專利名稱：一種表達(dá)人胰腺組織激肽釋放酶基因的重組表達(dá)載體及重組人胰腺組織激肽釋放酶的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種攜帶人胰激肽釋放酶基因的重組表達(dá)載體，具體地說(shuō)涉及攜帶人胰腺組織激肽釋放酶成熟蛋白基因的重組表達(dá)載體。
本發(fā)明還涉及由該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及應(yīng)用基因工程技術(shù)制備重組激肽釋放酶的方法。
背景技術(shù)：
人類激肽釋放酶分為兩大類，即血漿激肽釋放酶和組織激肽釋放酶。組織激肽釋放酶為一簇性質(zhì)相似的化合物，可以由肝臟、胰臟、腦神經(jīng)等合成。組織激肽釋放酶基因編碼的蛋白首先表達(dá)生成前體完整蛋白，該前體蛋白在體內(nèi)經(jīng)過(guò)蛋白酶切割加工后成為具有生物活性的成熟蛋白。組織激肽釋放酶基因編碼組織激肽釋放酶(E.C.3.4.21.35)，它是一種絲氨酸蛋白酶，通過(guò)裂解低分子量的激肽原生成具有血管活性的激肽，后者參與機(jī)體一系列的生理及病理過(guò)程。
一、胰激肽釋放酶的生理作用1.胰激肽釋放酶與機(jī)體血壓調(diào)節(jié)及腎臟功能的關(guān)系激肽釋放酶和激肽系統(tǒng)(KKS)是維持血壓平衡中降壓系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分，與利鈉肽系統(tǒng)、EDRF/NO、PGE2/PDI2等共同參與血壓的舒張調(diào)節(jié)。KKS的功能缺陷或抑制很可能參與了高血壓的發(fā)生和維持。組織激肽釋放酶(Kallikrein，KK)是機(jī)體激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)的重要成員。KK在人體的許多部位廣泛表達(dá)，通過(guò)與其他血管活性物質(zhì)的相互作用，參與腎臟功能的調(diào)節(jié)。組織激肽釋放酶能夠裂解低分子量激肽原(kininogen)生成具有血管活性的激肽(kininpeptide)，后者可與緩激肽(bradykinin)B2受體相結(jié)合產(chǎn)生廣泛的生理效應(yīng)，包括擴(kuò)張腎內(nèi)小動(dòng)脈，增加腎血流量，抑制球旁細(xì)胞分泌腎素并促進(jìn)髓質(zhì)細(xì)胞分泌PGE2；抑制近曲小管對(duì)鈉、水的重吸收；進(jìn)入血循環(huán)后，擴(kuò)張外周血管，增加血管通透性，使血壓下降，并促進(jìn)電解質(zhì)及葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)。研究表明，腎組織受損時(shí)，由小管產(chǎn)生的激肽釋放酶減少，腎激肽水平下降。在抗腎小球基底膜抗血清所致的腎病綜合征模型大鼠中，尿激肽釋放酶水平明顯降低，且與蛋白尿程度成反比。由于尿中的激肽釋放酶來(lái)源于腎臟，表明組織KK參與腎臟功能的調(diào)節(jié)及血壓的自身平衡。將純化后的大鼠組織KK對(duì)飼高鹽飲食的Dah1-鹽敏感大鼠進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間灌流發(fā)現(xiàn)，大鼠的腎小管硬化減輕。表明，施于組織KK對(duì)機(jī)體的血壓調(diào)節(jié)及腎臟功能恢復(fù)均有重要作用。
2.胰激肽釋放酶與心腦血管疾病的關(guān)系胰激肽釋放酶可以裂解低分子量的激肽原生成具有血管活性的激肽，擴(kuò)張毛細(xì)血管，增加血管通透性，改善微循環(huán)。同時(shí)胰激肽釋放酶又是一種活化因子，能使纖維酶原激活成纖維酶，使不溶性的纖維蛋白酶水解成可溶性的小肽，從而對(duì)腦梗塞、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病起到治療作用，并可以治療血栓、預(yù)防血栓再形成。
3.胰激肽釋放酶對(duì)生殖的影響研究表明，胰激肽釋放酶可以提高纖溶活性，擴(kuò)張周圍血管，促進(jìn)生精細(xì)胞增生，改善精子活力，促進(jìn)精液液化。給大鼠注射胰激肽釋放酶后，不但可以增加精子的產(chǎn)生，而且可以增進(jìn)精子在體外的活動(dòng)能力。有人利用胰激肽釋放酶治療男性不育癥，取得明顯療效。
4.胰激肽釋放酶對(duì)其他疾病的作用研究表明，胰激肽釋放酶對(duì)糖尿病腎病、視網(wǎng)膜靜脈阻塞等均有較好療效。
二、研究現(xiàn)狀目前使用的胰激肽釋放酶均為由豬臟器提取、純化的產(chǎn)品。尚沒(méi)有人源胰激肽釋放酶產(chǎn)品，利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組人胰腺組織激肽釋放酶的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的一個(gè)目在于提供攜帶編碼人源胰激肽釋放酶成熟蛋白基因的重組表達(dá)載體。
本發(fā)明另一目的在于提供由該重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的再一目的在于提供一種利用基因工程技術(shù)制備重組人胰腺組織激肽釋放酶的方法。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，根據(jù)GeneBank報(bào)告的基因序列，利用計(jì)算機(jī)輔助系統(tǒng)設(shè)計(jì)了PCR引物，從中國(guó)人胰腺組織中提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆獲得具有SEQ ID NO1序列的DNA，其編碼的多肽序列如SEQ ID NO2。
本發(fā)明克隆的編碼胰腺組織激肽釋放酶的基因與GenBank報(bào)告的人胰腺激肽釋放酶基因有一個(gè)堿基不同。以翻譯起始密碼子ATG為1，本發(fā)明克隆的激肽釋放酶基因的第340位堿基為A，Genbank報(bào)告的為G。編碼氨基酸的密碼子Genbank為GAC，中國(guó)人為AAC，編碼的氨基酸Genbank為天冬氨酸(Asp，Genbank)，中國(guó)人為天冬酰氨(Asn)。天冬氨酸與天冬酰氨分子量接近，Asp為133.1，Asn為132.1，結(jié)構(gòu)也相近，但兩者的側(cè)鏈基團(tuán)不同。Asp為酸性氨基酸，Asn則偏堿性。該位置氨基酸的變化對(duì)激肽釋放酶的空間結(jié)構(gòu)以及活性可能產(chǎn)生影響。
在合成胰腺組織激肽釋放酶的過(guò)程中，由激肽釋放酶原(由激肽釋放酶全長(zhǎng)基因表達(dá)的激肽釋放酶完整蛋白)將進(jìn)一步被蛋白酶切割和加工成為成熟的具有生物學(xué)活性的激肽釋放酶。因此，由克隆的全長(zhǎng)基因表達(dá)的激肽釋放酶完整蛋白的活性大大低于激肽釋放酶成熟蛋白的活性。本發(fā)明利用電腦軟件分析比較了人(胰腺組織)、豬、大鼠、小鼠激肽釋放酶的氨基酸序列，推測(cè)出激肽釋放酶原(激肽釋放酶完整蛋白)轉(zhuǎn)換為激肽釋放酶(激肽釋放酶成熟蛋白)的可能蛋白切割位點(diǎn)及激肽釋放酶成熟蛋白的氨基酸序列，合成PCR引物，從克隆的人胰腺組織激肽釋放酶基因全序列中調(diào)出編碼激肽釋放酶成熟蛋白的基因，如SEQ ID NO.3所示序列。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供包含SEQ ID NO3序列的重組載體。其中載體可以以質(zhì)粒、病毒顆粒以及噬菌體等形式，構(gòu)建的重組載體可表達(dá)具有高生物學(xué)活性的人胰腺組織激肽釋放酶成熟蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，構(gòu)建了質(zhì)粒形式的載體，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，構(gòu)建了桿狀病毒形式的轉(zhuǎn)移載體。
可通過(guò)多種方法將目的DNA插入到載體中，一般而言，通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一些方法可以將本發(fā)明的DNA序列插入到一個(gè)適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶位點(diǎn)上。表達(dá)載體中的DNA可操作地與一個(gè)適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)調(diào)控序列(啟動(dòng)子)連接以指導(dǎo)mRNA的合成，表達(dá)載體也含有一個(gè)用于翻譯起始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)以及一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止子。表達(dá)載體同時(shí)含有用于篩選轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的表型性狀基因。用于構(gòu)建表達(dá)載體的質(zhì)?；虿《究赏ㄟ^(guò)商業(yè)途徑獲得。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)將人胰腺組織激肽釋放酶成熟蛋白基因(SEQ ID NO.3)插入質(zhì)粒pET20b的限制性內(nèi)切酶EcoR1、Xho1位點(diǎn)，構(gòu)建成分泌型表達(dá)載體，該載體可以在大腸桿菌中表達(dá)出具有高生物學(xué)活性的人組織激肽釋放酶成熟蛋白，并在N端融合信號(hào)肽序列，使得表達(dá)的目的蛋白分布于細(xì)胞漿中；在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)將表達(dá)人胰腺組織激肽釋放酶成熟蛋白基因(SEQ ID NO.3)插入質(zhì)粒pE28的限制性內(nèi)切酶EcoR1、Xho1位點(diǎn)，構(gòu)建成非分泌型表達(dá)載體，該載體可以在大腸桿菌中表達(dá)出具有高生物學(xué)活性的組織激肽釋放酶成熟蛋白。更為特別的是，本發(fā)明進(jìn)一步在該基因C端融合His Tag序列，使得表達(dá)的目的蛋白易于進(jìn)行親合層析純化。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將本發(fā)明的DNA插入病毒載體pBacPAK9的EcoR1、Xho1位點(diǎn)，構(gòu)建出桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，進(jìn)一步提供了由本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，宿主細(xì)胞可以包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞，其中用于轉(zhuǎn)化的原核細(xì)胞可以包括各種細(xì)菌，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，以大腸桿菌作為本發(fā)明載體的宿主細(xì)胞。用于轉(zhuǎn)化的真核細(xì)胞宿主可以是高等真核細(xì)胞(如哺乳動(dòng)物細(xì)胞)或是低等真核細(xì)胞(如酵母細(xì)胞)，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案以培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞作為宿主細(xì)胞。
宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可以通過(guò)各種方法，例如磷酸鈣沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)、電穿孔等方法，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，采用本發(fā)明構(gòu)建的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體通過(guò)共轉(zhuǎn)染將本發(fā)明DNA導(dǎo)入培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞，在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的蛋白被高度糖基化，其較在大腸桿菌中表達(dá)的人胰組織激肽釋放酶蛋白具有更接近天然蛋白的結(jié)構(gòu)和更高的酶活力。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供制備重組激肽釋放酶的方法。本發(fā)明的方法包括1)將編碼胰組織激肽釋放酶成熟蛋白的基因(SEQ IDNO.3)可操作的連接于表達(dá)調(diào)控序列，構(gòu)建表達(dá)載體；2)用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化原核或真核細(xì)胞，形成宿主細(xì)胞；3)在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞；4)從培養(yǎng)液中分離出具有激肽釋放酶活性的蛋白質(zhì)；5)用親和層析純化獲得重組激肽釋放酶。
本發(fā)明成功地從中國(guó)人胰腺組織中克隆了編碼具有胰激肽釋放酶活性的蛋白的新基因，并進(jìn)一步從該基因中調(diào)出了編碼人胰腺組織激肽釋放酶成熟蛋白的基因片段，用該基因片段構(gòu)建了攜帶編碼人胰腺組織激肽釋放酶成熟蛋白基因的分泌型、非分泌型表達(dá)載體以及桿狀病毒表達(dá)載體，進(jìn)而獲得了由本發(fā)明表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的原核和真核細(xì)胞宿主。本發(fā)明的表達(dá)載體可高效表達(dá)具有高生物學(xué)活性的胰腺激肽釋放酶，采用國(guó)際藥學(xué)聯(lián)合會(huì)(FIP)、中國(guó)藥品生物制品檢定所改進(jìn)的的電位滴定法以及Abe M等人使用的酶促熒光分光光度法檢測(cè)了本發(fā)明表達(dá)載體表達(dá)的蛋白產(chǎn)物的活性，同時(shí)與采用編碼人胰腺組織激肽釋放酶完整蛋白的基因(SEQ ID NO.1)構(gòu)建的表達(dá)載體比較。結(jié)果表明本發(fā)明構(gòu)建的分泌型、非分泌型原核表達(dá)載體以及桿狀病毒表達(dá)載體表達(dá)的產(chǎn)物均具有較高的胰腺激肽釋放酶活力，可以用于進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，并可進(jìn)一步用于治療高血壓等疾病的臨床前研究。同時(shí)，本發(fā)明的表達(dá)載體中還融合了His親和序列，包含該親和序列的表達(dá)產(chǎn)物，在分離純化時(shí)可利用His親和樹脂進(jìn)行親和層析純化。本發(fā)明為開發(fā)人源組織激肽釋放酶基因工程產(chǎn)品，開發(fā)人源組織激肽釋放酶的基因藥物奠定基礎(chǔ)。
附圖簡(jiǎn)述下面，結(jié)合附圖，通過(guò)對(duì)本發(fā)明較佳實(shí)施例的描述，詳細(xì)說(shuō)明但不限制本發(fā)明。


圖1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果泳道1100bp DNA ladder；泳道2人胰腺激肽釋放酶基因；圖2為本發(fā)明克隆的新基因的測(cè)序圖譜；圖3為人(胰腺組織)、豬、大鼠、小鼠激肽釋放酶氨基酸序列比較分析；圖4本發(fā)明表達(dá)載體pE20mK結(jié)構(gòu)示意圖；圖5為本發(fā)明另一分泌型表達(dá)載體pE28pK的結(jié)構(gòu)示意圖；圖6為發(fā)明非分泌型表達(dá)載體pE28mK的結(jié)構(gòu)示意圖；圖7為本發(fā)明桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體Pbac-KK的結(jié)構(gòu)示意圖；圖8為采用電位滴定法分析表達(dá)產(chǎn)物活力的曲線。
發(fā)明的
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1人胰組織激肽釋放酶基因的克隆和測(cè)序1材料與方法1.1材料胰腺組織取材于一例行胰腺切除術(shù)患者術(shù)后的部分新鮮組織，洗凈血液，立即提取總RNA。
1.2質(zhì)粒及菌株質(zhì)粒pBluescript II KS(+)，大腸桿菌XL1-Blue分別購(gòu)于STRATAGENE(晶美公司)。
1.3工具酶及其它試劑RNA分離試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于STRATAGENE(晶美公司)，限制性內(nèi)切酶、修飾酶、pfu高保真Taq DNA聚合酶等分別購(gòu)于promega、gene公司及上海生工。
1.4 PCR引物設(shè)計(jì)及合成根據(jù)GENBANK報(bào)告的基因序列，利用計(jì)算機(jī)輔助系統(tǒng)設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，由上海生工合成并聚丙烯凝膠電泳純化。
引物序列為上游引物如SEQ ID NO.4所示序列；下游引物如SEQ ID NO.5所示序列。
1.5 RNA提取及PCR擴(kuò)增制備組織勻漿后，參照試劑盒說(shuō)明提取總RNA。變性瓊脂糖電泳確認(rèn)RNA質(zhì)量，紫外分光光度法測(cè)定RNA含量。采用oligo(dT)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用eppendorf梯度PCR儀，95℃，40s；60℃，1min；72℃，1min；總溫度梯度10℃擴(kuò)增30循環(huán)，72℃延伸10min結(jié)束。確認(rèn)最佳條件后取適量產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。直接將適量Klenow大片段加至擴(kuò)增溶液中，25℃反應(yīng)30min補(bǔ)平產(chǎn)物。
1.6重組質(zhì)粒的構(gòu)建采用低溶點(diǎn)瓊脂糖法回收PCR產(chǎn)物，插入質(zhì)粒KS。連接后轉(zhuǎn)化XL1-Blue受體菌，利用X-gal進(jìn)行蘭-白篩選，酶切鑒定。
1.7 DNA序列分析堿裂解法提取質(zhì)粒并用PEG-8000純化，使用通用引物雙向測(cè)序。
2結(jié)果2.1激肽釋放酶基因的擴(kuò)增 將PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，在800-900bp之間可見(jiàn)特異DNA條帶，與預(yù)計(jì)大小～830bp相符(圖1)。
2.2激肽釋放酶基因的克隆及鑒定 按常規(guī)方法進(jìn)行基因克隆，分別使用限制性內(nèi)切酶styI、PvuII鑒定重組質(zhì)粒，結(jié)果正確。
2.3激肽釋放酶基因的序列分析 制備重組質(zhì)粒后上海Sangon生物工程公司測(cè)序部進(jìn)行序列分析。序列分析結(jié)果與GenBank報(bào)告的KK進(jìn)行序列比較，結(jié)果兩者有一個(gè)核苷酸不同。圖2為激肽釋放酶基因測(cè)序圖譜，序列分析結(jié)果得到SEQ ID NO.1的序列，其對(duì)于的氨基酸序列為SEQ ID NO.2。
實(shí)施例2人胰腺組織激肽釋放酶成熟蛋白基因的克隆利用電腦軟件比較分析人(胰腺組織)、豬、大鼠、小鼠激肽釋放酶的氨基酸序列(圖3)，推測(cè)激肽釋放酶原(激肽釋放酶完整蛋白)轉(zhuǎn)換為激肽釋放酶(激肽釋放酶成熟蛋白)的可能蛋白酶切割位點(diǎn)及激肽釋放酶成熟蛋白的氨基酸序列，合成如下序列的PCR引物上游(真核細(xì)胞)SEQ ID NO.6所示序列；上游(原核細(xì)胞)SEQ ID NO.7所示序列；下游SEQ ID NO.8所示序列；在上述引物設(shè)計(jì)中1.成熟蛋白前面增加一個(gè)ATG，用于真核表達(dá)；2.成熟蛋白前面沒(méi)有ATG，用于原核表達(dá)；3.共用下游引物；4.上下游均增加酶切位點(diǎn)利于克隆。
擴(kuò)增的成熟蛋白的編碼序列起始SEQ ID NO 1序列的第72個(gè)堿基，具有SEQ ID NO.3所示的序列。
實(shí)施例3表達(dá)載體的構(gòu)建1.人胰腺組織激肽釋放酶成熟蛋白分泌型表達(dá)載體pE20mK的構(gòu)建圖4所示為中國(guó)人胰腺組織激肽釋放酶基因原核分泌型表達(dá)載體pE20mK。具體方法是從質(zhì)粒KSKK中利用高保真Taq酶擴(kuò)增成熟激肽釋放酶基因(SEQ ID NO.3，mKK)，利用限制性內(nèi)切酶EcoR I、XhoI消化后，將其插入質(zhì)粒pET20b的EcoR I、XhoI位點(diǎn)，保證激肽釋放酶基因與His讀框正確，構(gòu)建出分泌型表達(dá)載體pE20pK。該載體可以在大腸桿菌中表達(dá)出組織激肽釋放酶成熟蛋白，并在N端融合信號(hào)肽序列，使得表達(dá)的目的蛋白傾向于分布在細(xì)胞質(zhì)(periplasmic localization)中。
2.人胰腺組織激肽釋放酶完整蛋白非分泌型表達(dá)載體pE28pK的構(gòu)建圖5所示為中國(guó)人胰腺組織激肽釋放酶基因原核非分泌型表達(dá)載體pE28pK。具體方法是從質(zhì)粒KSKK中利用高保真Taq酶擴(kuò)增完整激肽釋放酶基因(SEQ ID NO.1，pKK)，利用限制性內(nèi)切酶EcoR I、XhoI消化后，將其插入質(zhì)粒pET28的EcoR I、XhoI位點(diǎn)，保證激肽釋放酶基因與His讀框正確，構(gòu)建出非分泌型表達(dá)載體pE28pK。該載體可以在大腸桿菌中表達(dá)出組織激肽釋放酶完整的前提蛋白，并在C端融合His Tag序列，使得表達(dá)的目的蛋白易于進(jìn)行親合層析純化。
3.人胰腺組織激肽釋放酶成熟蛋白非分泌型表達(dá)載體pE28mK的構(gòu)建圖6所示為中國(guó)人胰腺組織激肽釋放酶基因原核非分泌型表達(dá)載體pE28mK。具體方法是從質(zhì)粒KSKK中利用高保真Taq酶擴(kuò)增成熟激肽釋放酶基因(SEQ ID NO.3，mKK)，利用限制性內(nèi)切酶EcoRI、XhoI消化后，將其插入質(zhì)粒pET28的EcoR I、XhoI位點(diǎn)，保證激肽釋放酶基因與His讀框正確，構(gòu)建出非分泌型表達(dá)載體pE28mK。該載體可以在大腸桿菌中表達(dá)出組織激肽釋放酶成熟蛋白，并在C端融合His Tag序列，使得表達(dá)的目的蛋白易于進(jìn)行親合層析純化。
5.桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體PBac-KK的構(gòu)建圖7所示為中國(guó)人胰腺組織激肽釋放酶基因的桿狀病毒表達(dá)轉(zhuǎn)移載體。具體方法是從質(zhì)粒KSKK中利用限制性內(nèi)切酶EcoR I、XhoI切出激肽釋放酶基因(SEQ ID NO.3)，將其插入轉(zhuǎn)移載體pBacPAK9的EcoR I、XhoI位點(diǎn)，構(gòu)建出桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體PBac-KK。
實(shí)施例4 人胰腺組織激肽釋放酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)1.大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備，采用氯化鈣制備法，具體方法參照金冬雁、黎孟楓等譯《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版，科學(xué)出版社(1992)，第55～56頁(yè)。只是采用由0.75mmol/L Tris-HCl代替水為溶劑配制0.1mol/L CaCl2。感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方法，參照上述參考文獻(xiàn)進(jìn)行。
2.質(zhì)粒的大量制備(除有特殊說(shuō)明外，試劑配制均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版，科學(xué)出版社(1992)參照金冬雁、黎孟楓等譯《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版，科學(xué)出版社(1992)，第26～28頁(yè)，采用堿裂解法制備，用PEG沉淀法純化。具體操作方法如下，離心收獲經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)后的菌體，用STE懸浮、洗滌菌體一次，然后用特殊TE(10mmol/L Tris，50mmol/L EDTApH8.0)，懸浮沉淀。加入2倍于TE體積的溶液II裂解，加入1.5倍體積的溶液III中和，離心后取上清，加入0.7倍體積的異丙醇沉淀。離心棄上清。用TE(pH8.0)溶解沉淀，加入等倍于TE體積的5mol/LLiCl，離心去除大分子RNA。移出上清至一新離心管中，加入2倍于上清體積的無(wú)水乙醇，沉淀DNA。加適量70％乙醇洗滌沉淀一次，涼干。用TE溶解沉淀，其中含無(wú)DNA酶的RNA酶終濃度為20Mg/ml，以去除RNA。加入等倍于TE體積的PEG溶液(20％PEG 6000，2.5mol/L NaCl)混勻，置4℃過(guò)夜后離心，棄上清。用TE溶解沉淀，用等倍于TE體積的飽合酚、酚氯仿，按順序各抽提一次，然后用2倍體積的無(wú)水乙醇沉淀DNA，用70％乙醇洗滌沉淀一次，涼干，最后溶于TE(pH8.0)中備用。
3.質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶消化與DNA片段的回收質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶消化均參照下列反應(yīng)條件進(jìn)行，每微克質(zhì)粒DNA用5單位限制性內(nèi)切酶消化，加1/10體積的限制性內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液，加滅菌二餾水調(diào)整反應(yīng)總體積為所用限制性內(nèi)切酶體積的10倍，按各種限制性內(nèi)切酶的供應(yīng)商推薦的反應(yīng)溫度反應(yīng)2～3小時(shí)。質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶消化后，DNA片段的回收采用DEAE-纖維素膜電泳回收法，具體方法參照金冬雁、黎孟楓等譯《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版，科學(xué)出版社(1992)，第319～321頁(yè)。本研究采用DE-81離子交換紙(Whatman公司產(chǎn)品)代替DEAE-纖維素膜。
4.線性質(zhì)粒的末端去磷酸化和DNA片段的連接酶切后線性質(zhì)粒的末端去磷酸化，采用小牛小腸堿性磷酸酶(CIP)，具體操作參照金冬雁、黎孟楓等譯《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版，科學(xué)出版社(1992)，第40～41頁(yè)。去磷酸化反應(yīng)后，CIP的滅活采用5mmol/L EDTA(PH8.0)存在下，75℃加熱10min。然后用酚氯仿抽提去除CIP，乙醇沉淀去磷酸化后的線性質(zhì)粒，溶于滅菌雙餾水中，用于連接反應(yīng)。
線性質(zhì)粒與DNA片段的連接反應(yīng)按GIBCO-BRL公司提供的T4DNA連接酶推薦的條件進(jìn)行。粘性末端的連接按質(zhì)粒載體∶目的DNA片段的摩爾比＝1∶2，25℃連接1h。平末端的連接采用質(zhì)粒載體∶目的DNA片段摩爾比＝1∶5的比例，14～16℃，連接17～24h，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。
5.重組質(zhì)粒的篩選與鑒定將連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，涂于含抗生素的平板上，挑選過(guò)夜培養(yǎng)長(zhǎng)出的單菌落，接種于2ml LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16～20h。然后參照金冬雁、黎孟楓等譯《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版，科學(xué)出版社(1992)，第19～22頁(yè)介紹的堿裂解法小量制備質(zhì)粒，以空載體質(zhì)粒作對(duì)照進(jìn)行質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳，挑選重組質(zhì)粒，作限制性內(nèi)切酶酶切，瓊脂糖凝膠電泳，鑒定插入的目的基因及其插入方向。
實(shí)施例5目的基因的表達(dá)參照Novagen公司的實(shí)驗(yàn)指南進(jìn)行。將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化pET表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)菌株，如BL21(DE3)、BL21(DE3)plysS、HMS174(DE3)等以及非表達(dá)(對(duì)照)菌株BL21，挑選過(guò)夜培養(yǎng)長(zhǎng)出的單菌落，接種于2ml LB液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6-1.0，4℃保存過(guò)夜。次日收集菌體，重懸于2ml新鮮培養(yǎng)基，然后接種于50ml培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6-1.0，加IPTG誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)3hr。收集菌體，裂解后進(jìn)行蛋白的純化、分析。
實(shí)施例5重組蛋白的分離純化及活性測(cè)定1.親和層析純化融合His Tag蛋白的純化使用Qiageen公司生產(chǎn)的Ni2+-NTA金屬親和樹脂，將菌體超聲裂解后，上Ni2+-NTA親和柱，依次使用不同的緩沖液進(jìn)行剃度洗脫。分別收集洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE分析。將含目的蛋白洗脫液透析后凍干保存。
2.常規(guī)純化參照試劑盒說(shuō)明書以及《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》第10章部分的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行層析純化。
3.激肽釋放酶的活性分析激肽釋放酶的生物活性可以通過(guò)其催化活力進(jìn)行測(cè)定。以純化的豬激肽釋放酶(Sigma產(chǎn)品，購(gòu)自深圳晶美公司)為標(biāo)準(zhǔn)品，采用兩種方法檢測(cè)了重組人胰激肽釋放酶活力。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)表達(dá)的激肽釋放酶的初步純化產(chǎn)物具有激肽釋放酶催化活性。
采用兩種方法檢測(cè)重組人胰激肽釋放酶活力(1)用國(guó)際藥學(xué)聯(lián)合會(huì)(FIP)推薦(Ruyssen Rand Lauwers A.Pharmaceutical Enzymes Properties and Assay MethodsKallikrein.1978.147-152)、中國(guó)藥品生物制品檢定所改進(jìn)的的電位滴定法(揚(yáng)化新，沈佳，劉金秀。藥物分析雜志1994；14(2)9-12)檢測(cè)重組人胰激肽釋放酶活力。
(2)采用Abe M等(Abe M，Nakamura F，Tan F，et al.Expression of ratkallikrein and epithelikrein polarity in transfected Madin-Darby caninekidney cells.Hypertension 1995；26891-898)使用的酶促熒光分光光度法檢測(cè)重組人胰激肽釋放酶活力。
實(shí)施例7人胰腺組織激肽釋放酶基因在昆蟲細(xì)胞(sf9)中的表達(dá)1.共轉(zhuǎn)染(1)接種1.0×106sf9昆蟲細(xì)胞于培養(yǎng)皿，加入1.5ml完全培養(yǎng)基，27℃培養(yǎng)4hr；(2)將轉(zhuǎn)移載體與線性化野生型桿狀病毒DNA共轉(zhuǎn)染；a.使用含10％胎牛血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)sf9昆蟲細(xì)胞；b.當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)成片時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞；c.計(jì)數(shù)細(xì)胞；d.接種2×106sf9昆蟲細(xì)胞于60mm培養(yǎng)皿；e.逐滴加入Lipofectin-DNA復(fù)合物，混勻，27℃培養(yǎng)4-5小時(shí)；(3)同源重組后進(jìn)行空斑篩選，光學(xué)顯微鏡下篩選出重組桿狀病毒。
2.表達(dá)大規(guī)模培養(yǎng)重組桿狀病毒后接種昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)(參照試劑盒說(shuō)明書以及《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》第16章部分的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行表達(dá))。
3.表達(dá)蛋白的初步純化參照試劑盒說(shuō)明書以及《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》第16章部分的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行層析純化。
4.表達(dá)蛋白的活性檢測(cè)參照原核表達(dá)產(chǎn)物活性檢測(cè)方法進(jìn)行。
實(shí)施例8大腸桿菌表達(dá)的人胰腺組織激肽釋放酶成熟蛋白與完整蛋白的生物活性比較分別構(gòu)建激肽釋放酶完整蛋白、成熟蛋白載體(本發(fā)明表達(dá)載體pE28pK以及表達(dá)載體pE28mK)并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，初步純化、復(fù)性，利用凝血酶切除融合的氨基酸，采用電位滴定法檢測(cè)產(chǎn)物活力，結(jié)果表明pE28mK表達(dá)產(chǎn)物水解苯甲酰精氨胺酸乙酯的活力明顯高于pE28pK的表達(dá)產(chǎn)物(圖8)。說(shuō)明，表達(dá)載體pE28mK可以表達(dá)具有生物活力的成熟激肽釋放酶。表達(dá)載體pE28pK表達(dá)的激肽釋放酶原在大腸桿菌中沒(méi)有獲得翻譯后的切割加工。
以上實(shí)施例說(shuō)明，本發(fā)明成功地構(gòu)建了可以攜帶人胰腺組織激肽釋放酶成熟蛋白基因的重組表達(dá)載體，該載體在宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組人胰腺組織激肽釋放酶具有較高的生物學(xué)活性，并且可以利用親和層析對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化。
本發(fā)明不限于以上方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明做出各種改變和變形，只要不脫離本發(fā)明精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明的范圍。
SEQUENCE LISTING<110>深圳市人民醫(yī)院<120>一種表達(dá)人胰腺組織激肽釋放酶基因的重組表達(dá)載體及重組人胰腺組織激肽釋放酶的制備<130>PI02943<150>CN01104112.9<151>2001-02-20<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>818<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(4)..(789)<223><400>1acc atg tgg ttc ctg gtt ctg tgc ctc gcc ctg tcc ctg ggg ggg act48Met Trp Phe Leu Val Leu Cys Leu Ala Leu Ser Leu Gly Gly Thr1 5 10 15ggt gct gcg ccc ccg att cag tcc cgg att gtg gga ggc tgg gag tgt96Gly Ala Ala Pro Pro Ile Gln Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys20 25 30gag cag cat tcc cag ccc tgg cag gcg gct ctg tac cat ttc agc act144Glu Gln His Ser Gln Pro Trp Gln Ala Ala Leu Tyr His Phe Ser Thr35 40 45ttc cag tgt ggg ggc atc ctg gtg cac cgc cag tgg gtg ctc aca gct192Phe Gln Cys Gly Gly Ile Leu Val His Arg Gln Trp Val Leu Thr Ala50 55 60gct cat tgc atc agc gac aat tac cag ctc tgg ctg ggt cgc cac aac240Ala His Cys Ile Ser Asp Asn Tyr Gln Leu Trp Leu Gly Arg His Asn65 70 75ttg ttt gac gac gaa aac aca gcc cag ttt gtt cat gtc agt gag agc288Leu Phe Asp Asp Glu Asn Thr Ala Gln Phe Val His Val Ser Glu Ser80 85 90 95ttc cca cac cct ggc ttc aac atg agc ctc ctg gag aac cac acc cgc336Phe Pro His Pro Gly Phe Asn Met Ser Leu Leu Glu Asn His Thr Arg100 105 110caa gca aac gag gac tac agc cac gac ctc atg ctg ctc cgc ctg aca384Gln Ala Asn Glu Asp Tyr Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Thr115 120 125gag cct gct gat acc atc aca gac gct gtg aag gtc gtg gag ttg ccc432Glu Pro Ala Asp Thr Ile Thr Asp Ala Val Lys Val Val Glu Leu Pro130 135 140acc cag gaa ccc gaa gtg ggg agc acc tgt ttg gct tcc ggc tgg ggc480Thr Gln Glu Pro Glu Val Gly Ser Thr Cys Leu Ala Ser Gly Trp Gly145 150 155agc atc gaa cca gag aat ttc tca ttt cca gat gat ctc cag tgt gtg528Ser Ile Glu Pro Glu Asn Phe Ser Phe Pro Asp Asp Leu Gln Cys Val160 165 170 175gac ctc aaa atc ctg cct aat gat gag tgc gaa aaa gcc cac gtc cag576Asp Leu Lys Ile Leu Pro Asn Asp Glu Cys Glu Lys Ala His Val Gln180 185 190aag gtg aca gac ttc atg ctg tgt gtc gga cac ctg gaa ggt ggc aaa624Lys Val Thr Asp Phe Met Leu Cys Val Gly His Leu Glu Gly Gly Lys195 200 205gac acc tgt gtg ggt gat tca ggg ggc ccg ctg atg tgt gat ggt gtg672Asp Thr Cys Val Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met Cys Asp Gly Val210 215 220ctc caa ggt gtc aca tca tgg ggc tac gtc cct tgt ggc acc ccc aat720Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Tyr Val Pro Cys Gly Thr Pro Asn225 230 235aag cct tct gtc gcc gtc aga gtg ctg tct tat gtg aag tgg atc gag768Lys Pro Ser Val Ala Val Arg Val Leu Ser Tyr Val Lys Trp Ile Glu240 245 250 255gac acc ata gcg gag aac tcc tgaacgccca gccctgtccc ctaccccca818Asp Thr Ile Ala Glu Asn Ser
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權(quán)利要求
1.包含SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的重組載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組載體，其特征在于所述載體為質(zhì)粒載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組載體，其特征在于在所述載體的C端融合His Tag序列，使得表達(dá)的目的蛋白易于進(jìn)行親合層析純化。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組載體，其特征在于所述載體為桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體。
5.一種權(quán)利要求2所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，其特征在于所述細(xì)胞為大腸桿菌。
7.一種權(quán)利要求4所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于所述細(xì)胞為昆蟲細(xì)胞。
9.一種制備重組激肽釋放酶的方法，包括下述步驟1)將編碼胰組織激肽釋放酶成熟蛋白的基因可操作地連接于表達(dá)調(diào)控序列，構(gòu)建表達(dá)載體；2)用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化原核或真核細(xì)胞，形成宿主細(xì)胞；3)在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞；4)從培養(yǎng)液中分離出具有激肽釋放酶活性的蛋白質(zhì)；5)用親和層析純化獲得重組激肽釋放酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及攜帶編碼人胰激肽釋放酶成熟蛋白基因的分泌型和非分泌型重組載體以及轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞,本發(fā)明還涉及應(yīng)用基因工程技術(shù)制備重組人激肽釋放酶的方法。本發(fā)明的表達(dá)載體可高效表達(dá)具有胰腺激肽釋放酶活性的蛋白產(chǎn)物,同時(shí),本發(fā)明的表達(dá)載體中還融合了His親和序列,包含該親和序列的表達(dá)產(chǎn)物,在分離純化時(shí)可利用His親和樹脂進(jìn)行親和層析純化。本發(fā)明為開發(fā)人源組織激肽釋放酶基因工程產(chǎn)品,開發(fā)人源組織激肽釋放酶的基因藥物奠定基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1384199SQ02103538
公開日2002年12月11日 申請(qǐng)日期2002年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月20日
發(fā)明者李體遠(yuǎn), 戴勇, 杜珙, 黃瑞芳, 石之磷, 蔡筱彥, 肖德明 申請(qǐng)人:深圳市人民醫(yī)院