專利名稱：從人羊膜上皮細(xì)胞中提取不飽和脂肪酸組合物的方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從人羊膜上皮細(xì)胞中分離有用物質(zhì)的方法，特別涉及從人羊膜上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中提取呈游離狀態(tài)不飽和脂肪酸組合物的方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人羊膜上皮細(xì)胞源自胎盤羊膜組織，是一種成體干細(xì)胞，具有明顯的可塑性和多向分化潛能，在不同生長因子的調(diào)節(jié)下，可分化成來源于3個胚層的不同組織細(xì)胞類型，如肝樣細(xì)胞、心肌樣細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和胰島樣細(xì)胞等。在人胚早期發(fā)育過程中，人羊膜上皮細(xì)胞(Human amniotic epithelial cells, HAECs)起源于胚泡發(fā)育時期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，由上胚層部分細(xì)胞(成羊膜細(xì)胞)于受精后第二周初(第8天)分化而成。HAECs 周緣與中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的原基外胚層相連，于胚胎發(fā)育早期向羊膜腔內(nèi)分泌具有營養(yǎng)作用的羊水，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中起著重要作用，有望成為細(xì)胞替代治療和再生醫(yī)學(xué)的新的細(xì)胞來源。有關(guān)從人羊膜上皮細(xì)胞提取有用物質(zhì)的文獻(xiàn)有一些，現(xiàn)摘錄如下1、中國專利名稱從人羊膜上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)分化出多巴胺能神經(jīng)元的方法及分離所得神經(jīng)元的用途，申請(專利)號CN200910079088. X，申請日2009. 03. 05公開(公告)號CN1018M399A申請(專利權(quán))人中日友好醫(yī)院，地址北京市朝陽區(qū)和平里櫻花東街2號中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所，摘要本發(fā)明涉及從人羊膜上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)分化出多巴胺能神經(jīng)元的方法，該方法包括以下步驟取新鮮人胎盤，將人羊膜剝離，用生理鹽水反復(fù)沖洗除后，用無菌D-hank’ s液浸泡，再用生理鹽水漂洗；將人羊膜置于0. 25%胰蛋白酶溶液中，在36. 50C -37. 5°C溫度下消化；用含有10%胎牛血清的DMEM/F12終止上述人羊膜在胰蛋白酶溶液中的消化，然后用細(xì)胞篩對上述溶液進(jìn)行過濾，收集得到的細(xì)胞為人羊膜上皮細(xì)胞；分離所獲得的人羊膜上皮細(xì)胞，用10%無胎牛血清的培養(yǎng)基對分離出來的上述人羊膜上皮細(xì)胞進(jìn)行體外傳代培養(yǎng)；選擇生長狀態(tài)良好的3或4或5或6代人羊膜上皮細(xì)胞，然后用神經(jīng)干細(xì)胞分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；收獲上述多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞。主權(quán)項一種從人羊膜上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)分化出多巴胺能神經(jīng)元的方法，該方法包括以下步驟 (1)取新鮮人胎盤組織，將人羊膜組織剝離，用生理鹽水反復(fù)沖洗除去血凝塊，然后用無菌 D-hank' s液浸泡1. 2-2個小時后，再用生理鹽水漂洗2_5次；(2)將漂洗過的人羊膜組織置于0. 25%的胰蛋白酶溶液中，在36. 5°C -37. 5°C的溫度下消化10-20分鐘；(3)用含有 10%胎牛血清的DMEM/F12終止上述人羊膜在胰蛋白酶溶液中的消化，然后用180-220目細(xì)胞篩對上述溶液進(jìn)行過濾，收集得到的細(xì)胞為人羊膜上皮細(xì)胞；(4)分離所獲得的人羊膜上皮細(xì)胞，用10%無胎牛血清的培養(yǎng)基對分離出來的上述人羊膜上皮細(xì)胞進(jìn)行體外傳代培養(yǎng)；(5)選擇生長狀態(tài)良好的3或4或5或6代人羊膜上皮細(xì)胞，然后用神經(jīng)干細(xì)胞分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；(6)將上述人羊膜上皮細(xì)胞在神經(jīng)干細(xì)胞分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)7-14天后，對收獲的部分細(xì)胞進(jìn)行鑒定，確認(rèn)酪氨酸羥化酶陽性細(xì)胞的存在，并進(jìn)行定量分析，得到了包括多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞的細(xì)胞；(7)收獲上述所有細(xì)胞。2、中國專利名稱羊膜上皮細(xì)胞在制藥中的用途，申請(專利)號 CN200810043858. 0，公開(公告)號:CN101721430A，申請(專利權(quán))人和泓生物技術(shù)(上海)有限公司，地址上海市浦東新區(qū)張江高科技園區(qū)郭守敬路351號2號樓694-11室，發(fā)明(設(shè)計)人郭禮和；劉新；洪燕龍；尚婧瑨；龐力，摘要羊膜上皮細(xì)胞在治療出血性腦血管病的藥物中的用途。該發(fā)明公開了羊膜上皮細(xì)胞在制備治療和/或改善出血性腦血管病中的用途。本發(fā)明所述羊膜上皮細(xì)胞能有效治療和/或改善出血性腦血管病，顯著地改善出血腦血管病患者的行動功能，明顯地減少了出血性腦血管病所導(dǎo)致的腦水腫癥狀；羊膜上皮細(xì)胞因不或弱表達(dá)MHC，治療無需配型；羊膜上皮細(xì)胞也不表達(dá)端粒酶，細(xì)胞增殖受控，移植治療是安全的；同時，羊膜上皮細(xì)胞來源非常廣泛，不會產(chǎn)生倫理或道德問題。因此，本發(fā)明為今后臨床治療或改善出血性腦血管病提供了新的有效選擇。題名人羊膜上皮細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的特性作者宋秀軍陳代雄方寧章濤劉祖林劉金偉萬衛(wèi)紅機(jī)構(gòu)遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州省細(xì)胞工程重點實驗室，刊名中國組織工程研究與臨床康復(fù).2008，12 (38).-7518-文摘背景研究發(fā)現(xiàn)人羊膜上皮細(xì)胞系WISH和FC植入裸鼠體內(nèi)均可分化成軟骨和成骨，作者檢索關(guān)于足月分娩人胎膜的羊膜上皮細(xì)胞是否具有成骨特性國內(nèi)外報道少見。目的以足月分娩胎膜的人羊膜上皮細(xì)胞為前體細(xì)胞，觀察其在體外定向誘導(dǎo)條件下分化為成骨細(xì)胞的能力。設(shè)計、時間及地點細(xì)胞分子水平檢測，于2005-09/2006-12在貴州省細(xì)胞工程重點實驗室完成。材料經(jīng)產(chǎn)婦知情同意，無菌采集健康足月剖宮產(chǎn)胎盤6份，實驗經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。方法采用機(jī)械法剝離胎盤羊膜組織，用胰蛋白酶消化法分離人羊膜上皮細(xì)胞， 按3X10~8L~-1密度接種進(jìn)行原代培養(yǎng)。取第1代人羊膜上皮細(xì)胞，設(shè)立兩組誘導(dǎo)組以 1X10~8L~-1密度接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，24h后更換為含體積分?jǐn)?shù)為0. 1的胎牛血清、lOOnmol/L 地塞米松、50mg/L抗壞血酸、5mmol/L β -甘油磷酸的誘導(dǎo)培養(yǎng)液。對照組換液成分為僅含體積分?jǐn)?shù)為0. 1的胎牛血清的LG-DMEM培養(yǎng)液。主要觀察指標(biāo)原代細(xì)胞用流式細(xì)胞儀分析其表型，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測細(xì)胞角蛋白19的表達(dá)。誘導(dǎo)后采用鈣.鈷法檢測成骨細(xì)胞特異性堿性磷酸酶的表達(dá)，茜素紅S檢測鈣鹽沉積情況。結(jié)果人羊膜上皮細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志CD^、CD44和上皮細(xì)胞標(biāo)志細(xì)胞角蛋白19。向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化21d后， 人羊膜上皮細(xì)胞由圓形變成梭形、三角形，細(xì)胞胞漿內(nèi)堿性磷酸酶呈陽性表達(dá)，且可見鈣鹽沉積。結(jié)論源自足月分娩胎盤的人羊膜上皮細(xì)胞具有分化為成骨細(xì)胞的特性。題名羊膜對人臍血干細(xì)胞分化為多巴胺能神經(jīng)元的作用作者李榮平[1] 季風(fēng)清[1]孫海梅[1]王丹妮[1]曾小蓓[1]趙春禮[2]楊慧[2]機(jī)構(gòu)[1]首都醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)胚胎學(xué)教研室[2]首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所，刊名解剖學(xué)報.2008， 39(6).-790-79文摘目的探討羊膜上皮細(xì)胞對人臍血干細(xì)胞定向分化為多巴胺能神經(jīng)元的作用。方法體外分離、原代培養(yǎng)人羊膜上皮細(xì)胞，通過高速離心制備成條件培養(yǎng)液(CM) 對Pl代臍血干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，應(yīng)用免疫熒光染色和免疫印跡法檢測其酪氨酸羥化酶(TH)及多巴胺轉(zhuǎn)運體(DAT)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果P代臍血于細(xì)胞經(jīng)羊膜上皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)后，TH及DAT陽性細(xì)胞率明顯高于對照組，與對照組比較有顯著性差異(P <0.01)，免疫印跡分析結(jié)果與免疫熒光染色結(jié)果一致。結(jié)論羊膜上皮細(xì)胞能誘導(dǎo)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為多巴胺能神經(jīng)元。
題名人羊膜上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)及肝細(xì)胞特異性蛋白的表達(dá)作者許珊珊顧學(xué)范機(jī)構(gòu)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院新華醫(yī)院上海市兒科醫(yī)學(xué)研究所內(nèi)分泌遺傳代謝病研究室，刊名上海交通大學(xué)學(xué)報醫(yī)學(xué)版.2009，四(3).-303-30文摘目的完善人羊膜上皮細(xì)胞(AECs)的原代培養(yǎng)技術(shù)，檢測肝細(xì)胞特異性蛋白在AECs中的表達(dá)。方法采用膠原酶-胰蛋白酶聯(lián)合消化法分離獲取AECs并進(jìn)行原代培養(yǎng)。分別向培養(yǎng)液中添加10、20、 40ng/mL表皮生長因子(EGF)和lOng/mL的堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長和增殖情況，從中選擇最適宜AECs原代培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)液。以培養(yǎng)液中未添加生長因子的原代培養(yǎng)細(xì)胞作為對照。將羊膜組織石蠟切片和AECs細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫組化染色，檢測4種肝細(xì)胞特異性蛋白的表達(dá)，分別為白蛋白(Alb)、細(xì)胞角蛋白-18(CK-18)、 α -1-抗胰蛋白酶(AAT)和α 甲胎蛋白(AFP)。結(jié)果經(jīng)膠原酶-胰蛋白酶聯(lián)合消化法獲得大量較純的AECs，間雜少數(shù)間充質(zhì)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)液中添加lOng/mLEGF時，AECs生長和增殖速度顯著加快，故最終選擇添加lOng/mLEGF配制細(xì)胞培養(yǎng)液。免疫化學(xué)染色顯示， 羊膜組織和體外傳代培養(yǎng)的AECs中均有Alb、CK-18、AAT和AFP表達(dá)。結(jié)論膠原酶-胰蛋白酶聯(lián)合消化及培養(yǎng)液中添加lOng/mL的EGF是AECs較為適宜的原代培養(yǎng)方法。人羊膜組織及體外培養(yǎng)AECs能表達(dá)肝細(xì)胞特異性蛋白，提示AECs具有肝細(xì)胞的部分生物學(xué)特性。題名人羊膜上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)作者劉芳漆洪波機(jī)構(gòu)重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，刊名激光雜志.2008, ).-86-8文摘目的探討人羊膜上皮細(xì)胞和羊膜間質(zhì)細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定。方法取足月妊娠剖宮產(chǎn)術(shù)中的羊膜組織剪成碎片，胰蛋白酶消化15min，共四次，取消化液IOOOrpm離心5min收集細(xì)胞。剩余羊膜組織加入1. Og/L的膠原酶和0. lg/L的DNA酶，39°C消化120min，消化液IOOOrpm 離心5min收集細(xì)胞。用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)、傳代。倒置顯微鏡下觀察其細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞生長情況。通過免疫細(xì)胞化學(xué)的方法對細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞鑒定。結(jié)果通過不同的酶消化分離法可以將羊膜上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞分離培養(yǎng)，羊膜細(xì)胞體外一段時間內(nèi)表現(xiàn)出良好的細(xì)胞增殖能力和傳代能力。胰蛋白酶消化的細(xì)胞角蛋白染色呈陽性，波形蛋白染色呈陰性。膠原酶消化的細(xì)胞波形蛋白色陽性，角蛋白染色陰性。結(jié)論羊膜上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞能夠在體外分離、擴(kuò)增。這為羊膜細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞治療和組織工程技術(shù)奠定了實驗基礎(chǔ)。題名人羊膜上皮細(xì)胞分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導(dǎo)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞的分化可能性驗證作者張曉明[1]孫海梅[1]楊慧[2]季風(fēng)清[1]機(jī)構(gòu)[1] 首都醫(yī)科大學(xué)組織胚胎學(xué)系，[2]首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)系，刊名中國組織工程研究與臨床康復(fù).2010，14(6). -973-978文摘背景課題組前期實驗已證實人羊膜上皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液可以誘導(dǎo)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞分化為多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞，在此過程中人羊膜上皮細(xì)胞分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體可能起到了重要作用。目的探討人羊膜上皮細(xì)胞分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子對人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞神經(jīng)分化的作用。方法將Pl代人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞按2X 108L-1密度接種，分為3組對照組加入HG-DMEM培養(yǎng)基；誘導(dǎo)組加入人羊膜上皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液；阻斷劑組預(yù)先加入阻斷劑K25M工作液，36°C孵育40min后更換為羊膜上皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液。免疫熒光化學(xué)檢測誘導(dǎo)后人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞神經(jīng)元特異性烯醇化酶及多巴胺轉(zhuǎn)運體的表達(dá)，實時定量PCR法檢測誘導(dǎo)后人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞中神經(jīng)元特異性烯醇化酶、多巴胺轉(zhuǎn)運體及酪氨酸羥化酶的表達(dá)。結(jié)果與結(jié)論人羊膜上清中有神經(jīng)生長因子和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)，且Pl代人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)營養(yǎng)因子高黏附性受體Trka及Trkb。誘導(dǎo)48h后與對照組比較，誘導(dǎo)組及阻斷劑組神經(jīng)元特異性烯醇化酶、多巴胺轉(zhuǎn)運體陽性細(xì)胞數(shù)均明顯增加(P0. 05)，且誘導(dǎo)組陽性細(xì)胞數(shù)最多(P0.05)。誘導(dǎo)組、阻斷劑組神經(jīng)元特異性烯醇化酶、多巴胺轉(zhuǎn)運體及酪氨酸羥化酶mRNA含量均顯著高于對照組(P0. 01)，且誘導(dǎo)組各基因mRNA含量明顯高于阻斷劑組(P0. 01)。結(jié)果證實人羊膜上皮細(xì)胞分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子對人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的神經(jīng)分化有重要作用，其促神經(jīng)分化作用是通過酪氨酸激酶受體介導(dǎo)的。8題名人羊膜上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)及肝細(xì)胞特異性蛋白的表達(dá)作者許珊珊顧學(xué)范機(jī)構(gòu)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院新華醫(yī)院上海市兒科醫(yī)學(xué)研究所內(nèi)分泌遺傳代謝病研究室，刊名世界感染雜志.2009,9(4).-278-278文摘目的完善人羊膜上皮細(xì)胞(AECs) 的原代培養(yǎng)技術(shù)，檢測肝細(xì)胞特異性蛋白在AECs中的表達(dá)。方法采用膠原酶-胰蛋白酶聯(lián)合消化法分離獲取AECs并進(jìn)行愿代培養(yǎng)。分別向培養(yǎng)液中添加10、20、40ng/mL表皮生長因子(EGF)和lOng/mL的堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長和增殖情況，從中選擇最適宜AECs原代培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)液。以培養(yǎng)液中未添加生長因子的原代培養(yǎng)細(xì)胞作為對照。將羊膜組織石蠟切片和AECs細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫組化染色，9題名人羊膜上皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定作者方寧宋秀軍張路章濤陳代雄機(jī)構(gòu)遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院貴州省細(xì)胞工程重點實驗室，刊名遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報.2009，32 0).-121-文摘目的建立人羊膜上皮細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定方法。 方法從足月分娩人胎盤剝離羊膜，采用胰蛋白酶消化法分離人羊膜上皮細(xì)胞(hAECs)， 采用免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫熒光染色及流式細(xì)胞術(shù)分析其表型特征，使用含表皮生長因子LG-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。結(jié)果采用低速旋轉(zhuǎn)胰蛋白酶消化法從羊膜分離的hAECs數(shù)為 (6. 13士 1.42) X10~7，份(n = 12)，所分離的hAECs明顯表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志物角蛋白CK19， 不表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物波形蛋白，不同程度地表達(dá)C^9、CD44和CD71。在表皮生長因子存在的條件下，hAECs生長增殖較快，培養(yǎng)至第6天細(xì)胞總數(shù)可增殖171倍。結(jié)論建立了人羊膜上皮細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定方法，hAECs具有上皮細(xì)胞的特異標(biāo)志和間充質(zhì)干細(xì)胞的某些表型特征。10題名人羊膜上皮細(xì)胞的原代及傳代培養(yǎng)作者劉小勇[1]陳劍[1]吳靜 [2]周清；王彥平；李紅；徐錦堂；趙松濱；機(jī)構(gòu)[1]暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院刊名廣東醫(yī)學(xué).2007，28 (2). -181-18文摘目的建立體外培養(yǎng)人羊膜上皮細(xì)胞的方法，觀察體外培養(yǎng)的羊膜上皮細(xì)胞的生物學(xué)特性。方法取足月剖宮產(chǎn)術(shù)后羊膜，經(jīng)膠原酶和胰蛋白酶消化后，獲取的羊膜上皮細(xì)胞接種于含10%胎牛血清培養(yǎng)基中進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng)，探索其合適的培養(yǎng)條件，用倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)的人羊膜上皮細(xì)胞體外生長的特征。用蘇木精-伊紅染色、掃描電鏡和細(xì)胞角蛋白免疫組織化學(xué)染色的方法對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和鑒定。結(jié)果人羊膜上皮細(xì)胞可以在體外成功的培養(yǎng)傳代，體外可連續(xù)傳8 10代。體外培養(yǎng)細(xì)胞呈多角形，長滿后呈上皮細(xì)胞特有的鋪路石樣外觀。掃描電鏡觀察細(xì)胞表面有豐富的微絨毛。細(xì)胞角蛋白keratin單克隆抗體染色陽性。結(jié)論人羊膜上皮細(xì)胞在體外可成功進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng)，體外培養(yǎng)的人羊膜上皮細(xì)胞在一定時間內(nèi)可維持增殖能力。1題名人羊膜上皮細(xì)胞移植治療靈長類動物脊髓損傷的實驗研究作者李向東[1]惠國楨[1]吳智遠(yuǎn)[1]劉天津[2]蔣芝華[2]郭禮和[2]機(jī)構(gòu)[1]蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，[2]中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所刊名中華神經(jīng)外科雜志.2007，23 (2). -149-1文摘目的探討人羊膜上皮細(xì)胞移植治療恒河猴脊髓半切損傷的作用。方法采用脊髓半切損傷制作恒河猴脊髓損傷模型，同時移植人羊膜上皮細(xì)胞或轉(zhuǎn)染BDNF的羊膜上皮細(xì)胞，于損傷后70d行熒光金注入脊髓損傷下方 4cm處，損傷后80d觀察實驗動物的行為學(xué)變化，并行組織學(xué)檢查。結(jié)果治療組脊髓損傷側(cè)后肢運動功能恢復(fù)明顯優(yōu)于對照組。治療組移植物內(nèi)可見AchE、TH陽性神經(jīng)纖維和GFAP 陽性的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，移植物內(nèi)有熒光金染色。結(jié)論移植人羊膜上皮細(xì)胞使恒河猴脊髓半切損傷后運動功能明顯改善。上述公開文獻(xiàn)報道了一些人羊膜上皮細(xì)胞的分離及應(yīng)用，但是，未見有關(guān)于從人羊膜上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中提取呈游離狀態(tài)不飽和脂肪酸組合物及其應(yīng)用的公開文獻(xiàn)。不飽和脂肪酸包括人體必需的脂肪酸，根據(jù)雙鍵個數(shù)的不同，可分為單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸。多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs)是指含有兩個或兩個以上雙鍵，且碳鏈長度為16-22個碳原子的直鏈脂肪酸，其所屬n-3與n_6系列在營養(yǎng)、保健和醫(yī)學(xué)上具有重要的作用。PUFAs中DHA和花生四烯酸對正常胎兒腦、視網(wǎng)膜及其它組織的發(fā)育過程至關(guān)重要。胎兒在子宮內(nèi)發(fā)育過程中獲取PUFAs完全靠胎盤的主動轉(zhuǎn)運。隨著孕齡增長，胎盤轉(zhuǎn)運能力逐漸增強(qiáng)，母體需不斷補(bǔ)充足夠的必需脂肪酸，才能適應(yīng)胎兒生長發(fā)育的需要。然而，國內(nèi)外沒有資料顯示人羊膜上皮細(xì)胞在此過程中的作用。目前，以商品形式銷售的PUFAs主要從深海魚類中提煉出來，價格昂貴且產(chǎn)量有限，而通過微生物基因工程得到的生產(chǎn)PUFAs的微藻和酵母菌株亦面臨諸多需要解決的問題，使PUFAs的產(chǎn)量一直無法滿足人類的需求，急需開拓新的資源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的在于針對不飽和脂肪酸組合物(PUFAs)來源有限的問題，提供一種從人羊膜上皮細(xì)胞中提取不飽和脂肪酸組合物的方法，該方法來源充足，制備成本低廉，能夠得到較高濃度且n-6PU FA s/n-3PU FA s比例符合1994年世界衛(wèi)生組織建議的 5-10 1的平衡范圍。本發(fā)明的第二個目的在于將制得的不飽和脂肪酸組合物(PUFAs)，用于制備治療神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病(如帕金森病)、眼表疾病、心腦血管疾病和神經(jīng)損傷等疾病的藥物的應(yīng)用。本發(fā)明所述的從人羊膜上皮細(xì)胞中提取不飽和脂肪酸組合物(PUFAs)，包括如下順序的步驟和方法(1)取人正常足月剖宮產(chǎn)胎盤，分離獲取羊膜，清除致密層下結(jié)締組織，IXPBS洗凈，剪碎備用；(2)將上一步所得的羊膜組織分別用重量濃度0. 01-1. 00%的膠原酶IV(英文 collagenasetype IV)37°C消化 2-3 小時和 0. 10-1. 00%胰蛋白酶(英文Trypsinase)室溫下消化0. 5-1小時；(3)收集第( 步所得到的消化液，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，獲取人羊膜上皮細(xì)胞；(4)將人羊膜上皮細(xì)胞在低溫高壓下進(jìn)行細(xì)胞破碎，采用低溫超高壓連續(xù)流細(xì)胞破碎機(jī)，破碎全過程在4°C -6°C低溫水浴中進(jìn)行；(5)向每升細(xì)胞裂解液中加入3升正己烷，以500轉(zhuǎn)/分鐘振蕩12小時，提取脂肪酸；(6)取上層有機(jī)相正己烷，用氮氣吹干后，每升加入0. 28升三氟化硼甲醇溶液，置于80°C水浴中，進(jìn)行脂肪酸甲酯化；(7)加入正庚烷進(jìn)行萃取，振蕩后取上層有機(jī)相，用氮氣吹干，去除三氟化硼，正己烷復(fù)溶后上機(jī)測定。本發(fā)明從人羊膜上皮細(xì)胞內(nèi)的提取到的PUFAs組合物，主要包括DHA、花生四烯酸、dihomo-γ-亞麻酸、Y-亞麻酸(GLA)和亞油酸(LA)。本發(fā)明的優(yōu)點在于人的羊膜為產(chǎn)后的廢棄物，具有來源充足且成本低廉，不受倫理限制等優(yōu)越性，本發(fā)明從羊膜上皮細(xì)胞中提取不飽和脂肪酸，獲得的PUFAs組合物濃度高，n-3/n-6比例合理，能夠滿足人類對PUFAs的需求，具有廣闊的藥用前景。


圖1是實施例一中人正常足月剖宮產(chǎn)羊膜的透射電子顯微鏡照片。其中圖IA為人羊膜上皮細(xì)胞垂直切面，放大6000倍；圖IB為人羊膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)可見大而圓的不飽和脂質(zhì)，放大15000倍。圖2是實施例一中正常足月剖宮產(chǎn)人羊膜的光學(xué)顯微鏡照片。其中圖2A為蘇丹 III染色，放大1000倍的照片；圖2B為油紅0染色，放大400倍的照片；圖2C為硫酸尼羅藍(lán)染色，放大400倍的照片。圖3是實施例二中原代培養(yǎng)的人羊膜上皮細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞角蛋白照片。其中圖3A 為人羊膜上皮細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞角蛋白-18 ；圖:3B為人羊膜上皮細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞角蛋白-19 ’放大400倍。圖4是實施例二中原代培養(yǎng)第5天的人羊膜上皮細(xì)胞的掃描電子顯微鏡照片。其中圖4A為培養(yǎng)第5天的人羊膜上皮細(xì)胞，放大5000倍；圖4B為培養(yǎng)第5天的人羊膜上皮細(xì)胞，放大15000倍；圖4C為培養(yǎng)第5天的人羊膜上皮細(xì)胞，放大3000倍；圖4D為培養(yǎng)第 5天的人羊膜上皮細(xì)胞，放大20000倍。圖5是實施例三中人正常足月剖宮產(chǎn)人羊膜上皮細(xì)胞內(nèi)游離不飽和脂肪酸組合物質(zhì)譜檢測圖。圖6是實施例四中含有人羊膜上皮細(xì)胞胞質(zhì)中不飽和脂肪酸的組合物對體外培養(yǎng)的多巴胺能神經(jīng)元的影響的光學(xué)顯微鏡照片。其中圖6A、圖6B、圖6C為不同稀釋濃度 (1 1，1 2，1 16)的人羊膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)液上清組，放大400倍的照片；圖6D為對照組，放大400倍的照片。
具體實施例方式實施例一正常人足月剖宮產(chǎn)羊膜上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察及脂類染色取人正常足月剖宮產(chǎn)羊膜，入10%甲醛溶液內(nèi)固定M小時后，流水沖洗，入梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟后包埋。LEICA切片機(jī)切片，片厚7 μ m。45°C溫水展片后，用涂有多聚賴氨酸載玻片撈片。晾干，備用。
石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。經(jīng)蒸餾水洗后，浸染于蘇木精中淡染1-2分鐘，自來水洗。入70%酒精5秒鐘。入蘇丹III染液30分鐘。70%酒精洗5-10秒鐘。蒸餾水洗，甘油明膠封片。切片入硫酸尼羅藍(lán)液內(nèi)染色30分鐘后，用醋酸分色1-2分鐘。充分水洗，用甲基綠(要經(jīng)氯仿洗過)復(fù)染5分鐘。充分水洗，甘油明膠封片。取人正常足月剖宮產(chǎn)羊膜，入甲醛-鈣液(1% (%12溶于10%福爾馬林液)固定 M小時后，恒冷箱切片，片厚12-15 μ m，直接貼載玻片上晾干。切片入60%異丙醇漂洗后， 入油紅0染色15分鐘。60%異丙醇漂洗，用蒸餾水充分沖洗。蘇木精復(fù)染，流水沖洗，使核返藍(lán)色，甘油明膠封片。透射電子顯微鏡標(biāo)本制作取人正常足月剖宮產(chǎn)羊膜，入2. 5%戊二醛4°C冰箱固定過夜，修整羊膜組織為ImmX Imm組織塊，樹脂包埋，超薄切片機(jī)切片，行電子染色。本發(fā)明在對人正常足月剖宮產(chǎn)羊膜中上皮細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察時發(fā)現(xiàn)光鏡標(biāo)本中所見到的人羊膜上皮細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大量空泡樣結(jié)構(gòu)經(jīng)透射電鏡標(biāo)本觀察證實為不飽和脂質(zhì)； 經(jīng)各項脂類染色進(jìn)一步證實為呈游離狀態(tài)的不飽和疏水性脂肪酸結(jié)構(gòu)。實施例二 人羊膜上皮細(xì)胞的獲取、分離、培養(yǎng)和鑒定將羊膜從剖宮產(chǎn)后棄置的胎盤上撕下，置于含有青、鏈霉素雙抗的IXPBS中反復(fù)沖洗至無血跡。上皮面朝下平鋪于培養(yǎng)皿內(nèi)，用細(xì)胞刮子清除羊膜致密層下結(jié)締組織。 IXPBS中反復(fù)沖洗后，將羊膜用眼科剪剪成約ImmX Imm小塊，加入新配制的0. 01%膠原酶 IV，置于37°C孵箱靜置消化2-3小時。收集液體于離心管內(nèi)，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄上清。用IXPBS沖洗1次。加入0. 25%胰蛋白酶于室溫下消化0. 5-1小時。含血清培養(yǎng)基終止消化。1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄上清。用DMEM/F12 (含10% FBS,青、鏈霉素各 100U/ml)培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，200目的篩網(wǎng)過濾。收集細(xì)胞懸液，以1 X IO6個/ml密度的接種于培養(yǎng)皿中，置于5% CO2培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)，每隔2天換液1次。從(X)2孵育箱中取出已貼壁的人羊膜上皮細(xì)胞，倒掉培養(yǎng)液，用0. OlMPBS洗5分鐘，重復(fù)3次。用4%多聚甲醛固定20分鐘后，用IXPBS洗5分鐘，重復(fù)3次。滴加0. 25% TritonX-100，室溫孵育1小時。正常山羊血清封閉，室溫30min。甩凈不洗，直接滴加一抗細(xì)胞角蛋白-18(1 100)、細(xì)胞角蛋白-19(1 100)，陰性對照組滴加1XPBS，4°C冰箱孵育過夜。第二天，IXPBS洗5分鐘，重復(fù)3次，滴加二抗FITC(1 50)，室溫20分鐘，1 XPBS 洗5分鐘，重復(fù)3次。10%甘油封片劑封片。掃描電子顯微鏡標(biāo)本制作培養(yǎng)第5d的HAECs，入2. 5%戊二醛4°C冰箱固定過夜，經(jīng)脫水和臨界點干燥后，于樣品表面噴鍍薄層金膜。本發(fā)明通過細(xì)胞角蛋白-18、細(xì)胞角蛋白-19免疫熒光組化染色證實從羊膜上獲得的細(xì)胞為純?nèi)搜蚰ど掀ぜ?xì)胞。掃描電子顯微鏡標(biāo)本觀察證實人羊膜上皮細(xì)胞內(nèi)含有大量圓球狀結(jié)構(gòu)。實施例三氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用檢測從人羊膜上皮細(xì)胞中提取的呈游離狀態(tài)不飽和脂肪酸的種類及含量為減少實驗過程中非游離脂肪酸的干擾，細(xì)胞破碎采用低溫超高壓連續(xù)流細(xì)胞破碎機(jī)，每1. 8L細(xì)胞樣品內(nèi)加入IXPBS 25ml稀釋和沖洗，破碎全過程在4°C _6°C低溫水浴中進(jìn)行，以保持細(xì)胞內(nèi)原有物質(zhì)活性和性能。向破碎后的樣品內(nèi)加入75ml正己烷，500轉(zhuǎn)/分鐘振蕩器振蕩12小時。取25ml有機(jī)相氮吹干燥后，采用三氟化硼甲醇溶液對干燥后的脂肪酸進(jìn)行衍生化。加入IOml正庚烷萃取后，從中取5ml氮氣吹干。采用Iml正己烷復(fù)溶后上機(jī)測定。質(zhì)譜儀熱電公司Thermo-DSQ0色譜柱:DB-225MS (60mx0. 25mm, 0. 25 μ m)。載氣氦氣，lml/min。進(jìn)樣口溫度240°C。程序升溫。進(jìn)樣量2μ1。人羊膜上皮細(xì)胞中游離不飽和脂肪酸含量測定
權(quán)利要求
1.從人羊膜上皮細(xì)胞中提取不飽和脂肪酸組合物的方法，其特征在于包括以下步驟(1)取人正常足月剖宮產(chǎn)胎盤，分離獲取羊膜，清除致密層下結(jié)締組織，IXPBS洗凈， 剪碎備用；(2)用重量濃度0.01-1. 00%的膠原酶IV37°C消化2_3小時，重量濃度0. 10-1. 00%的胰蛋白酶室溫下消化0. 5-1小時；(3)收集消化液，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5-10分鐘，獲取人羊膜上皮細(xì)胞；(4)細(xì)胞破碎采用低溫超高壓連續(xù)流細(xì)胞破碎機(jī)，破碎全過程在4-6°C低溫水浴中進(jìn)行；(5)向細(xì)胞裂解液中加入正己烷，每升細(xì)胞裂解液中加入3升正己烷，以500轉(zhuǎn)/分鐘振蕩12小時，提取脂肪酸；(6)取上層有機(jī)相，用氮氣吹干后，每升有機(jī)相加入0.28升三氟化硼甲醇溶液，置于 80°C水浴中，進(jìn)行脂肪酸甲酯化；(7)加入正庚烷進(jìn)行萃取，振蕩后取上層有機(jī)相，用氮氣吹干，去除三氟化硼，正己烷復(fù)溶后上機(jī)測定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從人羊膜上皮細(xì)胞中提取不飽和脂肪酸組合物的方法，其特征在于，所述的不飽和脂肪酸組合物包括DHA、花生四烯酸、dihomo- γ -亞麻酸、Y -亞麻酸和亞油酸。
3.權(quán)利要求2所述的不飽和脂肪酸組合物在制備治療神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病藥物的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所述的組合物在制備治療眼表疾病的藥物的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求2所述的組合物在制備防治心腦血管疾病的藥物的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求2所述的組合物在制備治療神經(jīng)損傷的藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及從人羊膜上皮細(xì)胞中提取呈游離狀態(tài)不飽和脂肪酸組合物及其應(yīng)用。該組合物主要由多不飽和脂肪酸(PUFAs)組成，包括DHA、花生四烯酸、dihomo-γ-亞麻酸、γ-亞麻酸和亞油酸。該組合物可用于制備治療神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病(如帕金森病)、眼表疾病、心腦血管疾病和神經(jīng)損傷性疾病的藥物的應(yīng)用。目前，以商品形式銷售的PUFAs主要從深海魚類或藻類中提煉出來，價格昂貴且產(chǎn)量有限。本發(fā)明從人羊膜上皮細(xì)胞內(nèi)獲取的呈游離狀態(tài)的PUFAs組合物，來源充足，成本低廉，含量高且n-6/n-3比例分配合理，具有廣闊的藥用前景。
文檔編號A61P9/00GK102229528SQ20111009518
公開日2011年11月2日 申請日期2011年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月15日
發(fā)明者朱梅, 陳彪 申請人:廣西南寧靈康賽諾科生物科技有限公司