專利名稱：3,4-二羥基-苯基乳酸在制備治療微循環(huán)障礙的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及3,4-二羥基-苯基乳酸在制備治療缺血 /再灌注弓I起的微循環(huán)障礙的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
缺血/再灌注(I/R)引起大量的微循環(huán)損傷反應(yīng)，如增加從上皮細胞 產(chǎn)生的氧自由基產(chǎn)物，增加白細胞上的L-選擇素和內(nèi)皮細胞上的E-選擇 素的表達，引起白細胞的波動，增加白細胞上的CDllb/CD18和內(nèi)皮細胞 上的細胞間粘附分子(ICAM-1)的表達。這些分子能使白細胞粘附毛細 血管后細靜脈(postcapillary venules),引起氧自由基的釋放從而引起血管 內(nèi)皮的損傷。此外，毛細血管后細靜脈也以肥大細胞脫顆粒作用和血管活 性物質(zhì)釋放響應(yīng)I/R，其牽涉到增加白細胞粘附到毛細血管后細靜脈和白 蛋白外漏。再灌注后白細胞的粘附、氧自由基的釋放和肥大細胞脫顆粒作 用被認(rèn)為與微血管損傷的過程密切相關(guān)。
據(jù)報道，用對抗粘附分子的抗體進行預(yù)處理可抑制I/R引起的白細胞 向毛細血管后細靜脈的粘附和I/R-誘導(dǎo)的氧自由基生成。還有報道，以抗 氧化劑或肥大細胞脫顆粒抑制劑進行預(yù)處理可減弱I/R-促進的氧自由基生 成、白細胞向毛細血管后細靜脈的粘附和肥大細胞脫顆粒。然而，未見有 關(guān)抗氧化劑是否可以恢復(fù)I/R引起的粘附到細靜脈壁上的白細胞的報道。
丹參(&/v/a柳7riwr/2/za ， SM)在中國、韓國、日本和其他亞洲國 家被用于治療各種血管疾病。
丹參對缺血再灌注引起的微循環(huán)障礙有多靶點治療的作用臨床上丹 參用于治療心腦血管障礙性疾病。在微循環(huán)障礙已經(jīng)發(fā)生后丹參仍有較好 的治療作用。為了觀察丹參對缺血再灌注引起的微循環(huán)障礙的治療作用，
3已有研究在缺血再灌注10分(即微循環(huán)障礙發(fā)生之后)之后開始連續(xù)給予
丹參。缺血再灌注10分鐘時，微循環(huán)障礙已經(jīng)明顯發(fā)生，血管壁DHR熒 光強度增強、白細胞粘附于血管壁、白蛋白外漏等已經(jīng)出現(xiàn)。超氧化物歧 化酶SOD在缺血再灌注之前給予時，可以預(yù)防微循環(huán)障礙，但在缺血再 灌注10分鐘時開始再給予SOD時，沒能有效地清除過氧化物、沒能解離 已經(jīng)粘附在細靜脈內(nèi)皮細胞上的白細胞、沒能抑制肥大細胞脫顆粒、也未 能維護血管通透性。而丹參在缺血再灌注10分鐘時給予時，可以清除粘 附在細靜脈上的白細胞、清除過氧化物、維護血管通透性、抑制肥大細胞 脫顆粒?？梢姡⒃陬A(yù)防性給予時有與SOD相同的預(yù)防作用。在微循 環(huán)障礙發(fā)生之后，丹參有SOD所不具備的清除多種過氧化物、解離已經(jīng) 與血管粘附的白細胞、抑制肥大細胞脫顆粒等作用。SOD通過歧化超氧陰 離子來預(yù)防缺血再灌注引起的微循環(huán)障礙，其作用靶點、作用環(huán)節(jié)單一。 當(dāng)微循環(huán)障礙超出此環(huán)節(jié)后，SOD的作用就難以表現(xiàn)出來了。而丹參改善 微循環(huán)障礙的靶點較多，即使在微循環(huán)障礙發(fā)生之后也可以發(fā)揮治療作 用。
丹參水提取物中主要的化合物包括3,4-二羥基-苯基乳酸(DLA，圖1)， 原兒茶醛(PA1)、原兒茶酸(PA)、咖啡酸(CA,單酚酸)、丹酚酸A-G、丹參 酚酸(lithospermate acid ， LsA，多酚酸)。它們中的DLA是確認(rèn)的化合 物，其也構(gòu)成丹酚酸A-G和丹參酚酸(LsA，多酚酸)結(jié)構(gòu)的一部分。據(jù) 報道DLA和咖啡酸在口服水溶性總丹酚酸的受試者的血漿中檢出。
在過去十年中，DLA和包含DLA的化合物的生物作用吸引了許多 的關(guān)注，并且這些試劑的藥物活性的譜圖也已被揭示出來。體內(nèi)實驗結(jié)果 證明，1/R引起的器官損傷可以從DLA和包含DLA的化合物中獲得改善。 如，SM的水溶性化合物(WSC)據(jù)報道可增加存活率、減少梗塞大小與 左心室大小的比率，發(fā)現(xiàn)LsB可減少兔缺血心臟的心肌損傷，觀察到SalA 和Sa舊可保護大腦免受損傷。觀察到救心丸(CP，其主要成分是DLA和 SalB)可改善肝損傷，并且LSB和MLB據(jù)報道可保護肺免受損傷。
此外，還發(fā)現(xiàn)DLA可保護線粒體膜免受I/R引起的損傷和脂質(zhì)過氧 化作用(LPO)。另一方面，還進行了許多體外研究，以揭示DLA和包含DLA的化合物對由1/R損傷的器官的保護作用的機理，并且大量證據(jù)證實 了這些化合物的抗氧化劑活性。如，據(jù)報道，DLA可清除由黃嘌呤和黃 嘌呤氧化酶的反應(yīng)體系產(chǎn)生的超氧負離子(，0"，已發(fā)現(xiàn)SalA可在體外抑 制由1/R產(chǎn)生的腦部的LPO并且清除氫氧根(，OH)，發(fā)現(xiàn)SalB可潛在清除 1.1-聯(lián)苯-2苦基苯肼(DPPH)，抑制LPO和除去在原代大鼠肝細胞和肝臟星 形細胞(HSCs)中的活性氧族(ROS)，抑制由淀粉樣肽A弓l起的ROS在 PCL2細胞中的產(chǎn)生，在體外清除過氧化氫(11202)，并抑制人體主動脈平滑 肌細胞(HASMCs)中腫瘤壞死a因子(TNF-a )引起的ROS產(chǎn)物和NADPH 氧化酶的活性，LsB據(jù)報道可清除過氧化亞硝酸鹽(ONOCT)。
此外，體外研究證明包含DLA的SM的WSC可抑制血管粘附分子 的表達。接下來是許多公布的有關(guān)例子SM的水溶性提取物(WSE)可 抑制由TNF-a誘導(dǎo)的人體臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)上的粘附分子 ICAM-1和血管細胞粘附分子l(VCAM-l)的表達，并且抑制TNF-a誘導(dǎo)的 核因子KB(nuclear factor kappa B， NF-KB)從細胞質(zhì)到細胞核的遷移，并且 減少內(nèi)皮細胞中的谷胱甘肽(GSH)。
SM中的PA1， Sa舊和WSE抑制TNF-a-誘導(dǎo)的ICAM-1和內(nèi)皮細胞的 VCAM-1的表達，PA1抑制ICAM-1和VCAM-1以及HUVECs中的 VCAM-1和ICAM-1的mRNA表達，以及以劑量依賴性的方式由TNF-a 誘導(dǎo)的NF-kB和激活蛋白-l (AP-1)DNA的結(jié)合活性，SdB減弱VCAM-1 和ICAM-1的表達，抑制NF-kB在由TNF-a引起的內(nèi)皮細胞中E-選擇素 的表達中的活性，CP抑制TNF-a以劑量依賴性的方式誘導(dǎo)的HUVECs中 的VCAM-1和ICAM-1的表達，抑制血小板源生長因子BB(platelet-derived growth factor BB)誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞(VSMCs)中的DNA合成和細 胞增殖。
先前已報道DLA可抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的中性粒細胞粘附分子 CDllb/CD18的表達和在白細胞向大鼠腸系膜細靜脈壁的粘附。此外，包 含DLA化合物的丹參注射液被證明可抑制LPS-引起的氧的過氧化物從大 鼠腸系膜細靜脈壁生成。例如，據(jù)報道，DLA可清除由黃嘌呤和黃嘌呤 氧化酶反應(yīng)體系產(chǎn)生的超氧負離子('02')， SalA清除'OH， SalB清除過氧化氫并抑制NADPH氧化酶的活性，LsB清除ONOCT。值得注意的是， 所有的SM的水溶性提取物具有共同的結(jié)構(gòu)DLA，它的兩個羥基基團被認(rèn) 為與消除活性氧族(reactive oxygen species)禾B ONOO'有關(guān)。然而，還不 清楚DLA清除體內(nèi)響應(yīng)I/R生成的過氧化物的潛力，也不清楚DLA是否 可對已出現(xiàn)的由I/R引起的過氧化物起作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供3，4-二羥基-苯基乳酸在制備治療微循環(huán)障 礙的藥物中的應(yīng)用。
其中所述微循環(huán)障礙為腸系膜微循環(huán)障礙。
所述微循環(huán)障礙由缺血/再灌注引起。
本發(fā)明的另外一個目的是提供3，4-二羥基-苯基乳酸在制備防止微循 環(huán)障礙引起的白細胞粘附的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還有一個目的是提供3,4-二羥基-苯基乳酸在制備恢復(fù)微循環(huán) 障礙所引起的已粘附的白細胞的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還有一個目的是提供3，4-二羥基-苯基乳酸在制備抑制微循環(huán) 障礙引起的白蛋白從細靜脈滲出的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還有一個目的是提供3,4-二羥基-苯基乳酸在制備抑制微循環(huán) 障礙弓I起的肥大細胞脫顆粒的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還有一個目的是提供3,4-二羥基-苯基乳酸在制備抑制微循環(huán) 障礙引起的中性粒細胞上粘附分子CDllb和CD18表達的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還有一個目的是提供3,4-二羥基-苯基乳酸在制備抑制微循環(huán) 障礙引起的過氧化物生成的藥物中的應(yīng)用。
為了達到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的實驗方案如下，在戊巴比妥鈉 麻醉下，通過具有CCD或SIT照相系統(tǒng)的活體倒置式顯微鏡觀察雄性韋斯 特(Wistar)大鼠的回盲部的腸系膜微循環(huán)，研究DLA對缺血/再灌注(I/R) 引起的大鼠腸系膜微循環(huán)損傷的作用。
6腸系膜動脈和靜脈結(jié)扎10分鐘后，松開進行再灌注。測量在缺血前十 分鐘不間斷地注入或不注入DLA(5mg/kg/hr)或超氧化物歧化酶(SOD 12000 units/kg/hr)的細靜脈的直徑、粘附白細胞的量、異硫氰酸熒光素 (FITC)標(biāo)記白蛋白的滲出、二氫羅丹明123(dihydrorhodamine， DHR)的 熒光和肥大細胞的脫顆粒。在另一組實驗中，在再灌注開始后十分鐘不間 斷地注入DLA或SOD。通過體外實驗測定中性粒細胞粘附分子CDllb和 CD18的表達。
結(jié)果顯示采用DLA預(yù)處理明顯減少細靜脈壁上過氧化物的生成、白細 胞向細靜脈壁的粘附、肥大細胞脫顆粒作用以及I/R引起的大鼠腸系膜中白 蛋白的滲出。DLA后處理改善I/R引起的大鼠腸系膜紊亂，而且通過DLA 的注入使細靜脈壁上過氧化物的生成和白蛋白的滲出率維持不變，附著在 細靜脈壁上的白細胞也通過DLA恢復(fù)，除了肥大細胞脫顆粒作用不受DLA 后處理的影響。
CDllb和CD18的熒光強度通過H202的刺激明顯增加，并且這種增加 由DLA以濃度依賴性方式處理明顯地減弱，提高DLA抑制白細胞粘附的能 力可能與其抑制粘附分子表達的潛力相關(guān)的可能性。對于大多數(shù)測定的參 數(shù)，DLA起到的減弱作用通過SOD模擬，意味著DLA的抗氧化劑活性對 1/R引起的大鼠腸系膜微循環(huán)障礙具有潛在的多重改善作用。
本發(fā)明中，觀察到I/R導(dǎo)致毛細血管后細靜脈一系列的機能障礙，如白 細胞粘連、過氧化物在細靜脈管壁的生成、白蛋白從細靜脈管壁的滲出和 體內(nèi)肥大細胞脫顆粒作用。更為突出的，所有觀察的I/R誘導(dǎo)的現(xiàn)象，可通 過DLA處理明顯減少或完全消失，不管該處理是在缺血之前還是之后實施 的，例外的情況是，由I/R誘導(dǎo)的肥大細胞脫顆粒作用的增加只能通過采用 DLA預(yù)處理才能抑制。
此外，體外研究表明用H202刺激可增強中性粒細胞的CDllb/CD18的 熒光強度，并且這種增強可被DLA處理明顯減弱。
這很好地證明血管內(nèi)皮細胞響應(yīng)I/R，通過黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶爆發(fā) 性地生成02-，由于SOD的反應(yīng)黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶都轉(zhuǎn)化成H202。所得11202或者通過過氧化氫酶轉(zhuǎn)化為1120，或者和02'經(jīng)Haber-Weiss反應(yīng)生 成羥自由基。 一氧化氮與超氧自由基快速反應(yīng)的結(jié)果是形成過氧亞硝基 (peroxynitrite)， 一種在氧化應(yīng)激反應(yīng)中重要的細胞毒性的介質(zhì)。
此外，粘附到毛細血管后細靜脈的白細胞引起氧自由基的釋放。羥自 由基('OH)和過氧亞硝基(ONOCT)誘發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和DNA的損傷， 因而引起上皮細胞和基底膜的損傷。因此，消除過氧化物是改善由I/R引起 的微循環(huán)障礙的重要對策。越來越多的體外實驗證據(jù)已證明了SM及其衍 生物的抗氧化性潛力。
本發(fā)明的研究結(jié)果證明DLA可清除大鼠體內(nèi)腸系膜細靜脈壁由I/R刺 激引起的過氧化物生成的能力，并表明，不僅是提前給藥，而且試驗后給 藥，DLA都可在該體系內(nèi)發(fā)揮其清除作用。
白細胞恢復(fù)是由I/R刺激的關(guān)鍵結(jié)果，其從促炎癥反應(yīng)介質(zhì)的釋放以及 通過NF-KB的激活對粘附分子的表達的增強開始。白細胞上的粘附分子 CDllb/CD18結(jié)合它們在內(nèi)皮上的配體ICAM-l，引起白細胞粘附到上皮細 胞，導(dǎo)致產(chǎn)生過氧化物和蛋白酶，因此，損傷上皮細胞和基底膜。
因此，微循環(huán)障礙可從白細胞粘附的減弱中得到改善，其中白細胞粘 附的減弱通過白細胞粘附的預(yù)防或粘附的白細胞的恢復(fù)實現(xiàn)。
本發(fā)明的體內(nèi)動態(tài)觀察揭示了DLA預(yù)處理可抑制由I/R誘導(dǎo)的白細胞 向大鼠腸系膜細靜脈管壁的粘附，其效果與采用SOD預(yù)處理相似。此外， 體外實驗證明DLA對由H202刺激的白細胞上的CDllb/CD18的表達具有抑 制作用。這些結(jié)果結(jié)合之前已公布的結(jié)果說明DLA可減弱由I/R誘導(dǎo)的白 細胞向大鼠腸系膜細靜脈管壁的粘附，其通過抑制白細胞上的粘附分子 CDllb/CD18和上皮組織上的ICAM-l的表達來進行。本研究的一個有意義 發(fā)現(xiàn)是，如果I/R十分鐘后白細胞的粘附已經(jīng)發(fā)生時給藥，DLA能夠促進 粘附白細胞的恢復(fù)。
上述試驗結(jié)果與SOD在同種實驗情況下的表現(xiàn)形成鮮明的對比，SOD 可防止白細胞進一步粘附，但是不能恢復(fù)已粘附到細靜脈管壁的白細胞。
肥大細胞的脫顆粒是隨I/R發(fā)生的特定事件之一，其導(dǎo)致一系列的后果，如促炎癥反應(yīng)介質(zhì)的釋放，細靜脈和毛細血管的滲透性和白蛋白的滲
出的增加。本研究的另一個有結(jié)果是，由I/R引起的血管周圍局部化肥大細 胞的脫顆粒可通過DLA或SOD預(yù)處理減弱，而后處理不能減弱。肥大細胞 脫顆粒作用可通過包括氧化應(yīng)激和IgE的結(jié)合的多種刺激來激發(fā)。
DLA和SOD預(yù)處理減弱肥大細胞脫顆粒作用的相似性說明，DLA的抗 氧化劑活性是這種情況下防止肥大細胞脫顆粒作用的原因。DLA或SOD的 后處理對由I/R引起的大鼠腸系膜肥大細胞脫顆粒作用無影響，說明肥大細 胞脫顆粒作用在給予DLA或SOD之前己觸發(fā)，并且這個過程是不可逆的， 所以該過程一旦開始，通過使用抗氧化劑是不能干擾的。
本發(fā)明的研究中選用白蛋白的滲出作為由I/R刺激引起的血管損傷的 一個指標(biāo)，其是氧化應(yīng)激的結(jié)果，并通過隨后的白細胞粘附和肥大細胞脫 顆粒作用加重。本研究的結(jié)果說明DLA和SOD預(yù)處理都能明顯減弱由I/R
引起的白蛋白滲出。
采用DLA和SOD后處理也能明顯減弱由1/R引起的白蛋白的滲出，但 是與前處理的方式不同，在DLA和SOD輸注過程中白蛋白滲出不變，表明 可通過該試劑來防止白蛋白滲出的進一步增加。值得注意的是，細靜脈壁 上的氧化劑敏感型熒光探針DHR以相似的方式響應(yīng)DLA和SOD: 1/R引起 的DHR熒光可通過使用DLA或SOD預(yù)處理來抑制，然而在后處理的情況 下，只要出現(xiàn)DLA或SOD，則其保持不變。
響應(yīng)DLA和SOD后處理的白蛋白滲出動力學(xué)和DHR熒光性間的相似 性有力地表明，在該條件下觀察到的血管損傷與氧化應(yīng)激有緊密聯(lián)系。
總之，本發(fā)明的研究證明了DLA預(yù)處理明顯減少由I/R誘導(dǎo)的大鼠腸 系膜過氧化物生成、白細胞向微血管壁的粘附、肥大細胞脫顆粒作用和白 蛋白的漏出率。再灌注10分鐘后開始的DLA后處理也可以改善由I/R誘導(dǎo) 的大鼠腸系膜障礙，但其以獨特的方式進行，通過DLA的注入使過氧化物 的生成和白蛋白的滲出保持不變，已經(jīng)粘附到血管壁的白細胞可通過DLA 恢復(fù)，且與SOD的效果不同，SOD在這種情況下能防止白細胞進一步粘附， 但不能恢復(fù)已經(jīng)粘附的白細胞，例外的是，肥大細胞脫顆粒作用不受DLA
9或SOD后處理的影響。
體外實驗顯示，H202引起的中性粒細胞CDllb和CD18的熒光強度的 增加可通過濃度依賴方式的DLA處理明顯減弱，提高DLA抑制白細胞的粘 附與其抑制粘附分子表達的潛力相關(guān)的可能性。對于大多數(shù)測試參數(shù)來說 DLA產(chǎn)生的衰減效應(yīng)與SOD相仿，此事實有力地說明，抗氧活性和DLA對 白細胞上粘附分子CDllb/CD18的抑制是其對I/R誘導(dǎo)的大鼠腸系膜微循 環(huán)障礙的改善作用的基礎(chǔ)。3,4-二羥基-苯基乳酸可以作為制備治療缺血/ 再灌注引起的微循環(huán)損傷的理想藥物。
為讓本發(fā)明之上述和其它目的、特征和優(yōu)點能更明顯易懂，下文特舉 較佳實施例，并配合附圖，作詳細說明如下。


圖1為3， 4-二羥基-苯基乳酸(DLA)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。
圖2A和圖2B表示采用DLA或SOD預(yù)處理或后處理對由I/R誘導(dǎo)的大 鼠腸系膜細靜脈壁上白細胞粘附的經(jīng)時影響。其中圖2A表示采用DLA或 SOD對由I/R誘導(dǎo)的白細胞粘附的預(yù)處理。DLA+I/R:DLA預(yù)處理組； SOD+I/R:SOD預(yù)處理組。圖2B表示采用DLA或SOD對由I/R誘導(dǎo)的白細胞 粘附的后處理。1/R+DLA:DLA后處理組；I/R+SOD: SOD后處理組；數(shù)據(jù) 為六只大鼠的平均值士SD。 *P<0.05對基線，#P<0.05對I/R組，卞P0.05 對SOD組。
圖3A和圖3B表示大鼠腸系膜細靜脈壁上的DHR熒光比率的經(jīng)時變 化。其中圖3A表示采用DLA或SOD預(yù)處理對細靜脈管壁DHR熒光比率的 影響，DLA+I/R: DLA預(yù)處理組；SOD+I/R:SOD預(yù)處理組。圖3B表示采用 DLA或SOD后處理對細靜脈管壁DHR熒光比率的影響，I/R+DLA: DLA后 處理組；H+SOD:SOD后處理組，數(shù)據(jù)為六只大鼠的平均值士SD。 *P<0.05 對基線，弁P0.05對I/R組。
圖4A和圖4B表示大鼠腸系膜細靜脈壁白蛋白滲出的經(jīng)時變化。其中 圖4A表示采用DLA或SOD預(yù)處理對細靜脈管壁白蛋白滲出的影響，DLA+I/R:DLA預(yù)處理組；SOD+I/R:SOD預(yù)處理組。圖4B表示采用DLA或 SOD后處理對細靜脈管壁白蛋白滲出的影響，I/R+DLA: DLA后處理組； 1/R+SOD:SOD后處理組，數(shù)據(jù)為六只大鼠的平均值士SD。 *P<0.05對基線， #P<0,05對I/R組。
圖5A和圖5B表示DLA和SOD對對照組、1/R組、DLA+I/R組、SOD+I/R 組、1/R+DLA組和1/R+SOD組中由I/R誘導(dǎo)的大鼠腸系膜細靜脈壁的肥大 細胞脫顆粒作用的影響，數(shù)據(jù)為六只大鼠的平均值士SD。 *P<0.05對基線， #P<0.05對I/R組。
圖6表示DLA對H202誘導(dǎo)的大鼠腸系膜粘附分子CDllb和CD18的表 達的影響。粘附分子的表達在縱坐標(biāo)上以熒光強度表示。H202:H202 組；H2O2+DLA0.2:H2O2力卩DLA0.2mg/ml組；H2O2+DLA0.5:H2O2加 DLA0.5mg/ml組;H2O2+DLAl .0:H2O2加DLAl .0mg/ml組。數(shù)據(jù)為六只大鼠 的平均值士SD。 *P<0.05對對照組，弁P0.05對LPS組。
圖7表示DLA減輕由缺血和再灌注引起的微循環(huán)障礙的示意圖。I/R， 表示缺血和再灌注；XO，表示黃嘌呤氧化酶；CDllb/CD18，表示粘附分 子CDllb和CD18; ICAM-1，表示細胞間粘附分子-l;丄，表示抑制。
具體實施方式
實施例一 實驗材料的準(zhǔn)備 動物
所有研究都得到批準(zhǔn)，所有實驗動物的處理都是根據(jù)慶應(yīng)義塾大學(xué)動 物研究委員會的指南進行的。體重200g-250g的雄性韋斯特大鼠(埼玉縣 實驗動物提供有限公司，日本埼玉縣)在試驗前禁食12小時，但允許自由飲水。
試劑
DLA (化學(xué)式見圖l)購自中國藥品生物制品檢定所(中國北京)。 超氧化物歧化酶(SOD),甲苯胺藍，熒光標(biāo)記牛血清白蛋白購自西格瑪 化學(xué)試劑公司(Sigma chemical.co )(Missour, USA)， 二氫羅丹明123 (DHR)購自分子探針(Molecular Probes) (Oregon, USA)。結(jié)合FITC的小鼠抗 CDllb單克隆抗體(FITC-conjugated mouse anti國rat CDllb monoclonal antibody)，結(jié)合FITC的小鼠抗CD18單克隆抗體(FITC-conjugated mouse anti-rat CD 18 monoclonal antibody)，結(jié)合FITC的小鼠IgA、 k及結(jié)合FITC 的小鼠IgGl， k胸自BD Biosciences Pharmingen (San Diego, CA)，溶血素購 自BD Biosciences Immunocytometer Systems (San Jose， CA).
單-聚溶解介質(zhì)購自大日本制藥株式會社(Dainippon Pharmaceutical Corporation)(日本大阪)。RPMI 1640和胎牛血清購自Hyclone (Logan， UT)，其它所有的化學(xué)試劑都采用市售的最高等級。
缺血/再灌注大鼠的制備
大鼠腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉(30mg/kg體重)麻醉。右側(cè)頸靜脈用聚 乙烯導(dǎo)管插管。通過20-30mm長的中線切口打開腹部。輕取腸系膜尾端 20cm的回盲部，固定在專用于大鼠的透明塑料臺上。
通過在37。C在腸系膜上用K氏緩沖液(Krebs-Ringer bicarbonate buffered solution)連續(xù)表面灌流來維持溫度和濕度。通過倒置顯微鏡 (Diaphot TMD-2S, Nikon，日本東京)觀測腸系膜的微循環(huán)的血流動力學(xué)。 腸系膜通過12V100W直流穩(wěn)定光源透照。安放在顯微鏡上的攝像機將圖像 傳輸?shù)讲噬O(jiān)視器上，并且圖像通過錄影帶錄像機記錄。視頻時間-日期 發(fā)生器將時間和計時表投射在監(jiān)視器上。選用直徑范圍在25到40pm之間 且長度大于200pm的單獨的無支鏈的細靜脈進行實驗。
對大鼠腸系膜微脈管系統(tǒng)的基本的血液動力學(xué)10分鐘基礎(chǔ)觀察后，通 過由聚乙烯管制成的勒除器同時結(jié)扎前腸系膜動脈的供應(yīng)分枝和相應(yīng)的 細靜脈10分鐘，隨后再釋放血流引起I/R。由于在整個缺血過程中血管內(nèi)的 RBC速度不為0，所以可能會有間接的向觀察區(qū)域的灌注。因此，為了促 進缺血，對動脈和靜脈都進行結(jié)扎，以阻止血液供給并且誘導(dǎo)細靜脈充血。 早先研究表明，10分鐘的缺血接著再灌注足以誘導(dǎo)腸系膜微循環(huán)障礙，而 腸組織損傷最小。未進行I/R的對照大鼠作為對照。
實施例二實驗方案在I/R組(I/R)，在缺血前10分鐘開始經(jīng)過頸靜脈導(dǎo)管不斷地注入鹽 溶液(6 ml/kg/hr)，并一直保持到觀察結(jié)束。對照組動物(Sham)接受 與I/R組相同的處理。
在DLA預(yù)處理組(DLA+I/R)或SOD預(yù)處理組(SOD+I/R)，在缺血前 IO分鐘開始經(jīng)過頸靜脈不斷地注入DLA (5 mg/kg/hr)或SOD (12000 u/kg/hr)，并一直保持到觀察結(jié)束。
在DLA后處理組(I/R+DLA)或SOD后處理組(I/R+SOD),在再灌注后 IO分鐘開始經(jīng)過頸靜脈不斷地注入DLA (5 mg/kg/hr)或SOD (12000 u/kg/hr)，并一直保持到觀察結(jié)束。
實施例三實驗參數(shù)的測定
細靜脈參數(shù)的測量
細靜脈的圖像通過電荷耦合器件(CCD)彩色攝影系統(tǒng)(CC-090, Flovel, 日本東京)獲得。腸系膜細靜脈的直徑通過視頻測量尺(video measuring gauge ) (IV-560; Hod，日本東京)測量。在錄像帶圖像的回放過程中，離 線測定粘附和移動的白細胞的數(shù)量。從回放的錄像圖像中判斷，將附著在 同一位置超過30秒的白細胞確定為粘附到細靜脈壁上的粘附白細胞。
沿著從記錄的錄像帶圖像中隨機選擇的細靜脈(直徑25-40 長度 200 pm)對粘附的白細胞的數(shù)量進行計數(shù)，并且表示為每200um細靜脈長 度的數(shù)量。白細胞的移動表示為環(huán)繞細靜脈的每一視野的量。
為了定量白蛋白穿過腸系膜的細靜脈的滲出，正如之前所描述的，在 每次實驗前10分鐘向受試動物靜脈注射50mg/kg FITC標(biāo)記的牛血清白蛋 白。熒光強度(激發(fā)波長420到490nm，發(fā)射波長在520nm)由采用硅強化 靶的照相機(C-2400-08; Hamamatsu Photonics, Hamamatsu,日本)來測定。 細靜脈壁上的FITC-白蛋白的熒光強度用圖像處理器監(jiān)控和測定。
在另一組實驗中，如之前所描述的，將氧化劑敏感的熒光探針二氫羅 丹明123 (DHR; Molecular Probes,美國俄勒岡州)加入到腸系膜的灌流液 (10 pmol/L)中來判斷細靜脈壁中的氧化劑應(yīng)激反應(yīng)。觀察細靜脈壁上的 DHR熒光強度，并且通過圖像處理器(13)進行測定。細靜脈壁和室外間質(zhì)(extravenularinterstitium)的熒光強度通過Image-Pro Plus 5.0軟件來測量。 將I/R以前細靜脈壁和室外間質(zhì)之間的熒光強度的差異作為基線值，通過一 個時間點的細靜脈管壁和室外間質(zhì)之間的熒光強度的差異與基線值的比 例，來計算DHR熒光強度的比率。
肥大細胞通過在I/R以后30分鐘在腸系膜局部應(yīng)用0.1。/。甲苯胺藍活 體染色(vital staining)法來確認(rèn)。未脫顆粒的肥大細胞和脫顆粒的肥大細 胞的數(shù)量從CCD視頻圖像上進行計量，計算脫顆粒的肥大細胞的數(shù)量占全 部測評肥大細胞的數(shù)量的比率，并表示為脫顆粒的肥大細胞的比率。
中性粒細胞上粘附分子CDllb和CD18的表達的測定
血液取自正常大鼠的腹部主動脈并以肝素抗凝。每個實驗組取200 ^tl 整份血漿。在對照組(n=6)，樣品不添加任何添加劑，在11202組(n=6) 樣品中加入H2O2(100mM)。在DLA處理組，樣品中加入H2O2(100mM)和 DLA(0.2 mg/ml， 0.5 mg/ml or 1.0 mg/ml)。
所有的制劑在37t:保持兩小時，隨后用FITC標(biāo)記的抗-CDllb(5 pg/ml〕 或FITC標(biāo)記的抗-CD18 (5 pg/ml)的抗體或相應(yīng)的FITC標(biāo)記的小鼠同型物 (5 pg/ml)室溫下孵化20分鐘，并且根據(jù)廠商說明采用溶血素來使紅細胞溶 解。細胞用PBS沖洗兩遍，并且平均熒光強度采用流式細胞儀(FACS Calibur; BD company,美國)來測評。中性粒細胞按照報道(Sun K， Wang CS， Guo J， Liu YY， Wang F， Liu LY， He JG， Fan JY， and Han JY. Effect of Panax notoginseng saponins on lipopolysaccharide-induced adhesion of leukocytes in rat mesenteric venules. C7/w ^f/emor/zeo/ Af/croc/rc)描述的前-/ 側(cè)-散射的特性來分類，并且每個樣品測定5千個中性粒細胞。
實施例四統(tǒng)計分析
通過單因素方差分析(ANOVA)和費歇爾事后檢驗(Fisher's post hoc test)對數(shù)據(jù)進行分析。所有值用平均數(shù)i標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，設(shè)PO.05有統(tǒng)計 學(xué)意義。
實施例五實驗結(jié)果的分析 細靜脈直徑變化在整個實驗過程中，1/R組沒有觀察到細靜脈直徑的明顯的改變，并且 無論以DLA或SOD預(yù)處理還是后處理，情況都保持不變。(數(shù)據(jù)未寫出)
粘附到細靜脈壁的白細胞數(shù)量的改變
圖2A和圖2B表示以DLA或SOD進行預(yù)處理或后處理對I/R誘導(dǎo)的白細 胞向大鼠腸系膜細靜脈壁粘附的影響。粘附的白細胞數(shù)量在再灌注開始時 迅速增加，且數(shù)量隨時間進一步增加，直到再灌注30分鐘。用DLA預(yù)處理 可減少由I/R誘導(dǎo)的粘附白細胞，其在再灌注開始時明顯減小并在整個再灌 注過程中隨時間進一步減少。用SOD預(yù)處理可以以類似的方式減少由I/R 誘導(dǎo)的粘附白細胞數(shù)量，但是減少到更小的范圍，其在再灌注10分鐘時減 少明顯(圖2A)。
用SOD后處理抑制白細胞粘附的進一步增加，但是對已粘附的白細胞 無效。相反地，用DLA后處理顯著減少粘附的白細胞的量，表明已粘附在 細靜脈管壁上的白細胞的分離(圖2B)。
細靜脈管壁DHR熒光強度的改變
細靜脈管壁DHR熒光強度比率隨著時間過程的改變示于圖3A和圖 3B。在對照組，細靜脈管壁DHR熒光強度比率在整個觀察過程中沒有明顯 的改變。在I/R組，細靜脈管壁DHR熒光強度明顯線性增加直到再灌注結(jié) 束。用DLA前處理明顯減弱由I/R誘導(dǎo)的DHR熒光增強。用SOD前處理也 明顯減弱由I/R誘導(dǎo)的細靜脈管壁DHR熒光比率的增加，與I/R組相比較在 再灌注10和30分鐘時有明顯的不同(圖3A)。
用DLA和SOD后處理以類似的方式抑制I/R誘導(dǎo)的DHR熒光比率增 加，細靜脈壁DHR熒光強度在DLA或SOD輸注期間幾乎保持恒定，并且與 1/R組相比在再灌注30分鐘時達到顯著差異，其主要歸因于I/R組DHR熒光 強度的增加，如圖3B所示。
白蛋白從細靜脈管壁滲出的改變
大鼠腸系膜細靜脈管壁的白蛋白的滲出在圖4A和圖4B中隨時間定量 化表示。在I/R之前，在所有組中皆未發(fā)現(xiàn)白蛋白的滲出，且對照組的整個 觀察中這個情況始終保持。在I/R組， 一旦再灌注開始，則從細靜脈滲出的白蛋白立即增加，并且直到再灌注30分鐘時，滲出進一步增加。用DLA或 SOD預(yù)處理明顯減弱由I/R誘導(dǎo)的白蛋白從細靜脈管壁的滲出的增加(圖4 A)。
用DLA或SOD后處理也對I/R誘導(dǎo)的白蛋白從細靜脈管壁的滲出產(chǎn)生 明顯的減弱作用，如圖4B所示。實驗顯示，只要開始輸注DLA或SOD，則 細靜脈管壁白蛋白滲出保持不變，表明采用DLA或SOD處理可防止白蛋白 的滲出進一步增加。
微血管周圍肥大細胞脫顆粒作用
1/R引起肥大細胞脫顆粒作用明顯增加(圖5A和圖5B)。定量分析表 明通過DLA和SOD預(yù)處理對I/R誘發(fā)的肥大細胞脫顆粒作用增加有明顯的 減弱作用，但通過DLA和SOD后處理無效。
中性粒細胞上的粘附分子CDllb和CD18的熒光強度
進行體外研究測定中性粒細胞上的粘附分子CDllb和CD18的熒光強 度，結(jié)果表示在圖6中。與對照組相比，H202刺激明顯增強CDllb和CD18 的熒光強度，并且這種增強可被以濃度依賴性的方式用DLA (0.2 mg/ml， 0.5 mg/ml或1.0 mg/ml)處理明顯減弱。
DLA減輕由缺血和再灌注引起的微循環(huán)障礙的示意圖如圖7所示， I/R，表示缺血和再灌注；XO，表示黃嘌呤氧化酶；CDllb/CD18，表示粘 附分子CDllb和CD18; ICAM-1，表示細胞間粘附分子-l;丄，表示抑制。
雖然本發(fā)明已以較佳實施例披露如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任 何所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可作些 許的更動與改進，因此本發(fā)明的保護范圍當(dāng)視權(quán)利要求所界定者為準(zhǔn)。
1權(quán)利要求
1. 3，4-二羥基-苯基乳酸在制備治療微循環(huán)障礙的藥物中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述微循環(huán)障礙為腸系膜 微循環(huán)障礙。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述微循環(huán)障礙由缺 血/再灌注引起。
4. 3，4-二羥基-苯基乳酸在制備防止微循環(huán)障礙引起的白細胞粘附的 藥物中的應(yīng)用。
5. 3,4-二羥基-苯基乳酸在制備恢復(fù)微循環(huán)障礙所引起的己粘附的白 細胞的藥物中的應(yīng)用。
6. 3,4-二羥基-苯基乳酸在制備抑制微循環(huán)障礙引起的白蛋白從細靜 脈滲出的藥物中的應(yīng)用。
7. 3,4-二羥基-苯基乳酸在制備抑制微循環(huán)障礙引起的肥大細胞脫顆 粒的藥物中的應(yīng)用。
8. 3,4-二羥基-苯基乳酸在制備抑制微循環(huán)障礙引起的中性粒細胞上 粘附分子CDllb和CD18表達的藥物中的應(yīng)用。
9. 3,4-二羥基-苯基乳酸在制備抑制微循環(huán)障礙引起的過氧化物生成 的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
丹參(SM)包括在大量的用來治療血管疾病的傳統(tǒng)的中藥中，3，4-二羥基-苯基乳酸(DLA)是丹參的主要活性成分之一。本發(fā)明揭示3，4-二羥基-苯基乳酸在制備治療微循環(huán)障礙的藥物中的應(yīng)用。所述微循環(huán)障礙為腸系膜微循環(huán)障礙，由缺血/再灌注引起。本發(fā)明還揭示3，4-二羥基-苯基乳酸在制備防止微循環(huán)障礙引起的白細胞粘附的藥物中、恢復(fù)微循環(huán)障礙所引起的已粘附的白細胞的藥物中、抑制微循環(huán)障礙引起的白蛋白從細靜脈滲出的藥物中、抑制微循環(huán)障礙引起的肥大細胞脫顆粒的藥物中、制微循環(huán)障礙引起的中性粒細胞上粘附分子CD11b和CD18表達的藥物中、抑制微循環(huán)障礙引起的過氧化物生成的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號A61K31/192GK101485648SQ20081000104
公開日2009年7月22日 申請日期2008年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月15日
發(fā)明者韓晶巖 申請人:天津天士力制藥股份有限公司