專(zhuān)利名稱(chēng)：畜禽去勢(shì)基因疫苗(dna疫苗)的基因工程體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為構(gòu)建生產(chǎn)用于家畜和家禽去勢(shì)基因疫苗(DNA疫苗)的基因工程體，屬生物高新技術(shù)領(lǐng)域的尖端產(chǎn)品。
去勢(shì)俗稱(chēng)閹割，動(dòng)物去勢(shì)后，行為溫馴、飼料利用率高，增重快，肉質(zhì)好，管理方便。幾個(gè)世紀(jì)以來(lái)，一直采取用手術(shù)摘除性腺的方法去勢(shì)，但手術(shù)去勢(shì)易引起創(chuàng)傷、感染，造成意外損失。用于性成熟的動(dòng)物則更危險(xiǎn)。
應(yīng)用免疫中和(HIN)技術(shù)免疫去勢(shì)不存在這種危險(xiǎn)，不僅可用于幼年動(dòng)物，也可用于性成熟的動(dòng)物。這種方法，不但操作簡(jiǎn)便，且避免了手術(shù)去勢(shì)導(dǎo)致的出血、感染及應(yīng)激造成的體重下降。
免疫去勢(shì)主要應(yīng)用促黃體激素釋放激素(LHRH)。LHRH為一種由10個(gè)氨基酸組成的10肽激素，是一種高位調(diào)節(jié)激素，它由高位調(diào)節(jié)中樞下丘腦所分泌，作用于垂體，促進(jìn)黃體生成素(LH)和促卵泡激素(FSH)的釋放，而后者則作用于動(dòng)物性腺，促使性器官發(fā)育成熟，刺激排卵和精子生成。
為了充分利用LHRH生物活性，人們合成了很多LHRH類(lèi)似物，有些是高活性類(lèi)似物，主要用于刺激排卵。有些頡頏性類(lèi)似物，能競(jìng)爭(zhēng)性與垂體細(xì)胞的LHRH受體結(jié)合，從而抑制內(nèi)源LHRH的作用，阻斷LH和FSH釋放，抑制排卵。但是，鑒于激素作用的特點(diǎn)，大量長(zhǎng)期用藥必將帶來(lái)不良的副作用，故多已棄而不用。
代之而起的是抗LHRH的HIN技術(shù)。LHRH被抗體中和后，使垂體LH和FSH的合成和分泌下降，從而抑制性器官的發(fā)育，最終最致萎縮，達(dá)到免疫去勢(shì)目的。見(jiàn)

圖1。這一技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)①一次注射即能有效地維持較長(zhǎng)時(shí)間；②調(diào)節(jié)內(nèi)源性激素的釋放，無(wú)需持續(xù)給藥，沒(méi)有發(fā)生副作用的可能性，也不引起激素殘留；③對(duì)性成熟的動(dòng)物來(lái)說(shuō)，具有可逆性，免疫力消失后，可恢復(fù)生殖能力和性功能；④使用方便，費(fèi)用低廉，適于推廣應(yīng)用。
20世紀(jì)80年代以來(lái)，應(yīng)用LHRH合成肽疫苗主動(dòng)免疫多種動(dòng)物的研究已有報(bào)道。發(fā)明者之一杜念興教授于80年代后期，指導(dǎo)研究生開(kāi)展去勢(shì)疫苗研究，最早是劉功平等將人工合成的LHRH共價(jià)連接于牛血清白蛋白上，制成合成肽疫苗，用以免疫2月齡公免。結(jié)果免疫性功能喪失，睪丸萎縮，生精細(xì)胞水泡樣變性，生精管內(nèi)無(wú)精子生成；抗LHRH抗體顯著升高，睪酮水平下降。用抗LHRH抗體被動(dòng)疫亦可使LH和睪酮水平降至最低水平。外國(guó)已有LHRH合成肽疫苗出售，但主要用于人類(lèi)，治療前列腺癌、前列腺增生和前列腺肥大。因其生產(chǎn)成本高，價(jià)格十分昂貴，在獸醫(yī)上無(wú)法應(yīng)用。
為了降低制苗成本，又進(jìn)一步研究畜用和禽用兩種去勢(shì)基因工程疫苗。并完成了在家蠶桿狀病毒中表達(dá)的重組桿狀病毒的篩選和鑒定工作。在蠶體表達(dá)后，表達(dá)產(chǎn)物-HBsAg/LHRH融合蛋白在電鏡下呈病毒樣顆粒，具有良好的免疫原性。
但由于該疫苗需用家蠶生產(chǎn)，不適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，且提取工藝煩瑣，成本成本昂貴，因而未能轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力。繼之，將該HBs/LHRH基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)，亦因表達(dá)水平不高，提取困難，而放棄。最終又構(gòu)建了以硫氧還蛋白(TRX)為載體的LHRH基因工程亞單位疫苗。不僅表達(dá)水平高，且提取方便，生產(chǎn)成本低廉，免疫效果良好?，F(xiàn)已申請(qǐng)中試，有可能成為第一個(gè)進(jìn)入市場(chǎng)的去勢(shì)基因工程苗。發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0107831.3。
由于生命科學(xué)發(fā)展神速，近年來(lái)被譽(yù)為第三代苗的新型基因疫苗(亦稱(chēng)DNA疫苗)一面世就引起世界性的重視?；蛞呙缭趧?dòng)物細(xì)胞內(nèi)能持續(xù)表達(dá)2～3個(gè)月，不斷分泌免疫原。強(qiáng)化免疫效果。一次免疫有效期可達(dá)5個(gè)月。這是基因疫苗的最大優(yōu)點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)有動(dòng)物去勢(shì)基因疫苗的報(bào)道。
本發(fā)明的目的是提供用于生產(chǎn)畜禽去勢(shì)基因疫苗的基因工程體。使其表達(dá)產(chǎn)物在動(dòng)物體內(nèi)能組裝成呈顆粒性多價(jià)免疫原，在顆粒表面暴露有多個(gè)LHRH表位，其免疫原性優(yōu)于常規(guī)基因工程亞單位苗。且該基因工程體的質(zhì)粒能在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表達(dá)2～3個(gè)月，不斷分泌免疫原，一次注射即可達(dá)到免疫去勢(shì)的目的?？捎冒l(fā)酵生產(chǎn)，回收菌體，提取質(zhì)粒后，即可直接配苗。工藝簡(jiǎn)單，適于大規(guī)模生產(chǎn)。生產(chǎn)成本低廉，使用方便，無(wú)激素殘留，無(wú)潛在險(xiǎn)危，安全性好。
本發(fā)明畜禽去勢(shì)基因疫苗的基因工程體，其特征在于將畜、禽2個(gè)型的促黃體激素釋放激素(LHRH)基因分別插入人乙肝表面抗原基因(HBs)的第223密碼子之后，構(gòu)建成2株HBs/LHRH融合基因，并將其分別插入能在真核細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表達(dá)的pcDNA3.1質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，構(gòu)建成畜、禽2株基因工程體-E.coli-pcDNA3.1-HBs/LHRH(M)和E.coli-pcDNA3.1-HBs/LHRH(A)畜用去勢(shì)基因苗的基因工程體菌種分類(lèi)大腸埃希氏桿菌命名E.coli-pcDNA3.1-HBs/LHRH(M)保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏地址中國(guó).北京.中關(guān)村.2714信箱 郵政編碼100080保藏號(hào)0711禽用去勢(shì)基因苗的基因工程體菌種分類(lèi)大腸埃希氏桿菌命名E.coli-pcDNA3.1-HBs/LHRH(A)保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏地址中國(guó).北京.中關(guān)村.2714信箱 郵政編碼100080保藏號(hào)0710其主基因?yàn)長(zhǎng)HRH基因，它是由10個(gè)氨基酸殘基的小肽分子，哺乳動(dòng)物(mammal.M)的LHRH化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)完全相同，禽類(lèi)(avian.A)LHRH的第8位氨基酸與哺乳動(dòng)物不同。其氨基酸組成和密碼子如下LHRH(M) 基因12345678910pGlu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly-NH25’-CAG CAC TGG TCC TAT GGA CTG CGC CCT GGA-3’LHRH(A) 基因pGlu His Trp Ser Tyr Gly Leu Glu Pro Gly-NH25’-CAG CAC TGG TCC TAT GGA CTG CAG CCT GGA-3’本基因工程體的構(gòu)建過(guò)程為1 pBS-LHRH質(zhì)粒的構(gòu)建1.1人工合成LHRH基因?yàn)榱吮阌诨虻牟僮骷耙院笈cHBs基因的嵌合，試驗(yàn)設(shè)計(jì)的LHRH基因中，在5’端加有BamHI酶切位點(diǎn)，3’末端加有2個(gè)終止密碼子及Hind III酶切位點(diǎn)。設(shè)計(jì)方案如下LHRH(M)基因5’-AAGGATCCTCAGCACTGGTCCTATGGACTGCGCCCTGGATAATGAAAGCTTAT-3’BamHI3’-TTCCTAGGAGTCGTGACCAGGATACCTGACGCGGGACCTATTACTTCGAATA-5’LHRH(A)基因終止子 Hind III5’-AAGGATCCTCAGCACTGGTCCTATGGACTGCAGCCTGGATAATGAAAGCTTAT-3’BamHI3’-TTCCTAGGAGTCGTGACCAGGATACCTGACGTCGGACCTATTACTTTCGAATA-5’終止子 Hind III按上述設(shè)計(jì)要求，人工合成L1、L2、L33條寡核苷酸片段。L1為畜型(M)和禽型(A)所共有的正鏈，L2為M型的負(fù)鏈，L3為A型的負(fù)鏈。正鏈和負(fù)鏈之間有9個(gè)堿基是互補(bǔ)的。M型 L15’-AAGGATCCTCAGCACTGGTCCTATGGACTG-3’L2 3’-ATACCTGACGCGGGACCTATTACTTTCGAATA-5’A型 L1 5’-AAGGATCCTCAGCACTGGTCCTATGGACTG-3’L3 3’-ATACCTGACGTCGGACCTATTACTTTCGAATA-5’將上述人工合成寡核苷酸片段L1和L2，L1和L3退火、延伸、補(bǔ)齊后，即成以上設(shè)計(jì)的LHRH(M)和LHRH(A)2個(gè)基因。1.2構(gòu)建pBS-LHRH質(zhì)粒將上述LHRH(M)基因和LHRH(A)基因分別用BamHI和HandIII雙酶切，回收帶粘性末端的LHRH基因。提取pBS質(zhì)粒，用BamHI和HandIII雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，分別與LHRH(M)和LHRH(A)基因連接后，獲得2株pBS-LHRH質(zhì)粒。將其轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌。經(jīng)酶切鑒定和序列分析，證實(shí)構(gòu)建成功。見(jiàn)圖2。2 pBS-HBs/LHRH質(zhì)粒的構(gòu)建提取pWR13-HBs質(zhì)粒，以SacI及BglII雙酶切，電泳回收HBs酶切片段。
分別用SacI及BamHI雙酶切上述構(gòu)建的pBS-LHRH(M)和pBS-LHRH(A)2種質(zhì)粒，電泳回收pBS-LHRHs質(zhì)粒大片段。
將HBs片段與pBS-LHRH(M)和pBS-LHRH(A)質(zhì)粒片段連接，形成pBS-HBs/LHRH(M)和pBS-HBs/LHRH(A)2個(gè)重組質(zhì)粒。
將pBS-HBs/LHRH(M)和pBS-HBs/LHRH(A)2個(gè)重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，經(jīng)酶切篩選獲得2株帶LHRH和HBs融合基因的2株重組大腸桿-Ecoli-HBs/LHRH(M)和Ecoli-HBs/LHRH(A)。
提取pBS-HBs/LHRH(M)和pBS-HBs/LHRH(A)質(zhì)粒，用Bgl II、BamHI、HindIII單酶切和用BamHI和HindIII雙酶切鑒定，并用雙脫氧終止法測(cè)序分析結(jié)果完全符合設(shè)計(jì)要求，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。見(jiàn)圖5。3 pcDNA3.1-HBs/LHRH質(zhì)粒的構(gòu)建3.1 PCR擴(kuò)增HBs/LHRH融合基因合成HBs/LHRH融合基因引物上游引物 下游引物 從上述2株重組大腸桿菌分別提取pBS-HBs/LHRH(M)和pBS-HBs/LHRH(A)質(zhì)粒。引物L(fēng)0+L1以pBS-HBs/LHRH(M)為模板；L0+L2以pBS-HBs/LHRH(A)為模板，分別作PCR，擴(kuò)增出HBs/LHRH(M)和HBs/LHRH(A)2株融合基因。3.2 pcDNA3.1-HBs/LHRH質(zhì)粒和基因工程體構(gòu)建從E.coli-pcDNA3.1(+)重組大腸桿菌提取pcDNA3.1質(zhì)粒。用HindIII和EcoRI雙酶切，回收質(zhì)粒片段，分別與同樣雙酶切的上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接，獲得pcDNA3.1-HBs/LHRH(M)和pcDNA3.1-HBs/LHRH(A)2株重組質(zhì)粒；轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，獲得E.coli-pcDNA3.1-HBs/LHRH(M)和E.coli-pcDNA3.1-HBs/LHRH(A)2株基因工程體。從該基因工程體提取質(zhì)粒，用BamHI酶切者質(zhì)粒不被切開(kāi)，用HindIII和EcoRI酶切時(shí)，質(zhì)粒被切開(kāi)，用HindIII和EcoRI雙酶切者，則可見(jiàn)一帶720bp大小的小帶，用于生產(chǎn)去勢(shì)DNA苗的2株基因工程體。從重組質(zhì)粒中插入基因的3′起測(cè)序，結(jié)果與原設(shè)計(jì)完全符合，表明用于生產(chǎn)去勢(shì)DNA苗的2株基因工程體構(gòu)建成功。見(jiàn)圖6。
本發(fā)明所構(gòu)建的基因工程體，經(jīng)大量發(fā)酵后，回收菌體，提取質(zhì)粒，即可用以配制家畜和家禽去勢(shì)DNA疫苗(基因疫苗)。本疫苗與現(xiàn)有同類(lèi)產(chǎn)品相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和積極效果1.本基因工程體的表達(dá)產(chǎn)物-HBs/LHRH融合蛋白能組裝成大小20mm左右的病毒樣顆粒(VLP)。在顆粒表面暴露多個(gè)LHRH抗原表位，是一種多價(jià)顆粒性抗原，其免疫原性優(yōu)于游離的單價(jià)或2價(jià)、3價(jià)抗原。將表達(dá)產(chǎn)物設(shè)計(jì)成多價(jià)顆粒性抗原是本研究的閃光點(diǎn)。
2.本疫苗中的表達(dá)質(zhì)粒能在宿主肌肉細(xì)胞或上皮細(xì)胞內(nèi)，持續(xù)表達(dá)2～3個(gè)月，不斷分泌免疫原，強(qiáng)化免疫效果。一次注射即可達(dá)到免疫去勢(shì)目的。細(xì)胞內(nèi)的重組質(zhì)粒DNA，停止表達(dá)后，即能自行降解，不整合細(xì)胞DNA沒(méi)有激素和其他殘留物，無(wú)潛在危險(xiǎn)，安全性好。
3.基因工程體發(fā)酵后，回收菌體，提取質(zhì)粒，即可直接配苗。生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)便，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，成本低廉。生產(chǎn)過(guò)程中，不排毒，不散毒，不污染環(huán)境。
4.2種DNA苗分別用于家畜和家禽，應(yīng)用面廣，用以替代手術(shù)去勢(shì)，市場(chǎng)前景十分寬廣。還可打入國(guó)際市場(chǎng)，換取外匯。
5.目前國(guó)外生產(chǎn)的去勢(shì)疫苗為合成肽苗，因生產(chǎn)成本高，故主要用于治療人前列腺癌，前列腺肥大和前列腺增生。每注射一針需人民幣1000元，隔20天注射一次，一個(gè)療程需注射5次。本疫苗完全可應(yīng)用于人，用以替代國(guó)外進(jìn)口的合成肽疫苗，一次注射，即可達(dá)到一個(gè)療程的效果。對(duì)性成熟的人來(lái)說(shuō)，免疫有效期過(guò)后，即可恢復(fù)性功能。
圖1LHRH免疫調(diào)控原理圖2pBS-LHRH重組質(zhì)粒的構(gòu)建圖3pBS-LHRH重組質(zhì)粒的酶切鑒定ApBS-LHRH BpBS-LHRH+SmaI CpBS-LHRH+BamHIDpBS-LHRH+Hind II EpBS-LHRH+PstI圖4pBS-LHRH重組質(zhì)粒的序列分析圖5pBS-HBs/LHRH重組質(zhì)粒的構(gòu)建圖6pcDNA3.1-HBs/LHRH重組質(zhì)粒的構(gòu)建取200μl轉(zhuǎn)化大腸桿菌，涂布含Amp 50mg/ml的LB瓊脂平板，同時(shí)設(shè)未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)大腸桿菌作對(duì)照(陰性對(duì)照)，接種后置37℃液箱，培養(yǎng)18h。2.6重組質(zhì)粒的酶切鑒定在LHRH基因插入位點(diǎn)BamHI和HindIII中，尚有SamI和PstI 2個(gè)位點(diǎn)。挑選轉(zhuǎn)化后的單個(gè)菌落接種含Amp的LB肉腸培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，分別用BamHI、HindIII、SamI和PstI單酶切后作瓊脂糖電泳，結(jié)果SmaI和PstI酶切位點(diǎn)消失，而B(niǎo)amHI和HindIII仍存在，表明克隆成功。見(jiàn)圖2和圖3。2.7重組質(zhì)粒的序列分析經(jīng)篩選獲得的陽(yáng)性重組質(zhì)粒，以BamHI和Hind III雙酶切的片段克隆入M13噬菌體中，提取單鏈測(cè)序，結(jié)果見(jiàn)圖4?？寺』虻膲A基序列與設(shè)計(jì)的CHRH(M)和LHRH(A)完全符合。表明pBS-LHRHs質(zhì)粒構(gòu)建成功。3 LHRH基因與HBsAg基因的的融合和pBS-HBs/LHRHs質(zhì)粒的構(gòu)建3.1 HBsAg基因的回收參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》的介紹的方法，大量提取pWR13-HBs質(zhì)粒(由本組徐文忠提供)，以SacI及BglII雙酶切，電泳回收0.7kb左右的HBs酶切片段。3.2 pBS-LHRHs質(zhì)粒的酶切、回收大量提取上述構(gòu)建的pBS-LHRH(M)和pBS-LHRH(A)2種質(zhì)粒，分別用SacI及BamHI雙酶，按2.2法電泳回收質(zhì)粒大片段。3.3連接按2.3法將HBs片段與pBS-LHRH(M)和pBS-LHRH(A)質(zhì)粒片段連接，形成pBS-HBs/LHRH(M)和nBS-HBs/LHRH(A)2個(gè)重組質(zhì)粒。3.4轉(zhuǎn)化按2.4、2.5、2.6等程序?qū)⑸鲜?個(gè)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，經(jīng)酶切篩選獲得2株帶LHRH和HBs融合基因的2株重組大腸桿菌——Ecoli-HBs/LHRH(M)和Ecoli-HBs/LHRH(A)。3.5酶切鑒定分別提取pBS-HBs/LHRH(M)和pBS-HBs/LHRH(A)質(zhì)粒，用BglII、BamHI、HindIII單酶切和用BamHI和HindIII雙酶切，SacI和BglII切下的HBs片段，其兩個(gè)粘性末端可分別與以SacI和BamHI酶切的pBS-LHRH粘性末端相連。連接后融合部位BglII及BamHI位點(diǎn)消失，而HBs的5’端仍有一BamHI位點(diǎn)，LHRH基因3’有一Hind III位點(diǎn)。結(jié)果BglII不能切開(kāi)；BamHI和Hind III單酶切能將質(zhì)粒切開(kāi)；而在雙酶切時(shí)，則可見(jiàn)一條720bp的HBs/LHRH融合基因帶。表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。3.6序列分析重組質(zhì)粒用雙脫氧終止法測(cè)序從基因的3’-端開(kāi)始讀起，通讀LHRH的基因后即為融合基因的序列，乙肝病毒表面抗原基因3’-端經(jīng)過(guò)改造加入了BglII接頭，使整個(gè)基因的閱讀框架為1 2 3 4 217 218 219 220 221 222 223 SerAsp Pro5’-ATG GAG AAC ACA ---ATT TTC TTT TGT CCT TGG GTATAC GAT CCTHBsAg基因………………………………………………………………………………………………………BglII/BamHI1 2 3 4 5 6 7 8 9 10CAG CAC TGG TCC TAT GGA CTG CGC CCT GGATAA-3’LHRH基因……………………………………………………………………………Stop序列分析結(jié)果與之完全符合。表明重組質(zhì)粒pBS-HBs/LHRH(M)和pBS-HBs/LHRH(A)構(gòu)建成功，見(jiàn)圖5。4 pcDNA3.1-HBs/LHRH質(zhì)粒和去勢(shì)基因工程體構(gòu)建的構(gòu)建4.1 合成HBs/LHRH融合基因引物設(shè)計(jì)2對(duì)HBs/LHRHs融合基因引物，上游引物(L0)共用，下游引物L(fēng)1用于擴(kuò)增HBs/LHRH(A)融合基因；DL2用于擴(kuò)增HBs/LHRH(A)融合基因。引物設(shè)計(jì)如下上游引物L(fēng)0 下游引物 上述引物由上海博采生物技術(shù)公司合成。4.2 提取pBS-HBs/LHRHs質(zhì)粒從重組大腸桿菌Ecoli-HBs/LHRH(M)和Ecoli-HBs/LHRH(A)參照《分子克隆指南》介紹的方法，提取pBS-HBs/LHRH(M)和pBS-HBs/LHRH(A)質(zhì)粒，供作PCR的模板DNA。4.3 PCR擴(kuò)增HBs/LHRHs基因取10×反應(yīng)緩沖液(含15mmol/L MgCl2)3μl，2.5mmol/L dTNP 2ml，TaqDNA聚合酶3μl(1U)，上游引物和下游引物各1μl，模板DNA0.1μg，加滅菌雙蒸水25μl，在反應(yīng)管內(nèi)混勻，置TECHNIE公司GENINS自動(dòng)PCR儀。反應(yīng)條件94℃變性5min 1個(gè)循環(huán)；94℃變性40s，60℃復(fù)性40s，72℃延伸45s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。各取10μl PCR產(chǎn)物與marker一起經(jīng)1.5％瓊脂糖電泳后，用溴化乙錠染色，在紫外燈下觀察?？梢?jiàn)一條730pb左右的帶。4.4 pcDNA3.1質(zhì)粒的提取參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》所介紹的方法，用堿裂解法進(jìn)行，用RNA酶消化RNA，經(jīng)酚氯仿抽提除去RNA酶，無(wú)水乙醇沉淀后，加適量TE緩沖液溶解，即獲得純化的pcDNA3.1質(zhì)粒。4.5 pcDNA3.1質(zhì)粒的酶切、回收上述純化質(zhì)粒用Hind III和Eco RI雙酶切，參照2.2方法回收酶切后的大片段。4.6 連接和轉(zhuǎn)化按2.3和2.4所示方法將PCR擴(kuò)增的HBs/LHRH(M)和HBs/LHRH(A)基因與pcDNA3.1質(zhì)粒連接，獲得pcDNA3.1-HBs/LHRH(M)和pcDNA3.1-HBs/LHRH(A)2株重組質(zhì)粒。并按2.5所示方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，獲得Ecoli-pcDNA3.1-HBs/LHRH(M)和Ecoli-pcDNA3.1-HBs/LHRH(A)2株用于生產(chǎn)畜用和禽用的去勢(shì)DNA苗的基因工程體。4.7 重組質(zhì)粒的酶切鑒定用Hind III和EcoRI雙酶切后的HBs/LHRH基因片段與同樣酶切的表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1連接后，Hind III和EcoRI位點(diǎn)仍保留，而二者之間的BamHI位點(diǎn)消失。從上述2株基因工程體中提取質(zhì)粒，分別用Hind III、EcoRI、BamHI單酶切和用Hind III與EcoRI雙酶切。見(jiàn)圖6。用BamHI酶切者質(zhì)粒不被切開(kāi)，用Hind III和EcoRI酶切時(shí)，質(zhì)粒被切開(kāi)，用Hind III與EcoRI雙酶切者，則可見(jiàn)一帶720bp大小的小帶。表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。4.8重組質(zhì)粒的序列分析從重組質(zhì)粒中插入基因的3’起測(cè)序。由上海博生物技術(shù)公司測(cè)定。結(jié)果與原設(shè)計(jì)完全符合，表明生產(chǎn)畜用和禽用2株去勢(shì)DNA苗的基因工程體構(gòu)建成功。見(jiàn)圖6。5生產(chǎn)和應(yīng)用本發(fā)明提供的基因工程體大量發(fā)酵增殖后，回收重組大腸桿菌，提取質(zhì)粒，即可用于配制去勢(shì)基因疫苗。用以免疫性器官尚未發(fā)育的家畜或家禽，該重組質(zhì)粒能在宿主細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表達(dá)HBs/LHRH融合蛋白2～3個(gè)月。誘導(dǎo)產(chǎn)生LHRH抗體，中和LHRH活性，抑制促黃體生成素(LH)和促卵泡激素(FSH)的合成和分泌，從而使性器官(睪丸和卵巢)發(fā)育停止，變性萎縮。一次注射即可達(dá)到免疫去勢(shì)目的?？杀苊馐中g(shù)去勢(shì)有可能引起創(chuàng)傷感染等不安全因素。即簡(jiǎn)易快速，而又安全、可靠。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明畜禽去勢(shì)基因疫苗(DNA疫苗)的基因工程體，其特征在于將畜、禽2個(gè)型的促黃體激素釋放激素(LHRH)基因分別插入人乙肝表面抗原基因(HBs)的第223密碼子之后，構(gòu)建成2株HBs/LHRH融合基因，并將其分別插入能在真核細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表達(dá)的pcDNA3.1質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，構(gòu)建成畜、禽2株基因工程體-E.coli-pcDNA3.1-HBs/LHRH(M)和E.coli-pcDNA3.1-HBs/LHRH(A)畜用去勢(shì)基因苗的基因工程體菌種分類(lèi)大腸埃希氏桿菌命名E.coli-pcDNA3.1-HBs/LHRH(M)保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏地址中國(guó).北京.中關(guān)村.2714信箱 郵政編碼100080保藏號(hào)0711禽用去勢(shì)基因苗的基因工程體菌種分類(lèi)大腸埃希氏桿菌命名E.coli-pcDNA3.1-HBs/LHRH(A)保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏地址中國(guó).北京.中關(guān)村.2714信箱 郵政編碼100080保藏號(hào)0710
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程體，其特征在于由以下方法構(gòu)建而成2.1 pBS-CHRH質(zhì)粒的構(gòu)建首先人工合成畜型和禽型2個(gè)CHRH基因，設(shè)計(jì)的通式為5′-保證性堿基-內(nèi)切酶-保護(hù)框架堿基-LHRH基因-終止子-內(nèi)切酶-保護(hù)性堿基-3′具體設(shè)計(jì)如下LHRH(M)基因5′-AAGGATCCTCAGCACTGGTCCTATGGACTGCGCCCTGGATAATGAAAGCTTAT-3′BamHI3′-TTCCTAGGAGTCGTGACCAGGATACCTGACGCGGGACCTATTACTTCGAATA-5′終止子 HindIIILHRH(A)基因5′-AAGGATCCTCAGCACTGGTCCTATGGACTGCAGCCTGGATAATGAAAGCTTAT-3′BamHI3′-TTCCTAGGAGTCGTGACCAGGATACCTGACGTCGGACCTATTACTTTCGAATA-5′終止子 HindIII將上述2個(gè)型的LHRH基因分別插入pBS表達(dá)質(zhì)粒，分別構(gòu)建成畜型和禽型pBS-LHRH質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)酶切鑒定和序列分析，證實(shí)構(gòu)建成功；2.2 pBS-HBS/LHRH質(zhì)粒構(gòu)建 從本課題保存的重組大腸桿菌-E.coli-pWR13-HBs，提取pWR13-HBs質(zhì)粒，酶切、回收HBs片段，插入上述構(gòu)建pBS-LHRH(M)和pBS-LHRH(A)2種質(zhì)粒，構(gòu)建成pBS-HBs/LHRH(M)和pBS-HBs/LHRH(A)2個(gè)重組質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，獲得2株重組大腸桿菌-Ecoli-HBs/LHRH(M)和Ecoli-HBs/LHRH(A)，經(jīng)酶切鑒定和序列分析，結(jié)果完全符合設(shè)計(jì)要求，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功；2.3 pcDNA3.1-HBs/LHRH質(zhì)粒和基因工程體的構(gòu)建 根據(jù)權(quán)利要求1基因設(shè)計(jì)通式，合成L0、L1和L23條引物上游引物 下游引物 L0和L1可擴(kuò)增出畜型HBs/LHRH融合基因；L0和L2可擴(kuò)增出禽型HBs/LHRH融合基因；以pBS-HBs/LHRH質(zhì)粒為模板，分別用L0和L1和L0和L2做引物，用PCR擴(kuò)增出畜、禽2個(gè)型的HBs/LHRH融合基因，插入pcDNA3.1質(zhì)粒，獲得pBS-HBs/LHRH(M)和pBS-HBs/LHRH(A)2株重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)酶切鑒定和序列分析，證實(shí)本發(fā)明基因工程體-E.coli-pcDNA3.1-HBs/SS構(gòu)建成功。
全文摘要
本發(fā)明畜禽去勢(shì)基因疫苗(DNA疫苗)的基因工程體,屬生物高新技術(shù)領(lǐng)域。其構(gòu)建過(guò)程是:人工合成畜型的LHRH(M)和禽型LHRH(A)基因,構(gòu)建pBS－LHRH質(zhì)粒。然后從pWR－HBs質(zhì)粒,切下HBs片段,將其插入pBS－LHRH質(zhì)粒,構(gòu)建成pBS－HBs/LHRH質(zhì)粒。最后,用PCR從pBS－HBs/LHRH質(zhì)粒中,擴(kuò)增出HBs/LHRH融合基因片段,將其插入pcDNA3.1質(zhì)粒,獲得pcDNA3.1－HBs/LHRH(M)和pcDNA3.1－HBs/LHRH(A)2株重組質(zhì)粒。分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌,即構(gòu)建成本發(fā)明的基因工程體——Ecoli－pcDNA3.1－HBs/LHRH(M)和Ecoli－pcDNA3.1－HBs/LHRH(A)。圖為:pcDNA3.1－HBs/LHRH重組質(zhì)粒構(gòu)建。
文檔編號(hào)C12N15/79GK1384200SQ0210372
公開(kāi)日2002年12月11日 申請(qǐng)日期2002年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月13日
發(fā)明者杜念興, 李光富 申請(qǐng)人:杜念興, 李光富