專利名稱：人的細胞間粘附分子－1膜外i－ⅲ功能區(qū)基因表達產(chǎn)物及其制備方法和該產(chǎn)物在放免技 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種人的細胞間粘附分子-1膜外I-III功能區(qū)基因表達產(chǎn)物及其制備方法和該產(chǎn)物在放免技術(shù)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自身免疫性甲狀腺疾病，是一個多發(fā)病，包括Graves’病(GD)、慢性淋巴性甲狀腺炎(HT)等，其發(fā)病機理至今尚未完全明了。近年研究表明細胞間粘附分子-1(intracellular adhesion molecule-1，ICAM-1)與其發(fā)病密切相關(guān)。細胞間粘附分子是指一群在細胞表面表達具有細胞間粘附作用的糖蛋白物質(zhì)，它們參與細胞與細胞、細胞與細胞外基質(zhì)相互識別、相互粘著、信號傳遞及轉(zhuǎn)移、免疫細胞相互識別和相互作用，白細胞的再循環(huán)和遷移等功能。20世紀90年代初期Frank Schuppert等人應(yīng)用Northern印漬技術(shù)發(fā)現(xiàn)在自身免疫性甲狀腺炎患者中有ICAM-1表達，而正常人表達甚低或不表達。Mirazaki，Monica M等用免疫組化技術(shù)發(fā)現(xiàn)GD和HT患者甲狀腺濾泡上皮細胞和甲狀腺血管內(nèi)皮細胞都有ICAM-1表達。
Graves’病是一種常見的自身免疫性甲狀腺疾病，TRAb的出現(xiàn)為其臨床特征。由于Graves’病是一種慢性病，在治療過程中，以往多根據(jù)自身抗體的變化來評價治療效果，以增、減藥物或者停藥。
目前認為由于甲狀腺自身抗體會導致產(chǎn)生甲狀腺內(nèi)的自身免疫性炎癥，在該部位會出現(xiàn)淋巴細胞的浸潤，而T淋巴細胞的定位到自身免疫性炎癥部位與內(nèi)皮細胞，靶細胞的粘附，T細胞與B細胞及抗原遞呈細胞的相互作用等免疫過程中ICAM-1/LFA-1粘附系統(tǒng)起著重要作用。
粘附分子(adhesion molecules)是指由細胞產(chǎn)生存在于細胞表面介導細胞的細胞間或細胞與蒼質(zhì)間相互接觸和結(jié)合的一類分子。1993年第五屆人白細胞分化抗原國際專題討論會上，已將粘附分子單獨列為一組新抗原。根據(jù)結(jié)構(gòu)分為四類，即粘合素超家族、免疫球蛋白超家族、selectin家族和Cadherin家族。
細胞間粘附分子-1是最早發(fā)現(xiàn)的免疫球蛋白超家族粘附分子之一，是位細胞表面的單鏈糖蛋白，ICAM-1分子量為80-115KD。在細胞膜上分細胞外段、跨膜區(qū)段和細胞內(nèi)段。ICAM-1的mRNA含1846個堿基，編碼532個氨基酸。1988年Donald，E.S等報道編碼的532個氨基酸中含有27個氨基酸的信號態(tài)和505個氨基酸的ICAM-1蛋白，其中1-453編碼，細胞外區(qū)的分1-5細胞外免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)區(qū)，分別為1-88，89-185，186-284，285-385，386-483。其中第一個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)區(qū)與淋巴細胞功能相關(guān)抗原-1(LFA-1)配基相結(jié)合，參與抗原識別；第三個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)區(qū)與補體受體3(Mac-1)相結(jié)合。ICAM-1分布廣泛如血管內(nèi)皮細胞、胸腺上皮細胞、纖維母細胞、多種腫瘤細胞以及甲狀腺上皮細胞等。
可溶性細胞間粘附分子-1(s ICAM-1)為細胞表面ICAM-1脫落所形成的可溶形式，分子量約為80KD，正常人血清濃度為100-200ng/ml，sICAM-1與ICAM-1同樣具有LFA-1結(jié)合功能其異常表達是導致Graves’病發(fā)生的重要因素之一。與其它臨床常用指標相比，Graves’病患者體內(nèi)血清sICAM-1水平對于反映其疾病的狀況則更為快速、靈敏，所以對于判斷Graves’病的療效、停藥和復發(fā)具有重要意義。
目前，國內(nèi)外并無ICAM-1的甲狀腺提取物，而且國外經(jīng)真核系統(tǒng)獲取的ICAM-1基因工程產(chǎn)品價格昂貴。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中，國內(nèi)外尚無ICAM-1的甲狀腺提取物，以及運用基因工程技術(shù)制備表達產(chǎn)物，并應(yīng)用在臨床檢驗中，而提出的人的細胞間粘附分子-1膜外I-III功能區(qū)基因表達產(chǎn)物及其制備方法和該產(chǎn)物在放免技術(shù)中的應(yīng)用。
本發(fā)明是按以下技術(shù)方案實現(xiàn)的。
一種人的細胞間粘附分子-1膜外I-III功能區(qū)基因表達產(chǎn)物，該表達產(chǎn)物可以替代人的細胞間粘附分子-1全長的核苷酸序列，其重組蛋白具有免疫活性，其融合蛋白分子量為66.37kD，產(chǎn)率約為35mg/L培養(yǎng)基。
所述的功能區(qū)基因表達產(chǎn)物，其提取的重組質(zhì)粒命名為ZpUCICAM，且其基因片段大小與所要克隆基因片段一致。
所述的功能區(qū)基因表達產(chǎn)物，其功能區(qū)基因表達載體的重組質(zhì)粒命名為ZpET42aICM，且其接口序列、氨基酸讀碼框架為CC ATG GGA TAT CGG CAG ACA TCT GTG TCC CCPET42a載體 目的基因。
一種人的細胞間粘附分子-1膜外I-III功能區(qū)基因表達產(chǎn)物的制備方法，是由Graves’病患者甲狀腺組織中提取的總RNA，經(jīng)RT-PCR合成并擴增出ICAM-1膜外I-III功能區(qū)編碼基因，克隆入pUC18載體；將ICAM-1膜外I-III功能區(qū)編碼基因重組到表達型質(zhì)粒pET42a中，再將重組表達型質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入原核表達菌中；在親和純化柱中，純化獲得表達產(chǎn)物GST-ICAM-1，復經(jīng)親和層析純化，獲取重組ICAM-1膜外I-III功能區(qū)融合蛋白GST-ICAM-1。
所述的表達產(chǎn)物的制備方法，其重組表達型質(zhì)粒是轉(zhuǎn)化入E.coli BL21表達菌中表達的。
所述的表達產(chǎn)物的制備方法，其重組表達型質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coliBL21表達菌中的表達條件為以0.5-1％乳糖為誘導劑，20-37℃，誘導3-24小時。
所述的表達產(chǎn)物的制備方法，是將重組表達型質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coli BL21表達菌中的表達條件為以IPTG0.1-1.0mM為誘導劑。
所述的表達產(chǎn)物的制備方法，是將ICAM-1膜外I-III功能區(qū)編碼基因重組到表達型質(zhì)粒PET28b中，再將重組表達型質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入原核表達菌中。
所述的表達產(chǎn)物的制備方法，是將ICAM-1膜外I-III功能區(qū)編碼基因重組到表達型質(zhì)粒PGEX4T3中，再將重組表達型質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入原核表達菌中。
人的細胞間粘附分子-1膜外I-III功能區(qū)基因表達產(chǎn)物在放免技術(shù)中的應(yīng)用，是以表達產(chǎn)物GST-ICAM-1作為抗原，免疫家兔后獲得兔抗人的多克隆抗體，再將兔抗人的多克隆抗體作為一抗用于人血清sICAM-1放射免疫分析技術(shù)中。
這樣的人的細胞間粘附分子-1膜外I-III功能區(qū)基因表達產(chǎn)物在原核中的表達系統(tǒng)較真核系操作簡便，成本較低，且表達產(chǎn)品易于純化，所以使用原核表達系統(tǒng)獲取表達產(chǎn)物GST-ICAM-1，進而以此作為抗原用于免疫家兔，在國內(nèi)外率先研制出人血清sICAM-1放射免疫技術(shù)，并初步應(yīng)用于臨床檢測，對于判斷Graves’病的療效、停藥和復發(fā)具有重要意義。


圖1為RT-PCR擴增人ICAM-1膜外I-III功能區(qū)基因圖2為Bgl I酶切鑒定PCR產(chǎn)物圖3為HindIII單酶切鑒定重組質(zhì)粒ZpUCICAM圖4為HindIII和EcoRI雙酶切鑒定重組質(zhì)粒ZpUCICAM圖5為PCR鑒定重組質(zhì)粒ZpUCICAM圖6為接口序列7為ZpET42aICAM表達載體不同條件下誘導表達圖8為IPTG與乳糖誘導表達的比較圖9為融合蛋白GST-ICAM-1純化結(jié)果比較圖10為考馬斯亮藍蛋白定量法標準曲線圖11為重組蛋白GST-ICAM-1 Western Blot結(jié)果具體實施方式
(一)、獲取人ICAM-1膜外I-III功能區(qū)基因及其鑒定TRIzol法提取經(jīng)手術(shù)切除的Graves病患者甲狀腺組織總RNA，RT-PCR法合成并擴增人ICAM-1膜外I-III功能區(qū)基因，以100bp DNA梯度標準為核酸分子量標準，1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物結(jié)果顯示約868bp處可見一條清晰的電泳條帶，與所要擴增的目的基因片段大小一致如圖1，圖中1 Bgl I酶切產(chǎn)物，2 100bp DNALadder。
Bgl I酶切PCR產(chǎn)物，1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切產(chǎn)物結(jié)果，顯示在505和363bp處可見清晰的兩條電泳條帶，與理論計算結(jié)果相符合如圖2，圖中1 Bgl I酶切產(chǎn)物，2 100bp DNA Ladder。
(二)、人ICAM-1膜外I-III功能區(qū)基因克隆及鑒定1、重組質(zhì)粒ZpUCICAM酶切鑒定將人ICAM-1膜外I-III功能區(qū)基因插入到pUC18質(zhì)粒載體，命名為ZpUCICAM，轉(zhuǎn)導入DH5α菌中。堿裂解法提取重組質(zhì)粒ZpUCICAM，以HindIII單酶切后，1％瓊脂糖凝膠電泳顯示約在3554bp處有一條清晰的電泳條帶，而對照pUC18質(zhì)粒在2686bp處如圖3，圖中1 HindIII酶切重組質(zhì)粒ZpUCICAM，2 HindIII酶切pUC18質(zhì)粒，3 15000DL DNA Marker。
HindIII和EcoRI雙酶切鑒定結(jié)果顯示在2631bp和923bp處出現(xiàn)兩條電泳條帶，而對照空pUC18質(zhì)粒在2631bp處僅出現(xiàn)一條電泳條帶，與理論計算結(jié)果相一致，如圖4，圖中1 HindIII、EcoRI雙酶切重組質(zhì)粒ZpUCICAM，2 HindIII、EcoRI雙酶切pUC18質(zhì)粒，3 15000DL DNA Marker。
2、重組質(zhì)粒ZpUCICAM的PCR鑒定以ZpUCICAM為模板，PCR擴增人ICAM-1膜外I-III功能區(qū)基因，結(jié)果顯示868bp處可見一條清晰的電泳條帶，與所要克隆的目的基因片段大小一致，而對照空pUC18質(zhì)粒無電泳條帶，如圖5，圖中1PCR擴增pUC18產(chǎn)物，2 PCR擴增ZpUCICAM產(chǎn)物，3 200bp DNA Ladder。
3、重組質(zhì)粒ZpUCICAM測序分析以純化后重組質(zhì)粒ZpUCICAM為模板，在CEQ2000型DNA序列分析儀對含人ICAM-1膜外I-III功能區(qū)基因的重組質(zhì)粒進行序列測定，測定結(jié)果與Donald E.Staunton等報告的序列完全一致，見下ICAM-1 I-III功能區(qū)基因與氨基酸序列(852bp＝284aa)CAG ACA TCT GTG TCC CCC TCA AAA GTC ATC CTG CCC CGG GGA GGC TCC GTGGln Thr Ser Val Ser Pro Ser Lys Val Ile Leu Pro Arg Gly Gly Ser ValCTG GTG ACA TGC AGC ACC TCC TGT GAC CAG CCC AAG TTG TTG GGC ATA GAGLeu Val Thr Cys Ser Thr Ser Cys Asp Gln Pro Lys Leu Leu Gly Ile GluACC CCG TTG CCT AAA AAG GAG TTG CTC CTG CCT GGG AAC AAC CGG AAG GTGThr Pro Leu Pro Lys Lys Glu Leu Leu Leu Pro Gly Asn Asn Arg Lys ValTATGAA CTG AGC AAT GTG CAA GAA GAT AGC CAA CCA ATG TGC TAT TCA AACTyr Glu Leu Ser Asn Val Gln Glu Asp Ser Gln Pro Met Cys Tyr Ser AsnTGC CCT GAT GGG CAG TCA ACA GCT AAA ACC TTC CTC ACC GTG TAC TGG ACTCys Pro Asp Gly Gln Ser Thr Ala Lys Thr Phe Leu Thr Val Tyr Trp ThrCCA GAA CGG GTG GAA CTG GCA CCC CTC CCC TCT TGG CAG CCA GTG GGC AAGPro Glu Arg Val Glu Leu Ala Pro Leu Pro ser Ttp Gln Pro Val Gly LysAAC CTT ACC CTA CGC TGC CAG GTG GAG GGT GGG GCA CCC CGG GCC AAC CTCAsn Leu Thr Leu Arg Cys Gln Val Glu Gly Gly Ala Pro Arg Ala Asn LeuACC GTG GTG CTG CTC CGT GGG GAG AAG GAG CTG AAA CGG GAG CCA GCT GTGThr Val Val Leu Leu Arg Gly Glu Lys Glu Leu Lys Arg Glu Pro Ala ValGGG GAG CCC GCT GAG GTC ACG ACC ACG GTG CTG GTG AGG AGA GAT CAC CATGly Glu Pro Ala Glu Val Thr Thr Thr Val Leu Va1 Arg Ar Aspg His HisGGA GCC AAT TTC TCG TGC CGC ACT GAA CTG GAC CTG CGG CCC CAA GGG CTGGly Ala Asn Phe Ser Cys Arg Thr Glu Leu Asp Leu Arg Pro Gln Gly LeuGAG CTG TTT GAG AAC ACC TCG GCC CCC TAC CAG CTC CAG ACC TTT GTC CTGGlu Leu Phe Glu Asn Thr Ser Ala Pro Tyr Gln Leu Gln Thr Phe Val LeuCCA GCG ACT CCC CCA CAA CTT GTC AGC CCC CGG GTC CTA GAG GTG GAC ACGPro Ala Thr Pro Pro Gln Leu Val Ser Pro Arg Val Leu Glu Val Asp ThrCAG GGG ACC GTG GTC TGT TCC CTG GAC GGG CTG TTC CCA GTC TCG GAG GCCGln Gly Thr Val Val Cys Ser Leu Asp Gly Leu Phe Pro Val Ser Glu AlaCAG GTC CAC CTG GCA CTG GGG GAC CAG AGG TTG AAC CCC ACA GTC ACC TATGln Val His Leu Ala Leu Gly Asp Gln Arg Leu Asn Pro Thr Va Thr TyrlGGC AAC GAC TCC TTC TCG GCC AAG GCC TCA GTC AGT GTG ACC GCA GAG GACGly Asn Asp Ser Phe Ser Ala Lys Ala Ser Val Ser Val Thr Ala Glu AspGAG GGC ACC CAG CGG CTG ACG TGT GCA GTA ATA CTG GGG AAC CAG AGC CAGGlu Gly Thr Gln Arg Leu Thr Cys Ala Val Ile Leu Gly Asn Gln Ser GlnGAG ACA CTG CAG ACA GTG ACC ATC TAC AGC TTT CCGGlu Thr Leu Gln Thr Val Thr Ile Tyr Ser Phe Pro。
(三)、人ICAM-1膜外I-III功能區(qū)基因表達載體的構(gòu)建及鑒定將人ICAM-1膜外I-III功能區(qū)基因插入表達質(zhì)粒pET42a中，命名為ZpET42aICAM。
1、重組質(zhì)粒ZpET42aICAM接口序列測序分析結(jié)果顯示重組質(zhì)粒ZpET42aICAM 5’-端接口序列完全正確，氨基酸讀碼框架正確，如圖6，圖中1為PET42a載體 2 3目的基因。
(四)、人ICAM-1膜外I-III功能區(qū)基因在大腸桿菌中的表達將ZpET42aICAM表達載體轉(zhuǎn)化入E.coli BL21表達菌中，以乳糖為誘導劑進行誘導表達，同時以空菌，空質(zhì)粒為對照。
表達條件為以0.5％乳糖為誘導劑，20℃，誘導6小時。超聲碎菌后取上清液上樣，10％SDS-PAGE結(jié)果顯示重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)在分子量約為64.79kD處有一明顯加深的蛋白帶，而空載體質(zhì)粒在分子量約為35.09kD處有一蛋白帶，空菌在兩處均無蛋白帶，如圖7，圖中1. 1.0mM IPTG37℃誘導E.coli BL21(DE3)3小時碎菌上清2. 1.0mM IPTG37℃誘導pET42a轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)3小時碎菌上清3. 1.0mM IPTG25℃誘導ZpET42aICAM轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)3小時碎菌上清4. 1.0mM IPTG30℃誘導ZpET42aICAM轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)3小時碎菌上清5. 1.0mM IPTG37℃誘導ZpET42aICAM轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)3小時碎菌上清6. 1.0mM IPTG37℃誘導E.coli BL21(DE3)pLysS 3小時碎菌上清7. 1.0mM IPTG37℃誘導pET42a轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)pLysS 3小時碎菌上清8. 1.0mM IPTG25℃誘導ZpET42aICAM轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)pLysS 3小時碎菌上清9. 1.0mM IPTG30℃誘導ZpET42aICAM轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)pLysS 3小時碎菌上清10. 1.0mM IPTG37℃誘導ZpET42aICAM轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)pLysS 3小時碎菌上清11.低分子量蛋白標準。
(五).誘導劑IPTG與乳糖誘導表達的比較ZpET42aICAM為最佳表達載體，以1.0mMIPTG為誘導劑，在最佳表達條件下，100ml 2-YT液體培養(yǎng)基中誘導表達，同時與以0.5％乳糖為誘導劑，誘導溫度20℃，誘導時間分別為6小時及過夜比較目的蛋白的表達量。結(jié)果顯示1.0mMIPTG，5％乳糖誘導6小時和過夜碎菌上清目的蛋白占總體蛋白含量分別為26.71％，41.61％和42.20％。如圖8，圖中
1. 0.5％乳糖誘導過夜碎菌沉淀2. 0.5％乳糖誘導過夜碎菌上清3. 0.5％乳糖誘導6小時碎菌沉淀4. 0.5％乳糖誘導6小時碎菌上清5. 1.0mMIPTG誘導3小時碎菌沉淀6. 1.0mMIPTG誘導3小時碎菌上清。
(六)、重組人ICAM-1膜外I-III功能區(qū)基因表達產(chǎn)物的純化與鑒定1.融合蛋白的純化超聲碎菌后的上清液分別以His.Tag融合蛋白的純化系統(tǒng)和GST.Tag融合蛋白的純化系統(tǒng)純化融合蛋白GST-ICAM-1，10％SDS-PAGE結(jié)果顯示兩種純化系統(tǒng)均能在64.79kD處可見一條清晰蛋白條帶，但是GST.Tag融合蛋白的純化系統(tǒng)還存在其它兩條蛋白條帶，如圖9，圖中1 GST.Tag融合蛋白純化系統(tǒng)純化融合蛋白GST-ICAM-1，2.His.Tag融合蛋白純化系統(tǒng)純化融合蛋白GST-ICAM-1，3.低分子量蛋白標準。
經(jīng)比較后決定采用His.Tag融合蛋白的純化系統(tǒng)。
2、表達產(chǎn)物的鑒定(1)、分子量的測定根據(jù)低分子量蛋白標準的各個條帶的分子量及其相對遷移率，建立Rf與LgMW的直線回歸方程，將融合蛋白的Rf值代入此回歸方程，算得融合蛋白分子量為66.37kD。
(2)、蛋白定量考馬斯亮藍染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后在595nm處存在紫外吸收峰。His.Tag融合蛋白的純化系統(tǒng)純化所得蛋白，酶標儀根據(jù)OD值可自動計算蛋白濃度，標準曲線如圖10。融合蛋白的濃度為35mg/L左右。折算成蛋白產(chǎn)量，融合蛋白約為35mg/L培養(yǎng)基。
(3)、免疫學活性的鑒定純化重組GST-ICAM-1從SDS-PAGE上電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上完全，經(jīng)Western Blot證實重組蛋白具有免疫活性。如圖11，圖中1.GST對照，2.重組蛋白GST-ICAM-1，3.低分子量蛋白標準。
(七)、重組蛋白GST-ICAM-1在臨床檢測中的初步應(yīng)用用GST-ICAM-1免疫家兔，制備抗體，作為人血清sICAM-1放射免疫方法中的抗體，初步應(yīng)用于臨床檢測。檢測結(jié)果顯示治療前Graves’病組、藥物治療后甲狀腺功能恢復正常的Graves’病組血清sICAM-1明顯高于正常組(P＜0.01)，而單純性甲狀腺腫大患者組與正常組無蒸異(P＞0.05)；治療前Graves’病組明顯高于藥物治療后甲狀腺功能恢復正常的Graves’病組(P＜0.05)；Graves’病患者在甲狀腺次全切除前后、131I治療前后及抗甲狀腺藥物治療前后，經(jīng)自身配對t檢驗表明血清sICAM-1明顯降低(P＜0.05)；Graves’病停藥復發(fā)患者組血清sICAM-1明顯高于甲狀腺功能恢復正常的Graves’病患者組(P＜0.01)。
權(quán)利要求
1.一種人的細胞間粘附分子-1膜外I-III功能區(qū)基因表達產(chǎn)物，其特征在于該表達產(chǎn)物可以替代人的細胞間粘附分子-1全長的核苷酸序列，其重組蛋白具有免疫活性，其融合蛋白分子量為66.37kD，產(chǎn)率約為35mg/L培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的功能區(qū)基因表達產(chǎn)物，其特征在于提取的重組質(zhì)粒命名為ZpUCICAM，且其基因片段大小與所要克隆基因片段一致。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的功能區(qū)基因表達產(chǎn)物，其特征在于功能區(qū)基因表達載體的重組質(zhì)粒命名為ZpET42aICM，且其接口序列、氨基酸讀碼框架為CC ATG GGA TAT CGG CAG ACA TCT GTG TCC CCPET42a載體 目的基因。
4.一種人的細胞間粘附分子-1膜外I-III功能區(qū)基因表達產(chǎn)物的制備方法，其特征在于由Graves’病患者甲狀腺組織中提取的總RNA，經(jīng)RT-PCR合成并擴增出ICAM-1膜外I-III功能區(qū)編碼基因，克隆入pUC18載體；將ICAM-1膜外I-III功能區(qū)編碼基因重組到表達型質(zhì)粒pET42a中，再將重組表達型質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入原核表達菌中；在親和純化柱中，純化獲得表達產(chǎn)物GST-ICAM-1，復經(jīng)親和層析純化，獲取重組ICAM-1膜外I-III功能區(qū)融合蛋白GST-ICAM-1。
5.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達產(chǎn)物的制備方法，其特征在于重組表達型質(zhì)粒是轉(zhuǎn)化入E.coli BL21表達菌中表達的。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達產(chǎn)物的制備方法，其特征在于重組表達型質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coli BL21表達菌中的表達條件為以0.5-1％乳糖為誘導劑，20-37℃，誘導3-24小時。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達產(chǎn)物的制備方法，其特征在于重組表達型質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coli BL21表達菌中的表達條件為以IPTG0.1-1.0mM為誘導劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達產(chǎn)物的制備方法，其特征在于將ICAM-1膜外I-III功能區(qū)編碼基因重組到表達型質(zhì)粒PET28b中，再將重組表達型質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入原核表達菌中。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達產(chǎn)物的制備方法，其特征在于將ICAM-1膜外I-III功能區(qū)編碼基因重組到表達型質(zhì)粒PGEX4T3中，再將重組表達型質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入原核表達菌中。
10.人的細胞間粘附分子-1膜外I-III功能區(qū)基因表達產(chǎn)物在放免技術(shù)中的應(yīng)用，其特征在于以表達產(chǎn)物GST-ICAM-1作為抗原，免疫家兔后獲得兔抗人的多克隆抗體，再將兔抗人的多克隆抗體作為一抗用于人血清sICAM-1放射免疫分析技術(shù)中。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人的細胞間粘附分子－1膜外I－III功能區(qū)基因表達產(chǎn)物及其制備方法和該產(chǎn)物在放免技術(shù)中的應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。將ICAM－1膜外I－III功能區(qū)編碼基因重組到表達型質(zhì)粒pET42a中，并將其轉(zhuǎn)化入原核表達菌中，純化獲得表達產(chǎn)物GST－ICAM－1；以此作為抗原，免疫家兔后獲得兔抗人的多克隆抗體。這樣制備的人的細胞間粘附分子－1膜外I－III功能區(qū)基因在原核系統(tǒng)的中表達產(chǎn)物較真核系操作簡便，更易于純化，價格便宜，產(chǎn)率高。在國內(nèi)外率先研制出人血清sICAM－1放射免疫分析技術(shù)，并初步應(yīng)用于臨床檢測，對于判斷Graves’病的療效、停藥和復發(fā)具有重要意義。
文檔編號C12N15/63GK1448509SQ02103820
公開日2003年10月15日 申請日期2002年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月29日
發(fā)明者方佩華, 呂枚, 張志友, 何紅鵬, 高碩 申請人:天津醫(yī)科大學總醫(yī)院