一種從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法，以牛肝臟為原料通過超聲提取及低溫離心等工藝制備得到過氧化氫酶粗提液，采用超濾濃縮和凝膠層析技術(shù)進行過氧化氫酶的提取純化，取代了利用大量有機溶劑或無機鹽溶液等進行提取的復(fù)雜工藝，一方面使提取工藝更加簡單易操作，酶活性及產(chǎn)率均得到大幅度提高，所得過氧化氫酶酶活達到10000U/mg以上，產(chǎn)率達到18％以上，且大大降低了生產(chǎn)成本；另一方面將超濾濃縮產(chǎn)生的透過液重復(fù)回收利用，避免了廢水的排放，是一種環(huán)境友好型生產(chǎn)工藝。
【專利說明】一種從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]過氧化氫酶(Catalase，CAT)，又稱觸酶，是一類廣泛存在于動物、植物和微生物體內(nèi)的末端氧化酶，是以過氧化氫為底物，通過催化一對電子的轉(zhuǎn)移而最終將其分解為水和氧氣，其系統(tǒng)名稱是H2O2:H202氧化還原酶，國際酶學(xué)委員會的編號為ECl.11.1.6。過氧化氫酶分子結(jié)構(gòu)中含有鐵卟啉環(huán)，I個分子酶蛋白中含有4個鐵原子，其作用基團是血紅素。過氧化氫酶主要由四種次單元組成，每一種單元含一種蘇木精衍生物稱為ProtohemelX。不管什么來源，它的分子量均是225。過氧化氫酶是在生物演化過程中建立起來的生物防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一，其生物學(xué)功能是催化細胞內(nèi)過氧化氫分解，防止脫脂過氧化。目前過氧化氫酶主要的應(yīng)用領(lǐng)域包括:臨床、醫(yī)藥及食品加工等領(lǐng)域。
[0003]酶的純化工作非常復(fù)雜，除了要保證純度外，酶產(chǎn)品還必須保持其生物活性。純化工藝必須能夠每次都能產(chǎn)生相同數(shù)量和質(zhì)量的酶，重復(fù)性良好。這就要求應(yīng)用適應(yīng)性非常強的方法而不是用能得到純酶的最好方法去純化酶。在實驗室條件下的好方法卻可能在大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用中失敗，因為后者要求規(guī)?；?，且在每日的應(yīng)用中要有很好的重復(fù)性。
[0004]國內(nèi)外目前生產(chǎn)過氧化氫酶的方法有三個:Novozymes A/S公司由變種黑曲霉在通風(fēng)攪拌等條件下培養(yǎng)而得；而杰能科公司則由纖維蛋白小球菌經(jīng)深層發(fā)酵提取精制而得。國內(nèi)由江南大學(xué)的華兆哲、陳堅等研究用利用Bacillus subtilis WSHDZ.01胞肉過氧化氫酶的純學(xué)提取在這個方面做僅做了嘗試，CN103509766提供了另外一中編號為CGMCCN03449的一株Serratia marcesces SRBC08高產(chǎn)過氧化氫酶菌的菌株為菌種,經(jīng)過種子培養(yǎng)和在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中添加100-200毫克/升煙酸作為誘導(dǎo)劑，調(diào)控菌體的生產(chǎn)代謝，該方法通過種子培養(yǎng)、發(fā)酵產(chǎn)酶、過氧化氫酶的提取純化等三個步驟得到產(chǎn)品，但亦未見工藝化大生產(chǎn)，目前發(fā)酵法雖然采用添加過活性氧、乙醇等誘導(dǎo)CAT表達的發(fā)酵策略，但是目前產(chǎn)量提高非常有限，導(dǎo)致生產(chǎn)成本高，不合適工業(yè)化生產(chǎn)。
[0005]國內(nèi)外主要是從豬、牛等動物肝臟中提取純化而得，如CN1436846提出了一種由動物肝臟中提取過氧化氫酶的方法，該方法經(jīng)過將動物肝臟在酸性條件下粗提、高速離心、硫酸銨沉淀、熱變性等四個步驟最后得到過氧化氫酶溶液，但是該方法中要用到大量的飽和度45%的硫酸銨，在生產(chǎn)中容易造成大量無機鹽的污染，不是環(huán)境友好型生產(chǎn)工藝，而且該方法得到的酶的活性不是很高，并只得到酶溶液而不是干品；CN101445794提供了另外一種方法，該方法經(jīng)過中空纖維濾膜兩次滲透，得到過氧化氫酶產(chǎn)品，但是該方法中中空纖維濾膜目前的成本高，難得到在大工業(yè)化中經(jīng)濟實惠的產(chǎn)品，不具備在市場上有競爭能力；US2992167中提供了一個由利用化學(xué)溶劑中動物肝臟中提取過氧化氫酶的，但是該方法使用的化學(xué)試劑對環(huán)境的污染比較大，生產(chǎn)工藝復(fù)雜且對生產(chǎn)條件要求高，造成提取率低，而且容易對人體造成比較大的傷害，不符合目前國內(nèi)外清潔環(huán)保的生產(chǎn)需求。
[0006]目前紡織印染企業(yè)生產(chǎn)用的過氧化氫酶產(chǎn)品幾乎都依賴進口，市場為外商所壟斷；食品行業(yè)用的過氧化氫酶則完全依靠進口且沒有現(xiàn)貨，因此國內(nèi)過氧化氫酶制品的研制是市場的需要，也是企業(yè)降低成本的需要。在國內(nèi)微生物發(fā)酵法制取過氧化氫酶僅處于實驗室研究階段，尚無工業(yè)化生產(chǎn)，而從動物原料中提取過氧化氫酶的研究也是在近幾年才引起重視。哺乳動物組織中過氧化氫酶含量差異很大，肝和腎中含量最高，紅細胞次之，結(jié)締組織中含量最低。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有的過氧化氫酶提取工藝的不足，提供一種從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法，本發(fā)明以牛肝臟為原料，順次經(jīng)過搗碎勻漿、超聲處理和低溫離心制備過氧化氫酶粗提液，將所得粗提液采用超濾濃縮和凝膠層析技術(shù)進行過氧化氫酶的提取及純化，取代利用大量有機溶劑提取、大量無機鹽沉淀等對環(huán)境污染的方法，且將超濾濃縮得到的大量透過液進行重復(fù)利用，具有節(jié)能減排、經(jīng)濟環(huán)保且酶活高的優(yōu)點，適合工業(yè)化生產(chǎn)的要求。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案為:
[0009]一種從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法，其特征在于，
[0010]以牛肝臟為原料提取獲得過氧化氫酶粗提液，將所得過氧化氫酶粗提液采用孔徑為0.004-0.006 μ m的中空纖維濾膜，以10_20L/h的流速進行超濾濃縮，收集超濾截留液得到含有高濃度過氧化氫酶的過氧化氫酶濃縮液；
[0011]此外，還包括以下步驟:
[0012]步驟一、純化，將所得過氧化氫酶濃縮液采用Sephacryl S-200凝膠進行凝膠過濾層析，用PH值為7.0-7.8的磷酸緩沖液進行洗脫，流速為1.0-2.0L/h，收集層析洗脫液得到純化的過氧化氫酶母液；
[0013]步驟二、冷凍干燥，將所得過氧化氫酶母液經(jīng)過冷凍干燥，既得所述過氧化氫酶。
[0014]優(yōu)選的是，所述的從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法中，所述過氧化氫酶粗提液的制備方法包括以下步驟:
[0015]步驟一、搗碎勻漿，將切碎的牛肝臟和pH值為7.0-7.8的磷酸緩沖液按照體積比I: 6-10混合后，保持溫度25-30°C進行搗碎20-30min，得到牛肝勻漿；
[0016]步驟二、超聲提取，將所得牛肝勻漿進行超聲振蕩10_30min，超聲波強度為30-80W，得到牛肝過氧化氫酶勻漿；
[0017]步驟三、離心分離，將所得牛肝過氧化氫酶勻漿在10-30°C下進行離心15_25min，取上層清液既得所述過氧化氫酶粗提液。
[0018]優(yōu)選的是，所述的從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法中，將所述超濾濃縮得到的透過液進行收集，并調(diào)節(jié)所得透過液的PH值為7.0-7.8后，可取代磷酸緩沖液與切碎的牛肝臟混合后進行搗碎。
[0019] 優(yōu)選的是，所述的從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法中，在進行凝膠過濾層析之前用PH值為7.0-7.8的磷酸緩沖液對所述凝膠柱進行沖洗。
[0020]優(yōu)選的是，所述的從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法中，步驟二中冷凍干燥溫度為-55—60°C。
[0021]優(yōu)選的是，所述的從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法中，離心分離的轉(zhuǎn)速為大于或等于5000rpm。
[0022]優(yōu)選的是，所述的從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法中，所用磷酸緩沖液的濃度均為 0.09-0.llmol/L。
[0023]本發(fā)明具有以下有益效果:首先，本發(fā)明將經(jīng)過搗碎勻漿后的牛肝臟進行超聲處理，使過氧化氫酶快速高效釋放，大大縮短過氧化氫酶的提取時間，并大幅度提高過氧化氫酶的產(chǎn)率。
[0024]其次，本發(fā)明將所得過氧化氫酶粗提液采用超濾濃縮和凝膠層析技術(shù)進行過氧化氫酶的提取及純化，取代利用大量有機溶劑提取、大量無機鹽沉淀等對環(huán)境污染的方法，且將超濾濃縮得到的大量透過液進行重復(fù)利用，具有節(jié)能減排、經(jīng)濟環(huán)保且酶活高的優(yōu)點，是一種環(huán)境友好型生產(chǎn)工藝。本發(fā)明所述方法提取得到的過氧化氫酶酶活至少達到1000U/mg以上，產(chǎn)品回收率達到18%以上，均高于現(xiàn)有的從動物肝臟中提取過氧化氫酶的方法，適合工業(yè)化生產(chǎn)的要求。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為本發(fā)明所述的從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法的工藝流程圖。

【具體實施方式】
[0026]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做詳細說明，以令本領(lǐng)域普通技術(shù)人員參閱本說明書后能夠據(jù)以實施。
[0027]如圖1所示，一種從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法，其中，
[0028]以牛肝臟為原料提取獲得過氧化氫酶粗提液，將所得過氧化氫酶粗提液采用0.004-0.006μπι的中空纖維濾膜，本發(fā)明所用濾膜為由北京海德能提供的型號為HU10-90，孔徑為0.005μπι的中空纖維濾膜，并以10_20L/h的流速進行超濾濃縮，截留分子量10萬以上的肽鏈，收集超濾截留液得到含有高濃度過氧化氫酶的過氧化氫酶濃縮液，而將超濾透過液回收到儲蓄罐中，并利用鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)透過液的pH值為7.0-7.8備用。另外，在進行超濾濃縮之前先用純凈水對超濾設(shè)備進行沖洗，將超濾設(shè)備的管道及容器沖洗干凈后再加入所述過氧化氫酶粗提液進行超濾濃縮。
[0029]此外，還包括以下步驟:
[0030]步驟一、純化，將所得過氧化氫酶濃縮液采用Sephacryl S-200凝膠進行凝膠過濾層析，在進行凝膠過濾層析之前用濃度為0.09-0.llmol/L, pH值為7.0-7.8的磷酸緩沖液對所述凝膠柱進行沖洗，上樣后用濃度為0.09-0.llmol/L, pH值為7.0-7.8的磷酸緩沖液進行洗脫，流速為1.0-2.0L/h，收集層析洗脫液得到純化的過氧化氫酶母液；
[0031]步驟二、冷凍干燥，將所得過氧化氫酶母液經(jīng)過冷凍干燥，既得所述過氧化氫酶，冷凍干燥溫度為-55-60°C，優(yōu)選_55°C，所用冷凍干燥儀器為FD-18S型冷凍干燥機。
[0032]所述的從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法中，所述過氧化氫酶粗提液的制備方法包括以下步驟:
[0033]步驟一、搗碎勻漿，將新鮮牛肝臟用水洗凈后切碎，將切碎的牛肝臟和pH值為
7.0-7.8的磷酸緩沖液按照體積比1: 6-10混合后，保持溫度25-30°C用組織搗碎勻漿機進行搗碎20-30min，勻漿機轉(zhuǎn)速為2000-3000rpm，得到牛肝勻漿；
[0034]步驟二、超聲提取，將所得牛肝勻漿進行超聲振蕩10_30min，超聲波強度為30-80W,使細胞破碎，細胞內(nèi)的過氧化氫酶快速溶出，得到牛肝過氧化氫酶勻漿；
[0035]步驟三、離心分離，將所得牛肝過氧化氫酶勻漿用低溫離心機在10_30°C下進行離心15-25min，離心分離的轉(zhuǎn)速大于或等于5000rpm，取上層清液既得所述過氧化氫酶粗提液。
[0036]所述的從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法中，將所述超濾濃縮得到的透過液進行收集，并調(diào)節(jié)所得透過液的PH值為7.0-7.8后，可取代磷酸緩沖液與切碎的牛肝臟混合后進行搗碎，從而將超濾產(chǎn)生的大量透過液回收利用，實現(xiàn)提取工藝中的廢水零排放。
[0037]實施例1
[0038]將新鮮牛肝20kg用自來水洗凈，切碎，加入6倍體積的pH值為7.2的磷酸緩沖液，用組織搗碎勻漿機搗碎，然后超聲波強度為20W提取20min，得到牛肝勻漿，取牛肝勻漿，然后用低溫離心機在15°C下于6000rpm離心20分鐘，上層清液為得到過氧化氫酶粗提液。先沖洗超濾設(shè)備，確定管道及容器干凈后，原料槽裝入料液，用北京海德能HU10-90，，以1L/h的流速進行超濾濃縮，得到過氧化氫酶濃縮液，而透過液回收到儲罐中，然后調(diào)節(jié)PH值為7.2后替代進行搗碎時的磷酸緩沖液使用。將得到的過氧化氫酶濃縮液采用SephacrylS-200凝膠柱進行凝膠過濾層析，裝柱后，用濃度為0.lmol/L，pH值為7.2的磷酸緩沖液沖洗后上樣，用0.lmol/L，pH值為7.2的磷酸緩沖液進行洗脫，流速1.0L/h，收集酶液得到過氧化氫酶母液，純化后的過氧化氫酶母液采用FD-18S型冷凍干燥機，_55°C冷凍干燥，得到過氧化氫酶產(chǎn)品，酶活達11000U/mg。
[0039]實施例2
[0040]將新鮮牛肝20kg用自來水洗凈，切碎，加入6倍體積的pH值為7.4的磷酸緩沖液，用組織搗碎勻漿機搗碎，然后超聲波強度為20W提取25min，得到牛肝勻漿，取牛肝勻漿，然后用低溫離心機在15°C下于6000rpm離心20分鐘，上層清液為得到過氧化氫酶粗提液。先沖洗超濾設(shè)備，確定管道及容器干凈后，原料槽裝入料液，用北京海德能HU10-90，以15L/h的流速進行超濾濃縮，得到過氧化氫酶濃縮液，而透過液回收到儲罐中，然后調(diào)節(jié)PH值為7.4后替代進行搗碎時的磷酸緩沖液使用。將得到的過氧化氫酶濃縮液采用SephacrylS-200凝膠柱進行凝膠過濾層析，裝柱后，用濃度為0.lmol/L，pH值為7.4的磷酸緩沖液沖洗后上樣，用0.lmol/L，pH值為7.4的磷酸緩沖液進行洗脫，流速1.5L/h，收集酶液得到過氧化氫酶母液，純化后的過氧化氫酶母液采用FD-18S型冷凍干燥機，_55°C冷凍干燥，得到過氧化氫酶產(chǎn)品，酶活達11000U/mg。
[0041]實施例3
[0042]將新鮮牛肝20kg用自來水洗凈，切碎，加入6倍體積的pH值為7.6的磷酸緩沖液，用組織搗碎勻漿機搗碎，然后超聲波強度為25W提取30min，得到牛肝勻漿，取牛肝勻漿，然后用低溫離心機在10°C下于7000rpm離心20分鐘，上層清液為得到過氧化氫酶粗提液。先沖洗超濾設(shè)備，確定管道及容器干凈后，原料槽裝入料液，用北京海德能HU10-90，以15L/h的流速進行超濾濃縮，得到過氧化氫酶濃縮液，而透過液回收到儲罐中，然后調(diào)節(jié)PH值為7.6后替代進行搗碎時的磷酸緩沖液使用。將得到的過氧化氫酶濃縮液采用SephacrylS-200凝膠柱進行凝膠過濾層析，裝柱后，用濃度為0.lmol/L，pH值為7.6的磷酸緩沖液沖洗后上樣，用0.lmol/L，pH值為7.6的磷酸緩沖液進行洗脫，流速1.5L/h，收集酶液得到過氧化氫酶母液，純化后的過氧化氫酶母液采用ro-18S型冷凍干燥機，-55°C冷凍干燥，得到過氧化氫酶產(chǎn)品，酶活達12000U/mg。
[0043]盡管本發(fā)明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細節(jié)和這里示出與描述的圖例。
【權(quán)利要求】
1.一種從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法，其特征在于， 以牛肝臟為原料提取獲得過氧化氫酶粗提液，將所得過氧化氫酶粗提液采用孔徑為0.004-0.006 μ m的中空纖維濾膜，以10_20L/h的流速進行超濾濃縮，收集超濾截留液得到含有高濃度過氧化氫酶的過氧化氫酶濃縮液； 此外，還包括以下步驟: 步驟一、純化，將所得過氧化氫酶濃縮液采用Sephacryl S-200凝膠進行凝膠過濾層析，用PH值為7.0-7.8的磷酸緩沖液進行洗脫，流速為1.0-2.0L/h，收集層析洗脫液得到純化的過氧化氫酶母液； 步驟二、冷凍干燥，將所得過氧化氫酶母液經(jīng)過冷凍干燥，既得所述過氧化氫酶。
2.如權(quán)利要求1所述的從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法，其特征在于，所述過氧化氫酶粗提液的制備方法包括以下步驟: 步驟一、搗碎勻漿，將切碎的牛肝臟和PH值為7.0-7.8的磷酸緩沖液按照體積比I: 6-10混合后，保持溫度25-30°C進行搗碎20-30min，得到牛肝勻漿； 步驟二、超聲提取，將所得牛肝勻漿進行超聲振蕩10_30min，超聲波強度為30-80W，得到牛肝過氧化氫酶勻漿； 步驟三、離心分離，將所得牛肝過氧化氫酶勻漿在10-30°C下進行離心15-25min，取上層清液既得所述過氧化氫酶粗提液。
3.如權(quán)利要求2所述的從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法，其特征在于，將所述超濾濃縮得到的透過液進行收集，并調(diào)節(jié)所得透過液的PH值為7.0-7.8后，可取代磷酸緩沖液與切碎的牛肝臟混合后進行搗碎勻漿。
4.如權(quán)利要求1所述的從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法，其特征在于，在進行凝膠過濾層析之前用PH值為7.0-7.8的磷酸緩沖液對所述凝膠柱進行沖洗。
5.如權(quán)利要求1所述的從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法，其特征在于，步驟二中冷凍干燥溫度為-55—60°C。
6.如權(quán)利要求2所述的從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法，其特征在于，離心分離的轉(zhuǎn)速為大于或等于5000rpm。
7.如權(quán)利要求2或4所述的從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法，其特征在于，所用磷酸緩沖液的濃度均為0.09-0.llmol/L.
【文檔編號】C12N9/08GK104178466SQ201410408847
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月19日
【發(fā)明者】張春穎, 楊旭錦 申請人:西藏天虹科技股份有限責(zé)任公司