基于酶誘導(dǎo)亞硫酸根作為激活劑的免疫分析方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于酶誘導(dǎo)亞硫酸根作為激活劑的免疫分析方法，屬于納米材料和生物分析【技術(shù)領(lǐng)域】。該方法通過目標(biāo)物結(jié)合的酶標(biāo)納米探針上的葡萄糖氧化酶催化葡萄糖產(chǎn)生過氧化氫，再依次加入硝酸、亞硫酸鈉、硝酸銀和TMB顯色液，用于紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行定量檢測。本發(fā)明的目的在于提供一種基于酶誘導(dǎo)亞硫酸根作為激活劑的免疫分析方法，該分析方法主要用于血清中低豐度蛋白含量的檢測。由于酶誘導(dǎo)亞硫酸根作為激活劑能夠?qū)е氯芤猴@色。利用這個(gè)特點(diǎn)，可以建立一種高靈敏且性能穩(wěn)定的比色免疫分析方法。本方法成本低，比色檢測方法簡便、顯色快速、靈敏度高，為臨床免疫學(xué)檢測提供了一種靈敏且性能穩(wěn)定的方法。
【專利說明】基于酶誘導(dǎo)亞硫酸根作為激活劑的免疫分析方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于酶誘導(dǎo)亞硫酸根作為激活劑的免疫分析方法，屬于納米材料和生物分析【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]免疫分析技術(shù)因其獨(dú)有的特異性，在臨床診斷和環(huán)境檢測等方面得到廣泛地應(yīng)用。酶聯(lián)免疫分析技術(shù)(ELISA)自1971年建立以來，便由于其所具有的快速、靈敏、簡便、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，得到迅速的發(fā)展和應(yīng)用，逐步成為應(yīng)用最廣泛的免疫分析方法之一，涉及免疫學(xué)檢驗(yàn)的各個(gè)領(lǐng)域。一般，比色免疫分析所采用的顯色劑為鄰苯二胺，聯(lián)苯胺和3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺。其中，3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺因?yàn)榉侵掳┬?，不突變，好的穩(wěn)定性和高的靈敏度的特性成為最廣泛應(yīng)用的顯色劑。但是，在傳統(tǒng)的檢測中，3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺是通過酶(過氧化物酶)或模擬酶來在過氧化氫的幫助下催化顯色。在顯色過程中極易受外部條件(pH和溫度)的影響，影響顯色的穩(wěn)定性。因此，在比色免疫分析中，設(shè)計(jì)一種在顯色階段不易受外界環(huán)境干擾的免疫傳感器是有重要的意義。
[0003]根據(jù)報(bào)道，我們發(fā)現(xiàn)3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺能夠直接和銀離子進(jìn)行反應(yīng)，達(dá)到顯色的目的[S.Liu et al., Sensor Actuat.B-Chem.2012, 165: 44] [R.Gonzalez-Fuenzalida et al., Anal.Chem.2013, 85: 10013]。而且亞硫酸根和硫酸根對(duì)于銀離子的穩(wěn)定常數(shù)是有顯著分別的，這使亞硫酸根相當(dāng)于抑制劑的性能能夠抑制3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺和銀離子反應(yīng)。此外，過氧化氫能夠把亞硫酸根氧化為硫酸根。這些反應(yīng)涉及到的僅是簡單的化學(xué)反應(yīng)。因此，我們整合這些反應(yīng)，把酶作為誘導(dǎo)亞硫酸根的激活劑，設(shè)計(jì)出一種更穩(wěn)定的顯色策略進(jìn)行比色免疫分析具有重大的實(shí)際意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種基于酶誘導(dǎo)亞硫酸根作為激活劑的免疫分析方法，該分析方法主要用于血清中低豐度蛋白含量的檢測。由于酶誘導(dǎo)亞硫酸根作為激活劑能夠?qū)е氯芤猴@色。利用這個(gè)特點(diǎn)，可以建立一種高靈敏且性能穩(wěn)定的比色免疫分析方法。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種基于酶誘導(dǎo)亞硫酸根作為激活劑的免疫分析方法包括如下步驟:
(1)制備金納米粒子；
(2)將抗體固載在磁珠上作載體，葡萄糖氧化酶和抗體同時(shí)固載在金納米顆粒上制成酶標(biāo)抗體納米探針；
(3)將已固載在磁珠上的抗體、待測樣品以及酶標(biāo)抗體納米探針通過夾心型免疫分析反應(yīng)模式形成抗體-抗原-抗體夾心型免疫磁珠復(fù)合物；將所述抗體-抗原-抗體夾心型免疫磁珠復(fù)合物用磁鐵分離出來，加入葡萄糖反應(yīng)，磁性分離，液體轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)板中；
(4)在酶標(biāo)板中，按順序依次加入硝酸、亞硫酸鈉、硝酸銀和TMB顯色液，用酶標(biāo)儀檢測各個(gè)微孔的吸光度值。
[0006]更具體地，
步驟(I)所述的金納米顆粒是通過檸檬酸三鈉還原氯金酸得到的；所述的金納米顆粒粒徑為16 nm，其表面帶負(fù)電荷。
[0007]步驟(2)所述載體中磁珠與抗體的結(jié)合為化學(xué)鍵結(jié)合；所述金納米顆粒與抗體和葡萄糖氧化酶的結(jié)合為正負(fù)電荷相吸作用結(jié)合、疏水作用結(jié)合和化學(xué)鍵作用結(jié)合。
[0008]步驟(3)所述待測樣品為大分子目標(biāo)物；所述夾心型免疫分析模式的完成采取兩步法:即待測樣品、固載在磁珠上的抗體混合發(fā)生免疫反應(yīng)形成一種免疫磁珠復(fù)合物，再與酶標(biāo)抗體納米探針混合發(fā)生免疫反應(yīng)形成抗體-抗原-抗體夾心型免疫磁珠復(fù)合物。
[0009]步驟(3)所用葡萄糖的量為50 μ L，濃度為4 mM。
[0010]步驟(4)所述硝酸用量為40 μ L,濃度為I mM;亞硫酸鈉用量為50 μ L,濃度為I mM ;硝酸銀用量為50 μ L，濃度為2 mM ；TMB顯色液為100 μ L含有濃度為I mM的3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液；所述檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液的PH值為4.0。
[0011]本發(fā)明的基于酶誘導(dǎo)亞硫酸根作為激活劑的免疫分析方法的測定原理是，首先將待測樣品加入到固載抗體的磁珠上，再加入酶標(biāo)抗體金納米探針孵育，從而在磁珠載體上形成抗體-抗原-抗體夾心型免疫復(fù)合物。當(dāng)待測樣品含量低時(shí)，結(jié)合在載體上的酶標(biāo)抗體金納米探針就少，酶催化葡萄糖產(chǎn)生的過氧化氫就少，從而導(dǎo)致還有大量的亞硫酸根沒被激活，阻礙了銀離子與3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺的反應(yīng)，顯色反應(yīng)減弱；吸光度值降低，反之結(jié)合在載體上的酶標(biāo)抗體金納米探針就多，酶催化葡萄糖產(chǎn)生的過氧化氫就多，從而導(dǎo)致大量的亞硫酸根被激活氧化為硫酸根，阻礙不了銀離子與3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺的反應(yīng)，顯色反應(yīng)增強(qiáng)，吸光度值升高。從而達(dá)到定量分析的目的。
[0012]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下:
(I)本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種比色免疫分析策略代替?zhèn)鹘y(tǒng)的比色策略應(yīng)用于比色免疫分析檢測大分子目標(biāo)物(主要用于血清中低豐度蛋白含量的檢測)的方法。本方法具有檢測線低、靈敏度和穩(wěn)定性聞等優(yōu)點(diǎn)。
[0013](2)本發(fā)明通過亞硫酸根與硫酸根的轉(zhuǎn)換來控制顯色劑的顯色程度，克服了在顯色階段傳統(tǒng)生物活性酶易失活、易變性等缺點(diǎn)，可望為疾病早期診斷等重要領(lǐng)域提供技術(shù)基礎(chǔ)，具備顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
[0014](3)與辣根過氧化物酶催化相比，亞硫酸根氧化為硫酸根是一種簡單的化學(xué)反應(yīng)，它在可控性上更穩(wěn)定、操作更方便，并且易于在戶外使用。
[0015](4)與已報(bào)道的基于酶的免疫分析相比，本發(fā)明的基于酶誘導(dǎo)亞硫酸根作為激活劑的免疫分析具有更低的檢測線、更高的靈敏度。本發(fā)明方法對(duì)于前列腺特異抗原的檢出限為 0.5 pg ml/1,線性范圍是 0.5 pg mL_1 到 10 ng mL'

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1是基于酶誘導(dǎo)亞硫酸根作為激活劑的免疫分析的示意圖；
圖2是比色免疫分析的機(jī)理圖(a:葡萄糖+葡萄糖氧化酶+亞硫酸鈉+硝酸銀+TMB顯色液；b:葡萄糖氧化酶+亞硫酸鈉+硝酸銀+TMB顯色液；c:葡萄糖+亞硫酸鈉+硝酸銀+TMB顯色液；d:葡萄糖+葡萄糖氧化酶+硝酸銀+TMB顯色液；e:葡萄糖+葡萄糖氧化酶+亞硫酸鈉+TMB顯色液；f:葡萄糖+葡萄糖氧化酶+亞硫酸鈉+硝酸銀。)；
圖3是與圖2曲線相對(duì)應(yīng)的溶液照片；
圖4是基于酶誘導(dǎo)亞硫酸根作為激活劑的免疫分析顯色前列腺特異抗原標(biāo)準(zhǔn)工作曲線圖(插圖為相對(duì)應(yīng)的溶液照片)。

【具體實(shí)施方式】
[0017]下面通過具體實(shí)施示例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說明，但是不能以此限制本發(fā)明的范圍。
[0018]實(shí)施例1
1.抗體固載在磁珠上的制備
50 mg Fe3O4磁珠加入I mL無水乙醇中，溶液在室溫下超聲10分鐘。30 μ L 3_氨基丙基三乙氧基硅烷加入其中，在室溫下攪拌6小時(shí)。結(jié)果溶液磁控分離，分散在I mL磷酸緩沖液(PBS，pH 7.4,300 μ L戊二醛)中，繼續(xù)攪拌6小時(shí)。在磁控分離后，沉淀溶解在ImL碳酸緩沖液(pH 9.6,100 yg前列腺特異抗體)中，在4 °C下振搖過夜。然后分離除去多余的抗體，加入1wt %牛白蛋白(BSA)-PBS(l mL, pH 7.4)，在4 °C下反應(yīng)2小時(shí)。最后，加入50 μ L硼氫化氰鈉，在4 °C下孵育I小時(shí)。所得固載抗體的磁珠沉淀分散在0.5mL PBS (pH 7.4，1.0 wt% BSA，0.1 wt% 疊氮化鈉)中。
[0019]2.酶標(biāo)抗體納米探針復(fù)合物的制備
首先，將1.0 mL所制備的16 nm金納米顆粒用濃度為0.1 M的碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH值到9.0-9.5。第二，將I μ L濃度為lmg/mL的前列腺特異抗體和10 μ L濃度為I mg/mL的葡萄糖氧化酶加入上述金納米顆粒溶液中，然后將混合液在4 1:攪拌下孵育過夜。最后，將上述混合液在14000 g轉(zhuǎn)速和4 °C下離心20分鐘，小心去除上層清夜，得到的沉淀再分散在I mL含有1.0 wt % BSA和0.1 wt %疊氮化鈉的PBS(pH=7.4)中，儲(chǔ)存于4 °C。
[0020]3.比色免疫分析的機(jī)理探究
首先，在高親和力的96孔酶標(biāo)微孔板上一個(gè)孔上加入10 PL葡萄糖氧化酶(I mg/mL)和50 PL葡萄糖(4mM)，在37 °C下孵育30分鐘。然后加入40 μ?硝酸(I mM)和50 μ?亞硫酸鈉(I mM)，反應(yīng)I分鐘。其次，加入50μ?硝酸銀(2mM)，反應(yīng)I分鐘。最后，加入100?ΤΜΒ顯色液(含有I mM的3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺，所用緩沖液為pH 4.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液)，室溫下顯色30 min后,用酶標(biāo)儀在652 nm處讀取吸光度值。在另外的五個(gè)孔中分別不加入葡萄糖氧化酶，葡萄糖，亞硫酸鈉，硝酸銀和3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺，按上述方法一樣進(jìn)行檢測。結(jié)果如圖2所示。曲線b和c分別沒有加入葡萄糖氧化酶和葡萄糖；而曲線e和f分別沒有加入硝酸銀和3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺；曲線d沒有加入亞硫酸鈉。圖3為與圖2曲線相對(duì)應(yīng)的照片。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，顯色的來源是硝酸銀和3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺相互作用的結(jié)果；亞硫酸鈉是作為該顯色反應(yīng)的模擬抑制劑存在；葡萄糖氧化酶能夠激活亞硫酸鈉，消除對(duì)顯色反應(yīng)的影響。這么，當(dāng)葡萄糖氧化酶的濃度變化時(shí)，吸光度也會(huì)發(fā)生變化，因此，我們可以把它應(yīng)用于免疫分析中。
[0021]4.比色免疫分析檢測PSA (本實(shí)施例前列腺特異性抗原作為模型目標(biāo)分析物)
圖1是本發(fā)明的基于酶誘導(dǎo)亞硫酸根作為激活劑的免疫分析過程示意圖。首先，50 μ?PSA加入0.5 mL的離心管(含25μ?抗體固載的磁珠)中，在37 °C下孵育30分鐘。在磁控分離后，加入50 μ?酶標(biāo)金納米粒子溶液，在4 °C下孵育30分鐘，磁控分離。50 μ?葡萄糖(4mM)加入其中，在37 °C下反應(yīng)30分鐘。其次，加入40 μ?硝酸(ImM)和50μ?亞硫酸鈉(ImM),反應(yīng)I分鐘。然后加入50μ?硝酸銀(2mM),反應(yīng)I分鐘。最后,每個(gè)離心管加入100μ?ΤΜΒ顯色液(含有I mM的3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺，所用緩沖液為pH 4.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液)，室溫下顯色30 min后,用酶標(biāo)儀在652 nm處讀取吸光度值。根據(jù)吸光度值和PSA濃度變化的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，如圖4所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法對(duì)于前列腺特異性抗原的檢出限為0.5 pg ml/1,線性范圍是0.5 pg ml/1至10 ng mL'該方法與傳統(tǒng)生物活性酶標(biāo)記的方法相比，本發(fā)明使用亞硫酸根作為模擬抑制劑，克服了在顯色階段傳統(tǒng)生物活性酶易失活、易變性等缺點(diǎn)，可望為疾病早期診斷等重要領(lǐng)域提供技術(shù)基礎(chǔ)。
[0022]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種基于酶誘導(dǎo)亞硫酸根作為激活劑的免疫分析方法，其特征在于:所述方法包括如下步驟: (1)制備金納米粒子； (2)將抗體固載在磁珠上作載體，葡萄糖氧化酶和抗體同時(shí)固載在金納米顆粒上制成酶標(biāo)抗體納米探針； (3)將已固載在磁珠上的抗體、待測樣品以及酶標(biāo)抗體納米探針通過夾心型免疫分析反應(yīng)模式形成抗體-抗原-抗體夾心型免疫磁珠復(fù)合物；將所述抗體-抗原-抗體夾心型免疫磁珠復(fù)合物用磁鐵分離出來，加入葡萄糖反應(yīng)，磁性分離，液體轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)板中； (4)在酶標(biāo)板中，按順序依次加入硝酸、亞硫酸鈉、硝酸銀和TMB顯色液，用酶標(biāo)儀檢測各個(gè)微孔的吸光度值。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于酶誘導(dǎo)亞硫酸根作為激活劑的免疫分析方法，其特征在于:步驟(I)所述的金納米顆粒是通過檸檬酸三鈉還原氯金酸得到的；所述的金納米顆粒粒徑為16 nm，其表面帶負(fù)電荷。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于酶誘導(dǎo)亞硫酸根作為激活劑的免疫分析方法，其特征在于:步驟(2)所述載體中磁珠與抗體的結(jié)合為化學(xué)鍵結(jié)合；所述金納米顆粒與抗體和葡萄糖氧化酶的結(jié)合為正負(fù)電荷相吸作用結(jié)合、疏水作用結(jié)合和化學(xué)鍵作用結(jié)合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于酶誘導(dǎo)亞硫酸根作為激活劑的免疫分析方法，其特征在于:步驟(3)所述待測樣品為大分子目標(biāo)物；所述夾心型免疫分析模式的完成采取兩步法:即待測樣品、固載在磁珠上的抗體混合發(fā)生免疫反應(yīng)形成一種免疫磁珠復(fù)合物，再與酶標(biāo)抗體納米探針混合發(fā)生免疫反應(yīng)形成抗體-抗原-抗體夾心型免疫磁珠復(fù)合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于酶誘導(dǎo)亞硫酸根作為激活劑的免疫分析方法，其特征在于:步驟(3)所用葡萄糖的量為50 μ L，濃度為4 mM。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于酶誘導(dǎo)亞硫酸根作為激活劑的免疫分析方法，其特征在于:步驟(4)所述硝酸用量為40 μ L,濃度為I mM ;亞硫酸鈉用量為50 μ L,濃度為ImM;硝酸銀用量為50 yL，濃度為2顯色液為100 μ L含有濃度為I mM的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液；所述檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液的PH值為.4.0。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104360076SQ201410650933
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年11月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月17日
【發(fā)明者】唐點(diǎn)平, 賴文強(qiáng), 莊君陽 申請(qǐng)人:福州大學(xué)