專利名稱：水稻矮縮病毒第六號(hào)基因片段的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物病毒的分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及水稻矮縮病毒(RDV)非結(jié)構(gòu)蛋白基因S6生物學(xué)功能的確定。
水稻矮縮病毒(RDV)基因組由12條雙鏈RNA組成，基因組的總長(zhǎng)度為25617bp，編碼7個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(P1，P2，P3，P5，P7，P8和P8’)和至少6個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(Pns4，Pns6，Pns9，Pns10，Pns11和Pns12)。這些非結(jié)構(gòu)蛋白的功能還不清楚。由于RDV基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜，并且不能機(jī)械傳播。因此，在完整的植物呼腸孤病毒基因組中用反義遺傳學(xué)的方法研究非結(jié)構(gòu)蛋白基因的功能，如細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)蛋白，是不可能的，導(dǎo)致目前都不能獲得RDV及其他植物呼腸孤病毒的侵染性克隆。
植物病毒的細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)是病毒對(duì)植物進(jìn)行系統(tǒng)侵染所必需的一步。在不同種的病毒之間，它們行使細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)的策略差異很大。通過對(duì)某些病毒的研究發(fā)現(xiàn)，它們的基因組能編碼細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)所必需的蛋白，而這些蛋白是通過改變細(xì)胞壁胞間連絲的通透直徑來行使功能的。
水稻矮縮病毒第六號(hào)基因片段S6編碼一個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白Pns6，利用計(jì)算機(jī)軟件對(duì)Pns6序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)它含有類似依賴于ATP的RNA解旋酶的保守模式。
為了找到RDV基因組中與細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)有關(guān)的基因，發(fā)明人利用含有Gus報(bào)告基因的馬鈴薯X病毒細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)缺陷型株pPVX25KmGUS與RDV基因組中各個(gè)基因組分進(jìn)行互補(bǔ)試驗(yàn)的方法，證明運(yùn)動(dòng)缺陷型病毒株pPVX25KmGUS在煙草葉片中的細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)可以通過共表達(dá)RDVS6基因而得以互補(bǔ)恢復(fù)，而RDV基因組中其他基因組分不具備上述功能。在pPVX25KmGUS中，細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)蛋白25K含有一個(gè)缺失突變導(dǎo)致缺失C端72個(gè)氨基酸，而不能進(jìn)行細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)。具體步驟為(1)將RDV-S6基因采用合適的限制性內(nèi)切酶釋放出來，克隆入帶有CaMV35S啟動(dòng)子的植物瞬間表達(dá)載體，經(jīng)過抗生素篩選以及酶切鑒定后確認(rèn)得到了植物瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒pRLRS6；(2)將上述表達(dá)質(zhì)粒與含有Gus報(bào)告基因的馬鈴薯X病毒細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)缺陷型株pPVX25KmGUS一起快速導(dǎo)入煙草葉片中，證明運(yùn)動(dòng)缺陷型病毒株pPVX25KmGUS在煙草葉片中的細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)可以通過共表達(dá)RDVS6基因而得以互補(bǔ)恢復(fù)，而RDV基因組中其他基因組分不具備上述功能。
此外，以綠色熒光蛋白(EGFP)為報(bào)告基因在煙草葉片表皮細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)S6基因和EGFP的融合基因，發(fā)現(xiàn)RDV基因S6編碼蛋白(Pns6)以點(diǎn)狀方式分布于細(xì)胞壁胞間連絲處，在細(xì)胞質(zhì)中形成不規(guī)則的聚集體，而且可以進(jìn)入細(xì)胞核中。具體步驟為(1)采用兩步重組PCR的方法獲得S6與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP，Clontech)的融合基因根據(jù)RDV S6基因和EGFP基因堿基序列，分別設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，通過高保真PCR方法擴(kuò)增出RDV S6基因和EGFP的融合基因片段，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒，將第一輪PCR產(chǎn)物回收，并以此產(chǎn)物為模板，用S6正向引物和EGFP反向引物進(jìn)行第二輪PCR，最后得到S6和EGFP基因開放讀碼框融合的基因產(chǎn)物；(2)將PCR得到的RDV S6-EGFP融合基因進(jìn)行回收純化，用KpnI酶切消化，克隆入帶有CaMV 35S啟動(dòng)子的植物瞬時(shí)表達(dá)載體pRTL2(用NcoI和KpnI兩種酶切開)中。經(jīng)過氨卞青霉素篩選以及酶切鑒定后確認(rèn)得到了植物瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒pRTL2RS6-EGFP；(3)將目的基因S6-EGFP快速導(dǎo)入煙草葉片，發(fā)現(xiàn)RDV基因S6編碼蛋白(Pns6)以點(diǎn)狀方式分布于細(xì)胞壁胞間連絲處，在細(xì)胞質(zhì)中形成不規(guī)則的聚集體，而且可以進(jìn)入細(xì)胞核中。
對(duì)RDV侵染水稻葉片的免疫組織化學(xué)分析結(jié)果均表明Pns6在RDV侵染的水稻葉片中具有相同的亞細(xì)胞定位，證明Pns6在細(xì)胞中的分布具有運(yùn)動(dòng)蛋白分布的典型特征。
本發(fā)明關(guān)于水稻矮縮病毒(RDV)非結(jié)構(gòu)蛋白基因S6生物學(xué)功能的確定，是有關(guān)雙鏈RNA植物病毒細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)蛋白的首次報(bào)道。水稻矮縮病毒第六號(hào)基因片段S6基因生物學(xué)功能的確定，有助于更深一步的了解水稻矮縮病毒系統(tǒng)侵染植物的機(jī)制，從而獲得更強(qiáng)的抗RDV植株，有廣泛的農(nóng)業(yè)利用價(jià)值。本發(fā)明通過對(duì)RDV S6基因生物學(xué)功能的研究，確定非結(jié)構(gòu)蛋白Pns6可以行使細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)蛋白的功能，有很大的理論和應(yīng)用價(jià)值，有助于對(duì)RDV侵染植物及其細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)機(jī)制的進(jìn)一步了解，從而更有效地防治水稻矮縮病。
實(shí)例1.
利用含有Gus報(bào)告基因的馬鈴薯X病毒細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)缺陷型株pPVX25KmGUS與RDV基因組中各個(gè)基因組分進(jìn)行互補(bǔ)試驗(yàn)的方法，證明運(yùn)動(dòng)缺陷型病毒株pPVX25KmGUS在煙草葉片中的細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)可以通過共表達(dá)RDVS6基因而得以互補(bǔ)恢復(fù)，而RDV基因組中其他基因組分不具備上述功能。在pPVX25KmGUS中，細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)蛋白25K含有一個(gè)缺失突變導(dǎo)致缺失C端72個(gè)氨基酸，而不能進(jìn)行細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)。具體步驟為(1)包含RDV-S6基因的植物瞬時(shí)表達(dá)載體克隆的構(gòu)建將RDV-S6基因采用合適的限制性內(nèi)切酶(BamHI和PstI)釋放出來，克隆入帶有CaMV 35S啟動(dòng)子的植物瞬間表達(dá)載體。經(jīng)過抗生素篩選以及酶切鑒定后確認(rèn)得到了植物瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒pRLRS6。
(2)將上述表達(dá)質(zhì)粒與含有Gus報(bào)告基因的馬鈴薯X病毒細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)缺陷型株pPVX25KmGUS一起利用基因槍快速導(dǎo)入煙草葉片中把5μl表達(dá)質(zhì)粒DNA(1.0μg/μl)用2.5M Cacl2和0.1M亞精胺沉淀附著在3mg的金顆粒(1μm)上。用70％乙醇洗滌質(zhì)粒DNA包裹的金顆粒，并使之懸浮于無水乙醇中。超聲處理后取20μl混合物待金顆粒干燥后高壓轟擊煙草葉片(PDS-1000型基因槍，Bio-Rad)。
發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)缺陷型病毒株pPVX25KmGUS在煙草葉片中的細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)可以通過共表達(dá)RDVS6基因而得以互補(bǔ)恢復(fù)，而RDV基因組中其他基因組分不具備上述功能。從而證明RDVS6基因編碼蛋白質(zhì)具有細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)功能。實(shí)例2.
以綠色熒光蛋白(EGFP)為報(bào)告基因在煙草葉片表皮細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)S6基因和EGFP的融合基因，發(fā)現(xiàn)RDV基因S6編碼蛋白(Pns6)以點(diǎn)狀方式分布于細(xì)胞壁胞間連絲處，在細(xì)胞質(zhì)中形成不規(guī)則的聚集體，而且可以進(jìn)入細(xì)胞核中。具體步驟為(1)RDV S6-GFP融和基因的獲得采用兩步重組PCR的方法獲得S6與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP，Clontech)的融合基因。
A.根據(jù)RDV S6基因和EGFP基因堿基序列，分別設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，分別為S6正向引物5’AAA ATG GAC ACA GAA ACT CTT TGC-3’S6反向引物5’CC TCG CCC TTG CTC ACC ATT TTG TAC ACG GTA ATA GCA-3’此引物包含S6基因3’端互補(bǔ)序列和EGFP基因的起始序列。
EGFP正向引物5’TGC TAT TAC CGT GTA CAAAAT GGT GAG CAA GGG CGA GG-3’此引物與S6反向引物互補(bǔ)。
EGFP反向引物5’GTC GGT ACC TTT ACT TGT ACA GCT CGT CC-3’此引物包含一個(gè)KpnI酶切位點(diǎn)。
B.根據(jù)基因工程方法我們?cè)O(shè)計(jì)了兩步重組PCR方法，采用了合適的條件，得到了S6-EGFP融合基因。
實(shí)驗(yàn)方法如下通過高保真PCR方法擴(kuò)增出RDV S6基因和EGFP基因片段，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(購(gòu)自Qiagen公司)，將第一輪PCR產(chǎn)物回收，并以此產(chǎn)物為模板，用S6正向引物和EGFP反向引物進(jìn)行第二輪PCR，最后得到S6和EGFP基因開放讀碼框融合的基因產(chǎn)物。
(2)包含RDVS6-GFP融合基因的植物瞬時(shí)表達(dá)載體克隆的構(gòu)建將PCR得到的RDV S6-EGFP融合基因進(jìn)行回收純化，用KpnI酶切消化，克隆入帶有CaMV 35S啟動(dòng)子的植物瞬時(shí)表達(dá)載體pRTL2(用NcoI和KpnI兩種酶切開)中。經(jīng)過氨卞青霉素篩選以及酶切鑒定后確認(rèn)得到了植物瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒pRTL2RS6-EGFP。
(3)利用基因槍將目的基因S6-EGFP快速導(dǎo)入煙草葉片把5μl表達(dá)質(zhì)粒DNA(1.0μg/μl)用2.5M Cacl2和0.1M亞精胺沉淀附著在3mg的金顆粒(1μm)上。用70％乙醇洗滌質(zhì)粒DNA包裹的金顆粒，并使之懸浮于無水乙醇中。超聲處理后取20μl混合物待金顆粒干燥后高壓轟擊煙草葉片(PDS-1000型基因槍，Bio-Rad)。
發(fā)現(xiàn)RDV基因S6編碼蛋白(Pns6)以點(diǎn)狀方式分布于細(xì)胞壁胞間連絲處，在細(xì)胞質(zhì)中形成不規(guī)則的聚集體，而且可以進(jìn)入細(xì)胞核中。
權(quán)利要求
1.水稻矮縮病毒第六號(hào)基因片段，屬于細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的水稻矮縮病毒第六號(hào)基因片段，其生物學(xué)功能的確定方法包括以下步驟(1)將RDV-S6基因采用合適的限制性內(nèi)切酶釋放出來，克隆入帶有CaMV 35S啟動(dòng)子的植物瞬間表達(dá)載體，經(jīng)過抗生素篩選以及酶切鑒定后確認(rèn)得到了植物瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒pRLRS6；(2)將上述表達(dá)質(zhì)粒與含有Gus報(bào)告基因的馬鈴薯X病毒細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)缺陷型株pPVX25KmGUS一起快速導(dǎo)入煙草葉片中，證明運(yùn)動(dòng)缺陷型病毒株pPVX25KmGUS在煙草葉片中的細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)可以通過共表達(dá)RDVS6基因而得以互補(bǔ)恢復(fù)，而RDV基因組中其他基因組分不具備上述功能。
3.如權(quán)利要求1所述的水稻矮縮病毒第六號(hào)基因片段，其生物學(xué)功能的確定方法包括以下步驟(1)采用兩步重組PCR的方法獲得S6與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP，Clontech)的融合基因根據(jù)RDV S6基因和EGFP基因堿基序列，分別設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，通過高保真PCR方法擴(kuò)增出RDV S6基因和EGFP基因片段，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒，將第一輪PCR產(chǎn)物回收，并以此產(chǎn)物為模板，用S6正向引物和EGFP反向引物進(jìn)行第二輪PCR，最后得到S6和EGFP基因開放讀碼框融合的基因產(chǎn)物；(2)將PCR得到的RDV S6-EGFP融合基因進(jìn)行回收純化，用KpnI酶切消化，克隆入帶有CaMV 35S啟動(dòng)子的植物瞬時(shí)表達(dá)載體pRTL2(用NcoI和KpnI兩種酶切開)中，經(jīng)過氨卞青霉素篩選以及酶切鑒定后確認(rèn)得到了植物瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒pRTL2RS6-EGFP；(3)將目的基因S6-EGFP快速導(dǎo)入煙草葉片，發(fā)現(xiàn)RDV基因S6編碼蛋白(Pns6)以點(diǎn)狀方式分布于細(xì)胞壁胞間連絲處，在細(xì)胞質(zhì)中形成不規(guī)則的聚集體，而且可以進(jìn)入細(xì)胞核中。
4.如權(quán)利要求1所述的水稻矮縮病毒第六號(hào)基因片段，其細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)功能的應(yīng)用開發(fā)。
全文摘要
本發(fā)明涉及水稻矮縮病毒rice dwarf virus(RDV)非結(jié)構(gòu)蛋白基因S6生物學(xué)功能及其確定方法。水稻矮縮病毒第六號(hào)基因片段S6編碼一個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白Pns6,利用馬鈴薯X病毒Potato Virus X(PVX)細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)缺陷株的侵染性克隆與RDV編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白基因進(jìn)行的互補(bǔ)試驗(yàn)表明RDV S6編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白是RDV的細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)蛋白。Pns6的細(xì)胞內(nèi)定位研究表明S6蛋白定位于植物細(xì)胞壁胞間連絲處,具有運(yùn)動(dòng)蛋白的典型特征。S6基因生物學(xué)功能的確定,有助于更深一步的了解水稻矮縮病毒系統(tǒng)侵染植物的機(jī)制,從而獲得更強(qiáng)的抗RDV植株,有廣泛的農(nóng)業(yè)利用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/46GK1344797SQ0113472
公開日2002年4月17日 申請(qǐng)日期2001年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月9日
發(fā)明者李毅, 魏春紅, 吳剛, 劉慧君 申請(qǐng)人:北京大學(xué)