水稻品種9194抗黑條矮縮病位點(diǎn)qRBSDV11及其分子標(biāo)記方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及水稻品種9194抗黑條矮縮病位點(diǎn)qRBSDV11及其分子標(biāo)記方法。對(duì)抗黑條矮縮病水稻品種9194(♀)與感病品種蘇御糯(♂)雜交獲得的F2單株的基因型和相應(yīng)F2:3家系的黑條矮縮病抗性級(jí)別進(jìn)行遺傳連鎖分析，獲得抗黑條矮縮病品種9194抗黑條矮縮病基因位點(diǎn)四個(gè)，其中qRBSDV11位于標(biāo)記RM26062-RM536之間。通過抗黑條矮縮病基因的分子標(biāo)記來檢測(cè)抗性品種9194及其衍生品種(系)中是否含有黑條矮縮病抗性基因位點(diǎn)，可預(yù)測(cè)其黑條矮縮病抗性水平，大大提高抗黑條矮縮病水稻的選擇效率。
【專利說明】水稻品種9194抗黑條矮縮病位點(diǎn)qRBSDV11及其分子標(biāo)記 方法
[0001] 分案說明
[0002] 本申請(qǐng)是2013-03-29日申請(qǐng)的申請(qǐng)?zhí)枮?013101097989,發(fā)明名稱為"水稻品種 9194抗黑條矮縮病位點(diǎn)及其分子標(biāo)記方法"的中國發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及水稻品種9194抗黑條矮縮病位點(diǎn)qRBSDVll及 其分子標(biāo)記方法。 技術(shù)背景
[0004] 水稻是我國的重要糧食作物。水稻黑條矮縮病是一種由水稻黑條矮縮病毒（Rice black-streaked dwarf virus, RBSDV)引起的病毒病，主要由灰飛風(fēng)以持久性不經(jīng)卵方式進(jìn) 行傳播。近年來，隨著耕作制度和栽培方式的變化、冬季氣候變暖和感病品種的大面積推 廣，傳毒介體灰飛虱發(fā)生量日益上升，水稻黑條矮縮病在江蘇、浙江、江西和福建大規(guī)模發(fā) 生，并迅速上升為生產(chǎn)上最主要的病毒病害，給水稻的安全生產(chǎn)帶來很大威脅。水稻黑條矮 縮病的典型癥狀是病株矮縮，葉色濃綠僵硬，葉背、葉鞘和莖桿有早期蠟白色，后期為黑褐 色的短條紋不規(guī)則突起，嚴(yán)重發(fā)病株不抽穗。目前生產(chǎn)上針對(duì)此類病害尚無特效農(nóng)藥，主要 是早期通過對(duì)灰飛虱的防治，減輕其危害，但防治效果并不理想，且污染環(huán)境，破壞生態(tài)平 衡。防治病毒病最理想的方法是選育和利用抗病品種，篩選、發(fā)掘和創(chuàng)新抗病種質(zhì)是開展抗 黑條矮縮病育種的前提和基礎(chǔ)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供水稻品種9194抗黑條矮縮病位 點(diǎn)及其分子標(biāo)記方法。
[0006] 本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] 水稻品種9194抗黑條矮縮病位點(diǎn)，包括位于分子標(biāo)記RM282-RM14898之間的 qRBSDV3,位于分子標(biāo)記RM20069-RM30之間的qRBSDV6、位于分子標(biāo)記RM3912-RM257之間 的qRBSDV9和位于分子標(biāo)記RM26062-RM536之間的qRBSDVll ;所述的分子標(biāo)記RM282引物 為SEQ ID NO. 1/SEQ ID N0. 2,存在qRBSDV3時(shí)的擴(kuò)增條帶為146bp條帶；所述的分子標(biāo)記 RM14898引物為SEQ ID NO. 3/SEQ ID N0. 4,存在qRBSDV3時(shí)的擴(kuò)增條帶為176bp條帶；所述 的分子標(biāo)記RM20069引物為SEQ ID NO. 5/SEQ ID N0. 6,存在qRBSDV6時(shí)的擴(kuò)增條帶為162bp 條帶；所述的分子標(biāo)記RM30弓丨物為SEQ ID NO. 7/SEQ ID NO. 8,存在qRBSDV6時(shí)的擴(kuò)增條帶 為136bp條帶；所述的分子標(biāo)記RM3912引物為SEQ ID NO. 9/SEQ ID NO. 10,存在qRBSDV9時(shí) 的擴(kuò)增條帶為191bp條帶；所述的分子標(biāo)記RM257引物為SEQ IDN0. 11/SEQ IDN0. 12,存在 qRBSDV9時(shí)的擴(kuò)增條帶為155bp條帶；所述的分子標(biāo)記RM26062引物為SEQ ID NO. 13/SEQ ID NO. 14,存在qRBSDVll時(shí)的擴(kuò)增條帶為149bp條帶；所述的分子標(biāo)記RM536引物為SEQ ID NO. 15/SEQ ID NO. 16,存在qRBSDVll時(shí)的擴(kuò)增條帶為242bp條帶。
[0008] 水稻品種9194抗黑條矮縮病位點(diǎn)qRBSDV3的分子標(biāo)記方法：用分子標(biāo)記RM282引 物：SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 2 或者用分子標(biāo)記RM14898 引物：SEQ ID NO. 3/SEQ ID NO. 4,擴(kuò)增 水稻抗黑條矮縮病品種或育種材料DNA，如果用分子標(biāo)記RM282引物能夠擴(kuò)增出146bp的擴(kuò) 增片段，或用分子標(biāo)記RM14898引物能夠擴(kuò)增出176bp的擴(kuò)增片段，則標(biāo)志著水稻品種抗黑 條矮縮病位點(diǎn)qRBSDV3的存在。
[0009] 水稻品種9194抗黑條矮縮病位點(diǎn)qRBSDV6的分子標(biāo)記方法：用分子標(biāo)記RM20069 弓丨物：SEQ ID NO. 5/SEQ ID N0. 6,或者用分子標(biāo)記 RM30 引物：SEQ ID NO. 7/SEQ ID N0. 8 擴(kuò)增 水稻抗黑條矮縮病品種或育種材料DNA，如果用分子標(biāo)記RM20069引物能夠擴(kuò)增出162bp的 擴(kuò)增片段，或用分子標(biāo)記RM30引物能夠擴(kuò)增出136bp的擴(kuò)增片段，則標(biāo)志著水稻品種抗黑 條矮縮病位點(diǎn)qRBSDV6的存在。
[0010] 水稻品種9194抗黑條矮縮病位點(diǎn)qRBSDV9的分子標(biāo)記方法：用分子標(biāo)記RM3912 引物：SEQ ID NO. 9/SEQ ID N0. 10,或者用分子標(biāo)記 RM257 引物：SEQ ID NO. 11/SEQ ID N0. 12 擴(kuò)增水稻抗黑條矮縮病品種或育種材料DNA，如果用分子標(biāo)記RM3912引物能夠擴(kuò)增出 191bp的擴(kuò)增片段，或用分子標(biāo)記RM257引物能夠擴(kuò)增出155bp的擴(kuò)增片段均標(biāo)志著水稻品 種抗黑條矮縮病位點(diǎn)qRBSDV9的存在。
[0011] 水稻品種9194抗黑條矮縮病位點(diǎn)qRBSDVl 1的分子標(biāo)記方法：用分子標(biāo)記 RM26062 引物：SEQ ID NO. 13/SEQ ID N0. 14,或者用分子標(biāo)記 RM536 引物：SEQ ID NO. 15/SEQ ID NO. 16擴(kuò)增水稻抗黑條矮縮病品種或育種材料DNA，如果用分子標(biāo)記RM26062引物能夠擴(kuò) 增出149bp的擴(kuò)增片段，或用分子標(biāo)記RM536引物能夠擴(kuò)增出242bp的擴(kuò)增片段，則標(biāo)志著 水稻品種抗黑條矮縮病位點(diǎn)qRBSDVll的存在。
[0012] 篩選所述的水稻品種9194抗黑條矮縮病位點(diǎn)的分子標(biāo)記的方法，包含如下步驟：
[0013] (1)以抗黑條矮縮病品種9194為母本，感黑條矮縮病粳稻品種蘇御糯為父本，配 制雜種匕，構(gòu)建了包含200個(gè)單株的F 2分離群體，每個(gè)F2單株通過自交獲得相應(yīng)的F2:3家 系，進(jìn)行抗黑條矮縮病鑒定；
[0014] ⑵用SDS法提取親本、Fi及F2群體各株系的DNA，采用簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記SSR對(duì) 兩親本進(jìn)行多態(tài)性篩選，PCR在PTC-200擴(kuò)增儀上進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物在8%聚丙烯酰胺凝膠上 進(jìn)行電泳分析，親本間有多態(tài)的引物在F 2群體中進(jìn)行分析，獲取群體基因型資料；
[0015] (3)根據(jù)連鎖交換規(guī)律，利用群體基因型資料構(gòu)建水稻的遺傳圖譜，所用軟件為 MAPMARKER/EXP3. 0,用Kosambi函數(shù)將重組值轉(zhuǎn)換為遺傳距離；
[0016] (4)采用田間誘發(fā)結(jié)合室內(nèi)接種鑒定進(jìn)行黑條矮縮病的抗性鑒定；
[0017] (5)利用MAPMARKER/EXP3. 0軟件對(duì)各個(gè)分子標(biāo)記的群體基因型和相應(yīng)家系的黑 條矮縮病抗性級(jí)別進(jìn)行連鎖分析，并將Kosambi函數(shù)轉(zhuǎn)換為遺傳距離。利用Windows QTL Cartographer V2. 0軟件復(fù)合區(qū)間作圖法，以2cM為步長在全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。QTL 的檢測(cè)采用5%總體顯著水平，相應(yīng)L0D統(tǒng)計(jì)量的顯著閾值用排列測(cè)驗(yàn)方法進(jìn)行估計(jì)，共重 復(fù)抽樣1000次。同時(shí)估計(jì)了各位點(diǎn)的加性效應(yīng)和貢獻(xiàn)率；
[0018] (6)獲得抗黑條矮縮病品種9194抗黑條矮縮病基因位點(diǎn)四個(gè)，分別為qRBSDV3， 位于標(biāo)記RM282-RM14898之間；qRBSDV6,位于標(biāo)記RM20069-RM30之間；qRBSDV9,位于標(biāo)記 RM3912-RM257之間；qRBSDVll，位于標(biāo)記RM26062-RM536之間。通過抗黑條矮縮病主基因 的分子標(biāo)記來檢測(cè)抗性品種9194及其衍生品種（系）中是否含有該主基因位點(diǎn)，可預(yù)測(cè)其 黑條矮縮病抗性水平，大大提高抗黑條矮縮病水稻的選擇效率。
[0019] 本發(fā)明所述的水稻品種9194抗黑條矮縮病位點(diǎn)在水稻育種中的應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明所述的水稻品種9194抗黑條矮縮病位點(diǎn)優(yōu)選在快速篩選抗黑條矮縮病品 種或品系中的應(yīng)用。
[0021] 本發(fā)明所述的水稻品種9194抗黑條矮縮病位點(diǎn)的分子標(biāo)記引物在水稻育種中的 應(yīng)用。
[0022] 本發(fā)明所述的水稻品種9194抗黑條矮縮病位點(diǎn)的分子標(biāo)記引物在快速篩選抗黑 條矮縮病品種或品系中的應(yīng)用。
[0023] 有益效果
[0024] 前期， 申請(qǐng)人:對(duì)來源于20個(gè)國家共960份水稻品種進(jìn)行了抗黑條矮縮病田間誘 發(fā)和人工接種鑒定，篩選到4個(gè)黑條矮縮病發(fā)病率較低的水稻品種，其中水稻品種9194， 連續(xù)三年每年三個(gè)地點(diǎn)田間鑒定均對(duì)黑條矮縮病表現(xiàn)高抗，進(jìn)一步室內(nèi)鑒定結(jié)果也表明， 該品種具有較高的黑條矮縮病抗性。該抗源的發(fā)掘?yàn)榭顾竞跅l矮縮病基因的定位、克隆 和育種利用提供了基礎(chǔ)材料。本發(fā)明利用9194與感病品種蘇御糯雜交獲得的F 2群體進(jìn) 行遺傳連鎖分析，獲得四個(gè)抗黑條矮縮病基因位點(diǎn)，分別為qRBSDV3, qRBSDV6, qRBSDV9和 qRBSDVll。通過與上述四個(gè)基因位點(diǎn)連鎖的分子標(biāo)記來檢測(cè)抗性品種9194及其衍生品種 (系）中是否含有抗黑條矮縮病基因位點(diǎn)，可預(yù)測(cè)其黑條矮縮病抗性水平，大大提高抗黑條 矮縮病水稻的選擇效率。本發(fā)明所提供的水稻品種9194抗黑條矮縮病主效基因位點(diǎn)的分 子標(biāo)記方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0025] (1)通過本發(fā)明在國際上首次用SSR標(biāo)記定位了水稻品種9194中的抗黑條矮縮病 的基因位點(diǎn)。
[0026] (2)通過本發(fā)明分子標(biāo)記定位的抗性基因位點(diǎn)位置明確，鑒定方便。通過檢測(cè)這些 與抗黑條矮縮病基因位點(diǎn)連鎖的分子標(biāo)記，即可以預(yù)測(cè)水稻植株的黑條矮縮病抗性，用于 水稻品種或品系的基因型檢測(cè)，以判斷該品種或品系是否具有黑條矮縮病抗性，進(jìn)而快速 篩選抗病品種或品系用于水稻育種?？剐曰蛭稽c(diǎn)的檢測(cè)方便快速，不受環(huán)境影響；
[0027] (3)輔助育種選擇目標(biāo)明確，節(jié)約成本。在傳統(tǒng)育種方法中，首先要收集具有抗源 的親本與栽培品種進(jìn)行一系列雜交，而且要對(duì)黑條矮縮病的抗性進(jìn)行單株選擇。對(duì)水稻黑 條矮縮病進(jìn)行表型鑒定復(fù)雜，同時(shí)受環(huán)境影響，由于黑條矮縮病不能經(jīng)卵傳毒，要經(jīng)飼養(yǎng)灰 飛虱、帶毒和接種傳毒等復(fù)雜的鑒定過程，非常困難，表型鑒定的結(jié)果可靠性低。因此，抗黑 條矮縮病育種不僅費(fèi)時(shí)，而且難度大，成本高。通過檢測(cè)抗黑條矮縮病基因位點(diǎn)，可以在苗 期就鑒定出抗黑條矮縮病的單株，淘汰其它植株，不僅節(jié)約生產(chǎn)成本而且大大提高抗黑條 矮縮病水稻的選擇效率。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0028] 圖1 9194和蘇御糯接種后的抗性表現(xiàn)。
[0029] 圖2 9194和蘇御糯F2群體抗黑條矮縮病次數(shù)分布圖。
[0030] 圖3水稻品種9194抗黑條矮縮病基因在染色體上的分布。
[0031] 圖4抗黑條矮縮病基因緊密連鎖分子標(biāo)記的電泳圖譜。M:Mark ;1:9194 ;2:蘇御 糯；3 A ;4-13:極抗單株；14-23 :極感單株。
【具體實(shí)施方式】 [0032] 材料與方法：
[0033] ( -）9194/蘇御糯F2群體構(gòu)建及表型鑒定
[0034] (1)以抗黑條矮縮病品種9194為母本，感黑條矮縮病粳稻品種蘇御糯為父本，配 制雜種，構(gòu)建了 9194/蘇御糯F2分離群體，每個(gè)F2單株通過自交獲得相應(yīng)的9194/蘇御糯 F2:3豕系。
[0035] (2)表型鑒定
[0036] (2.1)田間誘發(fā)鑒定
[0037] 材料分別種植于東?？h黃川鎮(zhèn)、贛榆縣土城鎮(zhèn)和灌云縣東辛農(nóng)場(chǎng)試驗(yàn)田，選用四 周為麥田的地塊種植待鑒定材料，以保證獲得足量蟲源。2010和2011年材料均在5月10 日（麥?zhǔn)涨?周）分兩個(gè)重復(fù)進(jìn)行播種，每個(gè)重復(fù)單個(gè)品種播80粒，均勻撒播1行，行長 50cm，行距10cm。6月27日移栽，單苗栽插，行株距15cmX 20cm，每個(gè)品種栽插60穴。常 規(guī)肥水管理，不施用任何農(nóng)藥。2012年鑒定材料分別于5月5日、5月10日和5月15日分 3個(gè)播期進(jìn)行播種，每個(gè)品種播150粒，移栽時(shí)間分別為6月20日、6月25日和6月30日， 每個(gè)品種栽插120穴，其他種植方式與2010和2011年相同。黑條矮縮病誘發(fā)如下：首先通 過盤拍法調(diào)查灰飛虱蟲口密度，將33cmX45cmX 5cm的搪瓷盆對(duì)準(zhǔn)秧苗基部輕拍植株，使 灰飛虱拍落于盤中，然后迅速將落入盤中的灰飛虱導(dǎo)入高約為60cm，直徑約為35cm的塑料 桶內(nèi)。于6月上旬在試驗(yàn)田進(jìn)行調(diào)查，種植材料田塊對(duì)角線定5點(diǎn)取樣，每點(diǎn)拍0. 30m2,記 載灰飛虱數(shù)量。隨機(jī)對(duì)從實(shí)驗(yàn)田塊采集來的100頭灰飛虱進(jìn)行水稻黑條矮縮病毒的RT-PCR 檢測(cè)，確定攜毒率。
[0038] 于7月下旬水稻分蘗盛期統(tǒng)計(jì)發(fā)病率。此時(shí)發(fā)病植株表現(xiàn)出明顯的病狀：極明顯 的矮縮、心葉突破下葉葉鞘而出、部分植株表現(xiàn)為從下葉枕口呈螺旋狀伸出、部分葉片的頂 端出現(xiàn)旋狀卷曲。而健康稻株表現(xiàn)分蘗旺盛，生命力強(qiáng)，但尚未拔節(jié)，發(fā)病植株和健康植株 反差非常明顯。另外，此時(shí)的發(fā)病植株很少有中間型病狀，以每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)2個(gè)重復(fù)的發(fā)病百 分率平均值作為品種抗黑條矮縮病表型值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
[0039] (2. 2)人工接種黑條矮縮病毒
[0040] 將親本、抗病和感病對(duì)照品種浸種催芽，播種200粒露白發(fā)芽種子于 70. 5cmX 50. 5cmX41. 5cm的塑料箱內(nèi)，底部接塑料管通水，保持水層約3cm。當(dāng)秧苗長至 2. 5-3. 0葉時(shí)間苗，淘汰病弱苗，保留約150株整齊一致的健苗，每個(gè)塑料箱頂端用紗布封 口。于2012年6月10日接入從東海黃川（試驗(yàn)點(diǎn)中灰飛虱帶毒率最高）采集的灰飛虱進(jìn) 行接種，每天驅(qū)趕灰飛虱數(shù)次。7d后拿掉紗布，移走苗上的灰飛虱，把接種后的苗移栽到大 田，長至分蘗盛期時(shí)調(diào)查病情。人工接種同期每個(gè)品種做三個(gè)重復(fù)，按每苗20頭灰飛虱計(jì) 算接蟲。
[0041] (二）9194/蘇御糯F2群體的分子標(biāo)記分析
[0042] (1)用SDS法提取親本、Fi及F2群體各株系的DNA。
[0043] (2) SSR分析參照 Chen et al. (1997)的程序。10 μ 1 反應(yīng)體系包括：10mM Tris-HCl ρΗ8· 3, 50mM KC1, 1. 5mM MgC12, 50 μ M dNTPs, 0· 2 μ Μ引物，0· 5U Taq polymerase (TaKaRa,大 連）和 20ng of DNA模板。擴(kuò)增反應(yīng)在PTC-200(MJ Research Inc. )PCR儀上進(jìn)行：94°C 4min ; 94°C lmin, 55°C lmin，72°C 1. 5min，35 個(gè)循環(huán)；72°C 7min。擴(kuò)增產(chǎn)物用 8% 的非變性 PAGE 膠分離，通過銀染顯色，銀染程序根據(jù)Sanguinetti etal. (1994)的方法制定而成。擴(kuò)增的 DNA條帶利用裝有熒光燈的燈箱進(jìn)行觀察。記錄結(jié)果，親本間有多態(tài)的引物在F2群體中進(jìn) 行分析，獲取群體基因型資料；
[0044] (3)根據(jù)連鎖交換規(guī)律，利用群體基因型資料構(gòu)建水稻的遺傳圖譜，所用軟件為 MAPMAKER/EXP3. 0,最小L0D值設(shè)為2,獲得連鎖圖譜；
[0045] (4)利用 Windows QTL Cartographer V2· 0 軟件（Wang et al.，2〇〇3)復(fù)合區(qū)間作圖 法（Composite interval mapping, CIM)，以2cM為步長在全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。QTL的 檢測(cè)采用5%總體顯著水平，相應(yīng)L0D統(tǒng)計(jì)量的顯著閾值用排列測(cè)驗(yàn)（Permutation test) (Churchill and Doerge，1994)方法進(jìn)行估計(jì)，共重復(fù)抽樣1000次。同時(shí)估計(jì)了各位點(diǎn)的 加性效應(yīng)和貢獻(xiàn)率。利用MAPMAKER/3. 0分析軟件進(jìn)行黑條矮縮病抗性與SSR標(biāo)記的分離 分析。并將Kosambi函數(shù)轉(zhuǎn)換為遺傳距離（cM)。
[0046] (三）結(jié)果與分析：
[0047] 9194和蘇御糯經(jīng)黑條矮縮病的田間和室內(nèi)鑒定其平均發(fā)病率分別8. 9%和78%， 表明9194具有較高的黑條矮縮病抗性，而蘇御糯對(duì)黑條矮縮病高度敏感（圖1)。200個(gè)F2:3 家系對(duì)黑條矮縮病的抗性頻率分布呈連續(xù)分布，表明該群體中可能存在多個(gè)抗黑條矮縮病 位點(diǎn)（圖2)。從&群體中挑選三個(gè)地點(diǎn)及室內(nèi)鑒定均表現(xiàn)高抗或高感的單株各10株，進(jìn)行 12條染色體的連鎖分析，在水稻第3,6,9和11染色體發(fā)現(xiàn)與目標(biāo)性狀有連鎖跡象。進(jìn)一步 構(gòu)建了第3,6,9和11全染色體的連鎖圖譜，結(jié)合表型數(shù)據(jù)，利用Windows QTL Cartographer V2. 0軟件進(jìn)行抗黑條矮縮病的QTL檢測(cè)。結(jié)果在水稻第3染色體標(biāo)記RM282-RM14898之 間檢測(cè)到一個(gè)抗黑條矮縮病QTL qRBSDV3, L0D值為2. 34,貢獻(xiàn)率為5. 4% ;在水稻第6染色 體標(biāo)記RM20069-RM30之間檢測(cè)到一個(gè)抗黑條矮縮病QTL qRBSDV6, L0D值為4. 42,貢獻(xiàn)率為 10. 3%;在水稻第9染色體標(biāo)記RM3912-RM257之間檢測(cè)到一個(gè)抗黑條矮縮病QTL qRBSDV9， L0D值為6. 63,貢獻(xiàn)率為35. 5% ;在水稻第11染色體標(biāo)記RM26062-RM536之間檢測(cè)到一個(gè) 抗黑條矮縮病QTL qRBSDVl 1，L0D值為3. 55，貢獻(xiàn)率為31. 1 %。上述四個(gè)QTLs可解釋表型 變異82. 3% (圖3)。
[0048] 分子標(biāo)記RM282引物：
[0049] 上游引物：CTGTGTCGAAAGGCTGCAC (SEQ ID NO. 1)
[0050] 下游引物：CAGTCCTGTGTTGCAGCAAG(SEQ ID Ν0· 2)
[0051] 分子標(biāo)記RM14898引物：
[0052] 上游引物：ATGTTCAACCTTGTCCCGACTAACC (SEQ ID N0. 3)
[0053] 下游引物：TAAAGACGGCAGCTATCACTTTGC (SEQ ID Ν0· 4)
[0054] 用分子標(biāo)記RM282引物：SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 2或者用分子標(biāo)記RM14898引 物：SEQ ID NO. 3/SEQ ID NO. 4,擴(kuò)增水稻抗黑條矮縮病品種或育種材料DNA，如果用分子標(biāo)記 RM282引物能夠擴(kuò)增出146bp的擴(kuò)增片段，或用分子標(biāo)記RM14898引物能夠擴(kuò)增出176bp的 擴(kuò)增片段，則標(biāo)志著水稻品種抗黑條矮縮病位點(diǎn)qRBSDV3的存在（圖4)。
[0055] 分子標(biāo)記RM20069引物：
[0056] 上游引物：GCGAGCGAGAGGAGAGATAGACG (SEQ ID N0. 5)
[0057] 下游引物：CGAATTCGGCACGAGTAATAGGG (SEQ ID NO. 6)
[0058] 分子標(biāo)記RM30引物：
[0059] 上游引物：ACACTGTAGCGGCCACTG (SEQ ID NO. 7)
[0060] 下游引物：CCTCCACTGCTCCACATCTT (SEQ ID NO. 8)
[0061] 用分子標(biāo)記RM20069引物：SEQ ID NO. 5/SEQ ID NO. 6,或者用分子標(biāo)記RM30引 物：SEQ ID NO. 7/SEQ ID NO. 8擴(kuò)增水稻抗黑條矮縮病品種或育種材料DNA，如果用分子標(biāo)記 RM20069引物能夠擴(kuò)增出162bp的擴(kuò)增片段，或用分子標(biāo)記RM30引物能夠擴(kuò)增出136bp的 擴(kuò)增片段，則標(biāo)志著水稻品種抗黑條矮縮病位點(diǎn)qRBSDV6的存在（圖4)。
[0062] 分子標(biāo)記RM3912引物：
[0063] 上游引物：GCGAGCGAGAGGAGAGATAGACG (SEQ ID N0. 9)
[0064] 下游引物：CGAATTCGGCACGAGTAATAGGG (SEQ ID Ν0· 10)
[0065] 分子標(biāo)記RM257引物：
[0066] 上游引物：ACACTGTAGCGGCCACTG (SEQ ID Ν0· 11)
[0067] 下游引物：CCTCCACTGCTCCACATCTT (SEQ ID Ν0· 12)
[0068] 用分子標(biāo)記RM3912引物：SEQ ID NO. 9/SEQ ID NO. 10,或者用分子標(biāo)記RM257引物： SEQ ID NO. 11/SEQ ID NO. 12擴(kuò)增水稻抗黑條矮縮病品種或育種材料DNA，如果用分子標(biāo)記 RM3912引物能夠擴(kuò)增出191bp的擴(kuò)增片段，或用分子標(biāo)記RM257引物能夠擴(kuò)增出155bp的 擴(kuò)增片段均標(biāo)志著水稻品種抗黑條矮縮病位點(diǎn)qRBSDV9的存在（圖4)。
[0069] 分子標(biāo)記RM26062引物：
[0070] 上游引物：TTTGCGTTTGCGTTTGCGTAGG(SEQ ID N0. 13)
[0071] 下游引物：ACCCGTACACCTCCACACAGTGC(SEQ ID Ν0· 14)
[0072] 分子標(biāo)記RM536引物：
[0073] 上游引物：TCTCTCCTCTTGTTTGGCTC(SEQ ID Ν0· 15)
[0074] 下游引物：ACACACCAACACGACCACAC(SEQ ID Ν0· 16)
[0075] 用分子標(biāo)記RM26062引物：SEQ ID NO. 13/SEQ ID NO. 14,或者用分子標(biāo)記RM536引 物：SEQ ID NO. 15/SEQ ID NO. 16擴(kuò)增水稻抗黑條矮縮病品種或育種材料DNA，如果用分子標(biāo) 記RM26062引物能夠擴(kuò)增出149bp的擴(kuò)增片段，或用分子標(biāo)記RM536引物能夠擴(kuò)增出242bp 的擴(kuò)增片段，則標(biāo)志著水稻品種抗黑條矮縮病位點(diǎn)qRBSDVll的存在（圖4)。
[0076] 通過與上述四個(gè)基因位點(diǎn)連鎖的分子標(biāo)記來檢測(cè)抗性品種9194及其衍生品種 (系）中是否含有抗黑條矮縮病基因位點(diǎn)，可預(yù)測(cè)其黑條矮縮病抗性水平，大大提高抗黑條 矮縮病水稻的選擇效率。
[0001] <110>南京農(nóng)業(yè)大學(xué) <120/水品種9辦1抗黑條矮華病位點(diǎn)Ψ歸sm7f MM分子標(biāo)記方法 <im> 20 <210> 1 <211> 19 <2?2> 0ΧΛ C213> 人工序_ <220 > <22Γ:分 RM2S2 Ι?Ι物 <400^ 1 g t g t g t c giM sggc t gcac 19 <210^ 2 <211'- 19 <2I2> DXA ^213'^ λΤ 宇列 <220-- (22丨> 分 ΚΜ2ΚΤ·#1_ <400> 2 cagtcetgtg ttgcagcaag 20 <210> 3 <2Π> 19 <212> DM (m、. Krmt <220> 22丨：分/? RM148· I:游引物 <?0> 3
[0002] atgttcaaee ttgtcccgac tmm 25 <210> -1 <211> HJ <212/ FJNA <213> KAff-n <mr> <22J> 分/ 標(biāo)記 RMMS98 Kiiw丨物 <400> 4 taaagaeggc agetateaet ttge 24 <210> 5 <2il> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <221 >分:f I小E RM20G69上游引物 <働> 5 gcgagcgiiga ggagagatag aeg 23 <2I0> 6 <211> 19 <212> mk <213> 人.L序列 <220> <221〉分/_標(biāo)id RM20069下游引物 <400> 6 cgaattcgge aegagtaata ggg 23
[0003] <2I0> 7 <211> 18 <212> ΟΝΛ <2I3> 人 I:賴 <220> 分/·標(biāo)k!RM30 1:游引物 <概，7 <icactgtagc ggccHctg 18 <210> 8 <21i> 20 <212：> !)ΝΛ ^2I3> 人 I-J?:列 <220> <221 > 分 Γ' 標(biāo) id RM30 K 游 I 物 <400> 8 cctccuctgc tccacatctt 20 <210> 9 <21 I > 2；i <2I2> Mh <213> Λ I-.序列 <220> <221>分]〈標(biāo)idRM3912丨:游_』|物 <400> 9 gcgagcgaga ggagagatag acg 23
[0004] <21(? 10 <21J> 23 <212> im <213> 人」:印列 /22C)> ，/ik!RM3912 RUI物 <^1()0> 10 rgaat.txggr. acgagtarta ggg 23 <2io> n <211> IB <2t2> I)：\A <213> 人！: Φ 列 <22?> <221>分子標(biāo)記RM257J：游引物 <40()> 11 aeactgtage ggccactg 18 <210> 12 <211> 20 <212> im <2110 Κ? 賴 <220> <221> 分 ffckiRM257 K游引物 <?00> 12 ectxcactgc tecaeatett 20 <210> 13
[0005] <211> 22 <212> i)\A <2ia> KAJ^n <220：> <22\.,分 /? RM2W62 l-JM丨物 <!00> 13 tttgcgtftg cgtttgcgta gg 22 <210^ H <211/ 2：3 <212> ?)ΝΛ <?:?> 人 Π !·;興 <221:.、分 N小丨d RM26062 1、'游*j|物 <400; Η HecegtaGm,: etxcaeTCag tge 23 <2\0'> ΙΓ) <21i> 20 <212； !)X\ <213/ K VffH <220> <22丨，分TSB RM536 i：壽引物 <100> !Γ> tctctcctct tgtttggctc 20 <210> 16 <21I> 20
[0006] <212> UNA <213>人I.斤:則 <220> <221>分/ 標(biāo)WRM536 K游引物 <4()0> 16 acacaccaac acgaccacac 20
【權(quán)利要求】
1. 水稻品種9194抗黑條矮縮病位點(diǎn)qRBSDVll的分子標(biāo)記方法，其特征在于：用分子 標(biāo)記RM26062 引物：SEQ IDNO. 13/SEQ IDNO. 14,或者用分子標(biāo)記RM536 引物：SEQ IDNO. 15/ SEQ ID NO. 16擴(kuò)增水稻抗黑條矮縮病品種或育種材料DNA，如果用分子標(biāo)記RM26062引物能 夠擴(kuò)增出149bp的擴(kuò)增片段，或用分子標(biāo)記RM536引物能夠擴(kuò)增出242bp的擴(kuò)增片段，則標(biāo) 志著水稻品種抗黑條矮縮病位點(diǎn)qRBSDVll的存在。
2. 篩選權(quán)利要求1所述的水稻品種9194抗黑條矮縮病位點(diǎn)qRBSDVll的分子標(biāo)記的方 法，其特征在于包含如下步驟： (1) 以抗黑條矮縮病品種9194為母本，感黑條矮縮病粳稻品種蘇御糯為父本，配制雜 種Fi，構(gòu)建了包含200個(gè)單株的F2分離群體，每個(gè)F 2單株通過自交獲得相應(yīng)的F2:3家系， 進(jìn)行抗黑條矮縮病鑒定； (2) 用SDS法提取親本、Fi及F2群體各株系的DNA，采用簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記SSR對(duì)兩親 本進(jìn)行多態(tài)性篩選，PCR在PTC-200擴(kuò)增儀上進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物在8%聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行 電泳分析，親本間有多態(tài)的引物在F 2群體中進(jìn)行分析，獲取群體基因型資料； (3) 根據(jù)連鎖交換規(guī)律，利用群體基因型資料構(gòu)建水稻的遺傳圖譜，所用軟件為 MAPMARKER/EXP3. 0,用Kosambi函數(shù)將重組值轉(zhuǎn)換為遺傳距離； (4) 采用田間誘發(fā)結(jié)合室內(nèi)接種鑒定進(jìn)行黑條矮縮病的抗性鑒定； (5) 利用MAPMARKER/EXP3. 0軟件對(duì)各個(gè)分子標(biāo)記的群體基因型和相應(yīng)家系的黑條 矮縮病抗性級(jí)別進(jìn)行連鎖分析，并將Kosambi函數(shù)轉(zhuǎn)換為遺傳距離，利用Windows QTL Cartographer V2. 0軟件復(fù)合區(qū)間作圖法，以2cM為步長在全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，QTL的 檢測(cè)采用5%總體顯著水平，相應(yīng)L0D統(tǒng)計(jì)量的顯著閾值用排列測(cè)驗(yàn)方法進(jìn)行估計(jì)，共重復(fù) 抽樣1000次，同時(shí)估計(jì)了各位點(diǎn)的加性效應(yīng)和貢獻(xiàn)率； (6) 獲得抗黑條矮縮病品種9194抗黑條矮縮病基因位點(diǎn)四個(gè)，分別為qRBSDV3,位 于標(biāo)記RM282-RM14898之間；qRBSDV6,位于標(biāo)記RM20069-RM30之間；qRBSDV9,位于標(biāo)記 RM3912-RM257之間；qRBSDVll，位于標(biāo)記RM26062-RM536之間；通過抗黑條矮縮病主基因的 分子標(biāo)記來檢測(cè)抗性品種9194及其衍生品種（系）中是否含有該主基因位點(diǎn)，預(yù)測(cè)其黑條 矮縮病抗性水平，大大提高抗黑條矮縮病水稻的選擇效率。
3. 權(quán)利要求1所述的水稻品種9194抗黑條矮縮病位點(diǎn)的分子標(biāo)記引物，其特征在于 選自分子標(biāo)記RM26062引物：SEQ IDNO. 13/SEQ IDNO. 14,或者分子標(biāo)記RM536引物：SEQ ID NO. 15/SEQ ID NO. 16 〇
4. 權(quán)利要求3所述的水稻品種9194抗黑條矮縮病位點(diǎn)的分子標(biāo)記引物在水稻育種中 的應(yīng)用。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的分子標(biāo)記引物在快速篩選抗黑條矮 縮病品種或品系中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104046692SQ201410289146
【公開日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2014年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月25日
【發(fā)明者】萬建民, 劉裕強(qiáng), 江玲, 孫志廣, 胡金龍, 王寶祥, 王 琦, 趙志剛, 王益華, 陳亮明, 劉世家, 劉喜, 陳賽華, 張文偉, 田云錄, 王春明, 徐大勇 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)