培養(yǎng)3天后收集，其方法如T.Audhya等所述(Arch.Biochem.Biophy.，234∶167-177，1984)。細(xì)胞在PBS中洗滌3次，再懸浮在濃度為1.0×107細(xì)胞/毫升的RPMI 1640中，在37℃下平衡30分鐘，加入試驗(yàn)肽(25μl)和對照肽，在震蕩水浴中保溫處理4-5分鐘，最后加1ml冰冷卻的TCA(10%)。
在TCA中的細(xì)胞均勻后超聲處理，使環(huán)狀核苷酸釋放出來。在4℃和3000xg下，懸浮液離心20分鐘，將生成的沉淀物溶于0.1N NaOH中，測定蛋白質(zhì)含量。上清液用5ml水飽和Et2O溶液提取4次，除去TCA。在最后一次提取后，殘留的少量醚通過在50℃水浴中加熱10分鐘除去。凍干后再將樣品置于50mM乙酸鹽緩沖液(pH6.2)中，用于環(huán)GMP的放射性免疫測定。
由1-1000微克肽/毫升的劑量響應(yīng)曲線測定各個(gè)化合物。圖1給\出活性肽的典型劑量響應(yīng)曲線(6個(gè)實(shí)驗(yàn)的綜合)與CEM細(xì)胞中thymopentin和無活性肽的對比。所述活性肽系A(chǔ)rg-Pro-Asp-Val-異丙酰胺，Arg-Lys-Asp-Val-苯胺酰胺，Arg-Lys-Asp-Val-環(huán)己基酰胺，Arg-Lys-Asp-Val-哌啶酰胺和Arg-Lys-Asp-Val-苯酰肼。所述無活性肽系A(chǔ)rg-Lys-Asp-Val-二甲酰胺和Arg-Lys-Asp-Val-2-萘酰胺。由此測定各試驗(yàn)肽的閾活性。這個(gè)測定限定了誘導(dǎo)環(huán)GMP細(xì)胞內(nèi)的量大于對照2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)離差為試驗(yàn)肽的最低濃度。對照的細(xì)胞內(nèi)環(huán)GMP值低于0.9微微摩爾/毫升(平均±標(biāo)準(zhǔn)離差)。如果環(huán)GMP的量大于同樣的負(fù)對照所測定的值2倍，則試驗(yàn)結(jié)果被認(rèn)為是正結(jié)果?；钚噪牡幕钚蚤撝捣秶鸀?-10μg/l。
環(huán)GMP測定的結(jié)果示于圖1，其中給出所述本發(fā)明的肽與thymopentin和對照肽的對比關(guān)系。這些結(jié)果證明本發(fā)明肽在刺激CEM細(xì)胞中T細(xì)胞抑制基因活性方面所具有的生物活性。
實(shí)施例9酶的穩(wěn)定性為了說明本發(fā)明肽對腸道酶和血清酶降解的穩(wěn)定性，可將典型的肽Arg-Pro-Asp-Val-異丙酰胺在37℃下置于老鼠腸液和血清中培養(yǎng)到120分鐘。類似對比處理所用的肽，例如有Arg-Lys-Asp-Val-二甲酰胺和thymopentin。HPLC期望證明Arg-Lys-Asp-Val-二甲酰胺僅在幾秒鐘后就被完全消化，在這種條件下，thymopentin大約20秒鐘降解50%。本發(fā)明的肽期望在血清和腸液中基本上保持不降解，顯然thymopentin或?qū)φ针呐懦谕狻?br> 實(shí)施例10Arg-Lys-Asp-Val-甲酰胺的合成A.Nα-叔丁氧羰基-(N-芐氧羰基)-精氨?；?(β-芐基)天冬氨酰基-纈氨酸甲酰胺將3.21gN-叔丁氧羰基-(N-芐氧羰基)(賴氨?；?(β-芐基)天冬氨?；?纈氨酸苯乙酮酯溶于50ml50%乙酸中，加入鋅粉5.2g，混合物劇烈攪拌1小時(shí)，過濾反應(yīng)混合物，用水稀釋過濾物，再用乙酸乙酯提取3次，合并有機(jī)相，用水和氯化鈉飽和溶液提取，然后用無水硫酸鎂干燥。除去溶劑，殘留油中先后加醚和己烷，產(chǎn)生膠質(zhì)沉淀物，用己烷研制至呈白色干固體，得到產(chǎn)物1.75g，再將其溶于14ml乙酸乙酯和1ml二甲基甲酰胺中。
在將溶液驟冷至-20℃后，加入0.30mlN-甲基嗎啉，然后再滴入0.36g氯甲酸異丁酯。反應(yīng)混合物在-15℃下比較20分鐘后，加入0.29mlN-甲基嗎啉和0.18g鹽酸甲胺的乙醇(10ml，95%)冷凍溶液，生成稠密的沉淀物，加入5mlDMF，以便于攪拌，該混合物在0℃下攪拌90分鐘后，再在室溫下攪拌30分鐘。將反應(yīng)混合物加到75ml水中。
在攪拌混合物時(shí)，有機(jī)相呈珠形蠟狀固體。固體過濾后用乙酸乙酯提取過濾物。將有機(jī)相蒸發(fā)后得到殘留物與固體產(chǎn)物合并，經(jīng)乙酸乙酯-異丙醚結(jié)晶，得到產(chǎn)物1.53g，m.p.183.5-184.5℃。元素分析C61.57(61.96)，H7.21(7.37)，N9.81(10.04)。
B.三芐氧羰基-精氨?；?(N-芐氧羰基)精氨?；?(β-芐基)天冬氨?；?纈氨酸甲酰胺將50ml50%三氟乙酸的二氯甲烷溶液加到1.46g上述A部分的產(chǎn)物中，攪拌25分鐘后，蒸去溶劑，再把醚加到殘留物中，生成白色固體，過濾后用醚洗滌。
將1.33g三芐氧羰基-精氨酸溶于10mlDMF中，溶液冷凍至-20℃，再先后加入0.25mlN-甲基嗎啉和0.31g氯甲酸異丁酯的DMF(2ml)溶液?；旌衔镌?20℃下攪拌20分鐘，再加0.26mlN-甲基嗎啉和三肽三氟乙酸鹽的DMF(10ml)冷凍溶液，在-20℃至-10℃下攪拌混合物30分鐘，再在室溫下攪拌過夜。16小時(shí)后，將混合物加到125ml水中。過濾收集沉淀物，用溫甲醇和乙酸乙酯洗滌，得到1.74g產(chǎn)物，m.p.118-120℃。氨基酸分析Asp，0.99;Val，1.03;Tyr，0.99;Lys，0.98;Arg，1.00;肽含量67.7%。
C.精氨?；?賴氨?；?天冬氨?；?纈氨酸甲酰胺通過2ml甲酸和1g鈀黑的三氟乙醇(40ml)溶液的還原作用，對上述1.72gB部份產(chǎn)物進(jìn)行去保護(hù)。混合物在具塞燒瓶中快速攪拌1.5小時(shí)，用硅藻土濾去鈀，通過旋轉(zhuǎn)式汽化除去過濾物中的大部分三氟乙醇。殘留物用5%乙酸稀釋，凍干后得到676mg產(chǎn)物。
肽通過在SP-Sephadex的2.6×85cm柱上進(jìn)行層析純化，洗脫用梯度為0.20-0.50N的NH4OAc，pH5.5，3升，進(jìn)行部份收集，每份10ml，在206nm上檢測，主峰值出現(xiàn)在185-220部分上，取3段即185-190，191-205和206-220，凍干后分別得到21mg，497mg和235mg。第一段含有雜質(zhì)，其他兩段的純度超過99.5%。
HPLC，u-Bondapak C18∶rt＝8.5分鐘，用0.01M NH4OAc，pH5，2.0ml/min。
氨基酸分析Asp，1.01;Val，0.95;Lys，1.01，Arg，1.02;肽含量56%。
薄板層析(硅酸60)Rf＝0.19(n-BuOH∶HOAc∶H2O∶吡啶/15∶3∶12∶10)Rf＝0.15(EtOAc∶pyr∶H2O/5∶5∶1∶3)Rf＝0.45(TFA∶NH4OH/2∶1)實(shí)施例11Arg-Lys-Asp-Val-丙酰胺的合成A.α-BOC-ε-(CBZ)-Lys-(β-Bzl)Asp-Val將酸腐蝕過的鋅粉(12.4g)加到室溫下經(jīng)快速攪拌過的α-BOC-ε-(CBZ)-Lys-(β-Bzl)Asp-Val苯乙酮酯(8.02g，10.0mmol)的85%HOAc(100ml)溶液中，1小時(shí)后，過濾反應(yīng)物，真空蒸發(fā)過濾物，生成的油狀殘留物在Et2O中研制，收集生成的固體，用Et2O和水洗滌，在40℃下真空干燥，得到產(chǎn)物4.95g，72%。
B.α-BOC-ε-(CBZ)Lys-(β-Bzl)-Asp-Val-NHCH(CH3)2將NMM(170μl，1.06當(dāng)量)和iBuOCOCl(195μl)，1.03當(dāng)量)加到在-15℃經(jīng)過攪拌的BOC三肽(1.00g，1.46mmol)的THF(5ml)溶液中，生成的暗濁溶液攪拌15分鐘后，再加入2-丙胺(150μl，1.1當(dāng)量)。將反應(yīng)物加溫至-5℃，生成膠凝狀固體后，再加至室溫。16小時(shí)后，在30℃下真空蒸發(fā)反應(yīng)物。固體殘留物用10%檸檬酸、水、NaHCO3飽和溶液和水洗滌，風(fēng)干后得到無色BOC三肽酰胺2.58g，55%。
C.(CBZ)3Arg-ε-(CBZ)Lys-(β-Bzl)Asp-Val-NHCH(CH3)2將BOC三肽酰胺(0.55g，0.76mmol)溶于4.4M HCl二噁烷(5ml)，攪拌45分鐘，真空蒸發(fā)溶液，固體在Et2O中研制，過濾得到無色HCl三肽酰胺0.51g，100%。
將NMM(92μl，1.1當(dāng)量)加到室溫下經(jīng)過攪拌的HCl三肽酰胺、(CBZ)3Arg-對硝基苯酯(0.53g，1.0當(dāng)量)和HOBt(0.12g，1.0當(dāng)量)的DMF(5ml)溶液中，在16小時(shí)內(nèi)緩慢生成沉淀物。加NaHCO3飽和溶液攪拌膠凝狀反應(yīng)混合物，過濾后固體殘留物用水、10%檸檬酸、水和Et2O洗滌，生成的被護(hù)四肽酰胺經(jīng)1 HOAc/EtOAc重結(jié)晶，得到無色固體743mg，83%。
D.Arg-Lys-Asp-Val-NHCH(CH3)2將被護(hù)四肽(0.70g，0.59mmol)與90%HOAc(50ml)混合，混合物用N2沖洗，裝載10%Pd/C(0.4g)。在帕爾震蕩裝置(250ml容器，P＝52.0psi)中氫化64小時(shí)，用0.45μ尼龍濾器過濾，部份蒸發(fā)和凍干后，得到四肽粗制品385g。
肽粗制品在CM Sephadex(2.6×93cm柱，1.7升，0.2M，再用0.3MNH4OAc，非緩沖;100ml/h流速，10ml/部分，225nm檢測器)上純化，合并335-370部分，凍干后得到產(chǎn)物231mg。
氨基酸分析Arg，1.00;Lys，1.02;Asp，0.98;Val，1.00;含肽量80.3。
薄板層析(250μ，硅膠G)Rf＝0.24(n-BuOH∶HOAc∶H2O∶EtOAc/1∶1∶1∶1)Rf＝0.52(n-BuOH∶HOAc∶H2O∶吡啶/15∶3∶12∶10)Rf＝0.61(EtOAc∶HOAc∶H2O∶吡啶/5∶1∶3∶5)實(shí)施例12N-乙?；?Arg-Pro-Asp-Val-N-甲酰胺的合成將4.5M HCl二噁烷(10ml)加到Aoc(Tos)Arg-Pro-(β-Bzl)Asp-ValNH3(1.50g，1.75mmol)中，反應(yīng)物經(jīng)蒸發(fā)后用水稀釋，凍干后得到無色粉末固體HCl四肽1.38g，99%。
將固體溶于DMF(10ml)，加入DIEA(1.4ml，4當(dāng)量)、DMAP(0.11g)和Ac2O(1.0ml)，1小時(shí)后反應(yīng)混合物用10%檸檬酸處理，生成的固體過濾后用水洗滌，風(fēng)干，在熱EtOAc中研制，得到被護(hù)乙?；碾?.42g，100%。
該固體在0℃下用HF/苯甲醚(30ml/8ml)經(jīng)60分鐘裂開，殘留物與EtOAc混合成漿狀，用10%HOAc(50ml)提取2次，水提取物凍干后得到Ac-Arg-Pro-Asp-Val-NHCH3。
肽粗制品在DEAE Sephadex(2.6×90cm柱，0.1M NH4HCO3，非緩沖;100ml/h流速，10ml/部分，206nm檢測器)上純化，合并32-40部分，凍干后得到345mg，32%。
氨基酸分析Arg，0.98;Pro，0.97;Asp，1.00;Val，1.05;含肽量87.0。
薄板層析(250μ硅膠G)Rf＝0.39(n-BuOH∶HOAc∶H2O∶EtOAc/1∶1∶1∶1)Rf＝0.56(n-BuOH∶HOAc∶H2O∶吡啶/15∶3∶12∶10)Rf＝0.76(EtOAc∶HOAc∶H2O∶吡啶/5∶1∶3∶5)上述實(shí)施例僅是為了說明，并非限制在權(quán)利要求書中提出的本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.一種具有增加人T細(xì)胞系CEM中cGMP活性能力并選自由下式的肽組成的肽
R-Arg-X-Asp-Y-NR1R2
式中
R是H，低級(jí)烷基，乙?；?，甲?；?，低級(jí)鏈烷基；
X是Pro，脫氫Pro，羥基Pro，D-Lys，Aib或Lys；
Y是Gly或選自Val，Ala，Ile，Leu，Asp，Glu，Gln或Lys的D或L氨基酸；
R1是H；
R2是具有1-10個(gè)碳原子的低級(jí)烷基或鏈烯基，具有4-8個(gè)碳原子的環(huán)烷基或鏈烯基，芳基或NHR3(其中R3是具有1-10個(gè)碳原子的低級(jí)烷基，具有4-8個(gè)碳原子的環(huán)烷基或鏈烯基，或芳基)；或
R1和R2一起構(gòu)成4-7個(gè)碳原子的亞甲基鏈。
2.按權(quán)利要求1的肽，其中X系Pro或Lys，Y系Val。
3.按權(quán)利要求1的肽，其含有Arg-Pro-Asp-Val-異丙酰胺。
4.按權(quán)利要求1的肽，其含有Arg-Lys-Asp-Val-苯胺酰胺。
5.按權(quán)利要求1的肽，其含有甲酰-Arg-Pro-Asp-Val-甲酰胺。
6.按權(quán)利要求1的肽，其含有乙酰-Arg-Pro-Asp-Val-甲酰胺。
7.按權(quán)利要求1的肽，其含有Arg-Pro-Asp-Val-甲酰胺。
8.按權(quán)利要求1的肽，其含有Arg-Lys-Asp-Val-甲酰胺。
9.按權(quán)利要求1的肽，其含有Arg-Lys-Asp-Val-2-苯酰肼。
10.按權(quán)利要求1的肽，其含有Arg-Lys-Asp-Val-哌啶酰胺。
11.按權(quán)利要求1的肽，其含有Arg-Lys-Asp-Val-環(huán)己基酰胺
12.按權(quán)利要求1的肽，其含有Arg-Lys-Asp-Val-異丙酰胺。
13.一種藥物組合物，其在藥物上可接受的配制劑中至少含有一種按權(quán)利要求1至12的肽的有效治療量。
14.按權(quán)利要求13的組合物，其適宜于口服給藥。
15.調(diào)節(jié)生物體中T細(xì)胞功能缺陷或過度的方法，包括將權(quán)利要求1至12中至少一種肽的有效治療量施用于生物體。
16.生產(chǎn)具有增加人T細(xì)胞系CEM中cGMP活性能力并選自由下式肽組成的肽的方法，該方法包括在固相中合成所述的肽，R-Arg-X-Asp-Y-NR1R2式中R是H，低級(jí)烷基，乙酰基，甲?；?，低級(jí)鏈烷基;X是Pro，脫氫Pro，羥基Pro，D-Lys，Aib或Lys;Y是Gly或選自Val，Ala，Ile，Leu，Asp，Glu，Gln或Lys的D或L氨基酸;R1是H;R2是具有1-10個(gè)碳原子的低級(jí)烷基或鏈烯基，具有4-8個(gè)碳原子的環(huán)烷基或鏈烯基，芳基或NHR3(其中R3是具有1-10個(gè)碳原子的低級(jí)烷基，具有4-8個(gè)碳原子的環(huán)烷基或鏈烯基，或芳基);或R1和R2一起構(gòu)成4-7個(gè)碳原子的亞甲基鏈。
17.按權(quán)利要求16的方法，其中所述肽中的X系Pro或Lys，Y系Val。
18.按權(quán)利要求16的方法，其中所述肽選自Arg-Pro-Asp-Val-異丙酰胺Arg-Lys-Asp-Val-苯胺酰胺甲酰基-Arg-Pro-Asp-Val-甲酰胺乙酰基-Arg-Pro-Asp-Val-甲酰胺Arg-Pro-Asp-Val-甲酰胺Arg-Lys-Asp-Val-甲酰胺Arg-Lys-Asp-Val-2-苯酰肼Arg-Lys-Asp-Val-哌啶酰胺Arg-Lys-Asp-Val-環(huán)己基酰胺Arg-Lys-Asp-Val-異丙酰胺
19.制備具有增加人T細(xì)胞系CEM中cGMP活性能力并選自由下式的肽組成的肽的方法，該方法包括在溶液中合成所述的肽，R-Arg-X-Asp-Y-NR1R2式中R是H，低級(jí)烷基，乙?；柞；?，低級(jí)鏈烷基;X是Pro，脫氫Pro，羥基Pro，D-Lys，Aib或Lys;Y是Gly或選自Val，Ala，Ile，Leu，Asp，Glu，Gin或Lys的D或L氨基酸;R1是H;R2是具有1-10個(gè)碳原子的低級(jí)烷基或鏈烯基，具有4-8個(gè)碳原子的環(huán)烷基或鏈烯基，芳基或NHR3(其中R3是具有1-10個(gè)碳原子的低級(jí)烷基，具有4-8個(gè)碳原子的環(huán)烷基或鏈烯基，或芳基);或R1和R2一起構(gòu)成4-7個(gè)碳原子的亞甲基鏈。
20.按權(quán)利要求19的方法，其中所述肽中的X系Pro或Lys，Y系Val。
21.按權(quán)利要求19的方法，其中所述肽選自Arg-Pro-Asp-Val-異丙酰胺Arg-Lys-Asp-Val-苯胺酰胺甲酰基-Arg-Pro-Asp-Val-甲酰胺乙?；?Arg-Pro-Asp-Val-甲酰胺Arg-Pro-Asp-Val-甲酰胺Arg-Lys-Asp-Val-甲酰胺Arg-Lys-Asp-Val-2-苯酰肼Arg-Lys-Asp-Val-哌啶酰胺Arg-Lys-Asp-Val-環(huán)己基酰胺Arg-Lys-Asp-Val-異丙酰胺
22.權(quán)利要求1至12的肽在制備用于調(diào)節(jié)人體免疫系統(tǒng)的藥物組合物中的應(yīng)用。
23.權(quán)利要求1至12的肽在制備用于調(diào)節(jié)人體內(nèi)T細(xì)胞功能缺陷或過度的藥物組合物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明介紹了在羧基末端具有一定酰胺取代物的肽，它們具有分子人thymopentin的生物活性，還提供了含該類肽的藥物組合物及其使用方法。
文檔編號(hào)C07K5/10GK1041366SQ8910767
公開日1990年4月18日 申請日期1989年9月30日 優(yōu)先權(quán)日1988年9月30日
發(fā)明者喬治·希夫納, 塔潘·歐德希耶, 吉迪恩·戈?duì)柎奶?申請人:免疫生物學(xué)研究所有限公司